CN1771331B

CN1771331B - 用于检测沙门氏菌种的stn基因寡核苷酸引物及使用该引物的检测方法

Info

Publication number: CN1771331B
Application number: CN038264307A
Authority: CN
Inventors: 吴拉姆·纳比·卡齐; 维杰施瓦·维尔马; 赛义德·里亚齐-乌-哈桑
Original assignee: Lektratek Instrumentation Pty Ltd
Current assignee: Lektratek Instrumentation Pty Ltd; Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2003-03-31
Filing date: 2003-03-31
Publication date: 2011-11-09
Anticipated expiration: 2023-03-31
Also published as: EP1608774B1; JP4249712B2; JP2006513718A; DE60334412D1; EP1608774A1; ATE483031T1; CN1771331A

Abstract

本发明涉及对沙门氏菌(Salmonella)肠毒素特异基因(stn)基因具有特异性的寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.21，这些引物对沙门氏菌的快速且特异筛查是有用的。本发明还涉及沙门氏菌肠毒素特异基因(stn)基因的快速且特异检测方法，该方法通过将寡核苷酸引物SEQID No.1～SEQ ID No.21用于聚合酶链式反应(PCR)，以确定寄生物沙门氏菌是否存在于受试对象中，所述方法包括以下步骤：制备所述基因的DNA模板，用所述引物通过PCR对该模板进行扩增，在凝胶上对PCR产物进行电泳，以及对所述寄生物进行检测。

Description

用于检测沙门氏菌种的stn基因寡核苷酸引物及使用该引物的检测方法

技术领域

本发明涉及对沙门氏菌(Salmonella)肠毒素基因(stn)具有特异性的寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.21，这些引物对沙门氏菌的快速和特异筛查是有用的；本发明还涉及沙门氏菌肠毒素基因(stn)的快速且特异检测方法，该方法通过将寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQID No.21用于聚合酶链式反应(PCR)，以确定寄生物沙门氏菌是否存在于受试对象中，该方法包括以下步骤：制备所述基因的DNA模板，用所述引物通过PCR对该模板进行扩增，在凝胶上对PCR产物进行电泳，以及对所述寄生物进行检测。

背景技术

沙门氏菌种是兼性的胞内寄生物，其侵入上皮细胞的粘膜，并且主要通过水、肉、蛋和禽产品传染给人。沙门氏菌感染是由动物传染给人的最常见的食源性胃肠疾病。在许多发展中国家，伤寒仍然是一种地方性疾病；在世界范围内，非伤寒性沙门氏菌病也是一种主要的食源性疾病，据估计每年造成死亡的人数超过500人，仅在美国每年就造成10亿～15亿美元的损失(Threlfall 1996；Mead等，1999)。在印度，这些数据没有得到完全记载，但是预计要高得多。为了防止沙门氏菌感染，需要良好的检测和筛查程序。通过常规细菌学方法对沙门氏菌进行检测非常耗时，通常需要至少5天。因此，许多工作者已进行了尝试以减少所需要的时间和提高沙门氏菌检测方法的灵敏性(Notermans等，1997；Ferretti等，2001；Carli等，2001)。

由于公众健康相关意识的增强和食源性污染和疾病对经济影响的增加，所以导致付出了更多的努力以研发更灵敏的病原检测和鉴定方法。随着分子生物学技术，尤其是聚合酶链式反应(PCR)的发展，微生物的鉴定和监测更加可靠。PCR还成为研究食源性疾病的发作和鉴定引起微生物流行性疾病的病原体的重要工具。PCR技术使得灵敏性提高，操作时间更快，对细菌病原的检测得以改进。除了对食物进行分析之外，PCR还成功地应用于对临床或环境样品中的病原微生物进行检测和鉴定(Simon，1999；White，1992)。

产肠毒素作用被认为是引起腹泻的细菌的显著的病理学性质之一。还证明了已知与人和动物中的肠胃炎和腹泻有关的沙门氏菌血清型可以产生肠毒素。stn基因定位在沙门氏菌(Salmonella lyphimurium)的染色体大约89分钟，完整的stn基因的存在对沙门氏菌总体毒力具有显著作用。本发明人在此提供了stn基因作为沙门氏菌的检测标记的用途。

