CN102242216B

CN102242216B - 一种3群霍乱弧菌荧光pcr检测试剂盒及系统鉴定方法

Info

Publication number: CN102242216B
Application number: CN2011101969184A
Authority: CN
Inventors: 罗芸; 叶菊莲; 张政; 金大智
Original assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2011-07-14
Filing date: 2011-07-14
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2031-07-14
Also published as: CN102242216A

Abstract

本发明提供了一种根据3群霍乱弧菌的蔗糖、阿拉伯糖、甘露糖、氧化酶、粘丝、无盐胨水等典型生化特征发明一个快速检测方法及检测过程中所用的荧光PCR检测试剂盒。本发明根据外膜蛋白基因(ompW)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)和溶血素基因(hlyA)设计引物和TaqMan探针，霍乱弧菌外膜蛋白基因作为鉴定霍乱弧菌的特征性基因，其他两种基因作为甄别霍乱弧菌携带的毒素基因，通过上述三个基因提供一种检测霍乱弧菌及其相关毒素基因的荧光检测方法。通过上述生化反应对菌株进行初筛，结果均为阳性的菌株用荧光定量PCR进行确认，ompW基因阳性的为霍乱弧菌。通过上述生化反应及荧光定量PCR可实现对霍乱弧菌及其相关毒素基因的快速、准确、特异检测。

Description

一种3群霍乱弧菌荧光PCR检测试剂盒及系统鉴定方法

(一)技术领域

本发明涉及一种3群霍乱弧菌荧光PCR检测试剂盒，以及利用该试剂盒进行3群霍乱弧菌系统鉴定的方法。

(二)背景技术

霍乱是由霍乱弧菌引起的一类以腹泻为主要症状的烈性传染病，是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一，曾在世界上引起多次大流行。霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是人类霍乱的病原体。霍乱弧菌根据菌体(O)抗原的不同，已被分为200个以上的血清群，其中只有O1和O139群能引起霍乱大流行，其余的血清型广泛分布于自然界水体中，一般不致病或仅引起散发性腹泻病例和肠道感染。

世界卫生组织腹泻控制中心将霍乱弧菌分为3群：O1群霍乱弧菌、非O1群霍乱弧菌、不典型O1群霍乱弧菌。以往认为非O1群弧菌不致病或仅引起散发的轻度腹泻，但1992年印度河孟加拉国等地暴发流行的霍乱首次被证实由非O1群弧菌引起。非O1群霍乱弧菌部分血清群可产生霍乱样肠毒素，从而引起人类腹泻并时有爆发流行的报道，因此近年受到细菌学专家的广泛关注。霍乱弧菌检测的传统方法主要有形态学、生物化学、凝结试验等，这些检测的周期长，一般在18～24小时以上，对因环境或营养缺乏导致的异形菌株(如L型、球型菌株)则不能检测。一些免疫学方法尽管速度快，但结果不稳定，而且目前的常规检测方法只针对O1群和O139群血清型的霍乱弧菌进行检测，对于非O1、非O139群血清型的菌株均无法进行检测。同时，已经有研究阐明了toxR、hlyA等毒力基因可以从霍乱O1群产毒株转移到环境非O1、O139群菌株，增强了非O1、O139群菌株的毒性，研究表明非O1、非O139群霍乱弧菌比O1、O139群霍乱弧菌更适于在海水产品中更适于生存和繁殖，因此极大地威胁海水产品的食品安全。

(三)发明内容

本发明目的是根据3群霍乱弧菌的蔗糖、阿拉伯糖、甘露糖、氧化酶、粘丝、无盐胨水等典型生化特征发明一个快速检测方法及检测过程中所用的荧光PCR检测试剂盒。

本发明根据外膜蛋白基因(ompW)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)和溶血素基因(hlyA)设计引物和TaqMan探针，霍乱弧菌外膜蛋白基因作为鉴定霍乱弧菌的特征性基因，其他两种基因作为甄别霍乱弧菌携带的毒素基因，通过上述三个基因提供一种检测霍乱弧菌及其相关毒素基因的荧光检测方法。通过上述生化反应对菌株进行初筛，结果均为阳性的菌株用荧光定量PCR进行确认，ompW基因阳性的为霍乱弧菌。通过上述生化反应及荧光定量PCR可实现对霍乱弧菌及其相关毒素基因的快速、准确、特异检测。

