CN116622871B - 鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌分子鉴别试剂盒及其非诊断性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌分子鉴别的试剂盒及其非诊断性检测方法。所述试剂盒包括PCR检测引物、阳性对照、阴性对照和空白对照，所述阳性对照为鸡伤寒沙门氏菌ATCC9184基因组DNA，阴性对照为鸡白痢沙门氏菌ATCC10398基因组DNA，空白对照为灭菌双蒸水，所述引物包括：For：5’‑CGTGGAGCGGCATTTATATATACAG‑3’；Rev：5’‑ACTACCGTTGTGGTGATACTCTGCG‑3’。本发明还公开了一种应用所述试剂盒鉴别鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌的PCR方法。本发明方法具有快速、简单、特异性强、灵敏度高的优点，相比传统的鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌生化鉴别方法，在检测时间与检测成本方面具有较大优势，适用于临床批量检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种用于鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌分子鉴别试剂盒及其非诊断性检测方法。
背景技术
鸡白痢和禽伤寒是家禽重要的烈性细菌传染病，也是兽医学界较早发现的两种细菌性疾病，其病原分别是鸡白痢沙门氏菌(Salmonella GallinarumbiovarPullorum,S.Pullorum)和鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella GallinarumbiovarGallinarum,S.Gallinarum),目前这2种病原已被归类为鸡伤寒血清型所属的2种不同生物型。鸡白痢沙门氏菌主要引起雏鸡急性系统性疾病，死亡率最高可达90％以上，而鸡伤寒沙门氏菌则引起急性或慢性败血病，主要危害成年家禽。尽管许多发达国家已在商业鸡群上对上述疾病实现了净化，但它们仍然是发展中国家养禽业的顽症，并造成严重的经济损失。
鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌是沙门氏菌属中非常独特的一类，因其不能表达鞭毛，所以不具有运动性，在琼脂平板上的菌落大小也明显小于其它血清型，此外在很多菌落呈黑色金属光泽为特征的沙门氏菌显色培养基上(如SS、XLD、BS、DHL、XLT4等)，鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌均为无色透明菌落，所以通过运动性、菌落大小、菌落颜色等方式很容易与其它血清型沙门氏菌区分。然而由于鸡白痢和鸡伤寒这2种沙门氏菌生物型在流行病学、临床症状、防控措施等方面存在诸多相似之处导致难以鉴别。研究表明，由于鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌均无运动性，且具有相同的抗原因子，所以很难通过常规诊断或血清学实验进行区分。虽然有研究表明，鸟氨酸和卫矛醇这2种生化指标可作为鉴别鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌的“金标准”，但因无法满足快速、批量化的检测要求导致其应用受到限制。随着分子生物学的快速发展，目前也报道了一些鉴别鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌的分子检测技术，但上述方法有的需要使用多对引物，有的需要对扩增产物进一步酶切鉴定，且有的方法还存在特异性问题，所以仍需进一步开发简便的分子鉴别方法。
为了能够快速、准确、简便的鉴别鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌，本发明根据已公开的沙门氏菌基因组序列，通过分析筛选出特异性检测靶标，进一步设计检测引物，开发出用于快速鉴别鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌的实用技术。
发明内容
本发明针对传统技术在鉴别鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌中存在的不足，提供了一种特异性鉴别鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌的分子试剂盒及其非诊断性检测方法。
本发明技术方案如下：
本发明提供了一种鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌分子鉴别试剂盒及其非诊断性检测方法，所述鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌分子鉴别试剂盒包括10×PCR缓冲液、2.5U/μl Taq DNA聚合酶、10Mm dNTPs、PCR检测引物、阳性对照、阴性对照和空白对照，所述阳性对照物为鸡伤寒沙门氏菌ATCC 9184基因组DNA，阴性对照为鸡白痢沙门氏菌ATCC10398基因组DNA，空白对照为灭菌双蒸水；所述引物组的引物包括：
For：5’-CGTGGAGCGGCATTTATATATACAG-3’
Rev：5’-ACTACCGTTGTGGTGATACTCTGCG-3’。
进一步的，所述PCR检测体系的组分为：每25μl反应液中包括10×PCR缓冲液2.5μl、dNTPs 2μl、Taq DNA聚合酶0.25μl、检测引物1μl、DNA模板1～2μl以及适量的灭菌双蒸水。
进一步的，所述PCR检测方法的制作方法程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s；共30个循环，最后72℃延伸8min。
进一步的，所述10×PCR缓冲液含有100mM KCl、80mM(NH4)SO4、pH为9.0的100mMTris-HCl、15mM MgCl2和0.5％Tergitol-type NP-40。
进一步的，所述的引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
