CN104232784A - 一种牛肉中三种主要致病菌多重pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛肉中三种主要致病菌多重PCR检测方法，该方法包括：沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7的菌株培养；不同增菌液对三种致病菌的增菌效果对比；选择引物；多重PCR扩增体系；提取待测牛肉样品中细菌的DNA；建立多重PCR反应体系参数。本发明的三种主要致病菌多重PCR检测方法，不仅保留了常规PCR的高特异性、敏感性，又减少了操作步骤，实现了一次扩增可同时检测多种微生物的目的，大大节省了时间，节约了经费开支。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种牛肉中三种主要致病菌多重PCR检测方法。
背景技术
食品安全已经成为全世界共同关注的公共卫生问题。在各种食品安全事件中，由细菌引起的食源性疾病最多，涉及人数最广。沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157：H7被认为是牛肉中最重要的三种食源性致病菌。在中国，70％-80％的细菌性食物中毒是由沙门氏菌引起的，而且大多数来源于动物源性食品，由牛肉引起的沙门氏菌食物中毒占四成以上。单增李斯特菌能引起李斯特菌病，死亡率高达20％-30％，特别是对孕妇、儿童、老人和免疫力低下的人群易造成极大的威胁。生肉制品如牛肉、猪肉、羔羊肉和禽肉是单增李斯特菌的重要食物来源，其中牛肉中的单增李斯特菌的检出率为10.9％-52％。单增李斯特菌在冰箱温度下仍可生长，WHO已将单增李斯特菌列为危害公共卫生和食品行业的一种重要食源性致病菌。大肠杆菌O157：H7是重要的人类致病菌，可以引起出血性肠炎，甚至溶血性尿毒综合征以及血小板减少性紫癜。牛被认为是该菌的主要携带者，大多数疾病暴发是由牛肉、牛肉制品引起的，近年来在全球范围内引起多起疾病暴发，受到广泛关注。
中国是牛肉生产大国，牛肉产量多年位居世界第三，随着城乡居民的肉类消费结构的变化，牛肉消费量不断提高，牛肉消费在肉类消费结构中所占的比重总体也在提高，上市供应的牛肉微生物控制环节薄弱，牛肉的微生物污染比较普遍。传统食源性致病菌检测涉及到增菌、选择性增菌、分离、生化试验和血清学分型鉴定，检测周期长、操作繁琐、特异性低。因此，急需建立一种快速、准确、灵敏、高通量的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牛肉中三种主要致病菌多重PCR检测方法，旨在解决传统食源性致病菌检测周期长、操作繁琐、特异性低的问题。
本发明是这样实现的，一种牛肉中三种主要致病菌多重PCR检测方法包括：
步骤一、菌株培养：
无菌条件下用接种环分别挑取适量沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157：H7接种于TSB中，37℃震荡培养18h，沙门氏菌采用HE琼脂平板计数，单增李斯特菌采用PALCAM琼脂平板计数，大肠杆菌O157：H7采用麦康凯琼脂平板计数；
步骤二、不同增菌液对三种致病菌的增菌效果对比：
取经国标检测不含有沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157：H7的牛肉25g，分别加入到225mL的LB和TSB增菌培养基中，接种三种致病菌经平板计数使其浓度均达到100、101、102、103CFU/g，37℃振荡培养18h，分别提取细菌基因组DNA进行多重PCR，确定增菌液的增菌效果；
步骤三、选择引物：
通过BLAST与GenBank中的核苷酸序列比对，选出最佳的引物组合用于实验研究，选用广泛存在于沙门菌属的侵袭蛋白基因invA作为检测沙门菌属的特异性基因，选用hlyA基因作为单增李斯特菌的毒力标志基因，采用高度保守的O抗原基因(rfbE)和鞭毛抗原基因(flic)相关的引物来检测大肠杆菌O157：H7；
步骤四、多重PCR扩增体系：
所述多重PCR扩增中，25μL反应体系具体为：检测沙门氏菌的引物终浓度为0.2μmol/L，检测单增李斯特菌引物终浓度为0.1μmol/L，检测大肠杆菌O157：H7引物终浓度为1μmol/L(flic)和0.3μmol/L(rfbE)，Mg2+浓度为4mmol/L，dNTP浓度为0.4mmol/L，Taq DNA聚合酶0.5U，待检样品模板基因组为1μL，剩下的用无菌水补至25μL；
步骤五、提取待测牛肉样品中细菌的DNA：
取1mL培养18-24h的菌液，进行细菌基因组DNA的提取和纯化，作为多重PCR扩增的模板；
步骤六、建立多重PCR反应体系参数：
多重PCR反应具体参数条件如下：95℃预变性30s，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。
进一步，进行细菌基因组DNA的提取和纯化的具体操作步骤如下：
步骤一、取10mL人工污染的牛肉匀浆液，1000rpm离心10min；
步骤二、取上清液于无菌离心管中，10000rpm离心10min，弃上清液；
