CN111996268A - 溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明利用溶藻弧菌两个基因的保守序列分别设计一对引物，优化PCR反应条件和反应体系，建立起检测溶藻弧菌的双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，在此基础上组装出简便、快速、特异性强、灵敏度高的溶藻弧菌检测试剂盒，该试剂盒对质粒的检测下限为5×101拷贝数/μL，对细菌纯培养物的检测下限为1.8×102 cfu/mL。本发明克服了单探针法在检测同属近缘细菌时可能存在的假阳性，可实现复杂样品基质中目标病原菌的特异性检测，因而在溶藻弧菌的流行病学调查、溶藻弧菌所致疾病的快速诊断、以及水产品质量安全监测等方面具有广泛的应用价值。

Description

溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒及其 制备方法
技术领域
本发明涉及一种鱼类致病菌的检测领域，具体涉及一种溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一种革兰氏阴性的嗜盐弧菌，无芽孢、荚膜，是多种海水养殖动物的条件致病菌，如大黄鱼、斜带石斑鱼、鲑点石斑鱼、大菱鲆、褐牙鲆、南美白对虾、贝类、黄鳍鲷、锯缘青蟹等，对海水养殖业造成巨大的经济损失；同时溶藻弧菌可通过海产品感染人类，引起腹泻和食物中毒。因而，溶藻弧菌作为一种影响食品安全及人类健康的病原菌也日益受到关注。
目前对于溶藻弧菌病的防治主要依赖抗生素，而抗生素的大量使用带来了药物残留，病原菌耐药性增加，环境污染等严重问题。因而，对溶藻弧菌的检测和早起诊断显得尤为重要。虽然目前对溶藻弧菌的检测方法有多种，如细菌生化方法、免疫学检测方法（酶联免疫吸附实验，ELISA）、变性高效液相色谱、环介导恒温扩增技术、聚合酶链式反应（PCR）等，但这些方法存在耗时长、操作繁琐、准确率不高、灵敏度低等问题。因此需要建立一种快速、准确、特异性强和灵敏度高的检测方法，尽早对溶藻弧菌进行诊断、监控和预警，以减少该菌所致的病害发生及食品安全危害。
多重PCR检测技术是在一次反应中同时扩增一个模板的不同区域或扩增多个目的片段的PCR技术，具有快速、准确性高、特异性好的特点。而TaqMan探针实时荧光定量PCR技术巧妙地利用了PCR技术的DNA高效扩增，TaqMan探针与DNA模板的高特异性杂交和光谱技术的敏感性及定量分析等优点，克服了常规PCR定性检测特异性差、灵敏度低等不足，目前已经应用于多种鱼类细菌性和病毒性疾病检测中，包括病毒性出血性败血症病毒（viralhemorrhagic septicemia virus, VHSV）、草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus,GCRV)、迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda)、变性假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）、副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）、及嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）。现在将多重PCR与荧光探针定量技术的整合应用，极大地提高检测的准确性、特异性、灵敏度，相较单探针具有更高的准确性和特异性，尤其在鉴别同属近缘不同种细菌时更具优势，克服了单探针法在检测同属近缘细菌时可能存在的假阳性，可实现复杂样品基质中目标病原菌的特异性检测，因而在溶藻弧菌的流行病学调查、溶藻弧菌所致疾病的快速诊断、以及水产品质量安全监测等方面具有广泛的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种所述可特异性检测溶藻弧菌的双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒及其制备方法。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
所述试剂盒包含特异性检测溶藻弧菌的引物和探针，根据已公开的溶藻弧菌基因组序列，选取溶藻弧菌的rpoS基因（登录号为EU224457）和toxR基因（登录号为KJ579443）作为扩增靶基因，所述可特异性检测溶藻弧菌的引物和探针，其序列如下：
