CN104278098A - 肠出血性大肠杆菌o157∶h7 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

肠出血性大肠杆菌o157∶h7 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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鄢明华
王利丽
张莉
李秀丽
任卫科
池晶晶
杨春蕾
路超
李富强
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Abstract

本发明涉及一种肠出血性大肠杆菌O157∶H7快速检测试剂盒及其检测方法。所述技术可用于肠出血性大肠杆菌O157∶H7型的检测。其特征是：该技术将环介导等温扩增技术与横向流胶体金试纸条检测技术相结合，能够肉眼直观的判定检测结果。该技术具有准确、快速、方便、高效、特异、灵敏的特点，适用于进出口检疫、食品卫生检验等的现场检测，对于保障食品安全具有重要意义。

Description

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP-LFD检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于动物卫生和食品检验技术领域，涉及一种用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7菌株的LAMP-LFD试剂盒及其检测方法。
背景技术
E.coli O157:H7(enterohaemorrhagic Escherichiacoli，EHEC)是肠出血性大肠杆菌的主要血清型,世界卫生组织于1997年将其列为新的食源性致病菌，它主要通过食用被污染的食物传染给人类。由EHEC O157:H7引发的疫情美国1982年首次报道,自此以后世界许多国家发生感染流行,日本和美国相继在1996年和2006年发生了大规模的人感染EHEC O157:H7疫情,引起广泛关注。我国仅1999年江苏省发生的人感染EHEC O157:H7事件, 就导致上百人死亡。该病原菌可引起人腹泻、出血性肠炎、血栓性血小板减少性紫癜和溶血性尿毒症等。而且强致病性、高致死率以及抗生素治疗可能加剧病情等,已构成严重的公共卫生问题。目前对其的鉴定包括选择性培养、生化和免疫、毒素的细胞学试验等，都存在费时费力、检测时限长等弊端。
对于突发性传染病，快速检测和鉴定病原体是控制疫情的关键。传统的EHEC O157∶H7的实验室检测方法主要是细菌培养，但周期长，工作量大；而PCR和DNA探针法等分子生物学检测技术虽然时效性好，但对检测人员要求高，且设备昂贵,不利于基层单位推广应用。因此，研究开发一种检测快速、操作简便、特异性高、灵敏度好、成本低廉、适于基层推广的检测方法, 对EHEC O157:H7疫情的监控将起到积极作用。
Notomi等（2000年）首次报道环介导等温扩增( loop-mediated isothermal amplification, LAMP)。其特点是针对靶基因的6个区域设计特异性引物，在等温条件下（60～65℃）利用Bst DNA聚合酶，高效、快速、特异性扩增靶序列。1h左右即可完成核酸扩增反应，其扩增效率可达到109个数量级，与传统技术相比，具有操作简单，快速、灵敏、高效、特异、不需要特殊的仪器设备、观察结果方式多,凝胶成像系统观察结果、肉眼观察颜色变化及试纸条技术。等优点。目前，该方法在食品安全检测、流行性病毒检测、临床诊断，以及水产养殖等领域的应用及研究已有相关论文报道。
本专利将环介导等温扩增技术（LAMP)）与横向流动试纸条技术（LFD）相结合，针对大肠杆菌O157∶H7的rfbE基因保守序列设计引物，建立一种快速、简单的食品中肠出血性大肠杆菌(enterohaemorrhagic Escherichiacoli，EHEC) O157∶H7的LAMP-LFD检测技术。该技术敏感性好，简单快速，1h内完成检测工作，且不需要使用精密昂贵的仪器设备，不需要通过琼脂糖凝胶电泳检测结果，避免了高致癌EB的污染，通过横向流动试纸条可直观的得到检测结果。本试剂盒操作简便，作为EHEC O157:H7的初筛工具,尤其适用于基层检验检疫机构,为EHEC O157:H7的疫情监控和快速检测提供了新的发展方向。
发明内容
本发明的一个目的是提供了一种用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的LAMP特异性引物组，它包括：
O157-F3    AGCGTTAGGTATATCGGAAG       SEQ ID NO：1 
O157-B3    GTTCCATATCACATGGATGTC       SEQ ID NO：2 
O157-FIP  TGGCTCCTGTGTATTTTATAGCATTTTGAGATGAAGTTATTGTTCCAACA
SEQ ID NO：3 
O157-BIP  ATGAAACTTGGCAAATGTCTGTTAGTTTTAATGGACACACATAATAGCTTTA 
SEQ ID NO：4
O157-LF   TTAACTGATGCTATATATGTCAG    SEQ ID NO：5
O157-LB    TGACATAGAACAAA             SEQ ID NO：6；
其中O157-LF和O157-LB引物分别标记有异硫氰酸荧光素和地高辛。
本发明进一步公开了采用用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP-LFD特异性引物组制成的检测试剂盒，其特征在于它的组成如下：
（1）LAMP反应液：
