CN113249499B

CN113249499B - 一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用

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Publication number: CN113249499B
Application number: CN202110215553.9A
Authority: CN
Inventors: 王伟佳; 董谦; 陈康; 王鑫杰; 刘鹏; 谢晋烨; 李洋; 耿逸云; 刘馨怡; 王娟; 冯砚平
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-02-26
Filing date: 2021-02-26
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2041-02-26
Also published as: JP7374377B2; WO2022179494A1; US20240084402A1; CN113249499A; JP2023530205A

Abstract

本发明公开了一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用，检测试剂盒，包括：扩增引物、crRNA、LbCas12a‑RR蛋白和单链DNA报告系统；crRNA为针对伤寒沙门氏菌flag基因检测区段的特异性crRNA；LbCas12a‑RR蛋白表达的序列为以Cas12蛋白核酸序列进行原核密码子优化，并对532和595位氨基酸分别进行突变为G532R和K595R后的序列；试剂盒的应用，为将伤寒沙门氏菌的检测试剂盒用于伤寒沙门氏菌的核酸检测；该试剂盒灵敏度高、特异性强、快速可视化。

Description

一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用，属于微生物检测技术领域。

背景技术

肠沙门菌伤寒血清型(S.Typhi)是一种人类宿主限制性病原体，其引起的伤寒仍然是一个重大的公共卫生问题。据估计，全球每年约1090万人感染伤寒，近10万人因此死亡，其中儿童的感染率最高。伤寒沙门氏菌主要通过被粪便污染的水或食物传播。当患者摄入被污染的食物或水后，伤寒沙门氏菌会侵入肠道粘膜并扩散至全身，引起高热、肝脾肿大、皮疹等急性症状。由于伤寒沙门氏菌引起的症状和体征是非特异性的，很难直接通过临床症状进行诊断，因此，实验室检查对于诊断至关重要。

目前实验室用于伤寒诊断的金标准是仍然是细菌分离培养，但是受血液中细菌数量及抗菌药使用的影响，血液培养的阳性率低于骨髓培养。但抽取骨髓会增加患者诊治过程中的感染风险，而且分离培养耗时较长，不利于早期诊断。因而，最常见的诊断方法是血清学的肥达实验。但此实验与其他感染性病原存在严重的交叉反应，如疟疾、登革热、布鲁氏菌病等等，容易产生假阳性结果，导致误诊率增加，而且肥达反应的滴度也因地区和年龄不同而差异很大。因而，在没有详细的背景资料时，单纯的血清学诊断是不准确的，不具有诊断意义。ELISA方法相较于肥达反应来说是一种既灵敏又特异的诊断方法，有文献指出ELISA在检测抗体方面的优势，提出ELISA可以代替肥达反应来监测血清抗体。目前市场上有一些商品化的抗体检测试剂盒，包括Tubex test、Typhidot/Typhidot-M、IgM Dipstick，这些试剂盒均以检测IgM为目的，也有着血清学方法的共同缺点，即交叉反应强烈。因而血清学检测对目前使用的抗原尚争议，需要寻找特异性抗原。除了细菌分离培养和血清学检测，核酸检测是目前公认最为敏感和特异的诊断方法。通过PCR进行核酸检测的最大优势是当培养的结果为阴性时，PCR把微量的核酸片段放大，捕捉到细菌的踪迹。但是PCR方法也有一定的缺陷，首先，容易污染；其次，抗生素的滥用加剧了血液中细菌数量的减少，增加了制备样品DNA模板的难度；再次，由于沙门菌属基因组90％以上是相似的，只有个别的碱基差异，因此目前的PCR是多重PCR，但这样复杂的扩增不如在基因组中发掘更多的独有基因。

虽然，准确的诊断对于确保患病者得到及时的医疗护理和适当的治疗至关重要。然而，鉴于沙门氏菌生物体独特的挑战性，数年来国际上一直在开发旨在提高成本效益并快速提供准确结果的新诊断工具。在2020年第11届国际伤寒和其他沙门氏菌病会议上提出了通过监测环境中沙门氏菌病原体数量来取代临床监测的新思路。因此，开发快速、高效、便捷的伤寒沙门氏菌检测方法尤为重要。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒，该试剂盒灵敏度高、特异性强、快速可视化。