本发明采用的技术方案是：

一种3群霍乱弧菌荧光PCR检测试剂盒，主要包括外膜蛋白基因(ompW)特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探针如下：

ompW上游引物：5′-TCCTCAACGCTTCTGTGTGGTAT-3′

ompW下游引物：5′-ATTGATTTCAACATCCGTGGATT-3′

ompW荧光探针：5′-FAM-TGA AAC AAC GGC AAC CTA CAA AGCAGG-BHQ1-3，其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。

为达到定量检测的效果，所述试剂盒还包括ompW标准品，所述ompW标准品序列如下：cttgac gactcatggg gacttgctgc taacgttggc tttgattatatgctcaatga tagctggttc ctcaacgctt ctgtgtggta tgccaatatt gaaacaacgg caacctacaaagcaggtgca gatgccaaat ccacggatgt tgaaatcaat ccttgggtat ttatgatcgc gggtgg。

为进一步检测霍乱弧菌的毒力，所述试剂盒还包括毒素表达调控蛋白基因(toxR)特异性引物和荧光探针以及溶血素基因(hlyA)特异性引物和荧光探针，所述特异性引物和荧光探针如下：

toxR上游引物：5′-GATTCGACAAAGTCCCCACAA-3′

toxR下游引物：5′-TCGGGCGATCAATTGGTAA-3′

toxR荧光探针：5′-HEX-CGT CAA AAC GGT TCC GAA ACG CG-BHQ1-3′

hlyA上游引物：5′-AGTGGTCAACCGATGCGATT-3′

hlyA下游引物：5′-TTCAGGATCTGCGCTTTATTGTT-3′

hlyA荧光探针：5′-ROX-CCC AAG ATT ATC GCT TCG TGT TTA ACGCA-BHQ2-3′

其中HEX和ROX为荧光报告基团，BHQ1和BHQ2为荧光淬灭基团。

为达到定量检测的效果，所述试剂盒还包括toxR标准品和hlyA标准品，

所述toxR标准品序列如下：ttgcatgact ttgtttggcg agagcaaggt tttgaagtcgatgattccag cttaacccaa gccatttcga ctctgcgcaa aatgctcaaa gattcgacaa agtccccacaatacgtcaaa acggttccga aacgcggtta ccaattgatc gcccgagtgg aaacggttgaagaagagatg gctcgcgaaa gcgaagctgc tcatgacatc tctcagccag aatctgtcaa tgaatacgcagagtcaagca gtgtgcct；

所述hlyA标准品序列如下：agatgatgaca gcacgggagc cggcattcatctgaatgatc aactcggtta tcgtcagttt ggagccagtt atacgacgtta gatgcctattt ccgtgagtggtcaaccgatgcg attgcccaag attatcgcttc gtgtttaacg catcgaacaat aaagcgcagatcctgaaaacc tttcctgtcg ataacattaa cgagaaattt gagcgcaaag aggtttcagg ttttgagc。

所述的荧光PCR检测试剂盒在3群霍乱弧菌系统鉴定中的应用。

本发明还涉及一种3群霍乱弧菌系统鉴定方法，所述方法包括：

(1)将待鉴定的细菌接种到哥伦比亚琼脂培养基上，37℃培养箱中培养18～24h；

(2)挑取步骤(1)中无色透明、圆形光滑湿润菌落穿刺到三糖斜面，37℃培养18～24h后观察结果，斜面上红下黄者为阳性，取阳性单菌落分别进行粘丝实验、氧化酶实验和无盐胨水实验，若粘丝实验、氧化酶实验和无盐胨水实验结果均为阳性，则进行下一步PCR检测；

其中粘丝实验、氧化酶实验、无盐胨水实验均为现有已知生化检测手段，可按本领域常规方法进行，具体可如下：

粘丝实验：在玻片或平皿上滴一大滴(约15μl)试剂，再取1接种环被检菌的新鲜琼脂培养物，放在试剂旁研磨混匀，再与试剂混合制成浓厚悬液。阳性者很快(1分钟内)由混变清并变的很粘稠，用接种环挑取时，可以拉出细丝来。阴性者呈均匀悬液状态，与蒸馏水对照相同；