 LAMP反应液中含有：2×Buffer（含Mg2+） 2.5μL；O157-F3  0.5μL； O157-B3  0.5μL；O157-FIP 4μL；O157-BIP 4μL；O157-LF  0.5μL； O157-LB  0.5μL；dNTPs 3.5μL；
（2）超纯水
（3）Bst酶（8U/μL）  
（4）横向流动试纸条：购自Milenia Biotec GmbH公司
（5）用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的LAMP特异性引物；其中的引物指的是：
O157-F3    AGCGTTAGGTATATCGGAAG       SEQ ID NO：1 
O157-B3    GTTCCATATCACATGGATGTC       SEQ ID NO：2 
O157-FIP  TGGCTCCTGTGTATTTTATAGCATTTTGAGATGAAGTTATTGTTCCAACA
SEQ ID NO：3 
O157-BIP  ATGAAACTTGGCAAATGTCTGTTAGTTTTAATGGACACACATAATAGCTTTA 
SEQ ID NO：4
O157-LF   TTAACTGATGCTATATATGTCAG    SEQ ID NO：5
O157-LB    TGACATAGAACAAA             SEQ ID NO：6。
其中O157-LF和O157-LB引物分别标记有异硫氰酸荧光素和地高辛。
本发明更进一步公开了采用此试剂盒，用于检测食源性肠出血性大肠杆菌O157∶H7的LAMP-LFD方法，其特征在于，按如下的步骤进行：
（1）LAMP扩增反应体系为：2×Buffer（含Mg2+） 2.5μL；O157-F3  0.5μL； O157-B3  0.5μL；O157-FIP 4μL；O157-BIP 4μL；O157-LF 0.5μL； O157-LB  0.5μL；dNTPs 3.5μL；8U/μL  Bst酶lμL；加入样品DNA模板1至5μL；用超纯水补充至终体积25μL
（2） 扩增反应过程：在恒温水浴锅内95 ℃条件下变性5min，在63 ℃进行60min，并且在80℃持续2min，4℃，保存；
（3）扩增反应结束，取扩增产物10μL加入到100μL缓冲液中，混合均匀，将横向流动试纸条插入均匀后的液体中3min。取出后在5至7min内读取检测结果；
（4）结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现红褐色条带，检测结果为阳性，则说明样品中含有肠出血性大肠杆菌O157∶H7；试纸条只有质控线出现条带，检测结果为阴性；如只有检测线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。
本发明同时也公开了用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的LAMP特异性引物组在制备用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP-LFD试剂盒中的应用。
实验结果表明： 
采用本发明所公开的肠出血性大肠杆菌O157∶H7的LAMP特异性引物组制备的试剂盒在检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP-LFD方面具有良好的积极效果。
本发明公开的用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的试剂盒与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）本发明采用的LAMP技术具有操作简便、快速、敏感等特点，其敏感性可达到1至10pg，比常规PCR高10倍以上；而且检测过程只需恒温水浴锅即可完成，不需要PCR仪等昂贵的设备，更适合于基层推广应用。此外，本发明将LAMP技术与横向流动试纸条技术相结合，可以通过肉眼直接观察和判定结果，仅需5-10min，比PCR方法（琼脂糖凝胶电泳）缩短15-20min，且避免了电泳染料对环境的污染，使检测更为便捷、环保。
（2）基于LAMP--LFD方法的敏感、特异，成本低廉，便于操作等诸多优势，本发明在一定程度上提高了我国肠出血性大肠杆菌O157∶H7菌株的检测能力，为肠出血性大肠杆菌O157∶H7疾病的临床实时快速诊断、动物和食品的出入境检验检疫中该菌的快速准确检测提供了新技术来源，对提高我国检验检疫机构EHEC O157:H7的疫情监控和快速检测水平，以及普及先进技术在基层检验检疫机构的推广应用均具有重要意义。
附图说明
图1 为LAMP-LFD试验图；自左向右，依次为1：肠出血性大肠杆菌O157∶H7；2：空白对照；
图2为食品样品的肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP-LFD试验图；自左向右，依次为1-5：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释；6，阳性对照； 
图3为LAMP-LFD特异性试验图；自左向右，依次为1：志贺氏菌；2：胸膜肺炎放线杆菌；3：无乳链球菌；4：停乳链球菌；5：表皮葡萄球菌；6：大肠杆菌(O157： H7)；7：蜡样芽苞杆菌；8：巴氏杆菌；9：大肠杆菌（K88）；10：大肠杆菌（O141：K99）；11：猪链球菌（2型）12：副猪嗜血杆菌；13：金黄色葡萄球菌；14：空白。
具体实施方式
为了更充分地解释本发明的实施方法，提供了用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的LAMP-LFD引物组的实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。其中所用的试剂原料均有市售。本发明所述的肠出血性大肠杆菌O157∶H7引物组序列见表1，表1
注：其中O157-LF和O157-LB引物分别标记有异硫氰酸荧光素和地高辛。
