CN107022601B - 用于检测具有国家限量标准的5种食品致病菌的引物组合及其应用 - Google Patents
用于检测具有国家限量标准的5种食品致病菌的引物组合及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测具有国家限量标准的5种食品致病菌的引物组合及其应用。本发明提供的引物组合由引物组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组成。引物组Ⅰ由Ⅰ‑F3、Ⅰ‑B3、Ⅰ‑FIP、Ⅰ‑BIP、Ⅰ‑LF和Ⅰ‑LB组成，引物组Ⅱ由Ⅱ‑F3、Ⅱ‑B3、Ⅱ‑FIP、Ⅱ‑BIP、Ⅱ‑LF和Ⅱ‑LB组成，引物组Ⅲ由Ⅲ‑F3、Ⅲ‑B3、Ⅲ‑FIP、Ⅲ‑BIP、Ⅲ‑LF和Ⅲ‑LB组成，引物组Ⅳ由Ⅳ‑F3、Ⅳ‑B3、Ⅳ‑FIP、Ⅳ‑BIP、Ⅳ‑LF和Ⅳ‑LB组成，引物组Ⅴ由Ⅴ‑F3、Ⅴ‑B3、Ⅴ‑FIP、Ⅴ‑BIP、Ⅴ‑LF和Ⅴ‑LB组成，依次如序列1至30所示。本发明可用于检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157、单核细胞增生李斯特氏菌或副溶血性弧菌，具有重大的推广价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测具有国家限量标准的5种食品致病菌的引物组合及其应用。
背景技术
沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157、单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌是重要的食源性致病菌，已被我国列为食品安全的常规检测项目，并且针对这5种菌制订了致病菌限量标准。沙门氏菌病是重要的人畜共患病原菌，其广泛分布于自然界，主要以家畜、家禽、肉制品和蛋为传播载体，可引起食物中毒、胃肠炎、人类的伤寒及副伤寒等肠道疾病，严重者可导致死亡，是各国公认、全球报道最多、世界最常见引发食源性疾病暴发的首要病原菌，也是我国食源性疾病的主要病原体；金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界，近年来由其引起的食物中毒已呈现出全球的分布状态，已经成为世界公共卫生的一个重要问题。它不仅存在于速冻米面制品中，乳制品和肉类等也通常含有金黄色葡萄球菌的肠毒性菌株，进食被金黄色葡萄球菌污染的食物易导致恶心、呕吐、腹痛、腹泻等急性胃肠炎症状，严重的会导致死亡；大肠埃希氏菌O157是近几十年来新发现的食源性强致病菌，牛肉、生奶、鸡肉及其制品，蔬菜、水果及制品等均可引起污染，其中牛肉是最主要的传播载体。感染少量即可致病，致死率高，能够引起顽固性腹泻及溶血性尿毒症等各种并发症，严重威胁公共卫生安全；单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的食源性致病菌，广泛存在于自然界中，，主要传播媒介为乳制品、肉制品、水产品、果蔬和即食食品，人类受感染后主要表现为败血症、脑膜炎、胃肠炎、孕妇流产等症状。婴幼儿，老年人及免疫耐受病人临床死亡率为30％左右，很多国家都已经采取措施以控制食品中的单核细胞增生李斯特氏菌，并制定了相应的标准；副溶血性弧菌广泛分布于海水和海产品中，是引起食源性疾病暴发的重要病原菌之一，能够引起人类肠胃炎，我国沿海城市副溶血性弧菌引起的食源性疾病暴发在全部食源性疾病暴发中已占首位，部分地区已占到60％左右。
基于传统分离方法的国标法GB依然是目前很多检测机构在进行具有国家限量标准的5种食品致病菌检测的主要依据。主要包括增菌培养，平板分离，生化鉴定等步骤。检测方法繁琐，检测时间长，灵敏度低，容易发生漏检和错检，传统的检测方法已无法满足目前食品快速检测的要求。近几年发展起来的分子检测技术,特别是PCR技术,在微生物快速鉴定和检测方面的应用,为食源性致病菌的快速检测开辟了新的途径。但是,PCR存在检测时间长、易污染、假阳性率高的缺点,使其应用受到限制。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术,其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6～8个区域的4～6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测常见的食源性微生物。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测具有国家限量标准的5种食品致病菌的引物组合及其应用。
本发明首先提供了一种引物组合，为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ和引物组Ⅴ组成；
(a2)由所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ、所述引物组Ⅳ和所述引物组Ⅴ中的任意两个、任意三个或任意四个组成；
(a3)所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ、所述引物组Ⅳ或所述引物组Ⅴ；
所述引物组Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成；
所述引物Ⅰ-F3为如下(b1)或(b2)；
(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-B3为如下(b3)或(b4)；
(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-FIP为如下(b5)或(b6)；
(b5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(b6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-BIP为如下(b7)或(b8)；
(b7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(b8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-LF为如下(b9)或(b10)；
(b9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(b10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-LB为如下(b11)或(b12)；