氧化酶实验：在新鲜培养物上滴加试剂1滴(约20μl)，并使其流开或将菌落挑至滴有试剂的滤纸上，氧化酶阳性时在1-2分钟内出现粉红-紫红-紫蓝色，有点最后呈黑紫色；

无盐胨水实验：用接种针沾取少量新鲜菌培养物至无盐胨水管，37℃培养18～24h后试管浑浊，有菌生长为阳性；

(3)荧光PCR检测：以外膜蛋白基因(ompW)特异性引物和荧光探针对待测细菌基因组DNA进行PCR扩增，以非靶细菌为阴性对照于相同条件下进行PCR扩增，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测细菌荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性；所述特异性引物和荧光探针如下：

ompW上游引物：5′-TCCTCAACGCTTCTGTGTGGTAT-3′

ompW下游引物：5′-ATTGATTTCAACATCCGTGGATT-3′

ompW荧光探针：5′-FAM-TGA AAC AAC GGC AAC CTA CAA AGCAGG-BHQ1-3；

其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。

为进一步检测霍乱弧菌阳性菌株的毒力，所述荧光PCR检测可同时以毒素表达调控蛋白基因(toxR)和溶血素基因(hlyA)特异性引物和荧光探针对待测细菌基因组DNA进行PCR扩增，以非靶细菌为阴性对照于相同条件下进行PCR扩增，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测细菌荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为toxR或hlyA阳性菌株；

所述特异性扩增引物和荧光探针如下：

toxR上游引物：5′-GATTCGACAAAGTCCCCACAA-3′

toxR下游引物：5′-TCGGGCGATCAATTGGTAA-3′

toxR荧光探针：5′-HEX-CGT CAA AAC GGT TCC GAA ACG CG-BHQ1-3′

hlyA上游引物：5′-AGTGGTCAACCGATGCGATT-3′

hlyA下游引物：5′-TTCAGGATCTGCGCTTTATTGTT-3′

hlyA荧光探针：5′-ROX-CCC AAG ATT ATC GCT TCG TGT TTA ACGCA-BHQ2-3′；

其中HEX和ROX为荧光报告基团，BHQ1和BHQ2为荧光淬灭基团。

为达到定量检测的效果，所述荧光PCR检测同时以霍乱弧菌外膜蛋白基因(ompW)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)和溶血素基因(hlyA)标准品的梯度浓度的DNA溶液进行荧光PCR检测，分别根据拷贝浓度的对数值与标准品Ct值的关系可绘制得到ompW、toxR和hlyA的标准曲线，测得样品DNA的Ct值后，对照标准曲线获得样品DNA中相应基因的拷贝浓度；

所述外膜蛋白基因(ompW)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)、溶血素基因(hlyA)标准品序列如前所述。毒素表达调控蛋白基因(toxR)除了间接调控霍乱弧菌的致病能力外，还可能是霍乱弧菌在环境中生存所必须的基因。溶血素基因(hlyA)表达的溶血素(hemolysin)是一种可使红血球细胞溶解的毒素，是霍乱弧菌比较重要的毒素之一。上述两个毒力基因在非O1和非O139群霍乱弧菌中携带率较高，是非O1和非O139群霍乱弧菌检测中比较重要的毒力基因，检测这两个毒力基因对于监测霍乱弧菌对人的致病力具有重要意义。

本发明的有益效果主要体现在：

1、目前，主要依靠O1群和O139群血清凝集来鉴定O1群和O139群霍乱弧菌，对于这两个血清型以外的霍乱弧菌均不做鉴定和报告。本发明的优势之处在于能对所有血清型的霍乱弧菌都能鉴定，加强了对霍乱弧菌的监测，防止霍乱弧菌变异，并且对现有的方法进行了有效的补充，完善了3群霍乱弧菌的诊断方法。