本发明的第二个目的在于提供上述伤寒沙门氏菌的检测试剂盒的制备方法，该制备方法简单快捷，适合工业化生产。

本发明的第三个目的在于提供伤寒沙门氏菌的检测试剂盒的应用，将伤寒沙门氏菌的检测试剂盒用于伤寒沙门氏菌的核酸检测，实现快速可视化检测。

实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒，包括：扩增引物、crRNA、LbCas12a-RR蛋白和单链DNA报告系统；

crRNA为针对伤寒沙门氏菌flag基因检测区段的特异性crRNA；

LbCas12a-RR蛋白表达的序列为以Cas12蛋白核酸序列进行原核密码子优化，并对532和595位氨基酸分别进行突变为G532R和K595R后的序列。

进一步地，扩增引物包括flag-RPA-F2和flag-RPA-R1，flag-RPA-F2的序列如SEQID NO.1所示，flag-RPA-R1的序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，crRNA包括flag-crRNA1和flag-crRNA3；flag-crRNA1的序列如SEQ IDNO.3所示，flag-crRNA3的序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，单链DNA报告系统包括单链DNA FQ reporter；单链DNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的单链DNA，标记产物为：/56FAM/TTTATTT/3BHQ1/。

实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒的制备方法，检测试剂盒包括扩增引物、crRNA、LbCas12a-RR蛋白和单链DNA报告系统；其制备方法包括：

扩增引物制备步骤：设计包含crRNA的扩增引物；

crRNA制备步骤：针对伤寒沙门氏菌flag基因，寻找包含LbCas12a-RR识别序列TTTN或/和TCTN的靶向序列，设计并制备crRNA；

LbCas12a-RR蛋白制备步骤：针对Cas12蛋白核酸序列进行原核密码子优化并对532和595位氨基酸分别进行突变为G532R和K595R，得到LbCas12a-RR蛋白表达的序列；然后构建到pET28a表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得LbCas12a-RR蛋白。

进一步地，扩增引物的长度为30-37bp。

进一步地，crRNA制备步骤中，crRNA的长度为23bp。

实现本发明的第三个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒的应用，将伤寒沙门氏菌的检测试剂盒用于伤寒沙门氏菌的核酸检测；检测试剂盒包括扩增引物、crRNA、LbCas12a-RR蛋白和单链DNA报告系统；

伤寒沙门氏菌的核酸检测包括：

扩增步骤：将扩增引物加入重组酶聚合酶扩增技术体系，以扩增待测样品的核酸，得到扩增产物；

检测步骤：将扩增产物加入包括crRNA、LbCas12a-RR蛋白和单链DNA报告系统的检测体系并进行反应，得到检测产物，用荧光检测法进行检测，得到结果。

进一步地，扩增步骤中，在温度为37℃的条件下扩增30min，得到扩增产物；检测步骤中，反应的条件为温度37℃，反应时间25min，得到检测产物。

进一步地，检测步骤中，荧光检测法为：使用酶标仪测量检测反应的荧光数值，设定检测激发光为485-520nm；或将检测产物置于485nm波长的光源下，直接观察。

本发明的设计原理如下：

CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫系统，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，CRISPR-Cas12a于Cas酶第二家族，用来引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域。Cas12酶识别富含胸腺嘧啶(Thymine，T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)，催化它们自身的指导CRISPR RNA(crRNA)成熟，并特异性识别和切割互补配对的双链DNA(dsDNA)。当CRISPR/Cas12蛋白以序列特异性方式识别切割靶双链DNA时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性，与ssDNA偶联的荧光报告分子在切割时产生荧光信号。本发明试剂盒基于Cas12上述特性，可以快速准确检测临床标本中伤寒沙门菌核酸。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明的检测试剂盒灵敏度高、特异性强、快速可视化，可用于伤寒沙门氏菌核酸快速检测；

2、本发明的检测试剂盒crRNA根据LbCas12a-RR识别特定PAM序列特点，在flag基因靶序列上设计的特异性crRNA，具有高效的特异性；

3、本发明的检测试剂盒LbCas12a-RR蛋白表达的序列经优化和突变，可识别除TTTN以外的TCTN靶向序列；

4、本发明的检测试剂盒的应用可实现荧光灯下肉眼直接可视检测，能实现方便快捷的结果判读，检测准确、快速、简便；便用于基层实验和临床一线对伤寒沙门氏菌的基层快速检测和鉴定诊断；

