CN116479094A - 一种基于PfAgo结合LAMP扩增一管法同时双靶点检测耐药菌的方法及应用 - Google Patents

一种基于PfAgo结合LAMP扩增一管法同时双靶点检测耐药菌的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于PfAgo结合LAMP扩增一管法同时双靶点检测耐药菌‑耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法及装置，称为STAR。利用所述方法，mecA和nuc基因的靶标被巧妙地转换为FAM和ROX荧光信号。STAR能够同时在一个反应中检测nuc基因和mecA基因。检测限低至10CFU/mL，动态范围为10至107CFU/mL。从提取到信号输出，整个检测可以在65分钟内完成。该方法成功地适用于检测MRSA污染的食物样本和MRSA感染的小鼠。此外，我们设计了一种用于低资源地区的便携式低成本检测设备。这项工作扩大了基于Argonaute的生物传感的检测范围，并提出了一种新的细菌POCT检测平台。

Description

一种基于PfAgo结合LAMP扩增一管法同时双靶点检测耐药菌 的方法及应用
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，尤其是一种基于Argonaute可视化检测耐药菌的方法、装置及其应用，特别是一种基于PfAgo结合LAMP扩增一管法同时双靶点检测耐药菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法及装置，命名为STAR(Simultaneous dual-geneTest ofmethicillin-resistant Staphylococcus aureus based on Argonaute-poweredpoRtable andvisual biosensor)。
背景技术
临床治疗中对抗菌药物的广泛使用导致病原菌耐药性逐年提高，对常见传染病的治疗产生了重大影响。世界卫生组织宣布，微生物耐药性是世界十大公共卫生威胁之一。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是一种对β-内酰胺类药物具有耐药性的革兰氏阳性菌，医院感染和公共感染最重要的病原菌之一，MRSA会导致皮肤、软组织、骨骼和血液中的一系列严重疾病，并可能导致败血症和死亡，其感染的病死率高达63.1％。MRSA于1961年被首次分离和发现，最初仅局限于在医疗机构中传播感染。但到了20世纪80年代，社区获得性MRSA的病例陆续被报道。MRSA已在全球广泛传播，并已成为严重威胁人类健康的病原体之一。近年来，在我国食源性疾病溯源调查中也多次发现MRSA通过食物传播引起了严重的人类感染。MRSA对食品的污染可对广大消费者造成较大安全风险。在多种类食品的调查监测结果显示，MRSA在不同类型的食品中都有发现，其中鲜奶和生肉中MRSA污染率相对较高。食品中MRSA的早期诊断在保证人类健康和确保食品安全方面发挥着至关重要的作用。因此，建立快速、灵敏、可视化、便携化的检测手段对于应对突发性公共卫生事件是非常重要的。
传统的MRSA检测方法主要分为三类：平板培养法、基于PBP2a蛋白的免疫检测、基于mecA基因的核酸扩增方法，但都存在一定的局限性，培养法检测周期长，需要专业的操作人员；免疫检测法依赖于抗原抗体的反应，稳定性和灵敏度低；核酸扩增方法包括PCR、实时荧光定量PCR、数字定量PCR等，虽然灵敏度高，但需要昂贵的仪器和专业人员操作，无法进行现场检测。CRISPR/Cas系统不仅被应用于基因编辑，也被广泛应用于核酸检测领域。尽管基于CRISPR/Cas已经建立了检测MRSA的生物传感策略，且各有优势但是都是基于MRSA的特异性基因mecA的单基因检测，不能严格解释其检测结果的准确性。通过CRISPR已经建立了多重检测方法，一方面，通过蛋白的正交反应，基于多种Cas蛋白的核酸偏好性不同；另一方面，通过反应体系时空的分离实现。然而，由于其复杂的反应成分以及RNA易降解等，可能会出现错误的诊断。
Argonaute是一种核酸引导的核酸内切酶，广泛存在于真核、原核等自然生物体内，可以分为真核Argonaute(eAgo)和原核Argonaute(pAgo)。eAgo在RNA干扰(RNAi)中起着关键作用，pAgo参与宿主防御机制以保护其免受外源核酸入侵。pAgo的识别和切割由DNA或RNA引导，而不限于靶中的PAM序列。目前，嗜热pAgo，如Thermus thermophilusArgonaute(TtAgo)和Pyrooccusfuriosus Argonate(PfAgo)被广泛研究和应用。PfAgo是一种起源于古细菌激烈火球菌的Ago蛋白，在80-99.9℃环境中发挥活性。PfAgo可以利用长度超过14nt的5'磷酸化DNA引导切割单链和双链DNA靶标。通过严格的碱基互补配对原则来识别和切割靶标，是PfAgo实现多重检测的前提。设计不同标记的荧光探针，通过与靶标碱基互补配对，可以实现高特异性的多重检测平台。近年来，由于其可编程性和高特异性，基于嗜热pAgo(例如，PfAgo和TtAgo)的核酸检测技术已被研究和建立，SARS-CoV-2、HPV、甲型/乙型流感病毒以及稀有基因的检测。与CRISPR/Cas系统相比，基于PfAgo的多重检测具有单一蛋白参与、无PAM依赖性和无RNA参与等独特优势。本研究首次利用PfAgo集成LAMP扩增双靶点检测耐药菌，同时具有高灵敏度和高特异性，并开发了一个便携式的3D打印装置可以实现荧光结果的可视化。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种基于Argonaute可视化检测耐药菌的方法、装置及其应用，特别是一种基于PfAgo结合LAMP扩增一管法同时双靶点检测耐药菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种基于PfAgo结合LAMP扩增一管法同时双靶点检测耐药菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待检测菌的基因组；
(2)选择耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的基因组中特异性基因nuc和mecA序列设计用于MRSA检测的LAMP引物；
(3)将混合的LAMP扩增体系放置于65℃孵育30min，得到LAMP扩增产物；
(4)将LAMP扩增产物加入PfAgo反应体系中，在95℃孵育15min，反应结束后通过酶标仪进行荧光值测量，或者将反应管放置于3D检测装置中，获得检测结果；
