CN107385077A - 用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物、含有该引物的试剂盒及其应用 - Google Patents

用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物、含有该引物的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物、含有该引物的试剂盒及其应用。本发明针对鸡白痢沙门氏菌的特异性片段，设计了一种用于特异性扩增鸡白痢沙门氏菌的引物，并建立了一种能够直接从粪便、鸡蛋和鸡肉样品中检测鸡白痢沙门氏菌的PCR检测方法，该方法特异性好、灵敏度高、检测时间短，可以快速准确的检测出鸡白痢沙门氏菌，与22种其他常见致病性沙门氏菌血清型和8种常见非沙门氏菌致病菌的扩增结果均为阴性，并且可以很好的区分大肠埃希氏菌。本发明的提出为鸡白痢沙门氏菌的检测提供了一种快速、有效的技术手段，且该方法操作简单、对设备的要求低，检测时间短，能够满足大部分家禽养殖厂对鸡白痢沙门氏菌快速检测的需求。

Description

用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物、含有该引物的试剂 盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物以及含有该引物的试剂盒，还涉及使用所述的引物以及试剂盒快速检测鸡白痢沙门氏菌的特异性PCR方法，本发明属于生物技术检测领域，
背景技术
沙门氏菌(Salmonella)是主要的食源性致病菌之一，其血清型众多，目前已经确定的血清型有2600多种，但只有某些特定的沙门氏菌血清型会感染人和动物。其中，鸡白痢沙门氏菌(S.pullorum)是严重影响我国禽养殖业发展的宿主特异性病原菌，其传播范围广，致病性强，主要感染21日龄以内的雏鸡，可以引起白色下痢，并且雏鸡感染后死亡率几乎100％；然而成年鸡感染鸡白痢沙门氏菌后通常没有临床症状，但作为病原携带者，不仅可以水平传播，而且可以垂直传播。因此，鸡白痢沙门氏菌是一种传播快、危害大的致病性病原菌。及时准确地检测出鸡白痢沙门氏菌，做出相应的防控措施显得尤为重要。
传统的沙门氏菌血清学检测仍然是通过细菌与特异性抗体的凝集反应鉴别其O抗原和H抗原，根据White-Kauffmann-Le Minor抗原表确定沙门氏菌的血清型。但该方法对某些血清型的鉴别容易混淆，甚至无法鉴别，如鸡白痢、鸡伤寒和肠炎三种沙门氏菌血清型的抗原结构相似，鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌没有运动性，H抗原检测结果为阴性，肠炎沙门氏菌H抗原容易发生变异，必须通过常规的生化鉴定才可以进一步确定这三种沙门氏菌血清型，这种常规的检测方法需要5至7天的时间，过程繁琐，耗时耗力。PCR作为病原检测的一种方法表现出巨大的潜力，它在检测病原菌时具有快速、灵敏、特异等优点。在我国，鸡白痢已经是我国家禽最主要的细菌病之一，并且被国家列为规定净化的细菌病，对鸡白痢沙门氏菌进行快速、准确的检测是净化和防治鸡白痢的关键。
张童利等[，王曼宇，曹俊，王忠星，刘思国*，于申业*.鸡白痢沙门氏菌与其它致病性沙门氏菌的血清型特异性PCR鉴别检测方法的建立.中国预防兽医学报，39(3):215-219，2017]公开了一组用于检测鸡白痢沙门氏菌的引物(SEEP17495-idF：5’CGATAATGGCAACCGCACTG 3’；SEEP17495-idR：5’TGATGTCTGCCCCTTTCGAC 3’)，并建立了检测一种鸡白痢沙门氏菌的方法，实验证明该方法对于两株鸡白痢沙门氏菌均可以特异性地扩增出356bp的目的片段，但对于7株常见非沙门氏菌致病菌和29株其他常见致病性沙门氏菌血清型的扩增结果均为阴性。但在后续实际应用中发现，使用该文献所建立的方法不能够有效区别大肠杆菌，极大影响了检测结果的准确性。
为此，急需建立一种能够快速准确的检测出鸡白痢沙门氏菌，并且区别其他常见致病性沙门氏菌血清型和常见非沙门氏菌致病菌，并且可以很好的区分大肠埃希氏菌的PCR检测方法。
发明内容
针对鸡白痢沙门氏菌在检测过程中容易出现的问题，本发明的目的在于提供一种快速地、特异性地检测鸡白痢沙门氏菌的引物及其检测方法，该方法不仅能够区别其他常见致病性沙门氏菌血清型和常见非沙门氏菌致病菌，并且可以很好的区分大肠埃希氏菌。
为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物，由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
