CN102676664B

CN102676664B - 同时检测多种水产品致病菌的荧光定量pcr引物和探针及检测方法

Info

Publication number: CN102676664B
Application number: CN201210130290.2A
Authority: CN
Inventors: 谢青梅; 吕英姿; 张凌俊; 孙宝丽; 毕英佐
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: Guangzhou Jinmiao Dongbao Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2012-04-28
Filing date: 2012-04-28
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2032-04-28
Also published as: CN102676664A

Abstract

本发明公开了同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针及检测方法，属于分子检测技术领域。所述的荧光定量PCR引物和探针共有5组，可以分别检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、福氏志贺氏菌和非O1群霍乱弧菌，除单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌基因两组的引物和探针不能同时使用外，其他任意两组或两组以上组合，均可以同时检测相应引物和探针对应能检测出的致病菌。本发明同时公开了一种利用上述各引物对和探针建立的多重荧光定量PCR扩增体系，可快速准确地检测出待检样品中是否有相应致病菌，操作方便快捷，且特异性高，不会出现假阳性结果，可以做成试剂盒等，在农副产品致病菌检测中非常适用。

Description

同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针及检测方法

技术领域

本发明涉及农副产品安全检测技术，具体涉及同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针及检测方法。

背景技术

食品安全是公共卫生问题中最应重视的环节，目前我国食品安全领域存在微生物污染；农产品生产、加工以及销售等环节仍然存在安全隐患；食品安全科技成果和技术储备不足；食品安全标准体系、检验检测体系、认证认可体系等方面还存在明显的不适应性，食品安全管理体制和法律法规体系有待完善；食物中毒和食源性疾病等一系列食品安全问题。

因此只有尽快加强食品安全监控，提高检测技术，建立、健全食品安全法规，使我国相应的法规、标准与国际接轨，特别是食品快速检测技术达到国际先进水平，大力加强食品检验的力度，才能为我国食品安全与食品贸易保驾护航。

食源性疾病定义为，通过摄食进入人体的，使人体患感染性或中毒性的疾病。常见的食源性致病菌包括沙门氏菌属、致病性大肠杆菌、葡萄球菌及毒素、变形杆菌属、副溶血性弧菌、李斯特菌、肉毒梭菌毒素、蜡样芽抱杆菌、韦氏梭菌、弯曲杆菌、酵米面椰毒假单胞杆菌、结肠炎耶尔森氏菌、链球菌及志贺氏菌属等。研究发现，人类有60%的疾病都与动物疾病有关，近些年出现的新型疾病中，这一比例更是高达 75%，在养殖业高度发达、人与动物多层面接触的今后，这一比例恐怕还会升高。

实时荧光定量PCR定义为，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。

荧光定量PCR方法已被广泛应用于各方面：（1）各型肝炎、艾滋病、胎儿畸形、肿瘤标志物及瘤基因等临床疾病诊断；（2）禽流感、新城疫等动物疾病检测；（3）医学、农牧、生物相关分子生物学定量等科学研究；（4）食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等食品安全的检测。

以上所述的致病菌目前还没有一套可以用荧光定量PCR技术同时检测其是否存在的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一套可同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针。

本发明的另一目的是提供根据上述检测引物和探针设计的一种荧光定量PCR检测方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明针对在我国食物中毒中最常见的致病菌，研究出一种食物中毒诊断及食品检测的有效方法。根据 GB 4789.1 食品卫生微生物学检验总则和GB4789.17 肉与肉制品检验中的相关要求以及结合我国目前食源性致病菌的发生发展情况，选取以下五种细菌作为检测对象：沙门氏菌，单核细胞增生李斯特氏菌，副溶血性弧菌，福氏志贺氏菌，非O1群霍乱弧菌，筛选出检测上述各致病菌的荧光定量PCR引物和探针。