rpoS-F：5’ – CGTGGTTTCCGTTTCTCTACT – 3’；
rpoS-R：5’ – TTTCTTCTGCGGTCGGTTCGT – 3’；
rpoS-Probe：5’ – 6-FAM – CTCGCACGATCCGTCTACCTATCCACG – BHQ1 – 3’；
toxR-F：5’ – CCAGCAGTGGAGTTAGAAGCGA – 3’；
toxR-R：5’ – GCAAACAGGAAGCAGCAGAGAC – 3’；
toxR-Probe：5’ – VIC – CCGACTAAAACTCAGCCGAAGCCAGC – BHQ1 – 3’。
所述溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒设有盒体、操作说明书和检测试剂；操作说明书和检测试剂设在盒体内，所述检测试剂包括裂解液、蛋白酶溶液、抽提液、析出液、洗涤液、溶解液、PCR反应液、阳性对照和阴性对照。
所述溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒的制备方法如下：
1）制备盒体；
2）配制检测试剂：
裂解液：终浓度100 mmol/L EDTA、100 mmol/L pH 8.0 Tris -HCl、1.5 mol/L NaCl、2% CTAB；
蛋白酶溶液：20 mg/mL Proteinase K；
抽提液：苯酚:氯仿:异戊醇体积比=25 : 24 : 1
析出液：异丙醇；
洗涤液：75%乙醇 ；
溶解液：灭菌超纯水；
PCR反应液：每19.5μL PCR反应液含有0.1μL 10mM rpoS-F引物；0.1μL 10mM rpoS-R引物；0.4μL 10mM rpoS-Probe；0.1μL 10mM toxR-F引物；0.1μL 10mM toxR-R引物；0.4μL10mM toxR-Probe； 10μL Premix Ex Taq（Probe qPCR）（购自中国大连宝生物公司）；8.3μL双蒸水；
阴性对照：灭菌超纯水；
阳性对照：重组质粒pMD18-rpoS和重组质粒pMD18-toxR混合液（每种重组质粒浓度均为1×108拷贝/μL）。
3）将操作说明书、裂解液、蛋白酶溶液、抽提液、洗涤液、析出液、溶解液、PCR反应液、阳性对照和阴性对照置入盒体内，即得溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒。
在步骤2）中，所述阳性对照的制备方法为：
（1）引物设计，具体方法为：
根据已公开的溶藻弧菌基因组序列，选取溶藻弧菌的rpoS基因（登录号为EU224457）和toxR基因（登录号为KJ579443）作为扩增靶基因，采用Primer Premier 5设计能特异性识别溶藻弧菌的两对引物，其序列如下：
rpoS-F：5’ – CGTGGTTTCCGTTTCTCTACT – 3’
rpoS-R：5’ – TTTCTTCTGCGGTCGGTTCGT – 3’
toxR-F：5’ – CCAGCAGTGGAGTTAGAAGCGA – 3’
toxR-R：5’ – GCAAACAGGAAGCAGCAGAGAC – 3’
（2）重组质粒pMD18-T-rpoS和pMD18-T-toxR的构建,具体步骤为：
分别使用rpoS基因和toxR基因引物，以溶藻弧菌的DNA样品为模板，经过PCR反应，分别获得一段181 bp的rpoS基因目的片段和174 bp的toxR基因目的片段，然后分别将PCR产物使用Gel Extraction Kit试剂盒（OMEGA，USA）胶回收后连接到pMD18-T载体（TaKaRa,Dalian, China）上，转化至Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞（TransGenBiotech，China）中，筛选阳性克隆并测序验证；
（3）阳性对照的制备
提取构建好的pMD18-T-rpoS和pMD18-T-toxR质粒，再用分光光度计检测质粒的质量和浓度，按照如下公式计算出目的基因的拷贝数，然后用灭菌超纯水将两种质粒浓度分别稀释为2×108拷贝/μL，再将两种质粒按照体积比1﹕1混合均匀，即得pMD18-T-rpoS和pMD18-T-toxR质粒混合液作为阳性对照（每种重组质粒浓度均为1×108拷贝/μL）。
Figure 181694DEST_PATH_IMAGE001
。
本发明的优点在于：