5、本发明的检测试剂盒的应用方式特异性强、耗时短、高通量、不依赖大型实验设备。

附图说明

图1为检测步骤示意图；

图2为实施例2crRNA的酶标仪测量的荧光检测结果；

图3为实施例2crRNA的肉眼观察的荧光检测结果；

图4为实施例3crRNA的酶标仪测量的荧光检测结果；

图5为实施例3crRNA的肉眼观察的荧光检测结果；

图6为实施例4crRNA的酶标仪测量的荧光检测结果；

图7为实施例4crRNA的肉眼观察的荧光检测结果；

图8为实施例5crRNA的酶标仪测量的荧光检测结果；

图9为实施例5crRNA的肉眼观察的荧光检测结果；

图10为实施例6crRNA的酶标仪测量的荧光检测结果；

图11为实施例6crRNA的肉眼观察的荧光检测结果。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒，包括：扩增引物、crRNA、LbCas12a-RR蛋白和单链DNA报告系统；

扩增引物包括flag-RPA-F2和flag-RPA-R1，flag-RPA-F2的序列如SEQ ID NO.1所示，flag-RPA-R1的序列如SEQ ID NO.2所示；

crRNA为针对伤寒沙门氏菌flag基因检测区段的特异性crRNA；crRNA包括flag-crRNA1和flag-crRNA3(等比例混合)；flag-crRNA1的序列如SEQ ID NO.3所示，flag-crRNA3的序列如SEQ ID NO.4所示；

LbCas12a-RR蛋白表达的序列为以Cas12蛋白核酸序列进行原核密码子优化(优化以常规软件进行)，并对532和595位氨基酸分别进行突变为G532R和K595R后的序列；

单链DNA报告系统包括单链DNA FQ reporter；单链DNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素(6-FAM)和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的单链DNA，标记产物为：/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/，命名为ssDNA FQ reporter/56FAM/TTTATTT/3BHQ1/。

上述伤寒沙门氏菌的检测试剂盒的制备方法，包括：

扩增引物制备步骤：设计包含crRNA的扩增引物，扩增引物的长度为30-37bp；

crRNA制备步骤：针对伤寒沙门氏菌flag基因(序列SEQ ID NO.5)，寻找包含LbCas12a-RR识别序列(PAM)TTTN和TCTN的靶向序列，设计并制备长度为23bp的crRNA；

LbCas12a-RR蛋白制备步骤：针对Cas12蛋白核酸序列进行原核密码子优化并对532和595位氨基酸分别进行突变为G532R和K595R，得到LbCas12a-RR蛋白表达的序列，如SEQ ID NO.6所示，LbCas12a-RR蛋白经改造后，识别区域扩大了，既可以识别TTTN也可以识别TCTN；然后构建到pET28a表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得LbCas12a-RR蛋白。

上述伤寒沙门氏菌的检测试剂盒的应用，为将伤寒沙门氏菌的检测试剂盒用于伤寒沙门氏菌的核酸检测，检测步骤如图1所示，包括：

扩增步骤：将扩增引物加入重组酶聚合酶扩增技术(RPA)体系，以扩增待测样品的核酸，扩增的条件为温度为37℃，时间30min，得到扩增产物；

检测步骤：将扩增产物加入CRISPR/Cas12a检测体系(CRISPR/Cas12a检测体系包括crRNA、LbCas12a-RR蛋白和单链DNA报告系统)并进行反应，反应的条件为温度37℃，反应时间25min，得到检测产物，用荧光检测法进行检测，得到结果；其中，荧光检测法可使用酶标仪测量检测反应的荧光数值，设定检测激发光为485-520nm；或将检测产物置于485nm波长的光源下，直接观察。

在使用荧光检测时，当检测体系中存在伤寒沙门氏菌核酸，会由在伤寒沙门氏菌特异性crRNA介导下特异性激活LbCas12a-RR蛋白的核酸内切酶活性。激活后的LbCas12a-RR蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA FQ reporter，从而释放激活荧光基团，使用酶标仪可以检测到荧光读数或肉眼可见绿色反应。相对应的，待检测样品中不存在伤寒沙门氏菌核酸时，不会有荧光读数或肉眼不可见绿色反应。

实施例1：

伤寒沙门氏菌的核酸制备：

伤寒沙门氏菌的flag基因片段，根据NCBI CMCC50071菌株序列设计扩增引物，由南京金斯瑞公司合成，命名为flag-PCR-F和flag-PCR-R，对应序列分别为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。

通过PCR制备伤寒沙门氏菌的flag基因对应的DNA核酸样品。具体操作如下：从疾控中心获得伤寒沙门氏菌的标准菌株(CMCC50071)，对菌株进行复苏扩增，使用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN天根)进行细菌基因组DNA提取。

Max Super-FidelityDNA Polymerase(Vazyme P505)，以伤寒沙门氏菌基因组DNA作为模板扩增对应的flag基因的DNA样品pcS.Typhi-flag。再用MEGAclear试剂盒(Thermo Fisher Scientific赛默飞世尔科技)纯化；检测DNA质量和浓度，并保存在-20℃直至使用。