同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针，核苷酸序列如下：

invA组：引物对SEQ ID NO:1~2，探针SEQ ID NO:3；

hly组：引物对SEQ ID NO:4~5，探针：SEQ ID NO:6；

toxR组：引物对SEQ ID NO:7~8，探针：SEQ ID NO:9；

ipaH组：引物对SEQ ID NO:10~11，探针：SEQ ID NO:12；

vcc组：引物对SEQ ID NO:13~14，探针：SEQ ID NO:15；

以上除hly组与tox组不能同时存在外，其他任何两组以上引物及相应探针组合，可以检测该组引物对和探针所对应的致病菌；

其中invA组引物对和探针用于检测沙门氏菌（Salmonella spp.），hly组引物对和探针用于检测单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes），toxR组引物对和探针用于检测副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus），ipaH组引物对和探针用于检测福氏志贺氏菌（Shigella flexneri），vcc组引物对和探针用于检测非O1群霍乱弧菌（Vibrio Cholerae non- O1）。

以上引物和探针是通过Blast、MegAlign和DNAStar程序筛选出的沙门氏菌inv基因簇保守序列（GenBank: FR775234.1），单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因hly保守序列（GenBank: NC_012488.1），副溶血性弧菌toxR基因保守序列（GenBank: L11929.1），福氏志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因ipaH7保守序列（GenBank: NC_004337.1），非O1群霍乱弧菌vcc基因保守序列（GenBank: NC_012578.1）作为模板，用Primer Explorer V5软件设计所得。

本发明选择靶基因遵循两个原则：1、毒力基因选择位于细菌基因组的基因。由于各种致病菌属间基因组的同源性很高，且与其同属的非致病型在生化反应上无任何区别，但与致病性相关的毒力基因特异性高。而通常在食品检测中只有检测出其毒力才能认定为致病菌，所以选择毒力基因为靶基因。2、细菌为原核生物，其遗传物质有基因组和质粒两类，很多毒力基因位于质粒上。但质粒不稳定，可能在细菌间转移，也容易在传代培养中丢失。由于基因组 DNA和质粒 DNA的大小相差很大，所以不能用同样方法提取。因此选择位于细菌基因组上的毒力基因为靶基因。

由于要在同一个PCR管体系中同时进行至少两个目的基因的扩增，引物和探针设计比较复杂，且对引物和探针扩增区的特异性要求较高。所以引物和探针设计没有普通引物很探针设计简单，要设计出优良的引物和探针，需要在各种生物信息软件评估的基础上进行费时的筛选。由于所设计的引物和探针具有高度的选择特异性，在进行病原细菌检测时，要求引物和探针所针对的靶序列位点应该相当保守，这样所建立的方法才具有更广泛适用性。

由于所设计的引物和探针要在下一步进行多重荧光定量PCR 反应，因此在设计引物和探针时要将各目的基因对应的序列共同进行分析比对。不仅要遵循引物和探针设计的一般原则，探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100~200bp相对要保守的片段来设计引物与探针，即Real-time PCR的扩增片段是50bp~150bp。Real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。要避免多重PCR的各个引物之间相互干扰和各个探针之间相互干扰，引物对内部和引物对之间也要尽量使 Tm 值相近，确保能在同一条件下均获得较好的扩增曲线；各对引物内部和引物对之间不能互补，尤其避免 3’端的互补，以减少引物二聚体的形成。设计好的引物和探针序列用DNAstar软件中的Primerselect软件分析并提交到 NCBI 网站进行 BLAST 分析，用以验证引物和探针的理论特异性。

一种同时检测多种水产品致病菌的检测方法，是使用上述除hly组与tox组不能同时存在外的5组引物和探针中任何两组以上的组合，以待检样品中提取的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增，所选组对应能检测的致病菌荧光定量PCR扩增结果作为阳性对照，待检样品检测结果中的特异性对数扩增曲线与阳性样品结果一致，表明存在该相应致病菌。

本发明还保护一种同时检测多种致病菌的多重荧光定量PCR反应体系，该反应体系为25μL，其中Real-timePCRmix 12.5μL，上、下游引物各0.4μL，探针0.8μL，待检测样品DNA模板1.0μL，超纯水补足25μL；

所述上、下游引物和探针为上述5组中的任意两组以上的组合，但是hly组和toxR组不能同时存在；

上、下游引物和探针的浓度分别为：

invA组：引物对 10μM/L，探针：7.5μM/L；

hly组：引物对5μM/L，探针：5μM/L；

toxR组：引物对7.5μM/L，探针：5μM/L；

ipaH组：引物对 5μM/L，探针：5μM/L；

vcc组：引物对 10μM/L，探针：7.5μM/L；

所述致病菌为选择的所述引物对和探针所对应能检测的致病菌。

上述同时检测多种致病菌的多重荧光定量PCR反应体系的扩增方法，扩增条件为95℃反应30s，PCR反应进行40个循环，每个循环的条件为95℃ 5s，60℃ 34s。