进一步的，所述的引物浓度为10μM。
进一步的，所述dNTPs包括dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM。
进一步的，所述试剂盒不包括其它引物。更进一步的，一种使用鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌分子鉴别试剂盒进行非诊断性检测的方法，包括以下步骤：
S1：使用煮沸法或商品化试剂盒提取细菌基因组DNA，得到检测模板。
S2：PCR扩增，将10×PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、检测引物组以及DNA模板加入灭菌PCR反应管中，添加灭菌双蒸水至总体积25μl，同时设置阳性、阴性和空白对照，使用PCR仪进行扩增反应；采用2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果；
所述引物组的引物包括：
For：5’-CGTGGAGCGGCATTTATATATACAG-3’
Rev：5’-ACTACCGTTGTGGTGATACTCTGCG-3’。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明通过一次反应，即可对鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌进行快速鉴别，即出现559bp条带者鸡伤寒沙门氏菌，未出现条带者为鸡白痢沙门氏菌。相比传统的生化分型与其它PCR检测方法，在检测时间与检测成本方面具有较大优势，适合于批量检测。
附图说明
图1为实施例1中鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌鉴别引物筛选实验凝胶电泳结果图。图中：M为DL-2000marker，泳道1-3分别为鸡白痢沙门氏菌ATCC10398、ATCC19945和CMCC50771，泳道4-6为鸡伤寒沙门氏菌ATCC 9184、ATCC70062、9R，泳道7为空白对照。
图2为实施例3中灵敏度评价实验凝胶电泳结果图。图中：M为DL-2000marker，泳道1～7为鸡伤寒沙门氏菌ATCC 9184基因组，浓度依次为101.4ng/反应、10.14ng/反应、1.014ng/反应、101.4pg/反应、10.14pg/反应、1.014pg/反应和0.1014pg/反应；8：空白对照。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌鉴别引物的筛选及分子鉴别方法的建立
鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌分属于鸡伤寒血清型的2种不同生物型，在抗原结构、生化特性、基因序列方面相似度极高，通过对鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌基因组中高度保守的Peg菌毛操纵子序列分析发现，在pegB基因上存在一些特异性的单核苷酸多态性位点(SNP)，分别位于54(T→C)、70(G→A)和581(A→C)处，将上述SNP置于上下游引物中(表1)，设计出鉴别引物1。
表1.鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌鉴别引物的筛选
注：加底纹碱基为单核苷酸多态性位点，加框碱基为人工突变位点。
PCR模板制备：将参考菌株鸡白痢沙门氏菌ATCC10398、ATCC19945、CMCC50771和鸡伤寒沙门氏菌ATCC 9184、ATCC70062、9R分别在TSB肉汤培养基中培养12h，使用试剂盒提取上述沙门氏菌标准菌株基因组，作为待检模板。
PCR扩增试剂包括：10×PCR缓冲液(其组分包括100mM KCl、80mM(NH4)SO4、pH为9.0的100mM Tris-HCl、15mM MgCl2和0.5％Tergitol-type NP-40)、dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM)、Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)、检测引物。
PCR检测体系及扩增程序：检测体系为25μl，具体包括：10×PCR缓冲液2.5μl，dNTPs2μl，Taq DNA聚合酶0.25μl，检测引物组1μl、DNA模板2μl以及适量的灭菌双蒸水。扩增程序的步骤包括：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃延伸8min；反应结束，取出扩增产物4℃保存。
PCR方法检测结果的判定：取5μl扩增产物，加1μl 6×Loading buffer混匀，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，100V电压，电泳40min，于凝胶成像仪下拍照判定。将扩增产物回收、克隆至pMD-19T载体，挑取阳性克隆测序，将结果与已知序列进行比对。
结果发现(图1)，所有6株鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌均可扩增出特异性条带，且扩增条带序列与目的序列一致。
在引物1的基础上，进一步对For引物3’端SNP上游再人工突变1个碱基，设计出引物2-4(表1)，经检验发现引物4将T→C后，只有鸡伤寒沙门氏菌出现特异性条带，而鸡白痢没有出现，而引物2、3仍可出现扩增条带(图1)，所以将引物4作为区分鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌的鉴别引物。
实施例2特异性评价实验
用实施例1的方法进行本发明分子鉴别方法的特异性评价，选取542株实验菌株(其中参考菌株6株，分离株536株)，将所有试验菌株进行富集培养后，煮沸法提取基因组DNA，按照实施例1所述方法进行PCR检测，结果如表2所示，所有鸡伤寒沙门氏菌(3株参考菌株和12株分离株)均可扩增出559bp的特异性扩增条带，而鸡白痢沙门氏菌(3株参考菌株和524株分离株)均没有出现扩增条带，分子检测结果与生化鉴定结果完全一致。上述结果表明，本发明建立的方法具有较好的特异性。
表2.特异性评价实验结果
注：“-”代表阴性结果，“+”代表阳性结果。
实施例3灵敏度测试实验