利用溶藻弧菌两个基因的保守序列分别设计一对引物，优化PCR反应条件和反应体系，建立起检测溶藻弧菌的双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，在此基础上组装出简便、快速、特异性强、灵敏度高的溶藻弧菌检测试剂盒，该试剂盒对质粒的检测下限为5×101拷贝数/μL，对细菌纯培养物的检测下限为1.8×102 cfu/mL，灵敏度显著高于其他方法，适用于溶藻弧菌的流行病学调查、溶藻弧菌所致疾病的快速诊断、以及水产品质量安全监测等方面，具有广泛的实用价值。
本发明提供了一种特异性强和灵敏度高的溶藻弧菌检测试剂盒，试剂齐全，操作简单，为溶藻弧菌的流行病学调查、所致疾病的快速诊断以及水产品质量安全监测提供了有效的检测手段。
附图说明
图1是溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒横截面剖视图（即盒内设置的组成及位置示意图）。在图1中，各标记为：1：盒体、2：裂解液、3：抽提液、4：溶解液、5：PCR反应液、6：操作说明书、7：析出液、8：洗涤液、9：阳性对照、10：蛋白酶溶液、11：阴性对照。
图2和图3分别为实施例1 rpoS基因和toxR基因的引物特异性实验电泳图。在图2和图3中，M为1000 bp分子量marker（Takara，China）；1：坎氏弧菌；2：无乳链球菌；3：铜绿假单胞菌；4：嗜水气单胞菌；5：副溶血弧菌；6：哈维氏弧菌；7：变形假单胞菌；8：溶藻弧菌；9：希瓦氏菌；10：诺卡氏弧菌；11：停乳链球菌；12：恶臭假单胞菌；13：荧光假单胞菌；14：空白对照。
图4为利用rpoS基因和toxR基因的引物和探针进行的标准品实时荧光定量PCR扩增标准曲线。1～8分别是浓度为5×107，5×106，5×105，5×104，5×103，5×102，5×101，5×100拷贝/μL的质粒。
图5为实施例2灵敏度检测实验图，1～8为5×107，5×106，5×105，5×104，5×103，5×102，5×101，5×100拷贝/μL的阳性对照的扩增曲线，9为阴性对照。
图6为实施例2灵敏度检测实验图。1～6分别是浓度为1.8×107，1.8×106，1.8×105，1.8×104，1.8×103，1.8×102 cfu/μL的菌液，7为阴性对照。
图7为实施例3初步应用实验图。1～8为采集到的不同样品。
具体实施方式
一、设计引物及进行引物筛选
根据已公开的溶藻弧菌的rpoS基因（登录号为EU224457）和toxR基因（登录号为KJ579443）进行分析设计，采用Primer Premier 5设计能特异性鉴别溶藻弧菌的两对引物，引物由上海生工公司合成：
rpoS-F：5’ – CGTGGTTTCCGTTTCTCTACT – 3’
rpoS-R：5’ – TTTCTTCTGCGGTCGGTTCGT – 3’
toxR-F：5’ – CCAGCAGTGGAGTTAGAAGCGA – 3’
toxR-R：5’ – GCAAACAGGAAGCAGCAGAGAC – 3’
二、常规PCR检测体系确定引物特异性
分别使用坎氏弧菌、无乳链球菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、变形假单胞菌、溶藻弧菌、希瓦氏菌、诺卡氏弧菌、停乳链球菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌的DNA作为模板，并用灭菌超纯水作为无模板空白对照，经过普通PCR反应，琼脂糖凝胶电泳观察所得到的PCR产物。结果只有在溶藻弧菌基因组中能扩增出来181 bp和174 bp的目的片段，其序列见表1，其他菌株均未扩增出目的片段（如图2和图3所示），表明引物的特异性好。其反应程序如下：
DNA模板 2 μL
rpoS-F/toxR-F引物 1 μL
rpoS-R/toxR-R引物 1 μL
dNTP混合物, 每种dNTP浓度为2.5 mM 4 μL
10× PCR缓冲液 5 μL
Taq DNA聚合酶 1 μL
灭菌去离子水 36 μL
PCR程序为：94ºC 5 min；94ºC 30 s，63ºC 30 s，72ºC 20 s，35个循环；72ºC 10 min。
表1 基因序列
Figure DEST_PATH_IMAGE003
三、重组质粒pMD18-T-rpoS和pMD18-T-toxR的构建