多重荧光定量 PCR 体系中增加了引物、探针和模板，影响反应的因素增多，互相之间增加了干扰。因此增加了设计引物和探针的难度。除此之外体系中各成分的量和浓度也需在实验中做适当调整，以减少非特异性扩增的影响。在实际检测中模板的量是不能确定的，因此引物和探针的浓度及其他成分要保证充分供给，但也不能过量，这会对检测结果产生直接影响。因此在体系中重点调整的是引物的浓度。

本发明的荧光定量PCR技术同时检测多种致病菌的检测用引物和探针特异性强，可用于制备农副产品尤其是水产品致病菌的检测试剂盒。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明筛选出了多种特异性强的致病菌荧光定量PCR扩增引物和探针，建立了一种同时检测多种致病菌的多重荧光定量PCR方法，为快速、高效检测农副产品中多种致病菌提供了一种简便快速的方法。

（2）本发明的5组引物和探针invA-Forword, Reverse, IN，hly-Forword, Reverse, IN，toxR-Forword, Reverse, IN，ipaH-Forword, Reverse, IN，vcc-Forword, Reverse, IN只引起相应靶基因的特异性对数扩增曲线，无任何非特异性对数扩增曲线，显示了良好的特异性。（注：Forword为上游引物，Reverse为下游引物，IN为探针）

（3）本发明的多重荧光定量检测方法扩增反应快速、高效、简便，整个扩增在不到1小时即可完成。

（4）本发明的5组引物和探针在五种细菌单重荧光定量PCR检测中灵敏度都是10¹cfu/mL，显示了高灵敏度。

（5）能够用荧光定量PCR技术同时检测多种致病性细菌：通过对5组引物和探针浓度的优化组合，通过一个多重荧光定量PCR体系的建立和调试，成功建立只引起相应五种菌靶基因的多重特异性对数扩增曲线，未出现相互间强抑制现象。

附图说明

图1. 引物和探针invA-Forword, Reverse, IN对表1中细菌的对数扩增曲线结果图，注：对数曲线表示沙门氏菌的特异性扩增曲线。

图2. 引物和探针hly-Forword, Reverse, IN对表1中细菌的对数扩增曲线结果图，注：对数曲线表示单核细胞增生李斯特氏菌的特异性扩增曲线。

图3. 引物和探针toxR-Forword, Reverse, IN，对表1中细菌的对数扩增曲线结果图，注：对数曲线表示副溶血性弧菌的特异性扩增曲线。

图4. 引物和探针ipaH-Forword, Reverse, IN，对表1中细菌的对数扩增曲线结果图，注：对数曲线表示福氏志贺氏菌的特异性扩增曲线。

图5. 引物和探针vcc-Forword, Reverse, IN，对表1中细菌的对数扩增曲线结果图，注：对数曲线表示非O1群霍乱弧菌的特异性扩增曲线。

图6. 沙门氏菌灵敏度检测结果，对数曲线1~7分别为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹cfu/mL。

图7. 单核细胞增生李斯特氏菌灵敏度检测结果，对数曲线1~7分别为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹cfu/mL。

图8. 副溶血性弧菌灵敏度检测结果，对数曲线1~7分别为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹cfu/mL。

图9. 福氏志贺氏菌灵敏度检测结果，对数曲线1~7分别为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹cfu/mL。

图10. 非O1群霍乱弧菌灵敏度检测结果，对数曲线1~7分别为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹cfu/mL。

图11. 二重荧光定量 PCR 对数扩增曲线结果，曲线1为invA基因对数扩增曲线，曲线2为hly基因对数扩增曲线。

图12. 二重荧光定量 PCR 对数扩增曲线结果，曲线1为invA基因对数扩增曲线，曲线2为ipaH基因对数扩增曲线。

图13. 二重荧光定量 PCR 对数扩增曲线结果，曲线1为invA基因对数扩增曲线，曲线2为vcc基因对数扩增曲线。

图14. 二重荧光定量 PCR 对数扩增曲线结果，曲线1为hly基因对数扩增曲线，曲线2为ipaH基因对数扩增曲线。

图15. 二重荧光定量 PCR 对数扩增曲线结果，曲线1为hly基因对数扩增曲线，曲线2为vcc基因对数扩增曲线。

图16. 二重荧光定量 PCR 对数扩增曲线结果，曲线1为invA基因对数扩增曲线，曲线2为toxR基因对数扩增曲线。

图17. 二重荧光定量 PCR 对数扩增曲线结果，曲线1为toxR基因对数扩增曲线，曲线2为ipaH基因对数扩增曲线。

图18. 二重荧光定量 PCR 对数扩增曲线结果，曲线1为vcc基因对数扩增曲线，曲线2为toxR基因对数扩增曲线。

图19. 三重荧光定量 PCR 对数扩增曲线结果，曲线1为invA基因对数扩增曲线，曲线2为ipaH基因对数扩增曲线，曲线3为hly基因对数扩增曲线。

图20. 三重荧光定量 PCR 对数扩增曲线结果，曲线1为invA基因对数扩增曲线，曲线2为vcc基因对数扩增曲线，曲线3为hly基因对数扩增曲线。

图21. 三重荧光定量 PCR 对数扩增曲线结果，曲线1为invA基因对数扩增曲线，曲线2为vcc基因对数扩增曲线，曲线3为ipaH基因对数扩增曲线。

图22. 三重荧光定量 PCR 对数扩增曲线结果，曲线1为vcc基因对数扩增曲线，曲线2为ipaH基因对数扩增曲线，曲线3为hly基因对数扩增曲线。

图23. 三重荧光定量 PCR 对数扩增曲线结果，曲线1为invA基因对数扩增曲线，曲线2为toxR基因对数扩增曲线，曲线3为ipaH基因对数扩增曲线。

图24. 三重荧光定量 PCR 对数扩增曲线结果，曲线1为invA基因对数扩增曲线，曲线2为vcc基因对数扩增曲线，曲线3为toxR基因对数扩增曲线。

图25. 三重荧光定量 PCR 对数扩增曲线结果，曲线1为vcc基因对数扩增曲线，曲线2为toxR基因对数扩增曲线，曲线3为ipaH基因对数扩增曲线。

图26. 四重荧光定量 PCR 对数扩增曲线结果，曲线1为invA基因对数扩增曲线，曲线2为vcc基因对数扩增曲线，曲线3为ipaH基因对数扩增曲线，曲线4为hly基因对数扩增曲线。

图27. 四重荧光定量 PCR 对数扩增曲线结果，曲线1为invA基因对数扩增曲线，曲线2为vcc基因对数扩增曲线，曲线3为toxR基因对数扩增曲线，曲线4为ipaH基因对数扩增曲线。

具体实施方式

以下实施例中如无特殊说明，均为本领域常规实验试剂和常规操作步骤。

实施例1 五种致病菌检测引物的设计与筛选

1.1实验材料

本实验中使用ABI7500荧光定量PCR仪。主要工具酶类、生化试剂及试剂盒：

LB 肉汤、各种生化管、李氏增菌液等试剂购自广州环凯生物试剂有限公司。

细菌基因组 DNA 提取试剂盒（天根），DNA 回收试剂盒（天根），pGM-T19连接含试剂盒（含载体，连接酶）购自广州市瑞真生物科技有限公司，质粒 DNA 小量提取试剂盒（天根），离心管、玻璃试管、平皿、三角瓶等耗材购自广州市芸荟试验仪器公司；其他试剂均为分析纯常规试剂。

LB 固体培养基：在LB肉汤基础上加入比例为 15g/L的琼脂粉，混匀煮沸熔化灭菌。

营养肉汤 NB 培养基(1L)：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，pH7.4。

实验菌株来源及编号见表1

表 1 实验菌株及来源

1.2 引物和探针设计

荧光定量PCR 扩增菌特异靶基因的选用：沙门氏菌inv基因簇-编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白基因invA，单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因hly，副溶血性弧菌toxR基因，福氏志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因ipaH7，非O1群霍乱弧菌vcc基因。