当双靶标同时存在，与阴性对照组即无靶标的荧光值相比，阳性组即有靶标的双荧光皆有增长，且在302nm紫外照射下为黄色荧光，则证明检测菌为MRSA，否则证明无MRSA。
进一步地，每总体积为25μL的LAMP扩增体系具体如下：
Buffer 2.5μL，10×引物mix-nuc基因扩增2.5μL，10×引物mix-mecA基因扩增2.5μL，dNTPs mix3.5μL，100mM MgSO42μL，BstDNA聚合酶0.5μL，待检测菌的基因组2μL，ddH2O9.5μL；
其中，Buffer成分为：200mM Tris-HCl，pH 8.8，500mM氯化钾，100mM硫酸铵，20mM硫酸镁，质量浓度为1％的Tween-20；
10×引物mix-nuc基因扩增包括：16μM FIP，16μM BIP，2μM F3，2μM B3，4μM LoopF，4μMLoop B；FIP、BIP、F3、B3、Loop F、Loop B的基因序列依次为SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.6；
10×引物mix-mecA基因扩增包括：16μM FIP，16μM BIP，2μM F3，2μM B3，4μM LoopF，4μMLoop B；FIP、BIP、F3、B3、Loop F、Loop B的基因序列依次为SEQ ID NO.7至SEQ IDNO.12；
dNTPs mix包括：10mM dATP，10mM dTTP，10mM dCTP，10mM dGTP，10mM dUTP；
进一步地，所述PfAgo反应体系为：
6μMPfAgo，0.5μM、nuc基因引导DNAs，0.5μM、mecA基因引导DNAs，0.2μM荧光探针A，0.2μM荧光探针B以及反应缓冲液；
其中，nuc基因引导DNAs包括3条相应的引导DNA即guide DNA 1、guide DNA2、guide DNA3，三条guide DNA总浓度为0.5μM，三条guide DNA的摩尔浓度比为1:1:1，三条guide DNA的基因序列依次为SEQ ID NO.21至SEQ ID NO.23；所述荧光探针A的基因序列为SEQ ID NO.24；
mecA基因引导DNAs包括3条相应的引导DNA即guide DNA 1、guide DNA2、guideDNA3，三条guide DNA总浓度为0.5μM，三条guide DNA的摩尔浓度比为1:1:1，三条guideDNA的基因序列依次为SEQ ID NO.25至SEQ ID NO.27；所述荧光探针B的基因序列为SEQ IDNO.28；
所述反应缓冲液的组成为：pH 7.5的HEPES、NaCl和MnCl2的混合液，Hepes-NaOH：NaCl：MnCl2的摩尔比为20：100：0.5；Hepes-NaOH与PfAgo的摩尔比为20：6；
或者，所述荧光探针A为与ssDNAA互补的5’ROX和3’BHQ2双标记；所述荧光探针B为与ssDNA B互补的5’FAM和3’BHQ1双标记。
进一步地，所述方法通过当靶标DNA存在时，PfAgo能够在引导DNA的引导下切割靶标DNA，产生的次级ssDNA，能够作为新的引导DNA与空-PfAgo结合并引导其特异性切割荧光探针，PfAgo的切割是基于严格的碱基互补配对，基于此设计双靶点检测平台。
进一步地，当体系中存在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌时，经过LAMP扩增能够得到nuc扩增子和mecA扩增子，PfAgo在相应的引导DNA的引导下分别切割nuc扩增子和mecA扩增子，得到次级ssDNA A和ssDNAB，作为新的引导DNA分别引导PfAgo切割荧光探针A和荧光探针B，在3D打印装置中能够观察到荧光呈黄色(因ROX红色荧光和FAM绿色荧光同时存在)；当体系中存在非耐药的金黄色葡萄球菌时，经过LAMP扩增仅能够得到nuc扩增子，在相应引导DNA引导PfAgo切割后，得到次级ssDNAA引导PfAgo切割荧光探针A，在3D打印装置观察到的荧光呈红色；当体系中存在除金黄色葡萄球菌外的耐甲氧西林葡萄球菌时，经过LAMP扩增仅能够得到mecA扩增子，在相应引导DNA引导PfAgo切割后，得到次级ssDNAB引导PfAgo切割荧光探针B，在3D打印装置观察到的荧光呈绿色；当体系中不存在以上三种菌时，无扩增子且无荧光探针被切割，3D打印装置中未观察到荧光。
进一步地，所述3D打印装置包括手机支架、紫外透射滤光片、紫外灯管、隔板、外壳、盖子、手机拍照孔、金属加热块、加热模块外壳、温控模块，所述外壳沿水平方向设置，该外壳的纵向一侧上可拆卸紧密相连接设置盖子，该外壳内呈中空的密封状，外壳的中空内部紧密相连接设置隔板，该隔板沿水平方向设置，隔板上方外壳内的中上部紧密相连接设置紫外透射滤光片，该紫外透射滤光片能够透射302nm的光，紫外透射滤光片的上表面上能够放置盛装待检测的反应完毕体系的试管，紫外透射滤光片下方的外壳内相连接设置紫外灯管，紫外灯管间隔设置于隔板上方，紫外透射滤光片上方的外壳顶部上设置手机拍照孔，手机拍照孔外侧的外壳上相连接设置手机支架，该手机支架上能够可拆卸相连接设置手机，且手机的相机镜头能够正对紫外透射滤光片设置；
所述隔板下方的外壳的中空内部设置有金属加热块、加热模块外壳和温控模块，所述金属加热块设置于加热模块外壳内，金属加热块沿水平方向设置，且金属加热块内沿均布间隔制有32个试管放置加热位，试管放置加热位与盛装反应体系的试管的形状相吻合设置，且试管能够与试管放置加热位可拆卸相连接设置，金属加热块能够对设置于试管放置加热位的试管进行加热操作；
所述温控模块通过温控按钮、电源与金属加热块相连接设置，温控模块能够调节金属加热块的加热温度。
进一步地，所述装置还包括温控显示屏，温控显示屏与金属加热块相连接设置，温控显示屏能够显示金属加热块的加热温度；
或者，所述金属加热块自上而下依次通过加热板、隔热垫与加热模块外壳相连接设置，加热模块外壳通过推拉板与外壳可拆卸相连接设置；
或者，所述滤光片通过滤光片固定卡扣与外壳相连接设置；
或者，所述温控模块通过导线与电源相连接设置，导线通过导线导出口9与外部电源相连接设置；
或者，所述外壳的尺寸为226mm×125mm×164mm，所述外透射滤光片的尺寸为200mm×100mm×3mm，所述紫外灯管能够发射302nm的紫外光，4W，且该紫外灯管由电池供电，所述手机支架的尺寸为77mm×25mm×25mm，所述手机拍照孔的直径为18mm；
或者，所述手机支架能够360°自由旋转和自由调整宽度；
或者，所述3D打印装置采用1.8mm黑色聚乳酸(PLA)长丝通过3D打印制成；
或者，所述3D打印装置的使用方法如下：通过按钮调节温度，使金属加热块达到目的温度，可以依次在金属加热块中完成核酸提取、LAMP扩增及PfAgo切割反应，反应结束后，将反应管横放于紫外透射滤光片上表面，打开紫外灯，将智能手机放置在手机支架上，调整手机支架将摄像头对准手机拍照孔，进行拍摄获得检测结果。
