CN112831580B

CN112831580B - 一种用于检测副溶血性弧菌dna的反应体系、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN112831580B
Application number: CN202110166903.7A
Authority: CN
Inventors: 吕鹏; 黄栋; 潘晔; 刘蕊; 裘宋琳; 聂小娟; 陈克平; 陈全胜
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2041-02-04
Also published as: CN112831580A

Abstract

本发明属于病原诊断技术领域，具体涉及一种用于检测副溶血性弧菌DNA的反应体系、试剂盒及其应用。本发明利用SHERLOCK技术建立了一种快速检测致病性副溶血性弧菌的检测方法，该方法可检测副溶血性弧菌的tlh基因、tdh基因、trh基因和toxR基因四种致病基因，特异性强，灵敏度高，并且操作简便快捷，结果读取准确迅速，克服了现有检测方法检测时间过长且灵敏度不够高的问题。

Description

一种用于检测副溶血性弧菌DNA的反应体系、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于病原诊断技术领域，具体涉及一种用于检测副溶血性弧菌DNA的反应体系、试剂盒及其应用。

背景技术

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一种广泛存在于海洋和盐湖中的嗜盐致病菌，致病力强，临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状，患者病后免疫力不强，可重复感染，严重者可发生休克。流行病学调查显示，由副溶血性弧菌感染引起的食物中毒在世界范围内引起了多次食源性公共卫生事件，对人类健康状况构成了威胁。研究发现，溶血毒素是引起副溶血性弧菌致病性的主要因素，其中溶血毒素包括耐热直接溶血素（TDH）、耐热直接溶血素相关溶血素（TRH）和不耐热溶血素（TLH）。副溶血性弧菌的主要毒力因子有TLH、TDH和TRH。TLH是一种非典型的磷脂酶，能溶解人的红细胞，具有副溶血性弧菌种属的特异性。TDH能在我妻氏血平板上引起β－溶血(神奈川现象)，具有致死毒性、心脏毒性、细胞毒性和肠毒素作用。TRH虽不能引起神奈川现象，但其与TDH有相似的免疫原性和 67% 的相同氨基酸序列，并同样具有致死作用和细胞毒性。而toxR基因是近年来在副溶血性弧菌中新发现的致病基因，与副溶血性弧菌的毒力和致病性密切相关。

现有副溶血性弧菌检测方法主要有PCR检测法、Elisa检测法、免疫胶体金 (ICG)检测法、核酸序列恒温扩增(NASBA)检测法等。在实际样品检测工作中，现有的检测技术主要存在的问题一是灵敏度不够高，无法检测到潜伏感病样品；二是容易产生假阳性，对模板质量要求高；三是操作繁琐，对实验条件要求高，不利于一线技术人员操作。

SHERLOCK是一种新型的等温核酸检测技术，即利用Crispr-Cas13a反应系统，将Cas13a的附带切割作用与等温扩增相结合，以建立基于CRISPR的诊断平台（CRISPR-Dx），可实现具有渺摩尔（aM）灵敏度和单碱基错配特异性的快速DNA或RNA检测。SHERLOCK反应可在5~60min之内实现致病菌的检测，在37~42 ℃即可进行快速、高灵敏度的检测，摆脱了恒温扩增设备的束缚。整个反应过程使用荧光读取器进行荧光值的读取，具有安全、快捷、高效的特点，此外，SHERLOCK反应试剂可冻干，具有冷链独立性和长期保存、易于推广等特点。目前尚未出现SHERLOCK技术应用在副溶血性弧菌检测的相关研究报道。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的缺陷，本发明提供一种用于检测副溶血性弧菌核酸的反应体系、试剂盒及其应用。利用SHERLOCK技术建立了一种快速检测致病性副溶血性弧菌的检测方法，该方法可检测副溶血性弧菌的四种致病基因，特异性强，灵敏度高，并且操作简便快捷，结果读取准确迅速，克服了现有检测方法检测时间过长且灵敏度不够高的问题，适用于食品、水样、粪便、呕吐物、增菌液等多样本中副溶血性弧菌的定性检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种用于检测副溶血性弧菌核酸的反应体系，该反应体系为SHERLOCK反应体系，其包括用于扩增目的核酸片段的引物组和/或对应的crRNA；所述目的核酸片段包括tlh基因、tdh基因、toxR基因和/或trh基因中的一种或多种。