2、本发明相比其他常规生化鉴定方法，能有效提高检出率，缩短检测时间，节约检测成本，适合用于基层疾病预防控制工作。

(四)附图说明

图1为标准品检测结果；从左至右分别：1：10⁵copies/μl、2：10⁴copies/μl。3：10³copies/μl、4：10²copies/μl、5：10¹copies/μl标准品；

图2为标准曲线；其中，a为ompW基因的标准曲线(y＝-3.174×lgx+40.51)；b为toxR基因的标准曲线(y＝-3.233×lgx+38.78)；c为hlyA基因的标准曲线(y＝-3.30×lgx+40.93)；其中y为Ct值；x为基因的拷贝数；

图3为环境样本分离株检测结果；其中1、3、4分别代表1号菌株ompW、toxR、hlyA基因扩增曲线；2、5分别代表2号菌株ompW、toxR基因扩增曲线；

图4为三糖斜面阳性实验结果；

图5为无盐胨水实验结果；

图6为氧化酶实验结果；

图7粘丝实验结果。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：特异性引物、荧光探针和标准品的获得

1、材料：

细菌基因组DNA提取试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；pGEM-T-Easy克隆系统、Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司，测序试剂、377型测序仪均为美国ABI公司产品。分光光度计(Eppendorf公司)，Bio-Rad icycler PCR仪(Bio-Rad公司)及ABI7500FAST型定量PCR仪(ABI公司)

2、引物及探针设计与合成：

以霍乱弧菌外膜蛋白基因(ompW)(注册号为DQ776044)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)(注册号为HQ452873)和溶血素基因(hlyA)(注册号为GU230682)为模板，使用Primer Express^TM(V2.0，美国ABI公司)软件分析TaqMan引物和探针位点，从中选择最佳组合。

标准品PCR上、下游引物序列为：

ompW1上游引物：5′-CTTGACGACTCATGGGGACT-3′

ompW1下游引物：5′-CCACCCGCGATCATAAATAC-3′

toxR1上游引物：5′-TTGCATGACTTTGTTTGGC-3′

toxR1下游引物：5′-AGGCACACTGCTTGACTCT-3′

hlyA1上游引物：5′-AGATGATGACAGCACGGGA-3′

hlyA1下游引物：5′-GCTCAAAACCTGAAACCTC-3′

均由上海辉睿生物科技有限公司合成。

3、检测标准品制备：

用DNA提取试剂提取基因组DNA，用分光光度计测定浓度，取1.0μl(50ng/μl)做PCR反应模板，分别三对用标准品上下游引物在Bio-Radicycler PCR仪上进行PCR扩增：

PCR反应液组成如下：

2×PCR buffer 10.0μl

标准品上游引物(10μM) 1μl

标准品下游引物(10μM) 1μl

DNA聚合酶(5U/μl) 0.2μl

dNTPs(各250mM) 1.60μl

(dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量比1∶1∶1∶1)

模板DNA(50ng/μl) 1μl

水补足至20μl。

PCR条件为：94℃5分钟变性，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒进行35个循环扩增，最后于72℃延伸5分钟后置4℃。

PCR产物经电泳检测后即用克隆系统插入pGEM-T-Easy克隆载体，并将阳性克隆经测序验证。ompW基因回收182bp片段、toxR基因回收258bp片段、hlyA回收236bp片段，即为标准品，测定浓度并换算成(拷贝数/体积)。

4、结果：

经测序，上述设计标准品完全与预期相符，回收的标准品片段序列如下：外膜蛋白基因(ompW)标准品序列：cttgac gactcatggg gacttgctgctaacgttggc tttgattata tgctcaatga tagctggttc ctcaacgctt ctgtgtggta tgccaatattgaaacaacgg caacctacaa agcaggtgca gatgccaaat ccacggatgt tgaaatcaat ccttgggtatttatgatcgc gggtgg。毒素表达调控蛋白基因(toxR)标准品序列：ttgcatgactttgtttggcg agagcaaggt tttgaagtcg atgattccag cttaacccaa gccatttcga ctctgcgcaaaatgctcaaa gattcgacaa agtccccaca atacgtcaaa acggttccga aacgcggtta ccaattgatcgcccgagtgg aaacggttga agaagagatg gctcgcgaaa gcgaagctgc tcatgacatctctcagccag aatctgtcaa tgaatacgca gagtcaagca gtgtgcct。所述溶血素基因(hlyA)标准品序列：agatgatgaca gcacgggagc cggcattcat ctgaatgatcaactcggtta tcgtcagttt ggagccagtt atacgacgtta gatgcctattt ccgtgagtggtcaaccgatgcg attgcccaag attatcgcttc gtgtttaacg catcgaacaat aaagcgcagatcctgaaaacc tttcctgtcg ataacattaa cgagaaattt gagcgcaaag aggtttcagg ttttgagc。