进一步的，本发明还提出了含有所述的特异性引物的PCR检测试剂盒。
在本发明所述的试剂盒中，优选的，还含有PCR扩增缓冲液、阳性对照以及阴性对照。
其中，优选的，所述的阳性对照为鸡白痢沙门氏菌菌株的基因组DNA或是含有SEQID NO.1所示序列的载体；所述的阴性对照为无菌水。
再进一步的，本发明还提出了使用所述试剂盒检测鸡白痢沙门氏菌的方法，其包括以下步骤：
步骤一，提取待检样品基因组DNA，使用所述的试剂盒进行PCR扩增；
步骤二，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有鸡白痢沙门氏菌；所述判断具体为：如果电泳结果在219bp位置出现单一的扩增条带，则说明样品中含有鸡白痢沙门氏菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有鸡白痢沙门氏菌。
其中，优选的，所述的方法中，在提取待检样品基因组DNA之前，还包括使用增菌液对样本进行增菌培养的步骤，所述增菌液为亚硒酸盐胱氨酸增菌液或RV沙门氏菌增菌液体培养基。
其中，优选的，步骤一中采用高温裂解法提取待检样品基因组DNA。
其中，优选的，步骤一中所述PCR扩增所采用的检测体系为25μL反应体系包括：2×Premix Ex Taq 12.5μL，10μM的上下游引物各0.5μL，模板溶液1μL，最后灭菌去离子水补足至25μL。
其中，优选的，步骤一中所述PCR扩增所采用的扩增程序为：先95℃预变性10min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，循环共30个；循环结束后，72℃延伸7min，降温至10℃，结束。
更进一步的，本发明还提出了所述的引物或所述的试剂盒在制备检测鸡白痢沙门氏菌试剂中的应用。
优选的，所述的试剂用于区别鸡白痢沙门氏菌与其他致病性沙门氏菌血清型以及大肠埃希氏菌。其中，优选的，所述的其他致病性沙门氏菌血清型包括鸡伤寒和肠炎沙门氏菌血清型。
与现有检测技术相比较，本发明的有益效果在于：
采用本发明的检测方法相比于其他检测方法具有明显优势。例如常规的细菌分离鉴定费时费力；平板凝集实验虽然快速简便，但容易出现假阳性，导致误淘，引起不必要的经济损失；免疫荧光、酶联免疫吸附等免疫学检测方法虽然比较准确，但由于这些方法的抗体制备困难，也不易于推广。但本发明建立的鸡白痢沙门氏菌PCR检测方法特异性好、灵敏度高、结果准确，并且可以很好的区分大肠埃希氏菌，能够有效防止对鸡只的误淘汰；而且该方法操作简单、快速，在普通的分子实验室均可以进行，整个检测过程只需一天就可以完成，在我国提倡净化养殖场鸡白痢沙门氏菌的背景下，本发明具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例2中增菌液直接作为模板的PCR结果；
其中，M：DL2000 DNA Marker；1：NB增菌液；2：LB增菌液；3：SC增菌液；4：RV增菌液；5：TTB增菌液；6：阴性对照；
图2为本发明施例2中按照(2)方法制备模板的PCR结果；
其中，M：DL2000 DNA Marker；1：NB增菌液；2：LB增菌液；3：SC增菌液；4：RV增菌液；5：TTB增菌液；6：阴性对照；
图3为本发明施例2中按照(3)方法制备模板的PCR结果；
其中，M：DL2000 DNA Marker；1：NB增菌液；2：LB增菌液；3：SC增菌液；4：RV增菌液；5：TTB增菌液；6：阴性对照；
图4为本发明施例2中退火温度优化结果；
其中，M：DL2000 DNA Marker；1：51℃；2：53℃；3：55℃；4：57℃；5：59℃；6：61℃；7：63℃；8：阴性对照；
图5为本发明施例2中引物浓度优化结果；
其中，M：DL2000 DNA Marker；1：5μM；2：10μM；3：20μM；4：阴性对照；
图6为本发明施例2中反应循环数优化结果；
其中，M：DL2000 DNA Marker；1：30循环；2：35循环；3：40循环；4：阴性对照；
图7为本发明施例2中鸡白痢沙门氏菌与其他血清型的致病性沙门氏菌的PCR特异性结果；
其中，M：DL2000 DNA Marker；1：鸡白痢沙门氏菌527；2：鸡白痢沙门氏菌528；3-33：依次对应表1中的3-33号菌株；34：阴性对照；
图8为本发明施例2中鸡白痢沙门氏菌与非沙门氏菌致病菌的PCR特异性结果；
其中，M：DL2000 DNA Marker；1：鸡白痢沙门氏菌527；2：鸡白痢沙门氏菌528；3-13：依次对应表1中的34-44号菌株；14：阴性对照；
图9为采用文献的方法(a)以及本发明的方法(b)检测的特异性结果；