利用设计优化好的溶藻弧菌rpoS基因和toxR基因引物，以溶藻弧菌的DNA样品作为模板，按照普通PCR检测体系反应，然后将PCR产物琼脂糖凝胶电泳，并使用Gel ExtractionKit试剂盒（OMEGA，USA）分别将181bp和174bp的目的片段切胶回收后连接到pMD18-T载体（TaKaRa, Dalian, China）上，转化至Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞（TransGen Biotech，China）中，筛选阳性克隆并测序验证
四、阳性对照的制备
提取构建好的pMD18-T-rpoS和pMD18-T-toxR质粒，再用分光光度计检测质粒的质量和浓度，按照如下公式计算出目的基因的拷贝数，然后用灭菌超纯水将两种质粒浓度分别稀释为2×108拷贝/μL，再将两种质粒按照体积比1﹕1混合均匀，即得pMD18-rpoS和pMD18-toxR质粒混合液作为阳性对照（每种重组质粒浓度均为1×108拷贝/μL）。
五、设计TaqMan探针
根据重组质粒阳性克隆的测序序列结果，利用Primer Premier 5设计满足以下要求的探针：①首字母不能为“G”；②尽量不要出现连续≥3的“G”；③一般尽量“C”碱基含量>“G”碱基，A、T、C、G含量均匀，GC含量在40%～60%；④探针长度尽量≤27bp，最好不要超过30bp，Tm值比引物≥10ºC，探针由上海生工公司合成：
rpoS-Probe：5’ – 6-FAM – CTCGCACGATCCGTCTACCTATCCACG – BHQ1 – 3’
toxR-Probe：5’ – VIC – CCGACTAAAACTCAGCCGAAGCCAGC – BHQ1 – 3’
六、灵敏度检测实验
将阳性对照质粒（pMD18-T-rpoS和pMD18-T-toxR质粒的混合液）按1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝数/μL系列稀释，同时采用平板计数测定溶藻弧菌的原始菌液浓度，再按照10倍梯度稀释，提取1mL各个梯度的细菌DNA，各取0.5μL做模板，在荧光PCR仪上进行扩增反应。
七、溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒的制备：
1. 制备盒体；
2. 配制检测试剂：
裂解液： 100 mmol/L EDTA、100 mmol/L pH 8.0 Tris -HCl、1.5 mol/L NaCl、2%CTAB；
蛋白酶溶液：20 mg/mL Proteinase K；
抽提液：苯酚:氯仿:异戊醇体积比=25 : 24 : 1
析出液：异丙醇；
洗涤液：75%乙醇；
溶解液：灭菌超纯水；
PCR反应液：每19.5μL PCR反应液含有0.1μL 10mM rpoS-F引物；0.1μL 10mM rpoS-R引物；0.4μL 10mM rpoS-Probe；0.1μL 10mM toxR-F引物；0.1μL 10mM toxR-R引物；0.4μL10mM toxR-Probe； 10μL Premix Ex Taq（Probe qPCR）（购自中国大连宝生物公司）；8.3μL双蒸水；
阴性对照：灭菌超纯水；
阳性对照：重组质粒pMD18-rpoS和重组质粒pMD18-toxR混合液（每种重组质粒浓度均为1×108拷贝/μL）。
八、将操作说明书6、裂解液2、抽提液3、溶解液4、PCR反应液5、析出液7、洗涤液8、阳性对照9、蛋白酶溶液10、阴性对照11置入盒体1内（参见图1），即得溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒。
九、溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂的应用如下：
1. 将采集到的样品放到离心管中，加入1mL 2号管中裂解液后匀浆组织。
2. 加入20 μL 11号管中的蛋白酶溶液，充分混匀，于56℃放置，直至组织完全溶解。
3. 加入等体积的3号管中的抽提液，混匀，12000 r/min离心5min。
4. 转移上层溶液至新的离心管中，再加入等体积的3号管中的抽提液，混匀，12000 r/min离心5min。
5. 转移上层溶液至新的离心管中，加入0.7倍体积的7号管中的析出液，充分颠倒混匀，12000 r/min离心2min，弃上清。
6. 加入8号管的洗涤液，吹打混匀，12000 r/min离心2min，弃上清，重复2次。