实施例2：系统鉴定霍乱弧菌及其相关毒素基因检测

1、环境标本分离株鉴定：

将30株待鉴定细菌菌株接种到哥伦比亚琼脂培养基上，37℃培养箱中培养18～24h后，挑取无色透明、圆形光滑湿润菌落穿刺到三糖斜面，37℃培养18～24h后观察结果，同时上述菌落做氧化酶、粘丝和无盐胨水实验。

三塘斜面：无色透明、圆形光滑湿润菌落穿刺到三糖斜面，37℃培养18～24h后观察结果，斜面上红下黄者为阳性；

氧化酶实验：在新鲜培养物上滴加试剂1滴(约20μl)，并使其流开或将菌落挑至滴有试剂的滤纸上，氧化酶阳性时在1～2分钟内出现粉红-紫红-紫蓝色，有点最后呈黑紫色；

所用到的试剂配方如下：

1、三糖斜面：培养基管分底层和斜面两层。

底层成份(g)：蛋白胨l、氯化钠l、牛肉膏0.3、蔗糖0.1、琼脂0.3蒸馏水100ml、1％(w/w)酚红水溶液0.125ml。

配制法：除指示剂外，按量称好，加热助溶，调pH7.2～7.4，加入指示剂混匀分装试管，每管约2ml，10磅15min灭菌，取出直立凝。

斜面成份(g)：蛋白胨l、氯化钠l、牛肉膏0.3、甘露糖0.1、阿拉伯胶糖0.5、琼脂1、蒸馏水100ml、1％酚红水溶液0.125ml。

配制法：除指示剂外，按量称好，加热助溶调pH7.2～7.4，加入指示剂，10磅15min灭菌，取出待降至60℃左右时以无菌手续分装于底层培养基上面，每管约2.5ml，放成斜面凝固后备用。

2、粘丝试验：0.5％去氧胆酸钠。

3、氧化酶：1％盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液。

4、无盐胨水：不含NaCl的蛋白胨水。

将三糖斜面、氧化酶、粘丝和无盐胨水实验结果均为阳性的分离株培养物经生理盐水洗涤后离心，采用基因组DNA提取试剂提取基因组DNA，分别取1.0μl做模板，用检测用上下游引物在ABI公司7500FAST型定量PCR仪上进行PCR扩增。

检测用PCR上游引物序列为：

ompW上游引物：5′-TCCTCAACGCTTCTGTGTGGTAT-3′

ompW下游引物：5′-ATTGATTTCAACATCCGTGGATT-3′

ompW荧光探针：5′-FAM-TGAAACAACGGCAACCTACAAAGCAGG-BHQ1-3′

toxR上游引物：5′-GATTCGACAAAGTCCCCACAA--3′

toxR下游引物：5′-TCGGGCGATCAATTGGTAA-3′

toxR荧光探针：5′-HEX-CGTCAAAACGGTTCCGAAACGCG-BHQ1-3′

hlyA上游引物：5′-AGTGGTCAACCGATGCGATT-3′

hlyA下游引物：5′-TTCAGGATCTGCGCTTTATTGTT-3′

hlyA荧光探针：5′-ROX-CCCAAGATTATCGCTTCGTGTTTAACGCA-BHQ2-3′

其中FAM、HEX和ROX为不同波长的荧光报告基团，BHQ1和BHQ2为荧光淬灭基团。

PCR反应液组成如下：

10×PCR buffer 5.0μl

ompW上游引物(10μM) 0.8μl

ompW下游引物(10μM) 1.4μl

toxR上游引物(10μM) 0.5μl

toxR下游引物(10μM) 1.2μl

hlyA上游引物(10μM) 0.8μl

hlyA下游引物(10μM) 1.2μl

ompW荧光探针(10μM) 0.3μl

toxR荧光探针(10μM) 0.2μl

hlyA荧光探针(10μM) 0.3μl

DNA聚合酶(5U/μl) 0.2μl

dNTPs(各250mM) 4.0μl

(dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量比1∶1∶1∶1)