其中，图中的数字对应于表1中的菌株编号；
图10为本发明施例2中鸡白痢沙门氏菌基因组DNA的检测灵敏度结果；
其中，M：DL2000 DNA Marker；1：阴性对照；2：213ng/μL；3：21.3ng/μL；4：2.13ng/μL；5：213pg/μL；6：21.3pg/μL；7：2.13pg/μL；8：213fg/μL；9：21.3fg/μL
图11为本发明施例2中鸡白痢沙门氏菌纯培养物的检测灵敏度结果；
其中，M：DL2000 DNA Marker；1：阴性对照；2：2.1×108cfu/mL；3：2.1×107cfu/mL；4：2.1×106cfu/mL；5：2.1×105cfu/mL；6：2.1×104cfu/mL；7：2.1×103cfu/mL；8：2.1×102cfu/mL；9：2.1×101cfu/mL；10：2.1cfu/mL
图12为本发明施例3中人工污染鸡粪样品检测结果；
其中，图a-d分别表示鸡白痢沙门氏菌初始接种量分别为13c fu/10g、1.3×103cfu/10g、1.3×105cfu/10g、1.3×107cfu/10g的模拟鸡粪样品的检测结果，其中，M：DL2000 DNA Marker；1-7：增菌时间分别为0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h的增菌液；8：阴性对照；9：鸡白痢沙门氏菌阳性对照；
图13为本发明施例3中人工污染鸡蛋样品检测结果；
其中，图a-d分别表示鸡白痢沙门氏菌初始接种量分别为13cfu/10mL、1.3×103cfu/10mL、1.3×105cfu/10mL、1.3×107cfu/10mL的模拟鸡蛋样品的检测结果，其中，M：DL2000 DNA Marker；1-7：增菌时间分别为0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h的增菌液；8：阴性对照；9：鸡白痢沙门氏菌阳性对照
图14为本发明施例3中人工污染鸡肉样品检测结果。
其中，图a-d分别表示鸡白痢沙门氏菌初始接种量分别为13c fu/10g、1.3×103cfu/10g、1.3×105cfu/10g、1.3×107cfu/10g的模拟鸡肉样品的检测结果，其中，M：DL2000 DNA Marker；1-7：增菌时间分别为0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h的增菌液；8：阴性对照；9：鸡白痢沙门氏菌阳性对照。
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：引物设计
对GenBank中鸡白痢、鸡伤寒和肠炎沙门氏菌血清型全基因组进行全面的生物信息学分析，最终确定SEEP17695基因(SEQ ID NO.1所示)为鸡白痢沙门氏菌的检测靶基因。
根据SEEP17695基因，使用Oligo 6软件设计特异性引物，引物由苏州金唯智公司合成。引物序列如下：
SEEP17695-idF10：5’TCTAGCACTGAACTTGGCGA 3’(SEQ ID NO.2所示)；
SEEP17695-idR10：5’TGTGTCGCCATTGTAGGTCA 3’(SEQ ID NO.3所示)。
实施例2：鸡白痢沙门氏菌PCR检测方法的建立
1、实验用菌株与试剂
实验菌株见表1，其中13株分离株为哈尔滨兽医研究所动物细菌病实验室分离鉴定。
Premix Ex Taq DNA聚合酶和Marker DL2000购自TaKaRa公司。
表1 实验菌株
注：①：中国兽医微生物菌种保藏管理中心；②：中国医学细菌保藏管理中心；③：中国工业微生物菌种保藏管理中心；④：美国典型培养物保藏中心；⑤：天根生化科技(北京)有限公司；⑥：本室保存。
2、方法
2.1最适增菌液及模板制备方法的选择
以五种不同的增菌液对鸡白痢沙门氏菌进行扩增培养，并使用三种不同的处理方法制备模板，使用引物组SEEP17695-idF10和SEEP17695-idR10对模板进行PCR扩增，扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。
2.1.1增菌液的选择
在检测样品时，为了提高检测效率和排除休眠菌的影响，通常需要进行预增菌，再进行后续检测。增菌液的确定需要考虑其对目的菌的选择性，同时需要兼顾其增菌效率以及对后续检测的影响。采用3种选择性增菌液：亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)、RV沙门氏菌增菌液体培养基、四硫磺酸盐煌绿增菌液(TTB)和2种普通增菌液：营养肉汤(NB)、LB Miller肉汤，分别对鸡白痢沙门氏菌标准株527进行6小时增菌培养。
