CN105018628B - 鉴别布鲁氏菌a19疫苗株与野毒株的试剂盒 - Google Patents

鉴别布鲁氏菌a19疫苗株与野毒株的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鉴别布鲁氏菌A19疫苗株与野毒株的试剂盒,其中包括用于鉴别布鲁氏菌疫苗株A19的特异性引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2;使用该试剂盒在通过PCR扩增‑电泳检测区分布鲁氏菌和其他常规细菌菌株后,对于PCR扩增产物进一步测序分析,通过测序结果能够快速有效的鉴别诊断临床样本中布鲁氏菌A19疫苗株。

Description

鉴别布鲁氏菌A19疫苗株与野毒株的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域,具体涉及一种鉴别布鲁氏菌A19疫苗株与野毒株的试 剂盒。
背景技术
[0002] 布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌属细菌引起的一种广泛分布于世界各地 的人畜(兽)共患传染病,其不仅影响畜牧业的健康发展而且危害人类公共卫生健康。根据 国家卫计委公布的全国法定传染病疫情数据,2014年我国人感染布鲁氏菌病人数为57222, 发病率比2013年增长了31.48%。人感染布鲁氏菌病的传染源主要来源于感染的动物及被 污染的畜产品,因此,控制和消灭动物布鲁氏菌病,是防止人类感染布鲁氏病的根本保障。
[0003] 目前疫苗免疫仍是控制动物布鲁氏菌病的主要措施之一。当前国外主要使用的布 鲁氏菌疫苗株是牛种S19株和RB51株以及羊种Rev. 1株,这些疫苗株我国目前尚未引进和使 用。我国使用的疫苗株主要是牛种布鲁氏菌A19疫苗株和猪种布鲁氏菌S2疫苗株,以前还曾 使用过羊种M5-90疫苗株,由于毒力问题现在暂时不再使用。A19疫苗株的使用为我国动物 群布鲁氏菌病的防控提供了重要保障,该菌株是光滑型,其LPS含有0-侧链,能持续刺激机 体产生抗体,对牛有一定的保护力,但是也存在着无法鉴别A19疫苗株与野毒感染株的关键 技术瓶颈问题。虽然竞争ELISA (cELISA)和荧光偏振实验(FPT)以其高通量以及操作方面的 优势,在布鲁氏菌弱毒疫苗与野生菌株感染的血清学鉴别有一定的应用,但是对未知背景 的血清样本来说,单次检测仍不能确切分辨疫苗免疫或野毒感染。从病原学方面鉴别诊断 布鲁氏菌野毒株核酸,可以准确判断动物体是否带菌,为布鲁氏菌病阳性动物的检疫淘汰 提供技术支撑。因此,利用分子生物学方法,依据A19疫苗株与其他布鲁氏菌毒株基因组差 异碱基序列,通过PCR扩增及PCR产物序列测定,可有效实现A19疫苗株与野毒株的分子鉴 另IJ,将其应用于临床鉴别,可以为我国A19疫苗株的鉴别提供技术保障。
发明内容
[0004] 发明人通过基因组序列比对,发现与其他布鲁氏菌属细菌基因组DNA序列不同的 是,A19疫苗株在基因组22840位点处,S卩SEQ ID No. 3的344位点处,缺失7个核苷酸序列,该 位点后序列为AGATTTCAGA,其他布鲁氏菌序列为AGATTTCAGATTTCAGA,因为此处为AGATTTC 的重复序列,所以在序列比对时会出现两种序列缺失现象(AGATTTC或TTTCAGA)。在该缺失 位点上下游处设计引物,通过PCR扩增后序列测定,序列比对以及测序峰图的不同就可以特 异性鉴别牛种布鲁氏菌A19疫苗株,以上是提出本发明的技术依据。
[0005] 本发明的目的是提供一种鉴别布鲁氏菌A19疫苗株与野毒株的试剂盒及其使用方 法,该试剂盒能够特异地鉴别临床样本中布鲁氏菌A19疫苗株。
[0006] 为实现本发明目的,采用如下技术方案:
[0007] 鉴别布鲁氏菌疫苗株A19与野毒株的试剂盒,该PCR试剂盒由PCR反应液、DNA聚合 酶、阳性质控标准品和阴性质控标准品组成;
[0008] 所述PCR反应液包括鉴定并测序A19疫苗株特异性核苷酸序列的引物对,其中鉴别 A19疫苗株的上游引物序列如SEQ ID No. 1所示,下游引物序列如SEQ ID No. 2所示,分别如 下:
[0009] SEQ ID No.l:5’-TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCA-3’
[0010] SEQ ID No.2:5’-GGCGGGCTGCATTCTTTACTCTGC-3’
[0011] 所述阳性质控标准品为牛种布鲁氏菌A19疫苗株阳性质控标准品;
[0012] 所述牛种布鲁氏菌A19疫苗株阳性质控标准品由含有562个碱基的核苷酸片段构 成的PEASY-T3重组质粒组成。
[0013] 所述含有562个碱基的核苷酸片段的序列如SEQIDNo. 3所示:
[0014] SEQIDNo.3:
Figure CN105018628BD00041
[0016] 所述PCR反应液还包括含有dNTPs、Mg2+、双蒸水的PCR缓冲液。
[0017] 所述含有562个碱基的核苷酸片段是从牛种布鲁氏菌A19疫苗株中克隆得到。
[0018] 所述阴性质控标准品为无菌双蒸水(ddH20)。
[0019] 本发明进一步提供了鉴别布鲁氏菌A19疫苗株与野毒株的PCR试剂盒的使用方法, 该方法的条件和步骤如下:
[0020] (1)提取待测样本的基因组DNA;
[0021] 所述待检测的样本为血液、奶样、组织样本、气溶胶样本等。
[0022] (2)以提取的样本基因组DNA为模板,将样本DNA、阳性质控标准品和阴性质控标准 品分别加入到含有PCR反应液和DNA聚合酶的50yL体系的PCR反应管中,按照经过优化后的 PCR反应条件进行扩增,具体的反应条件为:94°C 3min,94°C 30sec、60°C 30sec、72°C 30sec,35个循环,72°C IOmin;
[0023] 所述PCR反应液由鉴定布鲁氏菌A19疫苗株的引物对以及含有dNTPs、Mg2+、双蒸水 的PCR缓冲液组成;
[0024] 所述引物对分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No.2,分别命名为A19-F和A19-R序列如 下:
[0025] 正向引物A19-F: 5 ’ -TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCA-3 ’
[0026] 反向引物A19-R: 5 ’ -GGCGGGCTGCATTCTTTACTCTGC-3 ’
[0027] 所述的PCR反应体系为50yL,具体包括以下组份: IΟ X PCR BuiTcr dNTP Mixture (2.5 mM)
Figure CN105018628BD00051
10 μΜ的正向引物
[0028] 10 μΜ的反向引物 待测样本DNA DNA聚合酶 CidH2O
[0029] (3)取50yL PCR产物,以1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测,观察鉴别牛种布鲁氏菌 A19株引物对扩增出562bp及与之大小对应的条带;本领域技术人员应知晓,在琼脂糖凝胶 电泳检测时,显示与目的条带大小对应的条带,意指PCR扩增产物大小相近,因样品来源或 目标种属不同,PCR产物大小会有较小差异,但显示条带对应,例如相差30bp/20bp范围内的 条带均显示大小对应。
[0030] ⑷如果上述PCR检测结果与目的条带不符,则说明模板为布鲁氏菌阴性,如果PCR 检测条带大小正确,则对阳性条带进行切胶回收纯化,然后再进行序列测定。
[0031] (5)鉴别布鲁氏菌A19疫苗株的结果判定:使用A19-F引物对纯化的562bp或与之大 小对应的产物进行测序,如果测序结果峰图为单一峰,与SEQIDNo. 3比对后完全匹配,则该 样本为A19疫苗株;如果测序结果峰图为单一峰,与SEQIDN0.3比对后在第344位点处多出7 个核苷酸序列(AGATTTC或TTTCAGA),则该样本为除A19疫苗株以外的其他布鲁氏菌野毒株 或疫苗株;如果测序结果与SEQIDNo.3比对,在峰图的序列第354位,S卩AGATTTCAGA后出现套 峰,则该样本为A19疫苗株和其他布鲁氏菌株混合。
[0032] 本领域技术人员应当明了,上述鉴别方法,其直接目的是鉴别菌株种类,而非获取 疾病诊断结果。
[0033] 本发明取得了以下效果:
[0034] (1)为我国A19疫苗株的鉴别提供新的技术手段;
[0035] (2)本发明所述引物对具有较高的特异性,通过扩增-电泳检测,可有效的区分布 鲁氏菌和其他常规细菌菌株;
[0036] (3)本发明所述鉴别方法,有效地将布鲁氏菌A19疫苗株与其他布鲁氏菌野毒株或 疫苗株区分开来,具有极高的准确率。
附图说明
[0037] 图I A19疫苗株缺失位点处上下游序列PCR扩增,+ :模板为A19疫苗株阳性质控标 准品的PCR扩增产物562bp,_:模板为阴性质控标准品,1-5:模板分别为牛种布鲁氏菌疫苗 株A19株、猪种布鲁氏菌疫苗株S2株、羊种布鲁氏菌疫苗株M5-90株、绵羊种布鲁氏菌63/290 株、犬布鲁氏菌RM6/66株基因组DNA的PCR扩增产物562bp; 6-10:模板分别为大肠杆菌0157: H7、小肠结肠炎耶尔森菌0:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、牛分支杆菌基因组DNA。
[0038] 图2 A19疫苗株缺失位点处序列测定峰图,A:测序峰图为单一峰,与SEQ ID No.3 比对后完全匹配,检测模板为A19疫苗株。B:测序峰图为单一峰,与SEQ ID No.3比对后在 344位点处多出7个核苷酸序列(AGATTTC或TTTCAGA),检测模板为除A19疫苗株以外的其他 布鲁氏菌野毒株或疫苗株。C:测序结果与SEQ ID No. 3比对,峰图在序列第354位点后,即 AGATTTCAGA序列后出现套峰,检测模板为Al 9疫苗株与其他布鲁氏菌株的混合。
具体实施方式
[0039] 下述实施例用于进一步说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
[0040] 以下实施例均按照常规试验条件与方法进行,或者按照制造厂商所建议的试验条 件。
[0041] 1.试验材料
[0042] 牛种布鲁氏菌疫苗株A19株(B.abortus A19),猪种布鲁氏菌疫苗株S2株(B. suis S2),羊种布鲁氏菌疫苗株M5-90株(B.melitensis M5-90),绵羊种布鲁氏菌63/290株 (B.ovis 63/290),犬布鲁氏菌RM6/66株(B.canis RM6/66),大肠杆菌0157:H7、小肠结肠炎 耶尔森菌〇 : 9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌(CMCC25623)、牛分支杆菌(M. bovis ATCC 19210)、临床上确诊为布鲁氏菌阳性的血液、奶样、流产胎儿组织和气溶胶等DNA样本均由 山东省农业科学院奶牛研究中心疾病研究室保存。
[0043] DNA聚合酶(TaKaRa LA Taq)购自宝生物工程(大连)有限公司,琼脂糖购自北京全 式金生物技术有限公司,快速DNA提取试剂盒、细菌DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒 等均购自天根生化科技(北京)有限公司,其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。PCR引 物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,DNA序列测定由山东省农业科学院测序中心 完成。
[0044] 2.实验仪器
[0045] 梯度PCR仪(TaKaRa TP-600),电泳仪(北京市六一仪器厂DYY-6C型),Alpha个人型 凝胶成像系统red (美国ProteinSimple公司),DNA测序仪(ABI3730XL DNA Analyzer)。
[0046] 实施例一、鉴别布鲁氏菌A19疫苗株与野毒株的PCR试剂盒的使用方法
[0047] (1)提取待测样本的基因组DNA:使用快速DNA提取试剂盒对待检测的血液、奶样、 组织样本、气溶胶等样本进行基因组DNA的提取。