模板DNA(50ng/μl) 1μl

水补足至50μl。

在荧光定量PCR仪器上设置反应条件时，选择FAM、HEX和ROX三种荧光基团对应的检测波长，通过三种对应荧光基团的扩增曲线区分反应体系中三种基因进而对反应结果进行判定。

PCR反应条件为：93℃预变性5分钟，93℃20秒、55℃45秒进行40个循环扩增，最后置4℃。

以非靶细菌(创伤弧菌(CICC 10383))为阴性对照于相同条件下进行PCR检测，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测细菌荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。

同时在相同条件下以不同浓度标准品进行检测，并绘制标准曲线。

待测细菌的测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测霍乱弧菌及其相关毒力基因(toxR和hlyA)的数量。

以副溶血性弧菌(CMCC20022)、志贺菌(ACCC04121)、沙门氏菌(CICC21490)、单增李氏菌(CMCC54001)、空肠弯曲菌(ATCC33560)等按照上述方法进行PCR检测，检测结果均为阴性，说明本发明PCR检测方法特异性强。

2、环境样本分离株鉴定结果

标准品检测结果参见图1，标准曲线参见图2，环境样本分离株检测结果见图3，典型是生化鉴定结果见图4～7：图4为三糖斜面结果，图5为无盐胨水结果，图6为氧化酶结果，图7粘丝结果。

30株待鉴定菌株中三糖斜面结果符合的有14株，氧化酶阳性的有27株，粘丝阳性的有23株，无盐胨水阳性的有10株。10株均为阳性结果的分离株中检出OmpW阳性2株，其中携带toxR和hlyA基因的霍乱弧菌阳性1株、携带toxR基因的霍乱弧菌阳性1株，检测结果参见图3：

两株阳性菌株荧光定量PCR检测结果，第一株的ompW基因、toxR基因和hlyA基因的CT值分别为19.23、25.55和30.42，拷贝数为5.01×10⁶copies/μl、1.26×10⁴copies/μl和1.55×10³copies/μl；第二株的ompW基因、toxR基因和hlyA基因的CT值分别为23.03、33.21和0，对照标准曲线，拷贝数为3.16×10⁵copies/μl、5.0×10¹copies/μl和0copies/μl。

上述的荧光定量PCR结果，通过测序方法进行验证，采用实施例1中的方法及ompW1上游引物、下游引物，toxR1上游引物、下游引物，hlyA1上游引物、下游引物进行扩增测序验证，结果与荧光定量PCR结果相符。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省疾病预防控制中心

<120> 一种3群霍乱弧菌荧光PCR检测试剂盒及系统鉴定方法

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

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<212> DNA

<213> Unknown

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<223> 人工序列

<400> 1

tcctcaacgc ttctgtgtgg tat 23

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<211> 23

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

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attgatttca acatccgtgg att 23

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<211> 27

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

tgaaacaacg gcaacctaca aagcagg 27

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

gattcgacaa agtccccaca a 21

<210> 5

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<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

tcgggcgatc aattggtaa 19

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<211> 23

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

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cgtcaaaacg gttccgaaac gcg 23