2.1.2模板制备
将一定量的鸡白痢沙门氏菌接种到增菌液中，于37℃的恒温振荡器中振荡培养，取生长对数期的增菌液培养物分别以下述三种方法处理后作为PCR反应的模板。
(1)以增菌液培养物作为模板直接进行PCR扩增。
(2)取增菌液培养物1mL置于1.5mL Eppendorf离心管中，1500rpm离心3min，吸出上清加入另一洁净的1.5mL Eppendorf离心管中，10000rpm离心10min后弃掉上清，加入200μL去离子水将菌体重悬，以此作为PCR反应的模板。
(3)高温裂解法提取基因组：取增菌液1mL置于1.5mL Eppendorf离心管中，1500rpm离心3min，吸出上清加入另一洁净的1.5mL Eppendorf离心管中，10000rpm离心10min后弃掉上清，加入200μL去离子水将菌体重悬，于沸水浴中加热10min，立即放入冰中，待其冷却后取出，10000rpm离心10min，取上清作为PCR反应模板。使用超微量紫外分光光度计测定核酸纯度，吸光值A260/A280的比值均在1.8至2.0之间，表明提取的基因组质量好。
2.1.3PCR扩增方法
配制如下扩增体系：Premix Ex Taq 12.5μL，上下游引物浓度10μmol/L，各加入0.5μL，模板1μL，以无菌水为模板作为反应的阴性对照，加入灭菌去离子水补足25μL，将反应体系各组分加入PCR反应管中，使用涡旋仪振荡使其充分混匀，低速离心数秒，PCR反应管放入PCR仪中，按照以下PCR循环参数进行：在95℃预变性5min，接着作30个循环，每个循环的程序包括95℃变性30s，退火温度55℃，退火时间为30s，然后在72℃延伸30s，循环结束后在72℃延伸7min，最后降温至4℃，结束所有操作程序。
由图1、图2和图3结果结合比较显示，含有鸡白痢沙门氏菌的NB、LB、SC和RV四种增菌液培养物采用三种模板制备方法均可以扩增出219bp目的条带，但明显高温裂解法制备的模板扩增的条带比较亮。直接以TTB增菌液培养物为模板没有扩增到目的条带，经过(2)或(3)处理后扩增得到目的条带，且(2)处理后结果条带亮度很暗，只有(3)的高温裂解法制备的模板对PCR反应无影响。由以上结果结合实际检测中对选择性增菌液的需求，本发明确定以SC或RV增菌液作为检测过程中的样品增菌液，以高温裂解法作为模板制备方法。
2.2PCR反应条件的优化
为了达到最理想的检测效果，对引物浓度、退火温度和PCR反应循环数进行了优化。PCR反应体系共25μL，各组分含量见表2。程序：预变性95℃，10min；变性95℃，30s；退火，30s；延伸72℃，30s；终延伸72℃，7min。由变性到延伸进行循环。退火温度分别设为51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃、63℃，引物浓度分别为5μM、10μM和20μM，循环数分别设置为30、35、40，根据结果确定最佳退火温度、最佳引物浓度和最佳循环数。扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。
表2 P CR反应体系
组分 加入体积(μL)
Premix Taq(Ex Taq Version 2.0plus dye) 12.5
SEEP17695-idF10 0.5
SEEP17695-idF10 0.5
模板 1
ddH2O 10.5
图4显示了PCR最佳退火温度的优化结果，7个退火温度扩增的结果均为阳性，其中59℃、61℃两个温度条件下扩增产物条带最亮，将59℃确定为最佳退火温度。
图5显示了PCR最佳引物浓度的优化结果，3个引物浓度均可扩增出目的条带，其中引物为10μM浓度时，PCR结果最理想，因此确定10μM为本研究最佳引物浓度。
图6显示了PCR最佳循环数的优化结果，在30、35和40这三种循环数的条件下扩增时，均可扩增出目的条带，反应进行30个循环时，扩增产物条带较暗，而在进行35和40个循环扩增后，目的条带亮度相近。基于节省时间考虑，最终确定程序进行35个循环。
2.3检测方法特异性评价
使用优化的PCR反应体系和程序对表1中的所有菌株的基因组进行PCR扩增，其中两株鸡白痢沙门氏菌527和528作为阳性对照，31株其他常见沙门氏菌和11株非沙门氏菌属的常见致病菌作为阴性对照。
图7和图8显示了所用菌株的检测结果，引物对鸡白痢沙门氏菌可以扩增出特异性目的条带，但对31株常见致病性沙门氏菌血清型的扩增结果均为阴性；对其他11株常见非沙门氏菌致病菌的扩增结果也为阴性。结果表明本发明设计的引物扩增鸡白痢沙门氏菌时具有良好的特异性。