发明内容

本发明的主要目的是研发用于检测寄生物沙门氏菌的引物。

本发明的另一个主要目的是研发寄生物沙门氏菌的快速有效的检测方法。

本发明的另外的一个主要目的是研发从食物和生物样品等中检测寄生物沙门氏菌的方法。

本发明涉及对沙门氏菌肠毒素基因(stn)基因具有特异性的寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.21，这些引物对沙门氏菌的快速和特异筛查是有用的；本发明还涉及沙门氏菌肠毒素基因(stn)基因的快速且特异检测方法，该方法通过将寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.21用于聚合酶链式反应(PCR)，以确定寄生物沙门氏菌是否存在于受试对象中，该方法包括以下步骤：制备所述基因的DNA模板，用所述引物通过PCR对该模板进行扩增，在凝胶上对PCR产物进行电泳，以及对所述寄生物进行检测。

附图说明

图1显示了1％琼脂糖凝胶，该凝胶显示了在检测沙门氏菌中所使用的所有4个PCR产物。泳道1显示了1kb的DNA梯度(Fermentas)。泳道2显示了用引物QVR133和QVR134进行的PCR扩增(200bp)；泳道3了显示用引物QVR135和QVR136进行的PCR扩增(207bp)；泳道4显示了用引物QVR137和QVR138进行的PCR扩增(1318bp)；泳道5显示了用引物QVR139和QVR140进行的PCR扩增(450bp)；泳道6显示了采用引物QVR139和QVR140的阴性对照。

图2显示了1％琼脂糖凝胶，该凝胶显示了用引物QVR137和QVR138从血液中检测不同数量的沙门氏菌细胞。泳道1显示了1kb的DNA梯度(Fermentas)。泳道2显示了阳性对照；泳道3显示了掺入约1个细胞并且经过了5小时的预富集的血样；泳道4显示了阴性对照(未接种的血样)；泳道5显示了掺入低于10个细胞而未经预富集而进行PCR的血样；泳道6显示了掺入10个细胞并且未经预富集而进行PCR的血样；泳道7显示了掺入10³个细胞并且未经预富集而进行PCR的血样。

图3显示了1％琼脂糖凝胶，该凝胶显示了用巢式PCR检测沙门氏菌的PCR扩增产物。用引物QVR137和QVR138进行第一次PCR反应，而用引物QVR139和QVR140进行巢式PCR反应。泳道1显示了1kb的DNA梯度(Fermentas)；泳道2～泳道7显示了沙门氏菌的不同血清型；泳道8显示了阴性对照。

具体实施方式

相应地，本发明涉及对沙门氏菌肠毒素基因(stn)基因具有特异性的寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.21，这些引物对沙门氏菌的快速和特异筛查是有用的；本发明还涉及沙门氏菌肠毒素基因(stn)基因的快速且特异检测方法，该方法通过将寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.21用于聚合酶链式反应(PCR)，以确定寄生物沙门氏菌是否存在于受试对象中，该方法包括以下步骤：制备所述基因的DNA模板，用所述引物通过PCR对该模板进行扩增，在凝胶上对PCR产物进行电泳，以及对所述寄生物进行检测。

在本发明的一个实施方案中，其中，寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.21对沙门氏菌肠毒素基因(stn)基因具有特异性，对快速且特异筛查沙门氏菌是有用的。

在本发明的另一个实施方案中，其中，沙门氏菌肠毒素基因(stn)基因的快速且特异检测方法为通过将寡核苷酸引物SEQ ID No.1～SEQID No.21用于聚合酶链式反应(PCR)，以确定寄生物沙门氏菌是否存在于受试对象中，该方法包括以下步骤：

·制备所述基因的DNA模板，

·用所述引物通过PCR扩增对该模板进行扩增，

·在凝胶上对PCR产物进行电泳，和

·检测所述寄生物。

在本发明的另一个实施方案中，其中，所述的基因是由沙门氏菌的血清型来测序的。

在本发明的另一个实施方案中，其中，所述的引物可以检测每毫升至多含有(up to)约1个细胞的水，该水经过或未经过任何富集。

在本发明的另一个实施方案中，其中，所述的引物可以检测每毫升至多含有10个细胞的血液，该血液经过或未经过任何富集。

在本发明的另一个实施方案中，其中，所述的引物可以检测每克至多含有1个细胞的食物和临床样品，所述食物和临床样品经过或未经过任何富集。

在本发明的另一个实施方案中，其中，来自血液和背景微菌群的DNA不会干扰PCR分析。

在本发明的另一个实施方案中，其中，可以将所述方法用于水的质量控制和沙门氏细菌的诊断。

在本发明的另一个实施方案中，其中，所述受试对象是人和动物。

在本发明的另一个实施方案中，其中，由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2组成的一套引物产生200bp的扩增子。