(b11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(b12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；
所述引物组Ⅱ由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB组成；
所述引物Ⅱ-F3为如下(c1)或(c2)；
(c1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(c2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-B3为如下(c3)或(c4)；
(c3)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(c4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-FIP为如下(c5)或(c6)；
(c5)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
(c6)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-BIP为如下(c7)或(c8)；
(c7)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
(c8)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-LF为如下(c9)或(c10)；
(c9)序列表的序列11所示的单链DNA分子；
(c10)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-LB为如下(c11)或(c12)；
(c11)序列表的序列12所示的单链DNA分子；
(c12)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子；
所述引物组Ⅲ由引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB组成；
所述引物Ⅲ-F3为如下(d1)或(d2)；
(d1)序列表的序列13所示的单链DNA分子；
(d2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-B3为如下(d3)或(d4)；
(d3)序列表的序列14所示的单链DNA分子；
(d4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-FIP为如下(d5)或(d6)；
(d5)序列表的序列15所示的单链DNA分子；
(d6)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-BIP为如下(d7)或(d8)；
(d7)序列表的序列16所示的单链DNA分子；
(d8)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-LF为如下(d9)或(d10)；
(d9)序列表的序列17所示的单链DNA分子；
(d10)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-LB为如下(d11)或(d12)；
(d11)序列表的序列18所示的单链DNA分子；
(d12)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子；
所述引物组Ⅳ由引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB组成；
所述引物Ⅳ-F3为如下(e1)或(e2)；
(e1)序列表的序列19所示的单链DNA分子；
(e2)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-B3为如下(e3)或(e4)；
(e3)序列表的序列20所示的单链DNA分子；
(e4)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-FIP为如下(e5)或(e6)；
(e5)序列表的序列21所示的单链DNA分子；
(e6)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-BIP为如下(e7)或(e8)；
(e7)序列表的序列22所示的单链DNA分子；
(e8)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-LF为如下(e9)或(e10)；
(e9)序列表的序列23所示的单链DNA分子；
(e10)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-LB为如下(e11)或(e12)；
(e11)序列表的序列24所示的单链DNA分子；
(e12)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相同功能的DNA分子；
所述引物组Ⅴ由引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB组成；
所述引物Ⅴ-F3为如下(f1)或(f2)；
(f1)序列表的序列25所示的单链DNA分子；
(f2)将序列25经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列25具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅴ-B3为如下(f3)或(f4)；
(f3)序列表的序列26所示的单链DNA分子；
(f4)将序列26经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列26具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅴ-FIP为如下(f5)或(f6)；
(f5)序列表的序列27所示的单链DNA分子；
(f6)将序列27经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列27具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅴ-BIP为如下(f7)或(f8)；
(f7)序列表的序列28所示的单链DNA分子；