于 NCBI 网站检索相应基因序列，用 Primer premier 5.0 软件设计多重引物和探针，详见表 2。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，合成后的引物用超纯水稀释10 mmol/mL溶液，-20 ℃保存。引物和探针序列如下：

表 2 引物和探针相关信息

1.3 invA，hly，toxR ，ipaH和vcc 基因的单重荧光定量PCR 扩增

荧光定量PCR 反应体系组成如下：

在 PCR 管中依次加入上述组分，总反应体系为 25μL，在荧光定量PCR 仪上进行扩增反应。

经过组合优化，各引物对和探针的浓度依次对应：invA引物对和探针：10μM/L和7.5μM/L；hly 引物对和探针：5μM/L和5μM/L；toxR引物对和探针：7.5μM/L和5μM/L；ipaH引物对和探针：5μM/L和5μM/L；vcc引物对和探针：10μM/L和7.5μM/L；所述致病菌为所选用引物对和探针所对应能检测的致病菌。

上述的单重荧光定量PCR反应体系的扩增方法，扩增条件为：95℃ 30s →（95℃ 5s → 60℃ 34s）× 40个循环。

1.4 引物和探针特异性检测

分别以实验菌株沙门氏菌，单核细胞增生李斯特氏菌，副溶血性弧菌，福氏志贺氏菌，非O1群霍乱弧菌的新鲜培养液（平板计数法测定含菌量为10⁷cfu/mL）2mL，以及表1中其它细菌，提取基因组 DNA 为模板，与表2中各对引物和探针进行荧光定量 PCR 反应，荧光定量PCR 体系和热循环参数同1.3。扩增结束观察对数扩增曲线结果，并分析保存结果。

结果表明：图1，图2，图3，图4，图5，只引起相应靶基因出现特异性对数扩增曲线，无任何非特异性扩增曲线，显示了良好的特异性。

由此本实验确定了5组特异性良好的引物和探针invA-Forword, Reverse, IN，hly-Forword, Reverse, IN，toxR-Forword, Reverse, IN，ipaH-Forword, Reverse, IN，vcc-Forword, Reverse, IN用于后续实验。

1.5 灵敏度检测

分别取实验菌鼠伤寒沙门氏菌，单核细胞增生李斯特氏菌，副溶血性弧菌，福氏志贺氏菌，非O1群霍乱弧菌的新鲜培养液（平板计数法测定含菌量为10⁷cfu/mL）2mL 用试剂盒提取基因组 DNA 做模板，用 ddH₂O 十倍梯度稀释，制取10⁷cfu/mL 浓度的模板，与各自的相应引物和探针进行荧光定量PCR 反应，荧光定量PCR 体系和热循环参数同1.3。扩增结束后对数扩增曲线结果，检测出菌液的最低浓度为荧光定量PCR 反应的灵敏度。

实验操作中未作说明的所有涉及活菌接种、DNA提取等操作的过程都在超净工作台内按无菌操作规程进行，所有带菌液体均高压灭菌无害化处理后丢弃。

结果表明: 由图6 至图10 可知，引物对和探针 invA-Forword, Reverse, IN 引发的荧光定量PCR 反应，可使鼠伤寒沙门氏菌检测灵敏度分别达到10¹cfu/m；单核细胞增生李斯特氏菌、福氏志贺氏菌、副溶血性弧菌和非O1群霍乱弧菌检测灵敏度也均达到10¹cfu/mL。

本研究中五种细菌单重荧光定量PCR 检测灵敏度在10¹cfu/mL，灵敏度很高。

实施例2 水产品中五种致病性细菌四重荧光定量PCR检测方法的建立

试验中所用到的材料、试剂等同实施例1。

1 多重荧光定量PCR 扩增

1.1 invA, hly, ipaH和vcc 基因的多重荧光定量PCR方法

先从二重荧光定量PCR 试验开始，两两组合，体系测试稳定后再引入第三组的模板、引物和探针，第四组的模板、引物和探针。

invA, hly, ipaH和vcc 基因的二重荧光定量PCR 扩增 PCR 反应体系组成如下：

模板为实验菌鼠伤寒沙门氏菌，单核细胞增生李斯特氏菌，福氏志贺氏菌，非O1群霍乱弧菌的10⁷cfu/mL浓度培养液 2mL 试剂盒法提取的基因组 DNA。在 PCR 管中依次加入上述组分，补加 dd H₂O 至总反应体系为 25μL，在荧光定量 PCR 仪上进行扩增反应。