进一步地，包括如下步骤：
(1)在LB培养基中接种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA，37℃摇床振荡培养12h，利用磁珠提取法对MRSA基因组进行提取，将基因组加入到LAMP双靶点扩增体系中，将金属加热块设置为65℃孵育30min，得到的扩增产物加入PfAgo体系进行反应，将金属加热块设置为95℃孵育15min；
(2)将得到的不同浓度的MRSA撒入到样品中，利用磁珠提取法提取样品中不同浓度的MRSA基因组，加入到LAMP双靶点扩增体系中，将金属加热块设置为65℃孵育30min，将扩增产物加入到PfAgo体系中进行反应，将金属加热块设置为95℃孵育15min。
(3)反应结束后将反应管置于3D打印装置的紫外透射滤光片中，通过智能手机拍照获得检测结果，并使用App对结果进行采集和分析。
进一步地，所述方法的最低检测限度为10-100CFU/mL，并且能够检测上至107CFU/mL；所述方法的检测时间从核酸提取、LAMP扩增、PfAgo切割及信号输出仅需要65min。
如上所述的方法在检测耐药菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方面中的应用。
本发明取得的优点和有益效果：
1、本发明方法为LAMP-PfAgo进行检测的方法，应用此方法分为核酸提取、核酸扩增、荧光信号读出三部分，即可检出MRSA。
2、本发明建立的检测方法检测限低，最低检测限度为10-100CFU/mL，并且能够检测上至107CFU/mL，检测范围较宽，并且灵敏度高。
3、本发明建立起来的检测方法特异性强，以检测MRSA为例，对于大肠杆菌、酵母菌、根瘤农杆菌等微生物没有明显的荧光信号，证明本发明对于MRSA具有良好的选择性，而不受其他微生物的影响。
4、本发明设计的LAMP-PfAgo检测体系，可以在一管中对双靶点基因同时扩增，并且可以在同一管同时对双靶点产物进行识别和切割，产生双荧光信号。
5、本发明设计的LAMP-PfAgo检测体系，不仅可以准确的检测MRSA，仅需要设计引物序列，以及相应的引导DNA序列，即可用于多重检测其他病原微生物，该检测方法准确，检测范围较宽，方法简单快捷，易操作。
6、本发明设计的3D打印装置，实现对检测所用仪器的集成且构造简单，通过设置可得到不同反应所用的温度区间，并通过紫外透射可以直观的得到荧光结果，根据不同颜色的荧光可以判断检测结果，从而使荧光结果可视化，无需专业仪器设备。
7、本发明建立的方法检测时间短，从核酸提取、LAMP扩增、PfAgo切割及信号输出仅需要65min，优于大部分现有检测技术。
8、经过与其他传统方法的比较，如平板培养和qPCR，本发明设计具有方法简单、快速、灵敏性高等优点，同时本发明极大地缩减了检测成本、缩短了检测时间，因此便于对样品进行大规模快速检测。
9、本发明方法基于Argonaute结合LAMP扩增的检测结果具有高灵敏度和高特异性，提供一种基于PfAgo结合LAMP扩增，并通过便携式设备直观的得到检测结果的技术，使得灵敏、选择性、准确地在现场短时间检测耐药菌成为可能。该方法为精准检测耐药菌提供了一种新的思路。本实验检测的耐药菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
10、本发明方法基于Argonaute，能够高灵敏、高特异检测耐药菌，并通过3D打印装置输出荧光信号，为现场快速灵敏的检测提供了一种可能。
附图说明
图1为本发明中STAR生物传感检测的一种原理示意图；
图2为本发明中的可行性验证分析图；其中，2A：荧光强度图，2B：3D打印装置拍摄图，2C：App采集图2B的RGB值，2D：荧光扫描图，2E：PAGE胶验证Ago切割活性验证图；
图3为本发明中构造的3D打印装置的一种结构连接实物照片图及爆炸图；
图4为本发明中条件优化实验图；其中，4A：PfAgo浓度优化，4B：引导DNA浓度优化，4C：Mn2+浓度优化；
图5为本发明中检测灵敏度实验图；其中，5A：检测金黄色葡萄球菌的灵敏度验证，5B：检测耐甲氧西林葡萄球菌的灵敏度验证，5C：检测MRSA的灵敏度验证，5D：图5A的反应产物经3D打印装置拍摄结果图，5E：图4B的反应产物经3D打印装置拍摄结果图，5F：图5C的反应产物经3D打印装置拍摄结果图，5G：STAR检测MRSA的检测限，5H：通过App读取获得的(5D、5E、5F)图像中不同浓度样品的RGB值；
图6为本发明中特异性验证实验图；
图7为本发明中真实样品检测结果图；其中，7A：鸡蛋样本中MRSA的荧光检测结果，7B：牛奶样本中MRSA的荧光检测结果，7C：生肉样本中MRSA的荧光检测结果，7D：图7A的反应产物经3D打印装置拍摄结果图，7E：图7B的反应产物经3D打印装置拍摄结果图，7F：图7C的反应产物经3D打印装置拍摄结果图；
图8为本发明中重复性和重现性验证图；其中，8A为重复性图，8B重现性图；
图9为本发明中对感染MRSA的小鼠粪便样本检测的时间曲线图；其中，9A：不同时间实验组小鼠和对照组小鼠的粪便样本检出MRSA的FAM荧光结果，9B：不同时间实验组小鼠和对照组小鼠的粪便样本检出MRSA的ROX荧光结果；
图10为本发明中对感染MRSA的小鼠的组织检测结果图；其中，10A：感染MRSA小鼠的组织图，10B：对小鼠组织中MRSA的FAM荧光检测结果，10C：对小鼠组织中MRSA的ROX荧光检测结果；
图11为图3中的3D打印装置的一种结构连接示意图。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
一种基于PfAgo结合LAMP扩增一管法同时双靶点检测耐药菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待检测菌的基因组；
(2)选择耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的基因组中特异性基因nuc和mecA序列设计用于MRSA检测的LAMP引物；
(3)将混合的LAMP扩增体系放置于65℃孵育30min，得到LAMP扩增产物；
(4)将LAMP扩增产物加入PfAgo反应体系中，在95℃孵育15min，反应结束后通过酶标仪进行荧光值测量，或者将反应管放置于3D检测装置中，获得检测结果；
当双靶标同时存在，与阴性对照组即无靶标的荧光值相比，阳性组即有靶标的双荧光皆有增长，且在302nm紫外照射下为黄色荧光，则证明检测菌为MRSA，否则证明无MRSA。
较优地，每总体积为25μL的LAMP扩增体系具体如下：