(f8)将序列28经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列28具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅴ-LF为如下(f9)或(f10)；
(f9)序列表的序列29所示的单链DNA分子；
(f10)将序列29经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列29具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅴ-LB为如下(f11)或(f12)；
(f11)序列表的序列30所示的单链DNA分子；
(f12)将序列30经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的DNA分子。
所述引物组Ⅰ中，引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物组Ⅱ中，引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物组Ⅲ中，引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物组Ⅳ中，引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物组Ⅴ中，引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。
本发明还保护所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(g1)或(g2)：
(g1)鉴定沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌和/或大肠埃希氏菌O157和/或单核细胞增生李斯特氏菌和/或副溶血性弧菌；
(g2)用于检测待测样本中是否含有沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌和/或大肠埃希氏菌O157和/或单核细胞增生李斯特氏菌和/或副溶血性弧菌。
本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(g1)或(g2)：
(g1)鉴定沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌和/或大肠埃希氏菌O157和/或单核细胞增生李斯特氏菌和/或副溶血性弧菌；
(g2)用于检测待测样本中是否含有沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌和/或大肠埃希氏菌O157和/或单核细胞增生李斯特氏菌和/或副溶血性弧菌。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护一种检测待测菌是否为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157、单核细胞增生李斯特氏菌或副溶血性弧菌的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测菌的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为沙门氏菌；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为金黄色葡萄球菌；
如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为大肠埃希氏菌O157；
如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为单核细胞增生李斯特氏菌；
如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为副溶血性弧菌。
本发明还保护一种检测待测样本中是否含有沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌和/或大肠埃希氏菌O157和/或单核细胞增生李斯特氏菌和/或副溶血性弧菌的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，分别采用所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有沙门氏菌；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有金黄色葡萄球菌；
如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有大肠埃希氏菌O157；
如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有单核细胞增生李斯特氏菌；
如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有副溶血性弧菌。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅰ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅱ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅲ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅳ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅴ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
本发明还保护所述引物组合在检测待测菌是否为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157、单核细胞增生李斯特氏菌或副溶血性弧菌中的应用。
本发明还保护所述引物组合在检测待测样本中是否含有沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌和/或大肠埃希氏菌O157和/或单核细胞增生李斯特氏菌和/或副溶血性弧菌中的应用。
以上任一所述鼠伤寒沙门氏菌具体可为ATCC编号为14028的菌株。以上任一所述金黄色葡萄球菌具体可为ATCC编号为6538的菌株。以上任一所述大肠埃希氏菌O157具体可为CICC编号为21530的菌株。以上任一所述单核细胞增生李斯特氏菌具体可为ATCC编号为19115的菌株。以上任一所述副溶血性弧菌具体可为ATCC编号为17802的菌株。