经过组合优化，各引物对和探针的浓度依次对应：invA引物对和探针：10μM/L和7.5μM/L；hly 引物对和探针：5μM/L和5μM/L； ipaH引物对和探针：5μM/L和5μM/L；vcc引物对和探针：10μM/L和7.5μM/L；所述致病菌为所选用引物对和探针所对应能检测的致病菌。

上述的双重荧光定量PCR反应体系的扩增方法，扩增条件为：95℃ 30s →（95℃ 5s → 60℃ 34s）× 40个循环。

三重荧光定量PCR 多加一组 DNA 模板（1μL）和上下游引物各0.4μL，探针0.8μL，其余组分不变，引物和探针浓度为同上所述，补加 ddH₂O至总反应体系为25μL。

四重荧光定量PCR 为四组模板（各1μL）和相应上下游引物各0.4μL，探针0.8μL，其余组分不变，引物和探针浓度为同上所述，补加 ddH₂O至总反应体系为25μL。

1.2 invA, toxR, ipaH和vcc 基因的多重荧光定量PCR

先从二重荧光定量PCR 试验开始，两两组合，体系测试稳定后再引入第三组的模板、引物和探针、第四组的模板、引物和探针。

invA, toxR, ipaH和vcc 基因的二重荧光定量PCR 扩增 PCR 反应体系组成如下：

模板为实验菌鼠伤寒沙门氏菌，副溶血性弧菌，福氏志贺氏菌，非O1群霍乱弧菌的10⁷cfu/mL浓度培养液 2mL 试剂盒法提取的基因组 DNA。在 PCR 管中依次加入上述组分，补加 dd H₂O 至总反应体系为 25μL，在荧光定量 PCR 仪上进行扩增反应。

经过组合优化，各引物对和探针的浓度依次对应：invA引物对和探针：10μM/L和7.5μM/L；toxR引物对和探针：7.5μM/L和5μM/L；ipaH引物对和探针：5μM/L和5μM/L；vcc引物对和探针：10μM/L和7.5μM/L；所述致病菌为所选用引物对和探针所对应能检测的致病菌。

2 结果与分析

2.1 二重PCR扩增结果

实验菌鼠伤寒沙门氏菌，单核细胞增生李斯特氏菌，副溶血性弧菌，福氏志贺氏菌，非O1群霍乱弧菌的基因组模板，除单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌基因组模板不能组合以外，两两结合进行荧光定量PCR扩增，扩增体系和循环参数同前，结果见图11，图12，图13，图14，图15，图16，图17，图18。

结果表明：图11至图18中不同引物、探针和模板两两组合，都有相应特异性对数扩增扩增曲线，且无非特异性对数扩增曲线。

2.2 三重PCR扩增结果

实验菌鼠伤寒沙门氏菌，单核细胞增生李斯特氏菌，副溶血性弧菌，福氏志贺氏菌，非O1群霍乱弧菌的基因组模板，除单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌基因组模板不能组合以外，三种结合进行荧光定量PCR扩增，扩增体系和循环参数同前，结果见图19，图20，图21，图22，图23，图24，图25。

结果表明：图19，图20，图21，图22，图23，图24，图25中三对引物、探针和模板的组合均出现各自特异性对数扩增曲线，且曲线清晰。

2.3 四重PCR扩增结果

实验菌鼠伤寒沙门氏菌，单核细胞增生李斯特氏菌，福氏志贺氏菌，非O1群霍乱弧菌的基因组模板中四种结合进行荧光定量PCR扩增，扩增体系和循环参数同前，结果见图20。

实验菌鼠伤寒沙门氏菌，副溶血性弧菌，福氏志贺氏菌，非O1群霍乱弧菌的基因组模板中四种结合进行荧光定量PCR扩增，扩增体系和循环参数同前，结果见图26，图27。

结果表明：图26，图27中四对引物、探针和模板的组合均出现各自特异性特异性对数扩增曲线。

实施例3水产品中五种致病性细菌四重荧光定量PCR检测方法检验人工感染样品

试验中所用到的材料、试剂等同实施例1；四重荧光定量PCR检测反应体系和热循环参数同实施例2。

为了验证四重荧光定量PCR检测方法的有效性，本实施例分别检测22份用鼠伤寒沙门氏菌，单核细胞增生李斯特氏菌，副溶血性弧菌，福氏志贺氏菌，非O1群霍乱弧菌感染新鲜的样品。被感染的样品在37 ℃温度条件下振荡培养24小时。