步骤三、沉淀用500μL无菌蛋白胨水悬浮，加入0.25倍体积的乙酸乙酯洗涤，充分振荡混匀，10000rpm，离心10min，弃上清液；
步骤四、用1mL TE缓冲液悬浮，10000rpm离心1min，弃上清液；
步骤五、向菌体沉淀中加入180μL Buffer GTL，振荡，令菌体重悬，若为革兰氏阳性菌需加入180μL20mg/mL的Enzymatic Lysis Buffer振荡令菌体重悬，37℃孵育30分钟；
步骤六、加入20μL Proteinase K，涡旋振荡混匀，56℃孵育，使菌体完全裂解，孵育过程中每过一段时间颠倒或震荡使样本充分混匀；
步骤七、加入200μL Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，加200μL无水乙醇，涡旋振荡使其充分混匀；短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底；
步骤八、将步骤七所得溶液包括形成的沉淀全部加入到吸附柱SpinColumn DM中，放进收集管中，若不能一次性加完，可以分为多次转入，10000rpm离心1分钟，倒掉废液，把吸附柱重新放回到收集管中；
步骤九、往吸附柱里加入500μL Buffer GW1，使用之前，先检查无水乙醇是否已加入，10000rpm离心1分钟，把收集管中的废液倒掉，将吸附柱重新放回收集管；
步骤十、往吸附柱里加入500μL Buffer GW2，使用之前，先检查无水乙醇是否已加入，10000rpm离心1分钟，把收集管中的废液倒掉，将吸附柱重新放回收集管；
步骤十一、12000rpm离心2分钟，把收集管中的废液倒掉，令吸附柱静置于室温几分钟，来彻底晾干；
步骤十二、令吸附柱放于一个新的离心管里，往吸附柱的中间部位加入50-200μL Buffer GE，室温条件下放置2-5分钟，10000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
进一步，PCR扩增产物鉴定方法为：称取琼脂糖0.6g，加入40mL0.5×TBE中，在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解；冷却到60℃，加入2μL EB染料，并摇匀，不能有气泡，倒入已插入梳子的胶板小槽中，室温冷却凝固，制成体积分数为1.5％的琼脂糖凝胶，取5μL多重PCR产物，与2μL6×Loading buffer混匀后，加入DNA Marker，在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为100v，电泳30min，电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中成像，观察结果并保存电泳结果。
效果汇总
本发明的三种主要致病菌多重PCR检测方法，不仅保留了常规PCR的高特异性、敏感性，又减少了操作步骤，实现了一次扩增可同时检测多种微生物的目的，大大节省了时间，节约了经费开支。
附图说明
图1是本发明实施例提供的牛肉中三种主要致病菌多重PCR检测方法流程图；
图2是本发明实施例提供的对比不同增菌液对三种致病菌的增菌效果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1示出了本发明的牛肉中三种主要致病菌多重PCR检测方法流程，如图所示，本发明是这样实现的，一种牛肉中三种主要致病菌多重PCR检测方法包括：
S101、菌株培养：
无菌条件下用接种环分别挑取适量沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157：H7接种于TSB中，37℃震荡培养18h，沙门氏菌采用HE琼脂平板计数，单增李斯特菌采用PALCAM琼脂平板计数，大肠杆菌O157：H7采用麦康凯琼脂平板计数。
S102、不同增菌液对三种致病菌的增菌效果对比：
取经国标检测不含有沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157：H7的牛肉25g，分别加入到225mL的LB和TSB增菌培养基中，接种三种致病菌经平板计数使其浓度均达到100、101、102、103CFU/g，37℃振荡培养18h，分别提取细菌基因组DNA进行多重PCR，确定增菌液的增菌效果。
如图2所示，泳道M：1000bp DNA Marker；泳道1-4：LB增菌液中103-100CFU/g三种致病菌；泳道5-8：TSB增菌液中103-100CFU/g三种致病菌；泳道9：阴性对照；在LB增菌培养基中，沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7的检出限为100CFU/g，单增李斯特菌的检出限为102CFU/g；而采用TSB增菌培养基三种致病菌的检出限为103CFU/g。因此，选用LB作为三种致病菌的增菌培养基。
S103、选择引物：
通过BLAST与GenBank中的核苷酸序列比对，选出最佳的引物组合用于实验研究，选用广泛存在于沙门菌属的侵袭蛋白基因invA作为检测沙门菌属的特异性基因，选用hlyA基因作为单增李斯特菌的毒力标志基因，采用高度保守的O抗原基因(rfbE)和鞭毛抗原基因(flic)相关的引物来检测大肠杆菌O157：H7。