实施例1
1、肠出血性大肠杆菌O157∶H7 DNA的提取：采用天根生物公司的细胞/组织DNA提取试剂盒，方法参考说明书。
（1）取菌液1ml 12,000rpm离心5分钟，去上清，沉淀中加入200μLGA，重悬混匀。
（2）加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。在65℃水浴1小时，期间颠倒混合样品2-3次。从水浴锅中取出，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
（3 ）加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
（4）加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
（5）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
（6）向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
（7）向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
（8）向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液。
（9）将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置3分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
（10）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE（80℃水浴已预热），室温放置3分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
（11）将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
2、扩增反应
（1）试剂：BioLabs（NEW ENGLAND）生产的Bst DNA聚合酶大片段；LAMP反应液；肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP引物；Milenia Biotec GmbH公司生产的横向流动试纸条
（2）扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：2×Buffer（含Mg2+） 2.5μL；O157-F3  0.5μL； O157-B3  0.5μL；O157-FIP 4μL；O157-BIP 4μL；O157-LF 0.5μL； O157-LB  0.5μL；dNTPs 3.5μL；8U/μL  Bst酶lμL；水 7μL；DNA 样品1μL。
（3）扩增反应过程：95 ℃条件下变性5min，在63 ℃进行60min，并且在80℃持续2min，4℃，保存； 
（4）扩增反应结束，取扩增产物10μL加入到100μL缓冲液中，混合均匀，将横向流动试纸条插入均匀后的液体中3min。取出后在5min内读取检测结果。
（5）结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现红褐色条带，检测结果为阳性，则说明样品中含有肠出血性大肠杆菌O157∶H7；试纸条只有质控线出现条带，检测结果为阴性；如只有检测线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。结果见图1。
3、结果说明：从图可知，使用本专利的引物和试剂盒可以扩增出肠出血性大肠杆菌O157∶H7。
实施例2
1、食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7 DNA提取：
将过夜培养的EHEC O157:H7菌液（原始菌浓度为8.3×105cfu/ml）稀释至10-1～10-5，取各稀释度菌液1ml，加入到市售的猪肉中，制成模拟检测样本。按实例1的方法提取组织中的DNA。取3μLDNA模板分别进行LAMP-LFD检测。
2、扩增：
（1）试剂：BioLabs（NEW ENGLAND）生产的Bst DNA聚合酶大片段；LAMP反应液；肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP引物；Milenia Biotec GmbH公司生产的横向流动试纸条
（2）扩增反应体系 扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：2×Buffer（含Mg2+） 2.5μL；O157-F3  0.5μL； O157-B3  0.5μL；O157-FIP 4μL；O157-BIP 4μL；O157-LF 0.5μL； O157-LB  0.5μL；dNTPs 3.5μL；8U/μL  Bst酶lμL；水 5μL；DNA 样品 3μL。
（3）扩增反应过程：95 ℃条件下变性5min，在63 ℃进行45min，并且在80℃持续2min，4℃，保存； 
（4）扩增反应结束，取扩增产物10μL加入到100μL缓冲液中，混合均匀，将横向流动试纸条插入均匀后的液体中3min。取出后在5min内读取检测结果。
（5）结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现红褐色条带，检测结果为阳性，则说明样品中含有肠出血性大肠杆菌O157∶H7；试纸条只有质控线出现条带，检测结果为阴性；如只有检测线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。结果见图2。
3、结果说明：从图可知，本专利的试剂盒可以用于临床样品的检测。
 