其中，所述tlh基因的引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述tlh基因的crRNA如SEQ ID NO：3所示；

所述tdh基因的引物对如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，所述tdh基因的crRNA如SEQ ID NO：6所示；

所述toxR基因的引物对如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，所述toxR基因的crRNA如SEQ ID NO：9所示；

所述trh基因的引物对如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示，所述trh基因的crRNA如SEQ ID NO：12所示。

所述的反应体系中各引物对的浓度为10~20μM，所述crRNA的浓度为22.5~30nM。

所述反应体系还包含有荧光标记分子，所述荧光标记分子的浓度为250~300nM。

所述反应体系还包含有反应缓冲液（Reaction Buffer），Basic E-mix，CoreReaction Mix，纯化的LwCas13a蛋白，RNase抑制剂，T7 RNA 聚合酶，NTP 混合溶液，dNTP混合溶液和Mg²⁺。

更进一步地，本发明所述的引物和探针crRNA是根据GenBank公布的副溶血性弧菌基因组序列设计获得，其中tlh、tdh、toxR来自于副溶血性弧菌RIMD 2210633菌株，trh来自副溶血性弧菌OYVP7菌株（GenBank: AY586620.1）。

本发明的第二方面还提供一种用于快速检测副溶血性弧菌的试剂盒，所述试剂盒，其包含上述任一用于检测副溶血性弧菌核酸的反应体系。所述试剂盒还包括核酸提取试剂和阴性对照，所述阴性对照优选无核酶水。

本发明的第三方面还提供一种非诊断目的的用于检测副溶血性弧菌的方法，其包括如下步骤：

（1）使用核酸提取缓冲液热裂解方法提取待检测样品的核酸；

（2）以步骤（1）提取的核酸为模板，采用上述的反应体系进行SHERLOCK反应，反应时间为30~90min、反应温度为37～42℃，反应结束后分析检测结果。

本发明还提供了上述用于检测副溶血性弧菌的反应体系在制备用于检测副溶血性弧菌的试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用SHERLOCK技术建立了一种快速检测致病性副溶血性弧菌的检测方法，该方法可检测副溶血性弧菌的tlh基因、tdh基因、trh基因和toxR基因四种致病基因，特异性强，灵敏度高，并且操作简便快捷，结果读取准确迅速，克服了现有检测方法检测时间过长且灵敏度不够高的问题。

本发明根据待检测基因的保守区域设计引物组，Cas13a-crRNA对待检测基因进行特异性的识别，并对荧光探针分子进行切割释放出荧光信号，特异性和反应速度均优于常规PCR；其快速检测方法灵敏度高，是常规PCR的10³倍左右；检测时间短，可以在30min内获得检测结果，比常规PCR节约2～3小时；对仪器设备要求低，无需PCR仪、凝胶电泳和成像系统；操作步骤简单，结果直观易判定，绝大部分技术员都可以按步骤指导进行操作，通过荧光进行结果判定；对人和环境较安全，整个过程不使用有毒物质，适用于食品、水样、粪便、呕吐物、增菌液等多样本中副溶血性弧菌的现场快速定性检测。

附图说明

图1为实施例2中对LwCas13a蛋白的表达纯化图；

图2为副溶血性弧菌的反应特异性检测对比图；

图3为致病性副溶血性弧菌的SHERLOCK法检测反应灵敏度检测图；

图4为致病性副溶血性弧菌的不同基因检测时间测试对比图；

图5为海水样品中致病性副溶血性弧菌的SHERLOCK法检测反应灵敏度检测图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下述实施例中未注明具体成分的试剂和原料均市售可得。

本发明所述副溶血性弧菌购自美国模式培养物集存库（ATCC）；所用的引物均委托上海捷瑞生物公司合成，荧光标记分子（RNaseAlert-1 Substrate货号：11-04-02-03）购自于IDT公司；T7 RNA聚合酶购自于NxGen公司（货号：30223-1），RPA试剂盒购自于Twist公司（货号：LQBAS01），RNase 抑制剂（货号：R301-02）购自于诺维赞公司，NTP Mixture（货号：B600057）以及dNTP Mixture（货号：B500055）均购自于上海生工生物公司。pC013 -Twinstrep-SUMO-huLwCas13a表达质粒购自于Addgene公司；Reaction Buffer， Basic E-mix，Core Reaction Mix，MgOAc 均来自RPA Basic（TwistAmp^TM）试剂盒。