实施例2：

试剂盒crRNA的制备与检测：

根据LbCas12a-RR识别特定PAM TTTN和TCTN的靶向序列，在flag基因靶序列上设计20条特异性crRNA，序列如表格1所示：

表格1crRNA的设计序列

序列编号	crRNA命名	序列
			SEQ ID NO.3	flag-crRNA1	TCTGCGAATGGTACTAACTCCCAGTCT
SEQ ID NO.9	flag-crRNA2	TCTTTTAAATCAATATCGATAGTTTCA
			SEQ ID NO.4	flag-crRNA3	TTTAAAAGAAATCAGCTCTAAAACACT
SEQ ID NO.10	flag-crRNA4	TTTTAGAGCTGATTTCTTTTAAATCAA
			SEQ ID NO.11	flag-crRNA5	TTTGTCTTCCGGTCTGCGTATCAAC
SEQ ID NO.12	flag-crRNA6	TTTTACCGCGAACATCAAAGGTCTGAC
			SEQ ID NO.13	flag-crRNA7	TTTCACGCCGTTGAACTGAGTCTGGCC
SEQ ID NO.14	flag-crRNA8	TTTTAGCAGTAATTGCACCTGTTTTCT
			SEQ ID NO.15	flag-crRNA9	TTTGAGCAACGCCAGTACCATCTGTAT
SEQ ID NO.16	flag-crRNA10	TCTGCGCAATGGAGATACCGTCGTTAG
			SEQ ID NO.17	flag-crRNA11	TCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGCG
SEQ ID NO.18	flag-crRNA12	TCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAA
			SEQ ID NO.19	flag-crRNA13	TCTGGCCGGATACACGGTCGATTTCGT
SEQ ID NO.20	flag-crRNA14	TCTGGGCTGTAATAGGATCTGTACCAT
			SEQ ID NO.21	flag-crRNA15	TCTGTATAAGTAGTGGTTTTAGCAGTA
SEQ ID NO.22	flag-crRNA16	TTTGCGCCACCAAATTTCACAGCTCCA
			SEQ ID NO.23	flag-crRNA17	TTTGGTGGCGCAAATGGTAAATCTGAA
SEQ ID NO.24	flag-crRNA18	TTTGTCAAGGTCGCTTGCTAAGTAAGT
			SEQ ID NO.25	flag-crRNA19	TTTAAGCTCACCGCCTGTTCTGAAGTT
SEQ ID NO.26	flag-crRNA20	TTTCTGCAGTGGGTTTTCAGTCTTATC

依次检测flag-crRNA1～flag-crRNA20的效果。设置CRISPR/Cas12a检测体系如表格2所示，分别在体系中加入1μL flag-crRNA1～flag-crRNA20，其它各组分维持一致，混合均匀，37℃反应25min，得到检测产物。

表格2 CRISPR/Cas12a检测体系(20μL)

成分	用量/样品
		10*Buffer	2μL
Rnase Inhibitors(40U/μL)	1μL
		LbCas12a-RR蛋白(200ng/μL)	1μL
ssDNA FQ reporter(25pmol/μL)	1μL
		crRNA(1nM/μL)	1μL
DNA核酸样品	1μL
		H<sub>2</sub>O(RNA free)	加至体系总量为20μL

利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系的检测活性。使用全波长酶标仪测量检测反应的荧光，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，读取检测25min荧光数值为反应值。针对伤寒沙门氏菌不同，其反应检测结果如图2所示。结果表明，flag-crRNA1和flag-crRNA3能高效特异的检测对应的flag基因片段。

另外，将检测产物，置于在485nm波长的激光灯下，可由肉眼直接进行结果判读。当crRNA特异性识别靶核酸片段后，反应产物颜色由无色变为荧光绿；对应的，如果待检测无对应靶核酸，反应产物颜色仍为无色。如图3所示，flag-crRNA1和flag-crRNA3能高效特异的检测对应的flag基因片段。

实施例3：

试剂盒的扩增引物的制备与检测，设计扩增引物的序列如表格3所示：

表格3扩增引物的设计序列

根据伤寒沙门氏菌的flag基因片段对应DNA核酸样品，计算检测片段分子量，并进行10倍梯度稀释，获得每μL含有1*e4拷贝数(copy/μL)的DNA测试样品；分别将表格3的扩增引物加入重组酶聚合酶扩增技术(RPA)体系(如表格4所示)，以扩增DNA测试样品；