用实施例1的方法进行本发明分子鉴别方法的敏感性评价。将鸡伤寒沙门氏菌ATCC9184在TSB肉汤培养基中培养12h，使用商品化试剂盒提取细菌基因组，测定其原始浓度后10倍梯度稀释，将不同稀释梯度的基因组DNA进行灵敏度评价试验。反应结束后取5μl扩增产物，加1μl 6×Loading buffer混匀，使用2％浓度琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果如图2所示，M为DL-200marker(依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)，泳道1-7反应浓度依次为101.4ng/反应、10.14ng/反应、1.014ng/反应、101.4pg/反应、10.14pg/反应、1.014pg/反应和0.1014pg/反应。如图2所示，原始浓度101.4ng/反应的鸡伤寒基因组DNA经稀释10000倍(泳道5)后仍可看到较清晰的条带，而稀释100000倍(泳道6)后则看不到扩增条带(见图2)。因此，本发明的分子鉴别方法最低检出限为10.14pg/反应，具有较高的检测灵敏度。
实施例4鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌分子鉴别试剂盒的组装
使用试剂盒提取鸡伤寒沙门氏菌ATCC 9184基因组DNA，得到本发明的阳性对照；使用试剂盒提取鸡白痢沙门氏菌ATCC10398基因组DNA，得到本发明的阴性对照，根据实施例1表中引物4的序列合成特异性检测引物，用灭菌双蒸水稀释为10μM浓度，混合后得到检测引物；PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液(其组分包括100mM KCl、80mM(NH4)SO4、pH为9.0的100mM Tris-HCl、15mM MgCl2和0.5％Tergitol-type NP-40)、dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM)、Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)、检测引物、阳性对照(鸡伤寒沙门氏菌ATCC 9184基因组DNA模板)、阴性对照(鸡白痢沙门氏菌ATCC10398基因组DNA模板)、空白对照(灭菌双蒸水)。
将以上所涉试剂和产品共同包装，再配以产品使用说明书(包括产品保存条件、反应程序和结果判定方法等)，组装成本发明所述的鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌分子鉴别试剂盒。
实施例5鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌分子鉴别试剂盒的临床应用
从江苏省内3个种鸡场采集死胚217个，参考沙门氏菌检验国家标准(GB 4789.4-2016)方法，无菌吸取死胚尿囊液或卵黄加入SC选择性增菌液中，37℃过夜培养，将增菌液涂布XLD选择性琼脂培养基上过夜培养，选取疑似菌落进一步开展生化鉴定和血清学分型以确认分离株的血清型(生物型)。将鉴定为鸡白痢或鸡伤寒沙门氏菌的细菌菌液，离心后用PBS清洗，煮沸法提取基因组后再用本发明的分子鉴别方法进行验证，同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。
临床样品的检测结果见表3。由表可见从种鸡场采集的217份死胚样品中，共分离到21株鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌，没有分离到其它血清型沙门氏菌。使用国标方法和PCR方法均检出19株鸡白痢沙门氏菌和2株鸡伤寒沙门氏菌，样品检出率分别为8.8％和1.0％，两种方法的结果符合率为100％。其中种鸡场A和C均检出鸡白痢沙门氏菌，而种鸡场B只检出鸡伤寒沙门氏菌。通过对临床样品的进一步验证，表明该PCR方法具有良好的特异性，且操作比传统方法更为简便。
表3.临床检测结果
注：“SP”代表鸡白痢沙门氏菌，“SG”代表鸡伤寒沙门氏菌
以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.鸡伤寒沙门氏菌分子鉴别试剂盒，其特征在于：包括PCR检测引物组、阳性对照、阴性对照和空白对照，所述阳性对照为鸡伤寒沙门氏菌ATCC 9184基因组DNA，阴性对照为鸡白痢沙门氏菌ATCC10398基因组DNA，空白对照为灭菌双蒸水，所述检测引物组由下述For和Rev引物组成：
For：5’- CGTGGAGCGGCATTTATATATACAG-3’
Rev：5’- ACTACCGTTGTGGTGATACTCTGCG-3’。
2.根据权利要求1所述的鸡伤寒沙门氏菌分子鉴别试剂盒，其特征在于：所述PCR检测体系的组分为：每25μl反应液中包括10×PCR缓冲液2.5μl、dNTPs 2μl、Taq DNA 聚合酶0.25μl、检测引物组1μl、DNA模板1~2μl以及适量的灭菌双蒸水。
3.根据权利要求1所述的鸡伤寒沙门氏菌分子鉴别试剂盒，其特征在于：所述检测引物组浓度为10μM。
4.根据权利要求2所述的鸡伤寒沙门氏菌分子鉴别试剂盒，其特征在于：所述dNTPs包括dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM。
5.一种使用鸡伤寒沙门氏菌分子鉴别试剂盒进行非诊断性检测的方法，包括以下步骤：
S1：使用煮沸法或商品化试剂盒提取细菌基因组DNA，得到检测模板；
S2：PCR扩增，将10×PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、检测引物组以及DNA模板加入无菌PCR反应管中，添加灭菌双蒸水至总体积25μl，同时设置阳性、阴性、空白对照，使用PCR仪进行扩增反应；采用2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果，如扩增出559bp的特异性扩增条带则说明含有鸡伤寒沙门氏菌，否则说明不含有鸡伤寒沙门氏菌；所述检测引物组的引物由下述For和Rev组成：
For：5’- CGTGGAGCGGCATTTATATATACAG-3’
Rev：5’- ACTACCGTTGTGGTGATACTCTGCG-3’。
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