同时使用文献[张童利，王曼宇，曹俊，王忠星，刘思国*，于申业*.鸡白痢沙门氏菌与其它致病性沙门氏菌的血清型特异性PCR鉴别检测方法的建立.中国预防兽医学报，39(3):215-219，2017]所列的引物(SEEP17495-idF：5’CGATAATGGCAACCGCACTG 3’；SEEP17495-idR：5’TGATGTCTGCCCCTTTCGAC 3’)和PCR反应参数对表1中的22个菌株的基因组进行PCR扩增，其中两株鸡白痢沙门氏菌527和528作为阳性对照。
图9显示了采用以上两种方法检测22个菌株的检测结果，从该结果可以看出本发明设计的引物对鸡白痢沙门氏菌可以扩增出特异性目的条带，但对9株常见致病性沙门氏菌血清型的扩增结果均为阴性；对其他11株常见非沙门氏菌致病菌的扩增结果也为阴性；而文献[张童利，王曼宇，曹俊，王忠星，刘思国*，于申业*.鸡白痢沙门氏菌与其它致病性沙门氏菌的血清型特异性PCR鉴别检测方法的建立.中国预防兽医学报，39(3):215-219，2017]所列的引物用于扩增大肠杆菌DH5α(34号)时出现非特异性条带，说明本发明设计的引物相较于文献中公开的引物在扩增鸡白痢沙门氏菌时具有更好的特异性。
2.4检测方法灵敏度评价
2.4.1鸡白痢沙门氏菌基因组检测灵敏度评价
使用高温裂解法提取鸡白痢沙门氏菌的基因组，并用超微量紫外分光光度计测定其核酸的浓度及纯度，得到质量良好的、浓度为213ng/μL的基因组，使用去离子水将其10倍梯度倍比稀释，得到21.3ng/μL、2.13ng/μL、213pg/μL、21.3pg/μL、2.13pg/μL、213fg/μL、21.3fg/μL共7个梯度的稀释液，以这些稀释液作为模板，按照优化的PCR条件进行扩增，并通过1.5％琼脂糖凝胶电泳结果评价检测方法的灵敏度。
图10显示了基因组检测灵敏度的结果，结果显示，鸡白痢沙门氏菌基因组浓度为2.13pg/μL时，可以有效地扩增出目的片段，但菌液浓度为213fg/μL或更低时扩增结果为阴性。结果表明，该PCR方法对鸡白痢沙门氏菌基因组的最低检测浓度为2.13pg/μL，具有较好的灵敏度。
2.4.2鸡白痢沙门氏菌纯培养物检测灵敏度评价
用无菌去离子水对处于对数生长期的鸡白痢沙门氏菌增菌液进行10倍梯度稀释，稀释至10-8倍，取原始菌液100μL均匀涂于无抗性的LB琼脂平板上，置于37℃电热恒温培养箱中，培养12h-16h进行菌落计数，取三个重复的平均值，计算出原始菌液浓度约为2.1×108cfu/mL；同时，各个稀释浓度的菌液分别取出1mL加入1.5mL Eppen dorf离心管中，以高温裂解法提取的基因组为模板。按照优化的PCR条件进行扩增。并通过1.5％琼脂糖凝胶电泳结果评价本发明的PCR方法检测鸡白痢沙门氏菌纯培养物时的灵敏度。
图11显示了纯培养物检测灵敏度的结果，结果显示，鸡白痢沙门氏菌菌液浓度为2.1×104cfu/mL时，可以有效地扩增出目的片段，但菌液浓度为2.1×103cfu/mL或更低时扩增结果为阴性。结果表明，该PCR方法对鸡白痢沙门氏菌的最低检测浓度为2.1×104cfu/mL，具有较好的灵敏度。
实施例3：人工污染样品检测
在实际检测过程中，鸡粪和鸡肉都可能是被检测的对象，本发明选取这两种样品，用鸡白痢沙门氏菌进行人工污染，对得到的人工模拟污染样品进行检测。
1、人工污染鸡粪便样品的检测
无菌采集SPF级别饲养环境下的SPF鸡的粪便，取10g粪便加入90mL SC增菌液中，过夜培养。用无菌水10倍倍比稀释鸡白痢沙门氏菌过夜培养物，将适当稀释度的菌液分别接种于鸡粪混合液(10g粪便+90mL SC增菌液)中，并用菌落计数的方法得出鸡白痢沙门氏菌的浓度，进而计算鸡白痢沙门氏菌的接种量，使接种量分别约为13cfu、1.3×103cfu、1.3×105cfu、1.3×107cfu，置于恒温振荡器中180rpm，37℃振荡培养，每2h取一次样，分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h七个时间点各取出1mL增菌液，以高温裂解法提取的基因组为模板，无菌去离子水为阴性对照，按照优化的PCR条件进行扩增。扩增产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳。
图12显示了人工污染鸡粪便样品的检测结果，当初始接种量为13cfu/10g鸡粪时，增菌8h时可以检测出阳性结果；当初始接种量为1.3×103cfu/10g鸡粪时，增菌6h时可以检测出阳性结果；当初始接种量为1.3×105cfu/10g鸡粪时，增菌4h时可以检测出阳性结果；当初始接种量为1.3×107cfu/10g鸡粪时，只需增菌2h时即可以检测出阳性结果。
2、人工污染鸡蛋样品的检测