表格4重组酶聚合酶扩增技术(RPA)体系(25μL)

成分	用量/样品
		DNA核酸样品	1μL
ddH<sub>2</sub>O	5μL
		RPA-F	1.25μL
RPA-R	1.25μL
		反应缓冲液	15.5μL
乙酸镁	1μL

将DNA核酸样品、ddH₂O、RPA-F、RPA-R和反应缓冲液加入反应管溶解混匀，然后，加入1μL乙酸镁，扩增的条件为温度为37℃，时间30min，得到扩增产物。

取5μL等温扩增产物，加入到20μL CRISPR/Cas12a检测体系(同表格2，crRNA为以flag-crRNA1和flag-crRNA3等量混合)，混合均匀，37℃反应30min进行荧光结果判读。利用荧光检测判定CRISPR/Cas12a检测体系的检测活性，分别采用酶标仪检测(如图4所示)和荧光肉眼检测(如图5所示)，发现flag-RPA-F2和flag-RPA-R1能高效扩增检测对应的flag基因片段。

选取flag-RPA-F2和flag-RPA-R1作为扩增引物。

实施例4：

伤寒沙门氏菌的核酸检测的高灵敏度检测：

根据伤寒沙门氏菌的flag基因片段对应DNA核酸样品，计算检测片段分子量，并进行10倍梯度稀释，获得每μL含有1*e6、1*e5、1*e4、1*e3、1*e2、1*e1和1*e0拷贝数(copy/μL)的DNA测试样品。

扩增步骤，表格5作为扩增体系：

表格5重组酶聚合酶扩增技术(RPA)体系(25μL)

成分	用量/样品
		DNA测试样品	1μL
ddH<sub>2</sub>O	5μL
		flag-RPA-F2	1.25μL
flag-RPA-R1	1.25μL
		反应缓冲液	15.5μL
乙酸镁	1μL

以扩增待测样品的核酸，扩增的条件为温度为37℃，时间30min，得到扩增产物；

检测步骤：将5μL扩增产物加入如表格6所示的CRISPR/Cas12a检测体系，并进行反应，反应的条件为温度37℃，反应时间25min，得到检测产物。

表格6 CRISPR/Cas12a检测体系(20μL)

成分	用量/样品
		10*Buffer	2μL
Rnase Inhibitors(40U/μL)	1μL
		LbCas12a-RR蛋白(200ng/μL)	1μL
ssDNA FQ reporter(25pmol/μL)	1μL
		crRNA(1nM/μL)	1μL
扩增产物	5μL
		H<sub>2</sub>O(RNA free)	加至体系总量为20μL

采用酶标仪检测，使用全波长酶标仪测量检测反应的荧光，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，读取检测25min荧光数值为反应值，结果如图6所示，可实现对1*e1拷贝细菌核酸的高灵敏度检出；将检测产物置于在485nm波长的激光灯荧光肉眼检测，如图7所示，可实现对1*e1拷贝细菌核酸的高灵敏度检出。

实施例5：

为检测荧光检测法能否对伤寒沙门氏菌进行高特异反应，能否有效区分伤寒沙门氏菌和沙门氏菌其他血清型，进行以下检测。

首先，根据实施例1中针对伤寒沙门氏菌核酸检测区段pcS.Typhi-flag，参照实施例1中的方法，制备沙门氏菌其他血清型对应基因序列DNA样品：pcS.Typhimurium-flag、pcS.London-flag、pcS.Enteritidis-flag、pcS.Weltevreden-flag和pcS.Derby-flag。

其次，参照实施例4，使用每μL含有1*e4拷贝数(copy/μL)的DNA测试样品，经扩增步骤和检测步骤得到检测产物。

使用酶标仪的检测结果如图8所示，肉眼直接检测的结果如图9所示，荧光检测法可高特异性检测伤寒沙门氏菌核酸，而对沙门氏菌其他血清型没有反应。

实施例6：

伤寒沙门氏菌的核酸检测在临床分离的伤寒沙门氏菌菌株：

首先，将临床分离保存的伤寒沙门氏菌菌株进行复苏扩增，用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)进行细菌基因组DNA提取。每个临床菌株的基因组DNA取1μL进行如实施例4的扩增步骤和检测步骤，得到检测产物。

使用酶标仪的检测结果如图10所示，肉眼直接检测的结果如图11所示，荧光检测法可有效对临床分离菌株进行判定。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 王伟佳、袁勇