7. 倒置离心管，干燥5min，加入20 μL 4号管的溶解液，充分混匀。然后吸取0.5 μL和19.5 μL 8号管的PCR反应液混合，进行实时荧光定量PCR反应。PCR反应参数设置为：先95℃预处理1 min，进行40个循环反应，每个循环包括每个循环包括95℃ 15 s，63℃ 30 s，72℃ 30 s，于72℃时测定荧光值。9号管的阳性对照和10号管的阴性对照不需要处理，直接取0.5 μL进行后续PCR反应，反应条件与前面样品检测相同。
8. 结果判定：阳性对照和阴性对照成立的前提下，若两个待测基因都出现扩增反应曲线，且Ct＜35，则判断为阳性；若35≤Ct≤40，判断为可疑，可以加大模板量，重复扩增，如果得到相同的实验结果，则判断为阳性，否则为阴性；若两个待测基因均未出现扩增反应曲线或只有单个待测基因出现扩增反应曲线，以及如果Ct＞40，则判断为阴性。
备注：试剂盒不使用时，5、9、11和10号试剂-20℃保存，3号试剂4℃保存，其它室温保存，开封后，应在6个月内用完。
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例1引物的特异性实验
为了确定该双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒的两对引物的特异性，分别使用坎氏弧菌、无乳链球菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、变形假单胞菌、溶藻弧菌、希瓦氏菌、诺卡氏弧菌、停乳链球菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌的DNA作为模板，无菌超纯水为无模板空白对照，使用建立的常规PCR检测，实验结果显示：只有溶藻弧菌能扩增出来181 bp和174 bp的目的片段，其他菌株均未扩增出目的片段（如图2和图3），这表明所设计引物具有较好的特异性，可用于溶藻弧菌的特异性检测。
实施例2 灵敏度检测实验
将阳性对照质粒（pMD18-T-rpoS和pMD18-T-toxR质粒的混合液）按1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝数/μL系列稀释，同时采用平板计数测定溶藻弧菌的原始菌液浓度，再按照10倍梯度稀释，提取1mL各个梯度的细菌DNA，各取0.5μL做模板，在荧光PCR仪上进行扩增反应，结果显示每个反应管内两个待测基因的荧光信号达到阈值所需的循环数（Ct）和起始模板拷贝数的对数存在明显的线性关系（rpoS：R2=0.996，toxR：R2=0.997）（如图4），对质粒的检测下限为5×101拷贝数/μL（如图5），对细菌纯培养物的检测下限为1.8×102 cfu/mL（如图6）。
实施例3检测应用实验
利用本研究所建立的方法对海水网箱养殖鱼类样品进行检测
为了验证建立的双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，我们对采集的鱼类样品进行了检测分析，结果可准确地检测到溶藻弧菌的存在，与采用传统的培养基分离细菌方法所得到的结果一致（如图7）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒及其制备方法
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<170> PatentIn version 3.3
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cgtggtttcc gtttctctac t 21
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<213> 人工序列
<400> 5
gcaaacagga agcagcagag ac 22
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccgactaaaa ctcagccgaa gccagc 26
<210> 7
<211> 181
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgtggtttcc gtttctctac ttacgcaacg tggtggatcc gacaaacgat agagcgagcg 60
ttgatgaacc aaactcgcac gatccgtcta cctatccacg tagtgaaaga gctgaacatt 120