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<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 7

agtggtcaac cgatgcgatt 20

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 8

ttcaggatct gcgctttatt gtt 23

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<211> 29

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 9

cccaagatta tcgcttcgtg tttaacgca 29

<210> 10

<211> 182

<212> DNA

<213> Vibrio cholerae

<400> 10

cttgacgact catggggact tgctgctaac gttggctttg attatatgct caatgatagc 60

tggttcctca acgcttctgt gtggtatgcc aatattgaaa caacggcaac ctacaaagca 120

ggtgcagatg ccaaatccac ggatgttgaa atcaatcctt gggtatttat gatcgcgggt 180

gg 182

<210> 11

<211> 258

<212> DNA

<213> Vibrio cholerae

<400> 11

ttgcatgact ttgtttggcg agagcaaggt tttgaagtcg atgattccag cttaacccaa 60

gccatttcga ctctgcgcaa aatgctcaaa gattcgacaa agtccccaca atacgtcaaa 120

acggttccga aacgcggtta ccaattgatc gcccgagtgg aaacggttga agaagagatg 180

gctcgcgaaa gcgaagctgc tcatgacatc tctcagccag aatctgtcaa tgaatacgca 240

gagtcaagca gtgtgcct 258

<210> 12

<211> 236

<212> DNA

<213> Vibrio cholerae

<400> 12

agatgatgac agcacgggag ccggcattca tctgaatgat caactcggtt atcgtcagtt 60

tggagccagt tatacgacgt tagatgccta tttccgtgag tggtcaaccg atgcgattgc 120

ccaagattat cgcttcgtgt ttaacgcatc gaacaataaa gcgcagatcc tgaaaacctt 180

tcctgtcgat aacattaacg agaaatttga gcgcaaagag gtttcaggtt ttgagc 236

Claims

1.一种3群霍乱弧菌荧光PCR检测试剂盒，主要包括外膜蛋白基因ompW特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性引物和荧光探针如下：

ompW上游引物: 5′-TCCTCAACGCTTCTGTGTGGTAT-3′

ompW下游引物: 5′-ATTGATTTCAACATCCGTGGATT-3′

ompW荧光探针: 5′-FAM-TGA AAC AAC GGC AAC CTA CAA AGC AGG-BHQ1-3，其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。

2.如权利要求1所述的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括ompW标准品，所述ompW标准品序列如下：cttgac gactcatggg gacttgctgc taacgttggc tttgattata tgctcaatga tagctggttc ctcaacgctt ctgtgtggta tgccaatatt gaaacaacgg caacctacaa agcaggtgca gatgccaaat ccacggatgt tgaaatcaat ccttgggtat ttatgatcgc gggtgg。

3.如权利要求1或2所述的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括毒素表达调控蛋白基因toxR特异性引物和荧光探针以及溶血素基因hlyA特异性引物和荧光探针，所述特异性引物和荧光探针如下：

toxR上游引物: 5′-GATTCGACAAAGTCCCCACAA-3′

toxR下游引物: 5′-TCGGGCGATCAATTGGTAA-3′

toxR荧光探针: 5′-HEX-CGTCAAAACGGTTCCGAAACGCG- BHQ1-3′

hlyA上游引物: 5′-AGTGGTCAACCGATGCGATT-3′

hlyA下游引物: 5′-TTCAGGATCTGCGCTTTATTGTT-3′

hlyA荧光探针: 5′-ROX-CCC AAG ATT ATC GCT TCG TGT TTA ACG CA- BHQ2-3′

其中HEX和ROX为荧光报告基团，BHQ1和BHQ2为荧光淬灭基团。

4.如权利要求3所述的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括toxR标准品和hlyA标准品，

所述toxR标准品序列如下： ttgcatgact ttgtttggcg agagcaaggttttgaagtcg atgattccag cttaacccaa gccatttcga ctctgcgcaaaatgctcaaa gattcgacaa agtccccaca atacgtcaaa acggttccgaaacgcggtta ccaattgatc gcccgagtgg aaacggttga agaagagatggctcgcgaaa gcgaagctgc tcatgacatc tctcagccag aatctgtcaatgaatacgca gagtcaagca gtgtgcct；

所述hlyA标准品序列如下：agatgatgaca gcacgggagc cggcattcatctgaatgatc aactcggtta tcgtcagttt ggagccagtt atacgacgttagatgcctattt ccgtgagtggt caaccgatgcg attgcccaag attatcgcttc gtgtttaacg catcgaacaat aaagcgcaga tcctgaaaacc tttcctgtcg ataacattaa cgagaaattt gagcgcaaag aggtttcagg ttttgagc。