本发明所选用的目的菌株的引物见表1。
表1
由于大肠杆菌O157的血清型较复杂，采用单基因扩增容易导致漏检、错检，本发明中采用高度保守的O抗原基因(rfbE)和鞭毛抗原基因(flic)相关的引物来检测大肠杆菌O157：H7，具有高度特异性。
S104、多重PCR扩增体系：
所述多重PCR扩增中，25μL反应体系具体为：检测沙门氏菌的引物终浓度为0.2μmol/L，检测单增李斯特菌引物终浓度为0.1μmol/L，检测大肠杆菌O157：H7引物终浓度为1μmol/L(flic)和0.3μmol/L(rfbE)，Mg2+浓度为4mmol/L，dNTP浓度为0.4mmol/L，Taq DNA聚合酶0.5U，待检样品模板基因组为1μL，剩下的用无菌水补至25μL；
S105、提取待测牛肉样品中细菌的DNA：
取1mL培养18-24h的菌液，进行细菌基因组DNA的提取和纯化，作为多重PCR扩增的模板。
根据北京康为世纪细菌基因组提取试剂盒以及实际样品前处理，进行细菌基因组DNA的提取和纯化，作为多重PCR扩增的模板。
S106、建立多重PCR反应体系参数：
多重PCR反应具体参数条件如下：95℃预变性30s，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。
进一步，进行细菌基因组DNA的提取和纯化的具体操作步骤如下：
步骤一、取10mL人工污染的牛肉匀浆液，1000rpm离心10min；
步骤二、取上清液于无菌离心管中，10000rpm离心10min，弃上清液；
步骤三、沉淀用500μL无菌蛋白胨水悬浮，加入0.25倍体积的乙酸乙酯洗涤，充分振荡混匀，10000rpm，离心10min，弃上清液；
步骤四、用1mL TE缓冲液悬浮，10000rpm离心1min，弃上清液；
步骤五、向菌体沉淀中加入180μL Buffer GTL，振荡，令菌体重悬，若为革兰氏阳性菌需加入180μL 20mg/mL的Enzymatic Lysis Buffer振荡令菌体重悬，37℃孵育30分钟；
步骤六、加入20μL Proteinase K，涡旋振荡混匀，56℃孵育，使菌体完全裂解，孵育过程中每过一段时间颠倒或震荡使样本充分混匀；
步骤七、加入200μL Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，加200μL无水乙醇，涡旋振荡使其充分混匀。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底；
步骤八、将步骤七所得溶液包括形成的沉淀全部加入到吸附柱SpinColumn DM中，放进收集管中，若不能一次性加完，可以分为多次转入，10000rpm离心1分钟，倒掉废液，把吸附柱重新放回到收集管中；
步骤九、往吸附柱里加入500μL Buffer GW1，使用之前，先检查无水乙醇是否已加入，10000rpm离心1分钟，把收集管中的废液倒掉，将吸附柱重新放回收集管；
步骤十、往吸附柱里加入500μL Buffer GW2，使用之前，先检查无水乙醇是否已加入，10000rpm离心1分钟，把收集管中的废液倒掉，将吸附柱重新放回收集管；
步骤十一、12000rpm离心2分钟，把收集管中的废液倒掉，令吸附柱静置于室温几分钟，来彻底晾干；
步骤十二、令吸附柱放于一个新的离心管里，往吸附柱的中间部位加入50-200μL Buffer GE，室温条件下放置2-5分钟，10000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
进一步，PCR扩增产物鉴定方法为：称取琼脂糖0.6g，加入40mL0.5×TBE中，在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解；冷却到60℃，加入2μL EB染料，并摇匀，不能有气泡，倒入已插入梳子的胶板小槽中，室温冷却凝固，制成体积分数为1.5％的琼脂糖凝胶，取5μL多重PCR产物，与2μL6×Loading buffer混匀后，加入DNA Marker，在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为100v，电泳30min，电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中成像，观察结果并保存电泳结果。
电泳扩增出的目的片段大小分别为：沙门氏菌：284bp、单增李斯特菌：456bp、大肠杆菌O157：H7：625bp和812bp。PCR扩增产物DNA序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性的劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种牛肉中三种主要致病菌多重PCR检测方法，其特征在于，所述的牛肉中三种主要致病菌多重PCR检测方法包括：
步骤一、菌株培养：