Buffer 2.5μL，10×引物mix-nuc基因扩增2.5μL，10×引物mix-mecA基因扩增2.5μL，dNTPs mix3.5μL，100mM MgSO42μL，BstDNA聚合酶0.5μL，待检测菌的基因组2μL，ddH2O9.5μL；
其中，Buffer成分为：200mM Tris-HCl，pH 8.8，500mM氯化钾，100mM硫酸铵，20mM硫酸镁，质量浓度为1％的Tween-20；
10×引物mix-nuc基因扩增包括：16μM FIP，16μM BIP，2μM F3，2μM B3，4μM LoopF，4μMLoop B；FIP、BIP、F3、B3、Loop F、Loop B的基因序列依次为SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.6；
10×引物mix-mecA基因扩增包括：16μM FIP，16μM BIP，2μM F3，2μM B3，4μM LoopF，4μMLoop B；FIP、BIP、F3、B3、Loop F、Loop B的基因序列依次为SEQ ID NO.7至SEQ IDNO.12；
dNTPs mix包括：10mM dATP，10mM dTTP，10mM dCTP，10mM dGTP，10mM dUTP；
较优地，所述PfAgo反应体系为：
6μMPfAgo，0.5μM、nuc基因引导DNAs，0.5μM、mecA基因引导DNAs，0.2μM荧光探针A，0.2μM荧光探针B以及反应缓冲液；
其中，nuc基因引导DNAs包括3条相应的引导DNA即guide DNA 1、guide DNA2、guide DNA3，三条guide DNA总浓度为0.5μM，三条guide DNA的摩尔浓度比为1:1:1，三条guide DNA的基因序列依次为SEQ ID NO.21至SEQ ID NO.23；所述荧光探针A的基因序列为SEQ ID NO.24；
mecA基因引导DNAs包括3条相应的引导DNA即guide DNA 1、guide DNA2、guideDNA3，三条guide DNA总浓度为0.5μM，三条guide DNA的摩尔浓度比为1:1:1，三条guideDNA的基因序列依次为SEQ ID NO.25至SEQ ID NO.27；所述荧光探针B的基因序列为SEQ IDNO.28；
所述反应缓冲液的组成为：pH 7.5的HEPES、NaCl和MnCl2的混合液，Hepes-NaOH：NaCl：MnCl2的摩尔比为20：100：0.5；Hepes-NaOH与PfAgo的摩尔比为20：6；
或者，所述荧光探针A为与ssDNAA互补的5’ROX和3’BHQ2双标记；所述荧光探针B为与ssDNA B互补的5’FAM和3’BHQ1双标记。
较优地，所述方法通过当靶标DNA存在时，PfAgo能够在引导DNA的引导下切割靶标DNA，产生的次级ssDNA，能够作为新的引导DNA与空-PfAgo结合并引导其特异性切割荧光探针，PfAgo的切割是基于严格的碱基互补配对，基于此设计双靶点检测平台。
较优地，当体系中存在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌时，经过LAMP扩增能够得到nuc扩增子和mecA扩增子，PfAgo在相应的引导DNA的引导下分别切割nuc扩增子和mecA扩增子，得到次级ssDNAA和ssDNAB，作为新的引导DNA分别引导PfAgo切割荧光探针A和荧光探针B，在3D打印装置中能够观察到荧光呈黄色(因ROX红色荧光和FAM绿色荧光同时存在)；当体系中存在非耐药的金黄色葡萄球菌时，经过LAMP扩增仅能够得到nuc扩增子，在相应引导DNA引导PfAgo切割后，得到次级ssDNAA引导PfAgo切割荧光探针A，在3D打印装置观察到的荧光呈红色；当体系中存在除金黄色葡萄球菌外的耐甲氧西林葡萄球菌时，经过LAMP扩增仅能够得到mecA扩增子，在相应引导DNA引导PfAgo切割后，得到次级ssDNAB引导PfAgo切割荧光探针B，在3D打印装置观察到的荧光呈绿色；当体系中不存在以上三种菌时，无扩增子且无荧光探针被切割，3D打印装置中未观察到荧光。
较优地，所述3D打印装置包括手机支架、紫外透射滤光片、紫外灯管、隔板、外壳、盖子、手机拍照孔、金属加热块、加热模块外壳、温控模块，所述外壳沿水平方向设置，该外壳的纵向一侧上可拆卸紧密相连接设置盖子，该外壳内呈中空的密封状，外壳的中空内部紧密相连接设置隔板，该隔板沿水平方向设置，隔板上方外壳内的中上部紧密相连接设置紫外透射滤光片，该紫外透射滤光片能够透射302nm的光，紫外透射滤光片的上表面上能够放置盛装待检测的反应完毕体系的试管，紫外透射滤光片下方的外壳内相连接设置紫外灯管，紫外灯管间隔设置于隔板上方，紫外透射滤光片上方的外壳顶部上设置手机拍照孔，手机拍照孔外侧的外壳上相连接设置手机支架，该手机支架上能够可拆卸相连接设置手机，且手机的相机镜头能够正对紫外透射滤光片设置；
所述隔板下方的外壳的中空内部设置有金属加热块、加热模块外壳和温控模块，所述金属加热块设置于加热模块外壳内，金属加热块沿水平方向设置，且金属加热块内沿均布间隔制有32个试管放置加热位，试管放置加热位与盛装反应体系的试管的形状相吻合设置，且试管能够与试管放置加热位可拆卸相连接设置，金属加热块能够对设置于试管放置加热位的试管进行加热操作；
所述温控模块通过温控按钮、电源与金属加热块相连接设置，温控模块能够调节金属加热块的加热温度。
较优地，所述装置还包括温控显示屏，温控显示屏与金属加热块相连接设置，温控显示屏能够显示金属加热块的加热温度；
或者，所述金属加热块自上而下依次通过加热板、隔热垫与加热模块外壳相连接设置，加热模块外壳通过推拉板与外壳可拆卸相连接设置；
或者，所述滤光片通过滤光片固定卡扣与外壳相连接设置；
或者，所述温控模块通过导线与电源相连接设置，导线通过导线导出口9与外部电源相连接设置；
或者，所述外壳的尺寸为226mm×125mm×164mm，所述外透射滤光片的尺寸为200mm×100mm×3mm，所述紫外灯管能够发射302nm的紫外光，4W，且该紫外灯管由电池供电，所述手机支架的尺寸为77mm×25mm×25mm，所述手机拍照孔的直径为18mm；
或者，所述手机支架能够360°自由旋转和自由调整宽度；
或者，所述3D打印装置采用1.8mm黑色聚乳酸(PLA)长丝通过3D打印制成；
或者，所述3D打印装置的使用方法如下：通过按钮调节温度，使金属加热块达到目的温度，可以依次在金属加热块中完成核酸提取、LAMP扩增及PfAgo切割反应，反应结束后，将反应管横放于紫外透射滤光片上表面，打开紫外灯，将智能手机放置在手机支架上，调整手机支架将摄像头对准手机拍照孔，进行拍摄获得检测结果。
较优地，包括如下步骤：