[0048] (2)以提取的样本基因组DNA为模板,使用A19-F和A19-R引物对进行PCR扩增,同时 以阳性质控标准品和阴性质控标准品分别作为阳性和阴性对照,依次将50yL反应体系的各 组份加到PCR反应管中,分别为 10XPCR Buffer:5.0yL,dNTP Mixture (2.5mM) :8·0μί,10μΜ 的正向引物:2. OyL,ΙΟμΜ的反向引物:2. OyL,待测样本DNA: 5. OyL,DNA聚合酶:0.5yL,最后 加27.5yL双蒸水(ddH20)补足到SOyLt3PCR的扩增效果直接影响到检测结果的特异性和灵敏 性,因此需要对PCR反应条件中的相关参数进行优化,包括引物的浓度、Mg2+浓度、退火温度、 退火时间、循环次数以及延伸时间等。PCR反应条件的优化采用现有技术,最终优化后的PCR 反应条件为:引物浓度为0.4ymoL/L,Mg2+浓度为0.2mmoL/L,PCR反应条件为:94°C 3min,94 °C 30sec、60°C 30sec、72°C 30sec,35个循环,72°C 10min。以上述优化好的反应条件进行 PCR扩增。
[0049] (3)反应结束后,取5(^1^?0?产物,以1.5%琼脂糖凝胶进行电泳(12(^251^11)检 测,观察鉴别牛种布鲁氏菌A19株引物对扩增出562bp的条带。
[0050] (4)如果上述PCR检测结果与目的条带不符,则说明模板为布鲁氏菌阴性,如果PCR 检测条带大小正确,则对阳性条带进行切胶回收纯化,然后用DNA测序仪进行序列测定。
[0051] (5)布鲁氏菌A19疫苗株鉴别的结果判定:使用A19-F引物对纯化的562bp产物进行 测序,如果测序结果峰图为单一峰,与SEQ ID No.3比对后完全匹配,则该样本为A19疫苗 株;如果测序结果峰图为单一峰,与SEQ ID No. 3比对后在第344位点处多出7个核苷酸序列 (AGATTTC或TTTCAGA),则该样本为除A19疫苗株以外的其他布鲁氏菌野毒株或疫苗株;如果 测序结果与SEQ ID No.3比对,在峰图的序列第354位,S卩AGATTTCAGA后出现套峰,则该样本 为A19疫苗株和其他布鲁氏菌株混合。
[0052] 实施例二、PCR试剂盒的组装
[0053] (1)配制PCR反应液:
[0054] ①设计1对鉴定牛布鲁氏菌A19疫苗株的引物:为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2,命 名为A19-F和A19-R,序列如下:
[0055] A19-F:5 ’-TTCACCGTCATCGGATAATAGGTGCCA-3 ’
[0056] A19-R:5 ’-GGCGGGCTGCATTCTTTACTCTGC-3 ’
[0057] ②PCR反应液的配制:PCR反应液由牛种布鲁氏菌A19疫苗株的引物和含有dNTPs、 Mg2+、双蒸水(ddH20)的PCR缓冲液组成,PCR反应液的总体积为44.5yL,每条引物的量为2yL (引物浓度为l〇ym〇L/L),含有dNTPs、Mg2+、双蒸水(ddH20)的PCR缓冲剂的总量为40.5yL,其 中双蒸水(ddH20)为27.5yL。
[0058] (2)阳性质控标准品的制备:
[0059] ①模板DNA的提取:对牛种布鲁氏菌疫苗株A19的菌液应用细菌DNA提取试剂盒提 取 DNA。
[0060] ②PCR扩增:以提取的DNA为模板,按照PCR反应体系:DNA模板5yL、DNA聚合酶0.5μ L、PCR反应液44.5yL,PCR反应条件为:94°C 3min,94°C 30sec、60°C 30sec、72°C 30sec,35 个循环,72°C 10min,在PCR仪上扩增目的片段,以1.5%的琼脂糖凝胶电泳(120V 25min)鉴 定PCR目的产物。
[0061] ③重组质粒的构建及阳性质控标准品的建立:将PCR产物进行凝胶纯化回收,然后 连接PEASY-T3载体,转化,提取质粒后双酶切鉴定,将阳性重组质粒进行测序,并进行序列 比对。序列正确的重组质粒即为获得的阳性质控标准品。
[0062] 所说的阳性质控标准品为牛种布鲁氏菌A19疫苗株阳性质控标准品。
[0063] 所说的牛种布鲁氏菌A19疫苗株阳性质控标准品由含有562个碱基的核苷酸片段 连接到PEASY-T3载体后的重组质粒构成。
[0064] (3)阴性质控标准品:阴性质控标准品为无菌双蒸水,体积为5yL。
[0065] 实施例三、布鲁氏菌A19疫苗株鉴别试剂盒特异性试验