在本发明的另一个实施方案中，其中，由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4组成的一套引物产生207bp的扩增子。

在本发明的另一个实施方案中，其中，由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6组成的一套引物产生1318bp的扩增子。

在本发明的另一个实施方案中，其中，由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8组成的一套引物产生450bp的扩增子。

在本发明的另一个实施方案中，其中，所述引物的浓度为1pM～100pM。

在本发明的另一个实施方案中，其中，在浓度为0.3％～2.7％的凝胶上使PCR产物可视化。

在本发明的另一个实施方案中，其中，PCR包括：在93℃～97℃进行30秒～7分钟的起始变性；和进行23～50个循环：93℃～97℃进行3秒～2分钟，在50℃～67℃进行10秒～2分钟，在70℃～75℃进行10秒～2分钟；以及在70℃～75℃进行2分钟～10分钟的最终延伸。

在本发明的另一个实施方案中，其中，所述的DNA是分离自纯培养物、水、食物和临床样品。

在本发明的另一个实施方案中，其中，所述的stn基因由沙门氏菌的几个血清型来测序的，并发现该序列是保守的。通过使用基于沙门氏菌肠毒素基因(stn)的特异引物，研发出了基于PCR的沙门氏菌检测程序。这些引物和PCR程序已由本发明人设计并且首次报道的。本方法具有高度特异性，并且可以检测未经预富集的直到每毫升含有1个细胞的水和每毫升含有低于10个细胞的血液。所述引物没有显示任何扩增非沙门氏菌DNA的倾向。来自血液和背景微菌群的DNA既不产生任何非特异性PCR扩增子，也不抑制PCR分析，因而不干扰PCR分析。可以将该方法用于水的质量控制和人和动物中的沙门氏菌血症的诊断。

在本发明的另一个实施方案中，其中，基于stn基因(沙门氏菌肠毒素基因)而设计并用于聚合酶链式反应的寡核苷酸引物对通过PCR程序快速且特异性地检测沙门氏菌是有用的，所述PCR程序包括：在93℃～97℃进行30秒～7分钟的起始变性；和进行23～50个循环：93℃～97℃进行3秒～2分钟，在50℃～67℃进行10秒～2分钟，在70℃～75℃进行10秒～2分钟；以及在70℃～75℃进行2分钟～10分钟的最终延伸。通过任何已知适合于PCR的方法从纯培养物、水、食物和临床样品中分离DNA后，用Ifg～1Oug的DNA和热稳定的DNA聚合酶进行PCR，然后在0.5％～2.5％的琼脂糖凝胶上使PCR产物可视化。

在本发明的另一个实施方案中，其中，在沙门氏菌的快速检测方法中选择以下引物：

以下分别是组成第1套引物的SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，也称为QVR133和QVR134：

5’GAAGCAGCGCCTGTAAAATC3’/5’TGGCTGTGGTGCAAAATATC3’；

以下分别是组成第2套引物的SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，也称为QVR135和QVR136：

5’GCCACCAGCTTTTCTTTACG 3’/5’ACGAACCAGCGAAACAAACT 3’；

以下分别是组成第3套引物的SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，也称为QVR137和QVR138：

5’GGTCAAAATCCAGCGGTTTA 3’/5’TTGCTGCTAACGGCGAGA 3’；

以下分别是组成第4套引物的SEQ ID No.7和SEQ ID No.8，也称为QVR139和QVR140：

5’GCCGGCTTTCAACGCCTCTAC3’/5’GACCAAAGCTGACGGGACAG3’；

SEQ ID NO.9

5’ACGCCTCTACCGCCGTTTCC3’，

SEQ ID NO.10

5’CGACCAAAGCTGACGGGACAG3’，

SEQ ID NO.11

5’CGTTTCCACGCTGGAAAATGC3’，

SEQ ID NO.12

5’GCCGGCTTTCAACGCCTCTAC3’，

SEQ ID NO.13

5’CATGGCGGCGCGATTAAGG3’，

SEQ ID NO.14

5’AATCGGAATGGCGGGATTGAG3’，

SEQ ID NO.15

5’TGCCGTTCATAATCAAAATCG3’，

SEQ ID NO.16

5’GATTTTACAGGCGCTGCTTC3’，

SEQ ID NO.17

5’GGTCAAATCCAGCGGTTTA3’，

SEQ ID NO.18

5’GCTCAGGTGCGTGAGAAAGT3’，

SEQ ID NO.19

5’GTTCGAGCAATTCGCTTACC3’，

SEQ ID NO.20

5’GCTTGATGCAATGAAGCGTA3’，

SEQ ID NO.21

5’TTCCCGCTATCGGTAACAGT3’。

在本发明的另一个实施方案中，其中，涉及在如权利要求1和2所要求的引物和沙门氏菌的快速检测方法，其中所使用的引物浓度可以为1pM～100pM，第1套引物、第2套引物、第3套引物和第4套引物分别产生200bp、207bp、1318bp和450bp的特异性扩增子(图1)。