将SPF鸡蛋的蛋清与蛋黄混匀，取10mL加入90mL SC增菌液中，过夜培养。用无菌水10倍倍比稀释鸡白痢沙门氏菌过夜培养物，取适当稀释度的菌液分别接种于鸡蛋混合液(10mL蛋清与蛋黄混合液+90mL SC增菌液)中，并用菌落计数的方法得出鸡白痢沙门氏菌的浓度，进而计算鸡白痢沙门氏菌的接种量，使接种量分别约为13cfu、1.3×103cfu、1.3×105cfu、1.3×107cfu，于恒温振荡器中180rpm，37℃振荡培养，每2h取一次样，分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h七个时间点各取出1mL增菌液，以高温裂解法提取的基因组为模板，无菌去离子水为阴性对照，按照优化的PCR条件进行扩增。扩增产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳。
图13显示了人工污染鸡蛋样品的检测结果，当初始接种量为13cfu/10mL鸡蛋时，增菌10h时可以检测出阳性结果；当初始接种量为1.3×103cfu/10mL鸡蛋时，增菌6h时可以检测出阳性结果，但条带较暗；当初始接种量为1.3×105cfu/10mL鸡蛋时，增菌6h时可以检测出阳性结果；当初始接种量为1.3×107cfu/10mL鸡蛋时，增菌4h时可以检测到微弱的阳性结果。
3、人工污染鸡肉样品的检测
无菌条件下解剖SPF鸡，取鸡胸肉10g，使用组织研磨器将鸡肉组织磨碎加入90mLSC增菌液中，过夜培养。用无菌水10倍倍比稀释鸡白痢沙门氏菌过夜培养物，取适当稀释度的菌液分别接种于鸡肉混合液(鸡胸肉10g+90mL SC增菌液)中，并用菌落计数的方法得出鸡白痢沙门氏菌的浓度，进而计算鸡白痢沙门氏菌的接种量，使接种量分别约为13cfu、1.3×103cfu、1.3×105cfu、1.3×107cfu，于恒温振荡器中180rpm，37℃振荡培养，每2h取一次样，分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h七个时间点各取出1mL增菌液，以高温裂解法提取的基因组为模板，无菌去离子水为阴性对照，按照优化的PCR条件进行扩增。扩增产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳。
图14显示了人工污染鸡粪便样品的检测结果，当初始接种量为13cfu/10g鸡肉时，增菌6h时即可以检测出微弱的阳性条带；当初始接种量为1.3×103cfu/10g鸡肉时，增菌6h时可以检测出阳性结果；当初始接种量为1.3×105cfu/10g鸡肉时，增菌4h时可以检测出阳性结果；当初始接种量为1.3×107cfu/10g鸡肉时，只需增菌2h时可以检测出阳性结果。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120> 用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物、含有该引物的试剂盒及其应用
<130> klpi170786
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1047
<212> DNA
<213> S. pullorum
<400> 1
gtgtttatta ataactatat ccaacaaaac ttctggatat cgtacttact tattataata 60
tatttaatat atatatacct tgaattatac ctatgcgtat caaaaaaagg ctttgacatg 120
gatgaaagac cattaacaag tcaatattta tttaaacaat cacttagaat acctgtattc 180
tcagcgatat actttggtat attttcttgg cttggacatt cacctcaatt tgatagtgat 240
ggctttaata attttattgc aattagcaaa ctccccatcg ccttgctttc tttgtccata 300
ccatttgttg ctgtcgtagc aaacatacac cgtacagttc agacaaaccg acagattgag 360
gaaacaaagc aaaagaacct atctgatagc cactatagcc atctaaagtt cgtcactgat 420
tatttcacca atttacctag taaaatcgtt aaacgcgatc gttattataa cactaaagag 480
gtgtgttata agattaacta cccaatacat ctatatagat acattttcaa acatagttcg 540