无菌条件下用接种环分别挑取沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157：H7接种于TSB中，37℃震荡培养18h，沙门氏菌采用HE琼脂平板计数，单增李斯特菌采用PALCAM琼脂平板计数，大肠杆菌O157：H7采用麦康凯琼脂平板计数；
步骤二、不同增菌液对三种致病菌的增菌效果对比：
取经国标检测不含有沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157：H7的牛肉25g，分别加入到225mL的LB和TSB增菌培养基中，接种三种致病菌经平板计数使浓度均达到100、101、102、103CFU/g，37℃振荡培养18h，分别提取细菌基因组DNA进行多重PCR，确定增菌液的增菌效果；
步骤三、选择引物：
通过BLAST与GenBank中的核苷酸序列比对，选出最佳的引物组合用于实验研究，选用广泛存在于沙门菌属的侵袭蛋白基因invA作为检测沙门菌属的特异性基因，选用hlyA基因作为单增李斯特菌的毒力标志基因，采用高度保守的O抗原基因rfbE和鞭毛抗原基因flic的引物来检测大肠杆菌O157：H7；
步骤四、多重PCR扩增体系：
所述多重PCR扩增中，25μL反应体系具体为：检测沙门氏菌的引物终浓度为0.2μmol/L，检测单增李斯特菌引物终浓度为0.1μmol/L，检测大肠杆菌O157：H7引物终浓度为1μmol/L flic和0.3μmol/L rfbE，Mg2+浓度为4mmol/L，dNTP浓度为0.4mmol/L，Taq DNA聚合酶0.5U，待检样品模板基因组为1μL，剩下的用无菌水补至25μL；
步骤五、提取待测牛肉样品中细菌的DNA：
取1mL培养18-24h的菌液，进行细菌基因组DNA的提取和纯化，作为多重PCR扩增的模板；
步骤六、建立多重PCR反应体系参数：
多重PCR反应具体参数条件如下：95℃预变性30s，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。
2.如权利要求1所述的牛肉中三种主要致病菌多重PCR检测方法，其特征在于，进行细菌基因组DNA的提取和纯化的具体操作步骤如下：
步骤一、取10mL人工污染的牛肉匀浆液，1000rpm离心10min；
步骤二、取上清液于无菌离心管中，10000rpm离心10min，弃上清液；
步骤三、沉淀用500μL无菌蛋白胨水悬浮，加入0.25倍体积的乙酸乙酯洗涤，充分振荡混匀，10000rpm，离心10min，弃上清液；
步骤四、用1mL TE缓冲液悬浮，10000rpm离心1min，弃上清液；
步骤五、向菌体沉淀中加入180μL Buffer GTL，振荡，令菌体重悬，若为革兰氏阳性菌需加入180μL 20mg/mL的Enzymatic Lysis Buffer振荡令菌体重悬，37℃孵育30分钟；
步骤六、加入20μL Proteinase K，涡旋振荡混匀，56℃孵育，使菌体完全裂解，孵育过程中每过一段时间颠倒或震荡使样本充分混匀；
步骤七、加入200μL Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，加200μL无水乙醇，涡旋振荡使其充分混匀；离心，使管壁上的溶液收集到管底；
步骤八、将步骤七所得溶液包括形成的沉淀全部加入到吸附柱SpinColumn DM中，放进收集管中，若不能一次性加完，分为多次转入，10000rpm离心1分钟，倒掉废液，把吸附柱重新放回到收集管中；
步骤九、往吸附柱里加入500μL Buffer GW1，使用之前，先检查无水乙醇是否已加入，10000rpm离心1分钟，把收集管中的废液倒掉，将吸附柱重新放回收集管；
步骤十、往吸附柱里加入500μLBuffer GW2，使用之前，先检查无水乙醇是否已加入，10000rpm离心1分钟，把收集管中的废液倒掉，将吸附柱重新放回收集管；
步骤十一、12000rpm离心2分钟，把收集管中的废液倒掉，令吸附柱静置于室温几分钟，来彻底晾干；
步骤十二、令吸附柱放于一个新的离心管里，往吸附柱的中间部位加入50-200μLBuffer GE，室温条件下放置2-5分钟，10000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
3.如权利要求1所述的牛肉中三种主要致病菌多重PCR检测方法，其特征在于，PCR扩增产物鉴定方法为：称取琼脂糖0.6g，加入40mL 0.5×TBE中，在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解；冷却到60℃，加入2μL EB染料，并摇匀，不能有气泡，倒入已插入梳子的胶板小槽中，室温冷却凝固，制成体积分数为1.5％的琼脂糖凝胶，取5μL多重PCR产物，与2μL6×Loadingbuffer混匀后，加入DNA Marker，在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为100v，电泳30min，电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中成像，观察结果并保存电泳结果。
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