采用本发明提供的引物组合鉴定具有国家限量标准的5种食品致病菌，具有高特异性和高灵敏度，可以简便、快速、准确的检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157、单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌。本发明具有重大的推广价值。
附图说明
图1为实施例2中采用引物组Ⅰ的结果。
图2为实施例2中采用引物组Ⅱ的结果。
图3为实施例2中采用引物组Ⅲ的结果。
图4为实施例2中采用引物组Ⅳ的结果。
图5为实施例2中采用引物组Ⅴ的结果。
图6为实施例4中样本一的结果。
图7为实施例4中样本二的结果。
图8为实施例4中样本三的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。ATCC网址：http://www.atcc.org/。CICC网址：http://www.china-cicc.org/。
实施例1、试剂盒的制备
试剂盒由五个LAMP引物组组成，每个引物组用于检测一种食品致病菌。
用于检测沙门氏菌的引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列表的序列1)：CGATCTCGATAAAGTCTCTACAG；
外引物B3(序列表的序列2)：TCATTAATCAACAATACGATGCT；
内引物FIP(序列表的序列3)：CGCAAGTTGAGCTTTTTCCAGATACCGTTGATATTACTTGTGCC；
内引物BIP(序列表的序列4)：CAGTTCTTTATTGATTATGGCGTGCGTTATCGTCCAGGCCCTC；
环引物LF(序列表的序列5)：TCTTCACGCCGGCTCTTC；
环引物LB(序列表的序列6)：GCCTGCCGGAAGTATTGTTAC。
用于检测金黄色葡萄球菌的引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列表的序列7)：CACGCAAACTGTTGGCC；
外引物B3(序列表的序列8)：GAAAAAGTGTACGAGTTCTTGA；
内引物FIP(序列表的序列9)：GCTGCAATGACCTCGTTATTATTGTCTATGAGTTAAAGCTTGCTGAAGG；
内引物BIP(序列表的序列10)：TTGCTTACTTACTGCTGTACCTGTTTTCATAATCGATCACTGGACCG；
环引物LF(序列表的序列11)：TCCCACTAAATGTGTTTCAT；
环引物LB(序列表的序列12)：GAAAGTGTTCAAGTATTTTTATTCA。
用于检测大肠埃希氏菌O157的引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列表的序列13)：TGTGGGAACATTTGGAGAT；
外引物B3(序列表的序列14)：TCAGCAATTTCACGTTTTCG；
内引物FIP(序列表的序列15)：CAGCTAATCCTTGGCCTTTAAAATGAGGTGGAATGGTTGTCACG；
内引物BIP(序列表的序列16)：ACATAGGCAATATTGGCATGACGAACTGGGCTAATCCTATAGCAG；
环引物LF(序列表的序列17)：AAACAACGGTCATAAAGTGTTTT；
环引物LB(序列表的序列18)：TAGGCTACAATTATAGGATGACAAA。
用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列表的序列19)：ATCCTCCTGCATATATCTCAA；
外引物B3(序列表的序列20)：TTTGCGGAGCCACCGTA；
内引物FIP(序列表的序列21)：GCAGCTTTTACTTTGGTACTATGGGGTGTGGCATATGGCCGTC；
内引物BIP(序列表的序列22)：GCTGCCGTAAGTGGGAAATCGCTTTGAAGGAAGAATTTTTGATG；
环引物LF(序列表的序列23)：TTAGTTGATAATTTCAAATAAACTT；
环引物LB(序列表的序列24)：CTCAGGTGATGTAGAACTGACAAA。
用于检测副溶血性弧菌的引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列表的序列25)：AGCATCTGCGGTTTTGG；
外引物B3(序列表的序列26)：CGCGAATGTAATCGCCAT；
内引物FIP(序列表的序列27)：AGCACTTGCTCAACTTTAAGGTGTATCTATCCTTTTCAGTGGTTGG；
内引物BIP(序列表的序列28)：GACTGTGATTACTGATAACTTGCCAGGTACTTAACGTTCGACTCCA；
环引物LF(序列表的序列29)：CACTGCCCCAGTACAA；
环引物LB(序列表的序列30)：ACCGTAGGCCCGTTA。
用于检测沙门氏菌的引物组命名为引物组Ⅰ。用于检测金黄色葡萄球菌的引物组命名为引物组Ⅱ。用于检测大肠埃希氏菌O157的引物组命名为引物组Ⅲ。用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组命名为引物组Ⅳ。用于检测副溶血性弧菌的引物组命名为引物组Ⅴ。
实施例2、特异性
待测菌分别为：
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，ATCC编号为14028；
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，ATCC编号为6538；
大肠埃希氏菌O157，又称出血性大肠埃希氏菌，英文为Escherichia coli EHEC O157:H 7，CICC编号为21530。
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，ATCC编号为19115；
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，ATCC编号为17802。
1、提取待测菌的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，分别采用实施例1制备的各个引物组进行环介导等温扩增。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物和50pg-50ng模板DNA，补水至10μL。引物混合物即引物组中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