ccagagaatg gccgacctaa aaacacagat aaagaataca tacaggaagt aaataatcac 600
tggattggaa tattaaaaaa cctagagaag ataaattccc ctaatcgtgg ttctcaactt 660
cacgaagttt taatccgtca aatgcaatat cttcattcaa ttgaaaaaca tttatcaaaa 720
cttaatcgaa tgctttgcct aactccgata gagttaaatg aacatgcaac tttacactct 780
aagggatatg aaattaccac taatttcatg tctagcactg aacttggcga tactattgaa 840
acttatttta aatttaccat tgatattctt gacattaccg ataatttcct ttcattcaag 900
gatgatggca tgtccgggca aattattata cttgcaagat tactaaaaga taataatcca 960
gctatttttc atgagattat aacaaataaa gggaaggctg acccttcgct gacctacaat 1020
ggcgacacat tggcggcaga gcattaa 1047
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
tctagcactg aacttggcga 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
tgtgtcgcca ttgtaggtca 20

Claims (10)

1.一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物，其特征在于所述引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.含有权利要求1所述的特异性引物的PCR检测试剂盒。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还含有PCR扩增缓冲液、阳性对照以及阴性对照。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述的阳性对照为鸡白痢沙门氏菌菌株的基因组DNA或是含有SEQ ID NO.1所示序列的载体；所述的阴性对照为无菌水。
5.如权利要求2-4任一项所述的试剂盒，其特征在于用于检测鸡白痢沙门氏菌时包括以下步骤：
步骤一，提取待检样品基因组DNA，使用权利要求2-4任一项所述的试剂盒进行PCR扩增；
步骤二，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有鸡白痢沙门氏菌；所述判断具体为：如果电泳结果在219bp位置出现单一的扩增条带，则说明样品中含有鸡白痢沙门氏菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有鸡白痢沙门氏菌。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，在提取待检样品基因组DNA之前，还包括使用增菌液对样本进行增菌培养的步骤，所述增菌液为亚硒酸盐胱氨酸增菌液或RV沙门氏菌增菌液体培养基。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，采用高温裂解法提取待检样品基因组DNA。
8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于步骤一中所述PCR扩增所采用的检测体系为25μL反应体系包括：2×Premix Ex Taq 12.5μL，10μM的上下游引物各0.5μL，模板溶液1μL，最后灭菌去离子水补足至25μL；所述PCR扩增所采用的扩增程序为：先95℃预变性10min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，循环共35个；循环结束后，72℃延伸7min，降温至10℃，结束。
9.权利要求1所述的引物或权利要求2-7所述的试剂盒在制备检测鸡白痢沙门氏菌试剂中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的试剂用于区别鸡白痢沙门氏菌与其他致病性沙门氏菌血清型以及大肠埃希氏菌，优选的，所述的其他致病性沙门氏菌血清型包括鸡伤寒和肠炎沙门氏菌血清型。
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