<120> 一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用

<130> 2021

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 1

tctccattgc gcagaccact gaaggcgcgc tgaacg 36

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 2

tttcggggtg taggcatctt ggacattaag c 31

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 3

tctgcgaatg gtactaactc ccagtct 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 4

tttaaaagaa atcagctcta aaacact 27

<210> 5

<211> 1297

<212> DNA

<213> Salmonella

<400> 5

atggcacaag tcattaatac aaacagcctg tcgctgttga cccagaataa cctgaacaaa 60

tcccagtccg cactgggcac tgctatcgag cgtttgtctt ccggtctgcg tatcaacagc 120

gcgaaagacg atgcggcagg acaggcgatt gctaaccgtt ttaccgcgaa catcaaaggt 180

ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc 240

gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgcg 300

aatggtacta actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac ccagcgcctg 360

aacgaaatcg accgtgtatc cggccagact cagttcaacg gcgtgaaagt cctggcgcag 420

gacaacaccc tgaccatcca ggttggtgcc aacgacggtg aaactatcga tattgattta 480

aaagaaatca gctctaaaac actgggactt gataagctta atgtccaaga tgcctacacc 540

ccgaaagaaa ctgctgtaac cgttgataaa actacctata aaaatggtac agatcctatt 600

acagcccaga gcaatactga tatccaaact gcaattggcg gtggtgcaac gggggttact 660

ggggctgata tcaaatttaa agatggtcaa tactatttag atgttaaagg cggtgcttct 720

gctggtgttt ataaagccac ttatgatgaa actacaaaga aagttaatat tgatacgact 780

gataaaactc cgttggcaac tgcggaagct acagctattc ggggaacggc cactataacc 840

cacaaccaaa ttgctgaagt aacaaaagag ggtgttgata cgaccacagt tgcggctcaa 900

cttgctgcag caggggttac tggcgccgat aaggacaata ctagccttgt aaaactatcg 960

tttgaggata aaaacggtaa ggttattgat ggtggctatg cagtgaaaat gggcgacgat 1020

ttctatgccg ctacatatga tgagaaaaca ggtgcaatta ctgctaaaac cactacttat 1080

acagatggta ctggcgttgc tcaaactgga gctgtgaaat ttggtggcgc aaatggtaaa 1140

tctgaagttg ttactgctac cgatggtaag acttacttag caagcgacct tgacaaacat 1200

aacttcagaa caggcggtga gcttaaagag gttaatacag ataagactga aaacccactg 1260

cagaaaattg atgctgcctt ggcacaggtt gatacac 1297

<210> 6

<211> 3744

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 6

agcaagctgg aaaaatttac caactgctac agcctgagca agaccctgcg tttcaaagcg 60

atcccggttg gcaagaccca ggaaaacatt gacaacaaac gtctgctggt tgaggacgaa 120

aagcgtgcgg aggattataa aggtgtgaag aaactgctgg atcgttacta tctgagcttt 180

atcaacgacg tgctgcacag cattaagctg aaaaacctga acaactacat cagcctgttc 240

cgtaagaaaa cccgtaccga gaaggaaaac aaagagctgg aaaacctgga aatcaacctg 300

cgtaaggaga ttgcgaaggc gttcaagggt aacgagggct acaagagcct gttcaagaaa 360

gatatcatcg aaaccatcct gccggagttc ctggacgata aggacgaaat tgcgctggtt 420

aacagcttca acggttttac caccgcgttc accggcttct ttgataaccg tgagaacatg 480

tttagcgagg aagcgaaaag caccagcatc gcgttccgtt gcattaacga aaacctgacc 540

cgttacatca gcaacatgga cattttcgag aaggttgacg cgatctttga taaacacgag 600

gtgcaggaaa tcaaggagaa aattctgaac agcgactatg atgttgaaga tttctttgag 660

ggtgaattct ttaactttgt tctgacccaa gagggcatcg acgtgtacaa cgcgatcatt 720

ggtggcttcg tgaccgaaag cggcgagaag atcaaaggcc tgaacgagta cattaacctg 780

tataaccaga agaccaaaca aaagctgccg aaatttaagc cgctgtataa gcaggtgctg 840

agcgatcgtg aaagcctgag cttctacggc gagggctata ccagcgacga ggaagttctg 900

gaagtgtttc gtaacaccct gaacaaaaac agcgagatct tcagcagcat taagaaactg 960

gaaaagctgt tcaaaaactt tgacgagtac agcagcgcgg gtatctttgt taagaacggc 1020