实施例3 
1、肠出血性大肠杆菌O157∶H7LAMP-LFD试剂盒的特异性试验：
   （1）对照菌株包括：
（2）病毒DNA提取：采用天根生物公司的细胞/组织DNA提取试剂盒，方法参考说明书。
2、扩增反应：
（1）试剂：BioLabs（NEW ENGLAND）生产的Bst DNA聚合酶大片段；LAMP反应液；肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP引物；Milenia Biotec GmbH公司生产的横向流动试纸条
（2）扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：2×Buffer（含Mg2+） 2.5μL；O157-F3  0.5μL； O157-B3  0.5μL；O157-FIP 4μL；O157-BIP 4μL；O157-LF 0.5μL； O157-LB  0.5μL；dNTPs 3.5μL；8U/μL  Bst酶lμL；水 6μL；DNA 样品 2μL。
（3）扩增反应过程：95 ℃条件下变性5min，在65 ℃进行60min，并且在80℃持续2min，4℃，保存； 
（4）扩增反应结束，取扩增产物10μL加入到100ul缓冲液中，混合均匀，将横向流动试纸条插入均匀后的液体中3min。取出后在5min内读取检测结果。
（5）结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现红褐色条带，检测结果为阳性，则说明样品中含有肠出血性大肠杆菌O157∶H7；试纸条只有质控线出现条带，检测结果为阴性；如只有检测线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。结果见图3。
结果说明：从图可知，本专利的试剂盒具有很好的特异性，可以用于肠出血性大肠杆菌O157∶H7的检测。
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。
SEQUENCE LISTING
<110>  天津市畜牧兽医研究所
<120>  肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP-LFD检测试剂盒及其检测方法
<160>  6    
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
agcgttaggt atatcggaag                  20
 