(1)在LB培养基中接种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA，37℃摇床振荡培养12h，利用磁珠提取法对MRSA基因组进行提取，将基因组加入到LAMP双靶点扩增体系中，将金属加热块设置为65℃孵育30min，得到的扩增产物加入PfAgo体系进行反应，将金属加热块设置为95℃孵育15min；
(2)将得到的不同浓度的MRSA撒入到样品中，利用磁珠提取法提取样品中不同浓度的MRSA基因组，加入到LAMP双靶点扩增体系中，将金属加热块设置为65℃孵育30min，将扩增产物加入到PfAgo体系中进行反应，将金属加热块设置为95℃孵育15min。
(3)反应结束后将反应管置于3D打印装置的紫外透射滤光片中，通过智能手机拍照获得检测结果，并使用App对结果进行采集和分析。
较优地，所述方法的最低检测限度为10-100CFU/mL，并且能够检测上至107CFU/mL；所述方法的检测时间从核酸提取、LAMP扩增、PfAgo切割及信号输出仅需要65min。
如上所述的方法在检测耐药菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方面中的应用。
具体地，相关制备及检测如下：
1、细菌培养和菌落形成单位(CFU)试验
MRSA在Luria-Bertani培养基中生长。液体培养在37℃下用振动器在烧瓶中进行。对于菌落形成单位(CFU)试验，制备了细菌的系列稀释样品。取稀释后的样品100μL，分别涂于Baird-Parker琼脂平板和MRSA筛选琼脂平板，37℃保持24h，记录每个平板上的菌落数量。
2、MRSA基因组的提取
采用磁珠提取法进行MRSA基因组提取。取1mL菌液至1.5ml离心管，12000rpm离心，弃上清，加入600μL裂解液(2.5M氯化钠，2M盐酸胍,pH 4.0)重悬沉淀，100℃裂解5min，加入600μL无水乙醇混合10s，然后，向混合物中加入1mg磁珠，并用旋转混合器摇晃混合5min。之后，用400μL70％乙醇洗涤两次。将磁珠在室温下干燥5min。加入50μL TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)并在65℃(如热反应块中)孵育5min，在此期间混匀2-3次，洗脱得到MRSA基因组。
3、引物设计与LAMP扩增
在LAMP Primer Design Tool version 1.3.0网站，选择MRSA基因组(GenBank登录号NZ_CP013231.1)中特异性基因nuc和mecA序列设计用于MRSA检测的LAMP引物。
将混合的LAMP扩增体系放置于65℃(如热反应块中)孵育30min，得到LAMP扩增产物，LAMP的具体双靶点扩增体系如下：
*注：1Buffer成分为：200mM Tris-HCl，pH 8.8，500mM氯化钾，100mM硫酸铵，20mM硫酸镁，1％Tween-20。
210×引物mix包括：16μM FIP，16μM BIP，2μM F3，2μM B3，4μM Loop F，4μM LoopB。
3dNTPs mix包括：10mM dATP，10mM dTTP，10mM dCTP，10mM dGTP，10mM dUTP。
4、STAR检测MRSA的可行性验证实验
为了验证STAR基于特异性识别和切割实现同时检测双靶标的能力，进行了可行性验证实验，在4个相同的LAMP扩增体系中分别加入不同的基因组(水，金黄色葡萄球菌基因组，耐甲氧西林葡萄球菌基因组，MRSA基因组)，得到的扩增产物分别加入相同的PfAgo反应体系中，包括：6μMPfAgo，0.5μM引导DNAs(nuc基因检测用guide DNA 1/2/3)，0.5μM引导DNAs(mecA基因检测用guide DNA1/2/3)，0.2μM荧光探针A，0.2μM荧光探针B，以及反应缓冲液(20mM HEPES,100mMNaCl,0.5mM MnCl2,pH 7.5)，在95℃孵育15min，一方面，反应产物通过多功能酶标仪得到荧光强度数值，另一方面，反应产物置于3D打印装置中，由智能手机拍摄图片并通过App(如颜色识别器)采集相应的RGB值进行分析对比，结果如图2所示。当添加基因组为水时，双靶标皆不存在于体系中，呈现出低荧光，且在302nm紫外照射下无荧光发出；当体系中添加金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林葡萄球菌基因组时，反应体系仅存在单一靶标，呈现出单一荧光的增长，且在302nm紫外照射下为红色或绿色荧光；当MRSA的基因组添加到体系中时，双靶标同时存在，双荧光皆有增长，且在302nm紫外照射下为黄色荧光。此外，通过PAGE-电泳验证，证明只有当Ago，引导DNAs和靶标同时存在时，荧光探针才能被切割降解。以上实验初步证明本发明方法的可行性，具有高特异性识别和切割能力。
5、3D打印装置的设计和构造
本发明设计的3D打印装置的具体构造如图3、图11所示，3D打印装置采取柜式分层设计，一个主外壳和两个前后盖构成装置主体，由上至下可划分为三个区域：检测区、光源区和加热区。
具体地，所述3D打印装置包括手机支架1、紫外透射滤光片3、紫外灯管4、隔板5、外壳8、盖子11、手机拍照孔13、金属加热块7、加热模块外壳6、温控模块11，所述外壳沿水平方向设置，该外壳的纵向一侧上可拆卸紧密相连接设置盖子，该外壳内呈中空的密封状，外壳的中空内部紧密相连接设置隔板，该隔板沿水平方向设置，隔板上方外壳内的中上部紧密相连接设置紫外透射滤光片，该紫外透射滤光片能够透射302nm的光，紫外透射滤光片的上表面上能够放置盛装待检测的反应完毕体系的试管，紫外透射滤光片下方的外壳内相连接设置紫外灯管，紫外灯管间隔设置于隔板上方，紫外透射滤光片上方的外壳顶部上设置手机拍照孔，手机拍照孔外侧的外壳上相连接设置手机支架，该手机支架上能够可拆卸相连接设置手机，且手机的相机镜头能够正对紫外透射滤光片设置；
所述隔板下方的外壳的中空内部设置有金属加热块、加热模块外壳和温控模块，所述金属加热块设置于加热模块外壳内，金属加热块沿水平方向设置，且金属加热块内沿均布间隔制有32个试管放置加热位(图中未标号)，试管放置加热位与盛装反应体系的试管的形状相吻合设置，且试管能够与试管放置加热位可拆卸相连接设置，金属加热块能够对设置于试管放置加热位的试管进行加热操作；
所述温控模块通过温控按钮12、电源(图中未示出)与金属加热块相连接设置，温控模块能够调节金属加热块的加热温度。
较优地，所述装置还包括温控显示屏10，温控显示屏与金属加热块相连接设置，温控显示屏能够显示金属加热块的加热温度，便于操作。
较优地，所述金属加热块自上而下依次通过加热板、隔热垫(图中未标号)与加热模块外壳相连接设置，加热模块外壳通过推拉板(图中未标号)与外壳可拆卸相连接设置。