采用引物组Ⅰ的结果见图1。只有当待测菌为鼠伤寒沙门氏菌的时候显示阳性扩增曲线。当待测菌为鼠伤寒沙门氏菌以外的其它四种菌的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组Ⅱ的结果见图2。只有当待测菌为金黄色葡萄球菌的时候显示阳性扩增曲线。当待测菌为金黄色葡萄球菌以外的其它四种菌的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组Ⅲ的结果见图3。只有当待测菌为大肠埃希氏菌O157的时候显示阳性扩增曲线。当待测菌为大肠埃希氏菌O157以外的其它四种菌的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组Ⅳ的结果见图4。只有当待测菌为单核细胞增生李斯特氏菌的时候显示阳性扩增曲线。当待测菌为单核细胞增生李斯特氏菌以外的其它四种菌的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组Ⅴ的结果见图5。只有当待测菌为副溶血性弧菌的时候显示阳性扩增曲线。当待测菌为副溶血性弧菌以外的其它四种菌的时候均不显示阳性扩增曲线。
以上结果表明，本发明提供的五个引物组分别对其靶标菌具有很高的特异性。
实施例3、灵敏度
待测菌分别为：
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，ATCC编号为14028；
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，ATCC编号为6538；
大肠埃希氏菌O157，又称出血性大肠埃希氏菌，英文为Escherichia coli EHEC O157:H 7，CICC编号为21530。
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，ATCC编号为19115；
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，ATCC编号为17802。
一、引物组Ⅰ检测沙门氏菌的灵敏度
1、提取鼠伤寒沙门氏菌的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用实施例1制备的引物组Ⅰ进行环介导等温扩增。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物和模板DNA，补水至10μL。引物混合物即引物组中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的浓度均为1μM。反应体系中，模板DNA的含量为10、102、103、104或105个拷贝数。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
结果表明，引物组Ⅰ检测沙门氏菌的灵敏度为103个拷贝数/反应体系。
二、引物组Ⅱ检测金黄色葡萄球菌的灵敏度
用金黄色葡萄球菌代替鼠伤寒沙门氏菌，用引物组Ⅱ代替引物组Ⅰ，其他同步骤一。
结果表明，引物组Ⅱ检测金黄色葡萄球菌的灵敏度为103个拷贝数/反应体系。
三、引物组Ⅲ检测大肠埃希氏菌O157的灵敏度
用大肠埃希氏菌O157代替鼠伤寒沙门氏菌，用引物组Ⅲ代替引物组Ⅰ，其他同步骤一。
结果表明，引物组Ⅲ检测大肠埃希氏菌O157的灵敏度为103个拷贝数/反应体系。
四、引物组Ⅳ检测单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度
用单核细胞增生李斯特氏菌代替鼠伤寒沙门氏菌，用引物组Ⅳ代替引物组Ⅰ，其他同步骤一。
结果表明，引物组Ⅳ检测单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度为103个拷贝数/反应体系。
五、引物组Ⅴ检测副溶血性弧菌的灵敏度
用副溶血性弧菌代替鼠伤寒沙门氏菌，用引物组Ⅴ代替引物组Ⅰ，其他同步骤一。
结果表明，引物组Ⅴ检测副溶血性弧菌的灵敏度为103个拷贝数/反应体系。
实施例4、应用
待测样本为如下样本一、样本二或样本三：
样本一：已通过细菌培养鉴定确认含有沙门氏菌的鸡蛋；
样本二：已通过细菌培养鉴定确认含有金黄色葡萄球菌的午餐肉；
样本三：已通过细菌培养鉴定确认含有副溶血性弧菌的沙丁鱼罐头。
1、提取待测样本的总DNA。
2、以步骤1提取的总DNA为模板，分别采用实施例1制备的各个引物组进行环介导等温扩增。
反应体系(10μL)：7.0μL反应液(博奥生物集团有限公司产品，其产品目录号为CP.440020)、1μL引物混合物和50ng模板DNA，补水至10μL。引物混合物即引物组中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
样本一的结果见图6。只有采用引物组Ⅰ的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅰ以外的其它四个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线。
样本二的结果见图7。只有采用引物组Ⅱ的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅱ以外的其它四个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线。
样本三的结果见图8。只有采用引物组Ⅴ的时候显示阳性扩增曲线。当采用引物组Ⅴ以外的其它四个引物组的时候均不显示阳性扩增曲线。
以上结果表明，利用本发明提供的引物组合进行具有国家限量标准的5种食品致病菌的检测，结果准确可靠。
Claims (8)
1.引物组合，由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ和引物组Ⅴ组成；
所述引物组Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成；所述引物Ⅰ-F3为SEQ ID NO：1所示的单链DNA分子；所述引物Ⅰ-B3为SEQ ID NO：2所示的单链DNA分子；所述引物Ⅰ-FIP为SEQ ID NO：3所示的单链DNA分子；所述引物Ⅰ-BIP为SEQ IDNO：4所示的单链DNA分子；所述引物Ⅰ-LF为SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子；所述引物Ⅰ-LB为SEQ ID NO：6所示的单链DNA分子；