<210>  2
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
gttccatatc acatggatgt c                    21
 
<210>  3
<211>  50
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
tggctcctgt gtattttata gcattttgag atgaagttat tgttccaaca            50
 
<210>  4
<211>  52
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
atgaaacttg gcaaatgtct gttagtttta atggacacac ataatagctt ta         52
 
<210>  5
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
ttaactgatg ctatatatgt cag                            23
 
<210>  6
<211>  14
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
tgacatagaa caaa                                       14
 

Claims (4)

1.一种用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的LAMP特异性引物组，其特征在于它是由下述引物组成：
O157-F3       AGCGTTAGGTATATCGGAAG       SEQ ID NO：1 
O157-B3     GTTCCATATCACATGGATGTC       SEQ ID NO：2 
O157-FIP  TGGCTCCTGTGTATTTTATAGCATTTTGAGATGAAGTTATTGTTCCAACA
SEQ ID NO：3 
O157-BIP  ATGAAACTTGGCAAATGTCTGTTAGTTTTAATGGACACACATAATAGCTTTA 
SEQ ID NO：4
O157-LF   TTAACTGATGCTATATATGTCAG    SEQ ID NO：5
O157-LB          TGACATAGAACAAA             SEQ ID NO：6；
其中O157-LF和O157-LB引物分别标记有异硫氰酸荧光素和地高辛。
2.一种含有权利要求1所述用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP-LFD特异性引物组的检测试剂盒，其特征在于它的组成如下：
（1）LAMP反应液：
 LAMP反应液中含有：2×Buffer（含Mg2+） 2.5μL；O157-F3  0.5μL； O157-B3  0.5μL；O157-FIP 4μL；O157-BIP 4μL；O157-LF  0.5μL； O157-LB  0.5μL；dNTPs 3.5μL
超纯水
Bst酶（8U/μL）  
（4）横向流动试纸条
（5）用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的LAMP特异性引物；其中的引物指的是：
O157-F3       AGCGTTAGGTATATCGGAAG       SEQ ID NO：1 
O157-B3     GTTCCATATCACATGGATGTC       SEQ ID NO：2 
O157-FIP  TGGCTCCTGTGTATTTTATAGCATTTTGAGATGAAGTTATTGTTCCAACA
SEQ ID NO：3 
O157-BIP  ATGAAACTTGGCAAATGTCTGTTAGTTTTAATGGACACACATAATAGCTTTA 
SEQ ID NO：4
O157-LF   TTAACTGATGCTATATATGTCAG    SEQ ID NO：5
O157-LB      TGACATAGAACAAA             SEQ ID NO：6
所述的O157-LF和O157-LB引物分别标记有异硫氰酸荧光素和地高辛。
3.一种采用权利要求2所述试剂盒，用于检测食源性肠出血性大肠杆菌O157∶H7的LAMP-LFD方法，其特征在于，按如下的步骤进行：
（1）LAMP扩增反应体系为：2×Buffer（含Mg2+） 2.5μL；O157-F3  0.5μL； O157-B3  0.5μL；O157-FIP 4μL；O157-BIP 4μL；O157-LF 0.5μL； O157-LB  0.5μL；dNTPs 3.5μL；8U/μL  Bst酶lμL；加入样品DNA模板1至5μL；用超纯水补充至终体积25μL；
（2） 扩增反应过程：在恒温水浴锅内95 ℃条件下变性5min，在63 ℃进行60min，并且在80℃持续2min，4℃，保存；
（3）扩增反应结束，取扩增产物10μL加入到100μL缓冲液中，混合均匀，将横向流动试纸条插入均匀后的液体中3min；
取出后在5至7min内读取检测结果；
（4）结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现红褐色条带，检测结果为阳性，则说明样品中含有肠出血性大肠杆菌O157∶H7；试纸条只有质控线出现条带，检测结果为阴性；如只有检测线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。
4.权利要求1所述用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的LAMP特异性引物组在制备用于检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP-LFD试剂盒中的应用。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107022601A (zh) * 2016-02-01 2017-08-08 博奥生物集团有限公司 用于检测具有国家限量标准的5种食品致病菌的引物组合及其应用
CN107338291A (zh) * 2017-06-22 2017-11-10 中国农业大学 基于核酸层析生物传感技术检测大肠杆菌o157的方法
CN108531631A (zh) * 2018-06-19 2018-09-14 郑州轻工业学院 一种用于检测致病性大肠杆菌o157:h7的rpa-lfd引物对和探针及其应用
CN109536578A (zh) * 2019-01-25 2019-03-29 江苏省农业科学院 一种大肠杆菌o157:h7胶体金免疫检测试剂盒及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102329790A (zh) * 2011-09-28 2012-01-25 河南省农业科学院 双标记核酸恒温扩增方法及检测试纸条
CN102925545A (zh) * 2012-07-06 2013-02-13 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 一种新的松材线虫检测试剂盒及其检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102329790A (zh) * 2011-09-28 2012-01-25 河南省农业科学院 双标记核酸恒温扩增方法及检测试纸条
CN102925545A (zh) * 2012-07-06 2013-02-13 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 一种新的松材线虫检测试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JINHAI ZHANG ET AL: "Rapid Visual Detection of Highly Pathogenic Streptococcus suis Serotype 2 Isolates by Use of Loop-Mediated Isothermal Amplification", 《J CLIN MICROBIOL》 *
王丽等: "环介导等温核酸扩增技术快速检测食物中的大肠杆菌O157", 《食品与发酵工业》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107022601A (zh) * 2016-02-01 2017-08-08 博奥生物集团有限公司 用于检测具有国家限量标准的5种食品致病菌的引物组合及其应用
CN107022601B (zh) * 2016-02-01 2020-04-28 博奥生物集团有限公司 用于检测具有国家限量标准的5种食品致病菌的引物组合及其应用
CN107338291A (zh) * 2017-06-22 2017-11-10 中国农业大学 基于核酸层析生物传感技术检测大肠杆菌o157的方法
CN108531631A (zh) * 2018-06-19 2018-09-14 郑州轻工业学院 一种用于检测致病性大肠杆菌o157:h7的rpa-lfd引物对和探针及其应用
CN109536578A (zh) * 2019-01-25 2019-03-29 江苏省农业科学院 一种大肠杆菌o157:h7胶体金免疫检测试剂盒及其应用

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