较优地，所述滤光片通过滤光片固定卡扣2与外壳相连接设置。
较优地，所述温控模块通过导线(图中未示出)与电源相连接设置，导线通过导线导出口9与外部电源相连接设置。
较优地，所述外壳的尺寸为226mm×125mm×164mm，所述外透射滤光片的尺寸为200mm×100mm×3mm，所述紫外灯管能够发射302nm的紫外光，4W，且该紫外灯管由电池供电，所述手机支架的尺寸为77mm×25mm×25mm，所述手机拍照孔的直径为18mm。
较优地，所述手机支架能够360°自由旋转和自由调整宽度，以适应不同型号的手机。
较优地，本发明设计的3D打印装置采用1.8mm黑色聚乳酸(PLA)长丝通过3D打印制成。
详细地，本发明设计的3D打印装置使用方法可以如下：
通过按钮调节温度，使金属加热块达到目的温度，可以依次在金属加热块中完成核酸提取、LAMP扩增及PfAgo切割反应，反应结束后，将反应管横放于紫外透射滤光片上表面，打开紫外灯，将智能手机放置在手机支架上，调整手机支架将摄像头对准手机拍照孔，进行拍摄获得检测结果。
6、优化STAR的反应条件
本发明对Ago切割体系进行了优化，包括PfAgo浓度(0-7.5μM)、引导DNA浓度(0-1μM)、Mn2+浓度(0-2mM)。优化结果如图4所示，当PfAgo的添加浓度达到6μM时，与7.5μM时的荧光强度相近，因此选择PfAgo浓度为6μM；当引导DNAs的添加浓度为0.5μM时，其荧光强度为最高，因此选择引导DNAs的浓度为0.5μM；当Mn2+浓度为0.5mM时，其荧光强度最高，因此选择Mn2+的添加浓度为0.5mM。因此得到最优的反应体系为：6μMPfAgo，0.5μM引导DNAs(包括3条相应的引导DNA，guide DNA 1:guide DNA2:guide DNA3的摩尔浓度比1:1:1，三条guideDNA总浓度为0.5μM)，反应缓冲液(20mM HEPES,100mM NaCl,0.5mM MnCl2,pH 7.5)。
7、STAR用于MRSA检测的灵敏度和选择性
6μMPfAgo，0.5μM引导DNAs(靶向mecA扩增子)，0.5μM引导DNAs(靶向nuc扩增子)，0.2μM荧光探针A(5’ROX，3’BHQ2标记)，0.2μM荧光探针B(5’FAM，3’BHQ1标记)，以及不同浓度的MRSA基因组的LAMP扩增产物，在反应缓冲液(20mM HEPES,100mMNaCl,0.5mM MnCl2,pH7.5)中于95℃孵育15min。一方面，将反应产物通过多功能酶标仪得到量化的荧光强度；另一方面，将反应管置于3D打印装置中，通过手机拍照得到荧光结果，并使用App(如颜色识别器)采集图片的RGB值。此外，还检测了不同浓度的单一mecA或nuc基因的扩增产物。结果如图5所示，STAR的检测限可达10-100CFU/mL，动态检测范围为107CFU/mL，且体系中存在不同的靶标的RGB值具有良好的分类集群。另外，如图6所示，为了验证所提出的生物传感器的选择性，从与MRSA浓度相同的八种不同干扰生物中提取的基因组DNA使用MRSA特异性引物通过LAMP扩增，包括根瘤农杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、毕赤酵母菌以及Hela、HT29、MGC803等细胞，然后进行STAR检测，结果表明，只有当MRSA存在时，FAM和ROX都具有高荧光，当存在耐甲氧西林葡萄球菌时，仅出现FAM高荧光；当存在金黄色葡萄球菌时，仅存在ROX高荧光。综上所述，本发明的生物传感器具有优秀的灵敏度和选择性。
8、STAR检测MRSA的应用
为了进一步验证本发明设计的STAR在真实食品样品中MRSA检测的实用性，从当地超市购买了各种样品，包括鸡蛋、牛奶、生肉，添加不同浓度的MRSA培养物。如图7所示，鸡蛋、牛奶、生肉样品的LOD值均为10CFU/mL，与灵敏度检测结果一致。此外，验证本发明生物传感器的重复性和重现性，获得相对标准偏差(RSD)值，如图8所示。所有计算的重复性和重现性的RSD值均小于8％，表明可接受的重复性和重现性。可重复性和可重复性是生物传感器发展的关键问题。一般建议RSD值小于10％是验证所研制生物传感器可靠性的先决条件。最后，我们验证了STAR检测MRSA感染小鼠粪便和组织的能力，如图9和图10所示。与对照小鼠相比，实验组小鼠可以在感染后2小时即可从粪便中检测到MRSA。通过解剖死亡的小鼠后，我们在MRSA感染小鼠的肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中检测到了MRSA。综上所述，本发明提出的方法在灵敏度、动态范围和检测时间等方面的性能与大多数文献报道的方法相当或更好。上述数据充分表明，本发明提出的生物传感策略在真实耐药菌检测中的适用性，同时对于食品样本和小鼠粪便样本的检出表明STAR在食物检测和早期诊断耐药菌感染方面具有潜力。
9、STAR检测与现有技术的对比
整理了近年来检测MRSA的相关技术，并与本发明的传感器STAR进行对比，如表1所示，本发明的STAR的输出方式为荧光，但是可以通过可视化荧光，用作POCT检测，无需大型仪器设备；此外，本发明的检测限为10CFU/mL，与现有技术的检测限相当甚至更优；另一方面，本发明适用于对食品(如鸡蛋、牛奶、生肉)和小鼠粪便及组织等复杂样本中耐药菌的检测。综上所述，本发明的STAR检测传感器在在灵敏度，检测方法，检测范围方面优于现有检测技术，同时可作为POCT检测。
表1与现有技术检测MRSA的方法对比
本发明中用到的序列为：
nuc基因扩增所用的LAMP引物(5’-3’)：
F3：TTTAGATACATTCTTTGGAACGA
B3：GTAACATTGATCGCAACGT
FIP：CGTGGTAAAATTTTAGACCGAAACATGCCTATCTCATATGCTGTT
BIP：ATATGTATGCTTTGGTCTTTCTGCAAGAAGATGGTATGTGGAAGTT
Loop F：GTGGAATTGGCCAATACAGG
Loop B：CTGGAATAATGACGCTATGATCC
mecA基因扩增所用的LAMP引物(5’-3’)：
F3：AACAGTATATAGTGCAACTTCAA
B3：CTTTGTCAAACTCGACTTCAA
FIP：TGTCATTGGTTGACCTTTGTACATTAAAATTACATAAAGAACCTGCGA
BIP：GTTGATACACCTGAAACAAAGCATCATTTTTTTCGTAAATGCACTTGC
Loop F：CCGTATCACCATCAATCGCTTTAA
Loop B：AAAGGTGTAGAGAAATATGGTCCTG
nuc基因qPCR所用引物及探针(5’-3’)：
引物F：GGATGGCTATCAGTAATGTTTCG
引物R：TTAACCGTATCACCATCAATCG