在本发明的另一个实施方案中，其中，涉及检测沙门氏菌的引物和快速方法，其中可以从诸如食物、临床样品(图2)或和水样等不同来源中检测出沙门氏菌的所有类型血清型(图3)，所述样品可以经过富集或未经富集，每毫升或每克样品的细胞含量可以低至1个细胞。在如权利要求1～4所要求的检测沙门氏菌的引物和快速方法，可以从每25毫升或每25克样品含有1个细胞的不同来源中检测出沙门氏菌的所有类型血清型，所述样品可以经过富集或未经富集。

在本发明的另一个实施方案中，其中，涉及引物和沙门氏菌纯培养物的检测，其中可以在PCR中使用包括制备热激溶解产物在内的任何已知方法分离的染色体DNA，然后在0.5％～2.5％的琼脂糖凝胶上使PCR产物可视化。

方法

程序主要包括3个步骤：

·模板DNA的制备

·聚合酶链式反应

·产物在琼脂糖凝胶上的可视化

用于PCR的DNA分离：将来自1ml液体培养物的细胞沉淀或琼脂培养基上的单菌落悬浮在100μl的无菌的Millipore水中，并在干浴器中于100℃温育5分钟。将该混合物立即转移到冰浴器中，并放置3分钟。将所得到的细胞溶解物在7000rpm离心3分钟。将2μl的上清液直接用于20μl的PCR反应中。

只要觉得有必要，即可用分离的染色体DNA进行分析。对于纯染色体DNA的分离，可以将所述培养物在营养肉汤中培养6小时，并通过GES法(Pitcher等，1989)对DNA进行分离。在20μl的反应分析中通常使用10ng的DNA。

从血液中制备模板：将DNA分离试剂盒(M/S Bio Basic，加拿大)用于从血液中分离DNA(图2)。

从水中制备模板：为了从水源性细菌中分离DNA，将1ml的样品在5ml的微量离心管中以7000rpm离心3分钟，倒掉上清液，将10μl的经热压处理的Millipore水加到各管中。涡旋振荡所获得的悬浮液，在干浴器中于100℃温育5分钟，将所有体积的溶液用于20μl的PCR反应中。

富集：就血液而言，将250μl的等分样品接种到5ml的液体培养基中；而对于水，将1ml的等分试样接种到1ml的二倍浓缩的脑心浸出物培养液(Brain Heart Infusion Broth，HiMedia，印度)并在37℃温育5小时。按以上方法制备所述的细胞溶解产物。

Claims

1.寡核苷酸引物SEQ ID No.1和2、3和4、5和6、和7和8的组合，该组合中的四组引物对一起使用，且该组合对沙门氏菌血清型的肠毒素(stn)基因具有特异性。

2.寡核苷酸引物SEQ ID No.1和2、3和4、5和6、和7和8的组合在制备用于检测沙门氏菌的试剂盒中的应用，其中所述组合中的四组引物对一起使用。

3.如权利要求2所述的应用，其中，所述的试剂盒用于检测由沙门氏菌的血清型测序的沙门氏菌肠毒素基因。

4.如权利要求2所述的应用，其中，所述的试剂盒用于检测每毫升至多含有1个沙门氏菌细胞的水，所述水经过或未经过任何富集。

5.如权利要求2所述的应用，其中，所述的试剂盒用于检测每毫升至多含有10个沙门氏菌细胞的血液，所述血液经过或未经过任何富集。

6.如权利要求2所述的应用，其中，所述的试剂盒用于检测每克至多含有1个沙门氏菌细胞的食物和临床样品，所述食物和临床样品经过或未经过任何富集。

7.如权利要求2所述的应用，其中，所述的试剂盒用于水的质量控制和沙门氏细菌的诊断。

8.如权利要求2所述的应用，其中，所述的试剂盒用于检测人和动物中的沙门氏菌。

9.如权利要求2所述的应用，其中，所述的试剂盒用于检测来自纯培养物、水、食物和临床样品的沙门氏菌。