ccggcgatca gcaccattag caaagatatc ttcggtgaat ggaacgtgat tcgtgacaag 1080

tggaacgcgg agtatgacga tatccacctg aagaaaaagg cggtggttac cgaaaagtac 1140

gaggacgatc gtcgtaaaag cttcaaaaag attggcagct ttagcctgga acagctgcaa 1200

gagtacgcgg acgcggatct gagcgtggtt gaaaaactga aggagatcat tatccagaag 1260

gttgatgaaa tctacaaagt gtatggtagc agcgagaagc tgttcgacgc ggattttgtt 1320

ctggagaaga gcctgaaaaa gaacgacgcg gtggttgcga tcatgaagga cctgctggat 1380

agcgtgaaaa gcttcgaaaa ctacattaag gcgttctttg gtgaaggcaa agagaccaac 1440

cgtgacgaga gcttctatgg cgattttgtt ctggcgtacg acatcctgct gaaggtggac 1500

cacatctacg atgcgattcg taactatgtt acccaaaaac cgtacagcaa ggataagttc 1560

aagctgtact tccagaaccc gcaattcatg cgtggctggg acaaggataa agagaccgac 1620

tatcgtgcga ccatcctgcg ttacggtagc aagtactatc tggcgattat ggataaaaag 1680

tacgcgaaat gcctgcagaa gatcgacaaa gacgatgtta acggtaacta cgaaaagatc 1740

aactacaagc tgctgccggg cccgaacaag atgctgccgc gagtgttctt tagcaaaaag 1800

tggatggcgt actataaccc gagcgaggac atccaaaaga tctacaagaa cggtaccttc 1860

aaaaagggcg atatgtttaa cctgaacgac tgccacaagc tgatcgactt ctttaaagat 1920

agcattagcc gttatccgaa gtggagcaac gcgtacgatt tcaactttag cgagaccgaa 1980

aagtataaag acatcgcggg tttttaccgt gaggttgagg aacagggcta taaagtgagc 2040

ttcgaaagcg cgagcaagaa agaggtggat aaactggtgg aggaaggtaa actgtacatg 2100

ttccaaatct acaacaagga cttcagcgat aagagccacg gcaccccgaa cctgcacacc 2160

atgtacttca agctgctgtt tgacgaaaac aaccatggtc agatccgtct gagcggtggc 2220

gcggagctgt tcatgcgtcg tgcgagcctg aagaaagagg agctggttgt gcacccggcg 2280

aacagcccga ttgcgaacaa aaacccggat aacccgaaaa agaccaccac cctgagctac 2340

gacgtgtata aggataaacg ttttagcgaa gaccaatacg agctgcacat tccgatcgcg 2400

attaacaagt gcccgaaaaa catcttcaag attaacaccg aagttcgtgt gctgctgaaa 2460

cacgacgata acccgtatgt tatcggtatt gaccgtggcg agcgtaacct gctgtacatc 2520

gtggttgtgg acggtaaagg caacattgtg gaacagtata gcctgaacga gattatcaac 2580

aactttaacg gtatccgtat taagaccgat taccacagcc tgctggacaa aaaggagaag 2640

gaacgtttcg aggcgcgtca gaactggacc agcatcgaaa acattaagga gctgaaagcg 2700

ggctatatca gccaagttgt gcacaagatt tgcgaactgg ttgagaaata cgatgcggtg 2760

atcgcgctgg aggacctgaa cagcggtttt aagaacagcc gtgttaaggt ggaaaagcag 2820

gtttaccaaa agttcgagaa gatgctgatc gataagctga actacatggt ggacaaaaag 2880

agcaacccgt gcgcgaccgg tggcgcgctg aaaggttatc agattaccaa caagttcgaa 2940

agctttaaaa gcatgagcac ccaaaacggc ttcatctttt acattccggc gtggctgacc 3000

agcaaaatcg atccgagcac cggttttgtt aacctgctga agaccaaata taccagcatt 3060

gcggatagca aaaagttcat cagcagcttt gaccgtatta tgtacgtgcc ggaggaagac 3120

ctgttcgagt ttgcgctgga ctataagaac ttcagccgta ccgacgcgga ctacatcaaa 3180

aagtggaaac tgtacagcta tggtaaccgt atccgtattt tccgtaaccc gaaaaagaac 3240

aacgtttttg actgggagga agtgtgcctg accagcgcgt ataaggaact gttcaacaaa 3300

tacggtatca actatcagca aggcgatatt cgtgcgctgc tgtgcgagca gagcgacaag 3360

gcgttctaca gcagctttat ggcgctgatg agcctgatgc tgcaaatgcg taacagcatc 3420

accggtcgta ccgatgttga ttttctgatc agcccggtga aaaacagcga cggcattttc 3480

tacgatagcc gtaactatga agcgcaggag aacgcgattc tgccgaagaa cgcggacgcg 3540

aacggtgcgt ataacatcgc gcgtaaagtt ctgtgggcga ttggccagtt caaaaaggcg 3600

gaggacgaaa agctggataa ggtgaaaatc gcgattagca acaaagaatg gctggagtac 3660

gcgcaaacca gcgttaagca cgagaacctg tacttccaat cccaccacca ccaccaccac 3720

caccaccacc accaccacca ctga 3744

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcacaagtc attaatacaa acagcc 26