实施例1

crRNA的设计、转录和纯化：本实施例根据GenBank公布的副溶血性弧菌基因组序列（NC_004603.1，NC_004605.1）作为目标检测序列，经过序列比对和筛选，设计获得可以特异性检测副溶血性弧菌的引物。crRNA设计依据待检测基因的序列，crRNA的体外转录模板链为靶序列的反向互补序列前加LwCas13a的特异性识别序列（锚定序列）、保护碱基及T7启动子，合成此链及其反向互补链，两条链分别稀释后各加入1µL（100µM），10× PCR Buffer(Mg²⁺) 1µL，用水补足至10µL；经过95℃，5min变性，70℃，90s，ramp rate：0.5℃/s 退火后，得到转录所需模板DNA；利用T7 体外转录试剂盒（Thermo，货号：K0441）进行体外转录，得到所需要的crRNA，随后使用Nanodrop 2000进行浓度测定分别得到探针。共制备出4对RPA扩增引物和4种crRNA，分别为：

tlh基因：其引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，tlh-crRNA的序列如SEQID NO：3所示；

tdh基因：其引物对如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，tdh-crRNA的序列如SEQID NO：6所示；

toxR基因：其引物对如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，toxR-crRNA的序列如SEQID NO：9所示；

trh基因：其引物对如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示，trh-crRNA的序列如SEQID NO：12所示。

其中，tlh-crRNA、tdh-crRNA、toxR-crRNA分别来自于副溶血性弧菌RIMD 2210633菌株的tlh（GenBank: AB012596.1）、tdh（GenBank: BA000032.2）及toxR（GenBank:BA000031.2）基因，trh-crRNA来自于副溶血性弧菌OYVP7菌株trh基因（GenBank:AY586620.1）。

本实施例中使用本领域常规的RPA方法进行反应（具体详见RPA反应引物筛选说明书），在37℃水浴反应30min后，进行产物纯化，随后进行琼脂糖凝胶电泳验证并对产物进行浓度测定。

实施例2

在本实施例中对LwCas13a蛋白进行表达纯化，获得可用于SHERLOCK反应的LwCas13a蛋白。将pC013 - Twinstrep-SUMO-huLwCas13a表达质粒进行酶切验证后转化，单克隆扩增培养，使用含有30μg/mL氨苄青霉素的1L LB培养基进行菌株扩增，在OD₆₀₀达到0.6~0.8时，加入0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），于37℃诱导表达4h，后于8000×g，4℃离心15min，收集菌体。加入45mL的细菌裂解液（20~50mM Tris-HCl，200~500mM NaCl，1~5mM DTT，1~5mM PMSF，10000~20000单位（U）的溶菌酶，pH7.0~8.0）重悬菌体后进行超声破碎，破碎时间3s，间隔时间4s，总时长30min，后于8000×g，4℃离心1h，收集上清液；利用Strep-Ⅱ标签进行亲和层析，收集洗脱液，浓缩后进行凝胶过滤层析(GE)，得到所需的LwCas13a蛋白，并进行SDS-PAGE验证。

图1是LwCas13a蛋白的表达纯化图；图中，M为蛋白预染Marker，A图中，编号1代表LwCas13a蛋白诱导表达，超声破碎离心后的沉淀；编号2代表LwCas13a蛋白诱导表达，超声破碎离心后的上清；编号3代表上清液重力柱流穿一次后收集的样品；编号4代表与重力柱结合样品；编号5代表重力柱流穿洗涤液；编号6~8代表经过SUMO酶消化后收集的LwCas13a蛋白。B图中，编号1~2代表LwCas13a凝胶过滤层析(GE)后收集样品进行SDS-PAGE验证。如图1所示，获得了纯化的LwCas13a蛋白，可进一步应用于后续检测体系。

实施例3：副溶血性弧菌SHERLOCK法检测试剂盒的制备

本发明组装副溶血性弧菌检测试剂盒，以下提供的数据及试剂组分为单次检测所需试剂：所述试剂盒包含四种待测基因中的一种或多种检测反应体系。四种待测基因分别为tlh基因、tdh基因、toxR基因和trh基因。反应体系中含有引物对及crRNA，还包含有荧光标记分子。