qPCR-probe(TaqMan法)：HEX-AAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCA-BHQ1
mecA基因qPCR所用引物及探针(5’-3’)：
SYBR Green法引物F：CAGGAATGCAGAAAGACC
SYBR Green法引物R：AATACTTAGTTCTTTAGCG
TaqMan法引物F：AAATATTATTAGCTGATTCAGGTTAC
TaqMan法引物R：CGTTAATATTGCCATTATTTTCTAAT
qPCR-probe(TaqMan法)：FAM-CAAGGTGAAATACTGATTAACCCAGTA-BHQ1
nuc基因-PfAgo检测所用guide DNA及荧光探针序列(5’-3’)：
Guide DNA 1：P-TGAATGTCATTGGTTG
Guide DNA2：P-TCAACCAATAATAGTC
Guide DNA3：P-AGGTCAACCAATGACA
荧光探针A：ROX-ATAGTCTGAATGTCAT-BHQ2
mecA基因-PfAgo检测所用guide DNA及荧光探针序列(5’-3’)：
Guide DNA 1：P-ATGTGGAATTGGCCAA
Guide DNA2：P-ATTTTAGACCGAAACA
Guide DNA3：P-TGTATTGGCCAATTCC
荧光探针B：FAM-GAAACAATGTGGAATT-BHQ1
图2E中PAGE电泳验证所用序列(5’-3’)：
引导DNA：与上述mecA基因-PfAgo检测所用guide DNA 1/2/3序列一致
报告探针：TTTTTTTTTTTTGAAACAATGTGGAATTCTTTTTTTTTTT
靶标：AATACTTAGTTCTTTAGCGATTGCTTTATAATCTTTTTTAGATACATTCTTTG
GAACGATGCCTATCTCATATGCTGTTCCTGTATTGGCCAATTCCACATTGTTTCGGT
CTAAAATTTTACCACGTTCTGATTTTAAATTTTCAATATGTATGCTTTGGTCTTTCTG
CATTCCTG
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (10)

1.一种基于PfAgo结合LAMP扩增一管法同时双靶点检测耐药菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)提取待检测菌的基因组；
(2)选择耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的基因组中特异性基因nuc和mecA序列设计用于MRSA检测的LAMP引物；
(3)将混合的LAMP扩增体系放置于65℃孵育30min，得到LAMP扩增产物；
(4)将LAMP扩增产物加入PfAgo反应体系中，在95℃孵育15min，反应结束后通过酶标仪进行荧光值测量，或者将反应管放置于3D检测装置中，获得检测结果；
当双靶标同时存在，与阴性对照组即无靶标的荧光值相比，阳性组即有靶标的双荧光皆有增长，且在302nm紫外照射下为黄色荧光，则证明检测菌为MRSA，否则证明无MRSA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：每总体积为25μL的LAMP扩增体系具体如下：
Buffer2.5μL，10×引物mix-nuc基因扩增2.5μL，10×引物mix-mecA基因扩增2.5μL，dNTPsmix3.5μL，100mMMgSO42μL，BstDNA聚合酶0.5μL，待检测菌的基因组2μL，ddH2O9.5μL；
其中，Buffer成分为：200mMTris-HCl，pH8.8，500mM氯化钾，100mM硫酸铵，20mM硫酸镁，质量浓度为1％的Tween-20；
10×引物mix-nuc基因扩增包括：16μMFIP，16μMBIP，2μMF3，2μMB3，4μMLoop F，4μMLoopB；FIP、BIP、F3、B3、LoopF、LoopB的基因序列依次为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6；
10×引物mix-mecA基因扩增包括：16μMFIP，16μMBIP，2μMF3，2μMB3，4μMLoop F，4μMLoopB；FIP、BIP、F3、B3、LoopF、LoopB的基因序列依次为SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.12；
dNTPsmix包括：10mMdATP，10mMdTTP，10mMdCTP，10mMdGTP，10mMdUTP。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PfAgo反应体系为：
6μMPfAgo，0.5μM、nuc基因引导DNAs，0.5μM、mecA基因引导DNAs，0.2μM荧光探针A，0.2μM荧光探针B以及反应缓冲液；
其中，nuc基因引导DNAs包括3条相应的引导DNA即guideDNA1、guideDNA2、guide DNA3，三条guideDNA总浓度为0.5μM，三条guideDNA的摩尔浓度比为1:1:1，三条guide DNA的基因序列依次为SEQ ID NO.21至SEQ ID NO.23；所述荧光探针A的基因序列为SEQ ID NO.24；
mecA基因引导DNAs包括3条相应的引导DNA即guideDNA1、guideDNA2、guide DNA3，三条guideDNA总浓度为0.5μM，三条guideDNA的摩尔浓度比为1:1:1，三条guide DNA的基因序列依次为SEQ ID NO.25至SEQ ID NO.27；所述荧光探针B的基因序列为SEQ ID NO.28；
所述反应缓冲液的组成为：pH7.5的HEPES、NaCl和MnCl2的混合液，Hepes-NaOH：NaCl：MnCl2的摩尔比为20：100：0.5；Hepes-NaOH与PfAgo的摩尔比为20：6；
