CN103243171A

CN103243171A - 一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及其试剂盒和引物

Info

Publication number: CN103243171A
Application number: CN2013102077535A
Authority: CN
Inventors: 陈万义; 任婧; 杭锋; 穆海菠; 艾连中; 郭本恒
Original assignee: Shanghai Bright Dairy and Food Co Ltd
Current assignee: Shanghai Bright Dairy and Food Co Ltd; Bright Dairy and Food Co Ltd
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2013-05-29
Publication date: 2013-08-14
Also published as: CN103966353A; CN103966353B

Abstract

本发明公开了一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及其试剂盒和引物。所述的方法包括以下步骤：（1）提取待测样品的基因组DNA；（2）以步骤（1）所得的基因组DNA为模板，以序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对进行PCR反应；和（3）检测步骤（2）所得反应产物中498bp单一扩增产物的存在。所述引物包括序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物。所述试剂盒包括所述引物。本发明的方法检测时间短，成本低，具有单一特异性，检测结果可靠，结果判定简单；为食品安全检测技术领域提供了一种简单快速灵敏的检测阪崎克罗诺杆菌的方法，对我国的食品安全具有重要意义。

Description

一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及其试剂盒和引物

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及其试剂盒和引物。

背景技术

阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）隶属于克罗诺杆菌属（原阪崎肠杆菌），是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性无芽孢杆菌。经临床研究发现阪崎克罗诺杆菌是克罗诺杆菌属临床感染病例中最常见的条件致病菌，阪崎克罗诺杆菌菌株能够引起婴儿致命的感染，致死率高达40%-80%。它通常能导致婴儿严重的临床症状，例如脑脓疡，脑膜炎，坏死性小肠结肠炎和全身性败血症。曾经有在婴儿配方粉中分离到阪崎克罗诺杆菌菌株的报道。阪崎克罗诺杆菌菌株是通过配方粉危害婴幼儿健康的重要条件性致病菌。新生婴儿或早产儿都存在通过食用污染有阪崎克罗诺杆菌进驻的婴儿配方粉而感染阪崎克罗诺杆菌菌株的风险。在污染环节调查中发现，整个婴幼儿配方粉生产工艺流程中，可检测到阪崎克罗诺杆菌的污染点占到全部取样点的31%。因此，对阪崎克罗诺杆菌菌株快速鉴定与鉴别是实现有效控制的基础。该菌在1980年被首次命名和定义后，又于2008年由一个种被重新分为阪崎克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.），属下分为5个新种（其中Cronobacter sakazakii称为新组合）、1个阪崎克罗诺杆菌基因种（Genomospeciese）和3个新亚种，到2012年阪崎克罗诺杆菌属经多序列比对发现，最终确定将该属分为7个种。尽管该菌的分类和名称已变，但目前的检测仍然沿用程序式的阪崎肠杆菌标准检测方法，以传统生化反应进行鉴定，一般需要18-24h，而且无法区分为哪一种，这显然已经不能满足对阪崎克罗诺杆菌菌株检测的需求。在鉴别方面，尽管已有扩增片段长度多态性分析（Amplified fragment length polymorphismas，AFLP）、16S rRNA全序列比较、DNA-DNA杂交实验及多位点测序等多种可靠方法，但这些根据遗传特征的分析方法耗时长、工作量大。因此，本领域目前仍然缺乏对阪崎克罗诺杆菌菌株的高效率的鉴定与鉴别方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的对阪崎克罗诺杆菌的检测方法耗时长、操作繁琐等缺陷，而提供一种新的检测阪崎克罗诺杆菌的方法及其试剂盒和引物。以本发明的方法检测阪崎克罗诺杆菌菌株，检测时间短，成本低，检测结果特异，结果判定简单，在实际应用中非常方便。

本发明提供的技术方案之一是：一种非疾病的诊断或治疗目的的检测阪崎克罗诺杆菌的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA；

（2）以步骤（1）所得的基因组DNA为模板，以序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对进行PCR反应；和