所述引物组Ⅱ由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB组成；所述引物Ⅱ-F3为SEQ ID NO：7所示的单链DNA分子；所述引物Ⅱ-B3为SEQ IDNO：8所示的单链DNA分子；所述引物Ⅱ-FIP为SEQ ID NO：9所示的单链DNA分子；所述引物Ⅱ-BIP为SEQ ID NO：10所示的单链DNA分子；所述引物Ⅱ-LF为SEQ ID NO：11所示的单链DNA分子；所述引物Ⅱ-LB为SEQ ID NO：12所示的单链DNA分子；
所述引物组Ⅲ由引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB组成；所述引物Ⅲ-F3为SEQ ID NO：13所示的单链DNA分子；所述引物Ⅲ-B3为SEQ IDNO：14所示的单链DNA分子；所述引物Ⅲ-FIP为SEQ ID NO：15所示的单链DNA分子；所述引物Ⅲ-BIP为SEQ ID NO：16所示的单链DNA分子；所述引物Ⅲ-LF为SEQ ID NO：17所示的单链DNA分子；所述引物Ⅲ-LB为SEQ ID NO：18所示的单链DNA分子；
所述引物组Ⅳ由引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB组成；所述引物Ⅳ-F3为SEQ ID NO：19所示的单链DNA分子；所述引物Ⅳ-B3为SEQ IDNO：20所示的单链DNA分子；所述引物Ⅳ-FIP为SEQ ID NO：21所示的单链DNA分子；所述引物Ⅳ-BIP为SEQ ID NO：22所示的单链DNA分子；所述引物Ⅳ-LF为SEQ ID NO：23所示的单链DNA分子；所述引物Ⅳ-LB为SEQ ID NO：24所示的单链DNA分子；
所述引物组Ⅴ由引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB组成；所述引物Ⅴ-F3为SEQ ID NO：25所示的单链DNA分子；所述引物Ⅴ-B3为SEQ IDNO：26所示的单链DNA分子；所述引物Ⅴ-FIP为SEQ ID NO：27所示的单链DNA分子；所述引物Ⅴ-BIP为SEQ ID NO：28所示的单链DNA分子；所述引物Ⅴ-LF为SEQ ID NO：29所示的单链DNA分子；所述引物Ⅴ-LB为SEQ ID NO：30所示的单链DNA分子。
2.权利要求1所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(g1)或(g2)：
(g1)鉴定沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌和/或大肠埃希氏菌O157和/或单核细胞增生李斯特氏菌和/或副溶血性弧菌；
(g2)用于检测待测样本中是否含有沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌和/或大肠埃希氏菌O157和/或单核细胞增生李斯特氏菌和/或副溶血性弧菌。
3.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(g1)或(g2)：
(g1)鉴定沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌和/或大肠埃希氏菌O157和/或单核细胞增生李斯特氏菌和/或副溶血性弧菌；
(g2)用于检测待测样本中是否含有沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌和/或大肠埃希氏菌O157和/或单核细胞增生李斯特氏菌和/或副溶血性弧菌。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
5.一种检测待测菌是否为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157、单核细胞增生李斯特氏菌或副溶血性弧菌的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测菌的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为沙门氏菌；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为金黄色葡萄球菌；
如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为大肠埃希氏菌O157；
如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为单核细胞增生李斯特氏菌；
如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为副溶血性弧菌；
所述方法用于非疾病诊断与治疗。
6.一种检测待测样本中是否含有沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌和/或大肠埃希氏菌O157和/或单核细胞增生李斯特氏菌和/或副溶血性弧菌的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有沙门氏菌；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有金黄色葡萄球菌；
如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有大肠埃希氏菌O157；
如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有单核细胞增生李斯特氏菌；
如果采用所述引物组Ⅴ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有副溶血性弧菌；
所述方法用于非疾病诊断与治疗。
7.权利要求1所述引物组合在检测待测菌是否为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157、单核细胞增生李斯特氏菌或副溶血性弧菌中的应用；所述应用用于非疾病诊断与治疗。
8.权利要求1所述引物组合在检测待测样本中是否含有沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌和/或大肠埃希氏菌O157和/或单核细胞增生李斯特氏菌和/或副溶血性弧菌中的应用；所述应用用于非疾病诊断与治疗。
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