确定反应体系：通过反复试验优化反应体系，每种检测基因的反应体系（20μL）中包含：10~20μM Primer-F/R，22.5~30nM crRNA，250~300nM荧光探针，2×Reaction Buffer，10× Basic E-mix，20×Core Reaction Mix，45nM LwCas13a，1 µL RNase抑制剂，T7 RNA聚合酶（Polymerase）10单位，25mM NTP 混合溶液（Mixture）1 µL，25mM dNTP Mixture 1 µL，5mM MgCl₂。

实施例4

在本实施例中分别以50 ng/μL溶藻弧菌、拟态弧菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌核酸为模板，及阴性对照（无核酶水）作为参照进行特异性检测。检测步骤具体包括：

（1）将定量好模板，加入实施例2构建的反应体系，除阴性对照加入无核酶水为模板之外在其他样本的反应体系中对应加入1～2μL DNA模板使模板终浓度为50 ng/μL，充分震荡混合之后，加入1 μL 的 280mM MgOAc，用核酸酶测定缓冲液补足，使反应体系总体积为20μL；其中，核酸酶测定缓冲液包括：40 mM Tris-HCl, 60 mM NaCl, 6 mM MgCl₂, pH7.3。

（2）将检测反应管置于荧光信号读取器内，37～42℃，每5min读取一次，读取45~90min之内的荧光值；

（3）将荧光信号读取器内实时监测得出的荧光数值导出Excel表格，随后进行数据处理，去除背景值后，制作曲线图或柱状图，得出检测结果。图2是特异性测试结果柱状图；图中，1~8分别代表溶藻弧菌、拟态弧菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、副溶血性弧菌及阴性对照。由图2可见，在参照对比存在的情况下，本发明提供的检测体系可特异的识别并扩增副溶血性弧菌的目的基因。

实施例5

采用本发明所述的SHERLOCK检测方法对致病性副溶血性弧菌的检测灵敏度情况进行分析。同时分别使用不同的DNA模板浓度（10⁵，10⁴，10³，10²，10¹，10⁰，10^-1copies/μL）检测SHERLOCK检测方法对四种致病基因所引起的致病性副溶血性弧菌的灵敏度，共分为四组（A、B、C、D），每组中NC为阴性对照（均为无核酶水）。每组中分别加入tlh、tdh、trh、toxR对应的反应体系，对应加入10⁵~10^-1 copies/μL的副溶血性弧菌的热裂解DNA，于37℃反应，每5min读取一次荧光值，共90min。反应结束后，将荧光信号读取器内实时监测得出的荧光数值导出Excel表格，随后进行数据处理，去除背景值后，由荧光值_max减去荧光值_min，得出检测过程中荧光值的变化，制作柱状图，得出检测结果。图3

为致病性副溶血性弧菌的SHERLOCK法检测反应灵敏度检测图；图中，A为tlh基因，B为tdh基因，C为trh基因，D为toxR基因；由图4可见，本发明提供的检测试剂盒针对tlh、 tdh、trh、toxR基因检测灵敏度分别可以达到100、100、1、1 copies/μL，具有较高的灵敏度。

实施例6

在本实施例中参照实施例4检测的步骤分别对tlh基因、tdh基因、trh基因、toxR基因的副溶血性弧菌检测时间进行考量。加入副溶血性弧菌DNA模板的浓度为50ng/μL，检测时间为90min。图3为致病性副溶血性弧菌的不同基因检测时间测试对比图。图中，1~5分别代表tlh基因、tdh基因、trh基因、toxR基因及阴性对照的扩增曲线。由图4可见，tdh基因的最快检出时间为10min，trh基因的最快检出时间为20min，tlh、toxR基因的最快检出时间为30min，四个基因均可在30min内被检出。可见，本发明所开发的检测试剂盒可以在较短时间内对四种不同溶血毒素的副溶血性弧菌进行检测。

实施例7

对待测样本中的副溶血性弧菌进行检测。所述的待测样本包括但不限于食品、水样、粪便、呕吐物、增菌液等常规检测样本。待检测样本应为新鲜采集，如样本为海产品之类的固体样本建议称取少量（2~5g）样本后加入200 μL PBS研磨匀浆，其他液体样本建议直接吸取200 μL后10000×g离心5min。以本发明所述的SHERLOCK检测方法对海水样品中致病性副溶血性弧菌的检测灵敏度情况为例，检测步骤具体包括：