[0066] 采用本发明的PCR试剂盒分别对牛种布鲁氏菌A19、猪种布鲁氏菌S2、羊种布鲁氏 菌M5-90、绵羊种布鲁氏菌63/290株,犬布鲁氏菌RM6/66株,大肠杆菌0157 :H7、小肠结肠炎 耶尔森菌0:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、牛分支杆菌基因组DNA进行扩增,并设阳性与阴 性对照,验证PCR反应的特异性,PCR反应条件为:94°C 5min,94°C 30sec、60°C 30sec、72°C 30sec,35个循环,72°C 10min。反应结束后再进行PCR产物的纯化与测序。
[0067] 牛种布鲁氏菌A19疫苗株鉴别特异性结果如图1所示,琼脂糖凝胶电泳结果中:+为 阳性质控标准品,1-5:分别为牛种布鲁氏菌A19、猪种布鲁氏菌S2、羊种布鲁氏菌M5-90、绵 羊种布鲁氏菌63/290株,犬布鲁氏菌RM6/66株均扩增出562bp的条带,而-、6-10:分别为阴 性质控标准品、大肠杆菌Ol57 :H7、小肠结肠炎耶尔森菌0:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和 牛分支杆菌均无条带。序列测定后序列与峰图比对结果如图2所示,只有A19疫苗株344点处 存在7个核苷酸序列(AGATTTC)的缺失(图2-A),其他布鲁氏菌株与疫苗株结果均为图2-B所 不。
[0068] 实施例四、布鲁氏菌阳性临床样本A19疫苗株的鉴别
[0069] 分别对本实验室保存的布鲁氏菌阳性样本(已经经过PCR扩增测序验证),包括2份 血液样本、2份奶样、2份流产胎儿组织样本以及2份不同奶牛养殖场的牛舍气溶胶样本进行 疫苗株的鉴别,结果如下表所示。
[0070]
Figure CN105018628BD00081

Claims (8)

1. 一种用于鉴别牛种布鲁氏菌疫苗株A19的引物对,其特征在于,两条引物序列分别为 SEQ ID No. 1 和SEQ ID No.2 所示。
2. 权利要求1所述的引物对用于制备鉴别和/检测布鲁氏菌的试剂盒、芯片的应用。
3. 权利要求1所述的引物对用于制备鉴别和/检测布鲁氏菌疫苗株A19的试剂盒、芯片 的应用。
4. 包括权利要求1所述的引物对的试剂盒。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,还包括:PCR反应液、DNA聚合酶、阳性质 控标准品和阴性质控标准品。
6. —种非疾病诊断目的的鉴别布鲁氏菌A19疫苗株与其他布鲁氏菌野毒株或疫苗株的 方法,其特征在于, (1) 提取待测样本的基因组DNA; (2) 以提取的样本基因组DNA为模板,进行PCR扩增,所采用的引物为权利要求1所述的 引物对; (3) 取PCR产物,以琼脂糖凝胶电泳进行检测,观察是否出现牛种布鲁氏菌疫苗株A19引 物对扩增出的562 bp及与之大小对应的条带; (4) 如果上述PCR检测结果与目的条带不符,则说明模板为布鲁氏菌阴性,如果PCR检测 条带大小正确,则对阳性条带进行切胶回收纯化,然后再进行序列测定; (5) 结果判定:对使用SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2引物对纯化的562 bp或与之大小对 应的产物进行测序,如果测序结果峰图为单一峰,与SEQ ID No.3比对后完全匹配,则该样 本为A19疫苗株;如果测序结果峰图为单一峰,与SEQ ID No. 3比对后在第344位点处多出7 个核苷酸序列,则该样本为除A19疫苗株以外的其他布鲁氏菌野毒株或疫苗株;如果测序结 果与SEQ ID No. 3比对,在峰图的序列第354位后,S卩AGATTTCAGA后,出现套峰,则该样本为 A19疫苗株和其他布鲁氏菌株混合。
7. 权利要求6所述方法,其特征在于,所述待测样本为血液、奶样、组织样本、气溶胶样 本。
8. 权利要求6所述方法,其特征在于,PCR扩增条件为:94°C 3min,94°C 30sec、60°C 30sec、72°C 30sec,35个循环,72°C lOmin。
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