或者，所述荧光探针A为与ssDNAA互补的5’ROX和3’BHQ2双标记；所述荧光探针B为与ssDNAB互补的5’FAM和3’BHQ1双标记。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法通过当靶标DNA存在时，PfAgo能够在引导DNA的引导下切割靶标DNA，产生的次级ssDNA，能够作为新的引导DNA与空-PfAgo结合并引导其特异性切割荧光探针，PfAgo的切割是基于严格的碱基互补配对，基于此设计双靶点检测平台。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：当体系中存在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌时，经过LAMP扩增能够得到nuc扩增子和mecA扩增子，PfAgo在相应的引导DNA的引导下分别切割nuc扩增子和mecA扩增子，得到次级ssDNAA和ssDNAB，作为新的引导DNA分别引导PfAgo切割荧光探针A和荧光探针B，在3D打印装置中能够观察到荧光呈黄色(因ROX红色荧光和FAM绿色荧光同时存在)；当体系中存在非耐药的金黄色葡萄球菌时，经过LAMP扩增仅能够得到nuc扩增子，在相应引导DNA引导PfAgo切割后，得到次级ssDNAA引导PfAgo切割荧光探针A，在3D打印装置观察到的荧光呈红色；当体系中存在除金黄色葡萄球菌外的耐甲氧西林葡萄球菌时，经过LAMP扩增仅能够得到mecA扩增子，在相应引导DNA引导PfAgo切割后，得到次级ssDNAB引导PfAgo切割荧光探针B，在3D打印装置观察到的荧光呈绿色；当体系中不存在以上三种菌时，无扩增子且无荧光探针被切割，3D打印装置中未观察到荧光。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述3D打印装置包括手机支架、紫外透射滤光片、紫外灯管、隔板、外壳、盖子、手机拍照孔、金属加热块、加热模块外壳、温控模块，所述外壳沿水平方向设置，该外壳的纵向一侧上可拆卸紧密相连接设置盖子，该外壳内呈中空的密封状，外壳的中空内部紧密相连接设置隔板，该隔板沿水平方向设置，隔板上方外壳内的中上部紧密相连接设置紫外透射滤光片，该紫外透射滤光片能够透射302nm的光，紫外透射滤光片的上表面上能够放置盛装待检测的反应完毕体系的试管，紫外透射滤光片下方的外壳内相连接设置紫外灯管，紫外灯管间隔设置于隔板上方，紫外透射滤光片上方的外壳顶部上设置手机拍照孔，手机拍照孔外侧的外壳上相连接设置手机支架，该手机支架上能够可拆卸相连接设置手机，且手机的相机镜头能够正对紫外透射滤光片设置；
所述隔板下方的外壳的中空内部设置有金属加热块、加热模块外壳和温控模块，所述金属加热块设置于加热模块外壳内，金属加热块沿水平方向设置，且金属加热块内沿均布间隔制有32个试管放置加热位，试管放置加热位与盛装反应体系的试管的形状相吻合设置，且试管能够与试管放置加热位可拆卸相连接设置，金属加热块能够对设置于试管放置加热位的试管进行加热操作；
所述温控模块通过温控按钮、电源与金属加热块相连接设置，温控模块能够调节金属加热块的加热温度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述装置还包括温控显示屏，温控显示屏与金属加热块相连接设置，温控显示屏能够显示金属加热块的加热温度；
或者，所述金属加热块自上而下依次通过加热板、隔热垫与加热模块外壳相连接设置，加热模块外壳通过推拉板与外壳可拆卸相连接设置；
或者，所述滤光片通过滤光片固定卡扣与外壳相连接设置；
或者，所述温控模块通过导线与电源相连接设置，导线通过导线导出口与外部电源相连接设置；
或者，所述外壳的尺寸为226mm×125mm×164mm，所述外透射滤光片的尺寸为200mm×100mm×3mm，所述紫外灯管能够发射302nm的紫外光，4W，且该紫外灯管由电池供电，所述手机支架的尺寸为77mm×25mm×25mm，所述手机拍照孔的直径为18mm；
或者，所述手机支架能够360°自由旋转和自由调整宽度；
或者，所述3D打印装置采用1.8mm黑色聚乳酸长丝通过3D打印制成；
或者，所述3D打印装置的使用方法如下：通过按钮调节温度，使金属加热块达到目的温度，可以依次在金属加热块中完成核酸提取、LAMP扩增及PfAgo切割反应，反应结束后，将反应管横放于紫外透射滤光片上表面，打开紫外灯，将智能手机放置在手机支架上，调整手机支架将摄像头对准手机拍照孔，进行拍摄获得检测结果。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)在LB培养基中接种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA，37℃摇床振荡培养12h，利用磁珠提取法对MRSA基因组进行提取，将基因组加入到LAMP双靶点扩增体系中，将金属加热块设置为65℃孵育30min，得到的扩增产物加入PfAgo体系进行反应，将金属加热块设置为95℃孵育15min；
(2)将得到的不同浓度的MRSA撒入到样品中，利用磁珠提取法提取样品中不同浓度的MRSA基因组，加入到LAMP双靶点扩增体系中，将金属加热块设置为65℃孵育30min，将扩增产物加入到PfAgo体系中进行反应，将金属加热块设置为95℃孵育15min。
(3)反应结束后将反应管置于3D打印装置的紫外透射滤光片中，通过智能手机拍照获得检测结果，并使用App对结果进行采集和分析。
9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其特征在于：所述方法的最低检测限度为10-100CFU/mL，并且能够检测上至107CFU/mL；所述方法的检测时间从核酸提取、LAMP扩增、PfAgo切割及信号输出仅需要65min。
10.如权利要求1至9任一项所述的方法在检测耐药菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方面中的应用。
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Cited By (2)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116773840A (zh) * 2023-08-25 2023-09-19 四川徕伯益自动化技术有限公司 一种样本溶液的溯源方法及介质
CN117417070A (zh) * 2023-10-20 2024-01-19 广东海洋大学 一种养殖水域中抗生素抗性基因去除装置和快速检测方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116773840A (zh) * 2023-08-25 2023-09-19 四川徕伯益自动化技术有限公司 一种样本溶液的溯源方法及介质
CN116773840B (zh) * 2023-08-25 2023-10-27 四川徕伯益自动化技术有限公司 一种样本溶液的溯源方法及介质
CN117417070A (zh) * 2023-10-20 2024-01-19 广东海洋大学 一种养殖水域中抗生素抗性基因去除装置和快速检测方法
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