培养副溶血性弧菌OD₆₀₀=0.5时，菌浓度为5×10⁸CFU/mL ，使用人造海水（购自生物风公司，货号：M1217-01）进行连续十倍梯度稀释（至模板终浓度为10⁶~10^-3CFU/mL）后进行热裂解，验证SHERLOCK检测方法对海水中tlh基因所引起的致病性副溶血性弧菌的检测灵敏度情况。NC为阴性对照（为无核酶水），最后以NC的3倍值作为灵敏度指标进行评判。在tlh对应的反应体系中，对应加入10⁶~10^-3CFU/mL的副溶血性弧菌的热裂解DNA各1µL，于37℃反应，每5min读取一次荧光值，共90min。反应结束后，反应产物直接置于荧光读取仪内进行荧光读数，荧光数值大于阴性孔3倍的即认为为阳性。图5为海水中致病性副溶血性弧菌的SHERLOCK法检测反应灵敏度检测图；由图5可见，本发明提供的检测试剂盒针对实际样品中tlh基因检测灵敏度分别可以达到10^-1CFU/mL，具有较高的灵敏度。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 一种用于检测副溶血性弧菌DNA的反应体系、试剂盒及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaattaata cgactcacta taggggaacg cgagcgatcc ttgtttggac atcaaccgc 59

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cattccagaa cacaaacttc tcagcaccag acgc 34

<210> 3

<211> 67

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca augcgugggu guacauguaa 60

ucgacag 67

<210> 4

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaattaata cgactcacta tagggccaag taaaatgtat ttggatgaaa ctccag 56

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttattgttga tgtttacatt caaaaaacga ttc 33

<210> 6

<211> 67

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu uaccaauaua uuaccacuac 60

cacucuc 67

<210> 7

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaaattaata cgactcacta tagggccgtc atataggcgc ttaaccattt tgagcc 56

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atcgttgatg actactggac aaacccaaac a 31

<210> 9

<211> 67

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc gaaaaccaua uaaaagcguu 60

cacgguc 67

<210> 10

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaattaata cgactcacta tagggctgct gtttacaaac ccagcggaat ctcagttcc 59

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgtagcgttc aatgcactgc tcaatagaag gc 32

<210> 12

<211> 67

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu uuacaggugu caucacuggu 60

acguucu 67

Claims

1. 一种用于检测副溶血性弧菌DNA的反应体系，其特征在于，所述反应体系为SHERLOCK反应体系，其包括用于扩增目的核酸片段的特异性引物对和对应的crRNA；所述目的核酸片段为tlh基因、tdh基因、toxR基因和trh基因；所述特异性引物对包括如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示的tlh基因引物序列、如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的tdh基因引物序列、如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的toxR基因引物序列、如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的trh基因引物序列；所述crRNA序列用于结合扩增后的所述目的核酸片段转录的ssRNA，所述crRNA为4条，分别为如SEQ ID NO：3所示的tlh基因crRNA、SEQ ID NO6所示的tdh基因crRNA、SEQ ID NO：9所示的toxR基因crRNA、SEQ ID NO12所示的trh基因crRNA。

2.根据权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述的反应体系中各引物对的浓度为10~20μM，所述crRNA的浓度为22.5~30nM。

3.根据权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系还包含有荧光标记分子，所述荧光标记分子的浓度为250~300nM。

4. 根据权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系还包含有 ReactionBuffer，Basic E-mix，Core Reaction Mix，纯化的LwCas13a蛋白，RNase抑制剂，T7 RNA 聚合酶，NTP Mixture，dNTP Mixture和Mg²⁺。

5.一种用于检测副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1~4中任一项所述的用于检测副溶血性弧菌的反应体系。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取试剂和阴性对照。

7.一种非诊断目的的检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）使用核酸提取试剂提取待检样品中的核酸；

（2）以步骤（1）提取的核酸为模板，采用如权利要求1～4中任一项所述的反应体系进行SHERLOCK反应，反应时间为30~90min、反应温度为37～42℃，反应结束后分析检测结果。

8.权利要求1~4中任一项所述的用于检测副溶血性弧菌的反应体系在制备用于检测副溶血性弧菌的试剂中的应用。