结果表明：表3中菌株分离法的样品阳性检出率为100%（22/22），而且四重荧光定量PCR检测方法样品阳性检出率也为100%（22/22），两种方法检测结果完全符合。

结果表明：表4中菌株分离法的样品阳性检出率为100%（22/22），而且四重荧光定量PCR检测方法样品阳性检出率也为100%（22/22），两种方法检测结果完全符合。

表3菌株分离和四重荧光定量PCR检测两种方法分别检测四种病原菌感染的样品结果比较

S.S.表示沙门氏菌，M.P.L.表示单核增生性李斯特菌，S.F.表示福氏志贺氏菌V.C. 表示非O1群霍乱弧菌，阳性结果表示为+，阴性结果表示为-。

表4菌株分离和四重荧光定量PCR检测两种方法分别检测四种病原菌感染的样品结果比较

S.S.表示沙门氏菌，V.P.表示副溶血性弧菌，S.F.表示福氏志贺氏菌V.C. 表示非O1群霍乱弧菌，阳性结果表示为+，阴性结果表示为-。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针及检测方法

<130>

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcgtaattcg ccgccattg 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

attgtgggcg ccaagaga 18

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ataacgcgcc attgctccac gaatatg 27

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tggagtgaat gcagaaaatc cc 22

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcatcaaaag cagcttttac tttagta 27

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgtggcatat ggccgtcaag tttatt 26

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccagagtttg ttaaaaccgt tcc 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cagaagcagg ttcttcaact tca 23

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttgtactgtt gaacgcctaa gcccg 25

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttacctctaa ggggcataaa ctg 23

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggtaaatcag taaggatggt taattt 26

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttcctcgcta cctgtactcc ctgctt 26

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

attttgccaa accgctttg 19

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtgaaaatct tgctcttttt tatcc 25

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tattcgctcc aagatctttc cga 23

Claims

1.同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，所述的荧光定量PCR引物和探针由以下核苷酸序列组成：

invA组：引物对SEQ ID NO:1～2，探针SEQ ID NO:3；

hly组：引物对SEQ ID NO:4～5，探针：SEQ ID NO:6；

ipaH组：引物对SEQ ID NO:10～11，探针：SEQ ID NO:12；

vcc组：引物对SEQ ID NO:13～14，探针：SEQ ID NO:15；

或，由以下核苷酸序列组成：

invA组：引物对SEQ ID NO:1～2，探针SEQ ID NO:3；

toxR组：引物对SEQ ID NO:7～8，探针：SEQ ID NO:9；

ipaH组：引物对SEQ ID NO:10～11，探针：SEQ ID NO:12；

vcc组：引物对SEQ ID NO:13～14，探针：SEQ ID NO:15；

其中invA组引物对和探针用于检测沙门氏菌，hly组引物对和探针用于检测单核细胞增生李斯特氏菌，toxR组引物对和探针用于检测副溶血性弧菌，ipaH组引物对和探针用于检测福氏志贺氏菌，vcc组引物对和探针用于检测非O1群霍乱弧菌。

2.一种同时检测多种致病菌的多重荧光定量PCR反应体系，其特征在于反应体系为25μL，其中：Real-timePCRmix12.5μL；权利要求1所述的荧光定量PCR引物和探针，每条引物0.4μL，每条探针0.8μL；待检测样品DNA模板1.0μL；超纯水补足25μL；

其中引物和探针的浓度分别为：

invA组：引物对10μM/L，探针：7.5μM/L；

hly组：引物对5μM/L，探针：5μM/L；

toxR组：引物对7.5μM/L，探针：5μM/L；

ipaH组：引物对5μM/L，探针：5μM/L；

vcc组：引物对10μM/L，探针：7.5μM/L；

所述致病菌为选择的权利要求1所述引物对和探针所对应能检测的致病菌。

3.权利要求1所述同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针在制备农副产品致病菌检测试剂中的应用。