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 8

gaagtgtatc aacctgtgcc aagg 24

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 9

tcttttaaat caatatcgat agtttca 27

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 10

ttttagagct gatttctttt aaatcaa 27

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 11

tttgtcttcc ggtctgcgta tcaac 25

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 12

ttttaccgcg aacatcaaag gtctgac 27

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 13

tttcacgccg ttgaactgag tctggcc 27

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 14

ttttagcagt aattgcacct gttttct 27

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 15

tttgagcaac gccagtacca tctgtat 27

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 16

tctgcgcaat ggagataccg tcgttag 27

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 17

tctccattgc gcagaccact gaaggcg 27

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 18

tctgacctcg actccatcca ggctgaa 27

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 19

tctggccgga tacacggtcg atttcgt 27

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 20

tctgggctgt aataggatct gtaccat 27

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 21

tctgtataag tagtggtttt agcagta 27

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 22

tttgcgccac caaatttcac agctcca 27

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 23

tttggtggcg caaatggtaa atctgaa 27

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 24

tttgtcaagg tcgcttgcta agtaagt 27

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 25

tttaagctca ccgcctgttc tgaagtt 27

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 26

tttctgcagt gggttttcag tcttatc 27

<210> 27

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 27

tctccattgc gcagaccact gaaggcgcgc tgaa 34

<210> 28

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 28

cctgcagcgt gtgcgtgaac tggcggttca g 31

<210> 29

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 29

aacctgcagc gtgtgcgtga actggcggtt cag 33

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 30

gcagtttctt tcggggtgta ggcatcttgg ac 32

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 31

tcaacggtta cagcagtttc tttcggggtg 30

<210> 32

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 32

gcagtttctt tcggggtgta ggcatcttgg ac 32

Claims

1.一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒，其特征在于包括：扩增引物、crRNA、LbCas12a-RR蛋白和单链DNA报告系统；

所述crRNA为针对伤寒沙门氏菌flag基因检测区段的特异性crRNA；

所述LbCas12a-RR蛋白表达的序列为以Cas12蛋白核酸序列进行原核密码子优化，并对532和595位氨基酸分别进行突变为G532R和K595R后的序列；所述LbCas12a-RR蛋白表达的序列，如SEQ ID NO.6所示；

所述crRNA包括flag-crRNA1和flag-crRNA3；所述flag-crRNA1的序列如SEQ ID NO.3所示，所述flag-crRNA3的序列如SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1所述的伤寒沙门氏菌的检测试剂盒，其特征在于，所述扩增引物包括flag-RPA-F2和flag-RPA-R1，flag-RPA-F2的序列如SEQ ID NO.1所示，flag-RPA-R1的序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的伤寒沙门氏菌的检测试剂盒，其特征在于，所述单链DNA报告系统包括单链DNA FQ reporter；所述单链DNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的单链DNA，标记产物为：/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/。

4.一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述检测试剂盒包括扩增引物、crRNA、LbCas12a-RR蛋白和单链DNA报告系统；其制备方法包括：

扩增引物制备步骤：设计扩增引物；

crRNA制备步骤：针对伤寒沙门氏菌flag基因，寻找包含LbCas12a-RR识别序列TTTN和TCTN的靶向序列，设计并制备crRNA；所述crRNA包括flag-crRNA1和flag-crRNA3；所述flag-crRNA1的序列如SEQ ID NO.3所示，所述flag-crRNA3的序列如SEQ ID NO.4所示；

LbCas12a-RR蛋白制备步骤：针对Cas12蛋白核酸序列进行原核密码子优化并对532和595位氨基酸分别进行突变为G532R和K595R，得到LbCas12a-RR蛋白表达的序列；所述LbCas12a-RR蛋白表达的序列，如SEQ ID NO.6所示；然后构建到pET28a表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得LbCas12a-RR蛋白。

5.如权利要求4所述的伤寒沙门氏菌的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述扩增引物的长度为30-37bp。