tatctgcgta ctgcgcgtga actttctcaa aagctcgatc acgaaccgac cgcagaagaa 180
a 181
<210> 8
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccagcagtgg agttagaagc gagcgataca ccaccaacag agatagtgac cgatactact 60
gctgatcttg agcctcaagt agagccgact aaaactcagc cgaagccagc atctaacacg 120
attaactggc taccgcgtgt cattatcttt ttgtctctgc tgcttcctgt ttgc 174

Claims (4)

1.一种溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括了特异性检测溶藻弧菌的引物和探针，具体序列如下：
rpoS-F：5’ – CGTGGTTTCCGTTTCTCTACT – 3’；
rpoS-R：5’ – TTTCTTCTGCGGTCGGTTCGT – 3’；
rpoS-Probe：5’ – 6-FAM – CTCGCACGATCCGTCTACCTATCCACG – BHQ1 – 3’；
toxR-F：5’ – CCAGCAGTGGAGTTAGAAGCGA – 3’；
toxR-R：5’ – GCAAACAGGAAGCAGCAGAGAC – 3’；
toxR-Probe：5’ – VIC – CCGACTAAAACTCAGCCGAAGCCAGC – BHQ1 – 3’。
2.一种如权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）制备盒体；
2）配制检测试剂：
裂解液：终浓度100 mmol/L EDTA、100 mmol/L pH 8.0 Tris -HCl、1.5 mol/L NaCl、2% CTAB；
蛋白酶溶液：20 mg/mL Proteinase K；
抽提液：苯酚:氯仿:异戊醇体积比=25 : 24 : 1
析出液：异丙醇；
洗涤液：75%v/v乙醇 ；
溶解液：灭菌超纯水；
PCR反应液：每19.5μL PCR反应液含有0.1μL 10mM rpoS-F引物；0.1μL 10mM rpoS-R引物；0.4μL 10mM rpoS-Probe；0.1μL 10mM toxR-F引物；0.1μL 10mM toxR-R引物；0.4μL10mM toxR-Probe； 10μL Premix Ex Taq；8.3μL双蒸水；
阴性对照：灭菌超纯水；
阳性对照：重组质粒pMD18-rpoS和重组质粒pMD18-toxR混合液，每种重组质粒浓度均为1×108拷贝/μL；
3）将操作说明书、裂解液、蛋白酶溶液、抽提液、洗涤液、析出液、溶解液、PCR反应液、阳性对照和阴性对照置入盒体内，即得溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述阳性对照的制备方法为：
（1）利用设计优化好的溶藻弧菌rpoS基因和toxR基因引物，以溶藻弧菌的DNA样品作为模板，按照普通PCR检测体系反应，然后将PCR产物琼脂糖凝胶电泳，并使用Gel ExtractionKit试剂盒将目的片段切胶回收后分别连接到pMD18-T载体上，转化至Trans1-T1 PhageResistant化学感受态细胞中，筛选阳性克隆并测序验证；
（2）提取构建好的pMD18-T-rpoS和pMD18-T-toxR质粒，再用分光光度计检测质粒的质量和浓度，按照如下公式计算出目的基因的拷贝数，然后用灭菌超纯水将两种质粒浓度分别稀释为2×108拷贝/μL，再将两种质粒按照体积比1﹕1混合均匀，即得pMD18-rpoS和pMD18-toxR质粒混合液作为阳性对照（每种重组质粒浓度均为1×108拷贝/μL）。
4.一种利用权利要求1所述的试剂盒判定溶藻弧菌的方法，其特征在于，具体为：阳性对照和阴性对照成立的前提下，若两个待测基因都出现扩增反应曲线，且Ct＜35，则判断为阳性；若35≤Ct≤40，判断为可疑，可以加大模板量，重复扩增，如果得到相同的实验结果，则判断为阳性，否则为阴性；若两个待测基因均未出现扩增反应曲线或只有单个待测基因出现扩增反应曲线，以及如果Ct＞40，则判断为阴性。
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