（3）检测步骤（2）所得反应产物中498bp单一扩增产物的存在。

根据本发明，步骤（1）中，所述的提取待测样品的基因组DNA的方法为本领域常规，如使用市售的各种基因组DNA提取试剂盒进行操作。

步骤（2）中，所述的PCR反应为本领域常规，只要能够扩增出阪崎克罗诺杆菌特异性的基因片段即可。

较佳地，所述PCR反应的反应体系包括：1×PCR反应缓冲液，10-15mmol/L Mg²⁺，0.2-0.3mmol/L dNTP，0.1-0.3μmol/L的序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，Taq酶0.01-0.1U/μL，和DNA模板10-100ng/μL。所述PCR反应的反应程序为：①94～95℃，3～5min；②94～95℃，20～40s；③60～62℃，30～40s；④68～72℃，30～40s；步骤②至④共30～35个循环；⑤68～72℃，7～10min；⑥4～15℃保存。

更佳地，所述PCR反应的反应体系包括：1×PCR反应缓冲液，12.5mmol/LMg²⁺，0.25mmol/L dNTP，0.2μmol/L的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的引物，Taq酶0.04U/μL，和DNA模板50ng/μL。所述PCR反应的反应程序为：①94℃，5min；②94℃，30s；③60℃，30s；④72℃，30s；步骤②至④共35个循环；⑤72℃，10min；⑥12℃保存。

步骤（3）中，所述的检测可以采用本领域常规的方法，优选为凝胶电泳检测法，可以是琼脂糖凝胶电泳，也可以是聚丙烯酰胺凝胶电泳。根据本领域常规可知，在本发明中，若步骤（2）所得的反应产物在498bp位置存在单一扩增产物，则说明待检样品中含有阪崎克罗诺杆菌菌株；若步骤（2）所得的反应产物在498bp位置不存在单一扩增产物，则说明待检样品中不含有阪崎克罗诺杆菌菌株。

本发明的方法尤其适用于检测食品中的阪崎克罗诺杆菌菌株，特别是奶粉中的阪崎克罗诺杆菌菌株。

本发明提供的技术方案之二是：一种检测阪崎克罗诺杆菌的引物对，其包括序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物。

本发明提供的技术方案之三是：一种检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒，其包括前述引物对。

本发明中，较佳地，所述的试剂盒还包括PCR缓冲液，Taq酶，dNTP溶液和Mg²⁺中的一种或多种。更佳地，所述的试剂盒还包括基因抽提试剂和/或阳性基因组DNA。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：采用本发明的检测方法及引物对和试剂盒检测阪崎克罗诺杆菌菌株，检测时间短、检测成本低、检测效率高；本发明的检测方法具有单一特异性，检测结果可靠，结果判定简单。本发明为食品安全检测技术领域提供了一种简单快速灵敏的检测阪崎克罗诺杆菌的方法及其试剂盒和引物，对我国的食品安全具有重要意义。

附图说明

图1为实施例1中PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后的实验结果。泳道1～32为：阪崎克罗诺杆菌（ATCC29544），鼠伤寒沙门氏菌（ATCC14023），肠炎沙门氏菌（ATCC13311），阴沟肠杆菌（ATCC13047），大肠杆菌（ATCC43889），大肠杆菌（ATCC25922），奇异变形杆菌（ATCC12453），普通变形杆菌（ATCC33420），枸橼酸杆菌（ATCC8090），肺炎克雷伯杆菌（ATCC27336），肺炎克雷伯杆菌（ATCC46114），宋志氏志贺氏菌（CMCC51334），痢疾志贺氏菌（CMCC51335），福氏志贺氏菌（ATCC51371），绿脓杆菌（CDCB32116），蜡样芽胞杆菌（ATCC1220），气味沙雷氏菌（ATCC33077），粘质沙雷氏菌（ATCC14040），恶臭假单胞菌（ATCC17485），产碱假单胞菌（IQCC12604），金黄色葡萄球菌（ATCC29213），金黄色葡萄球菌（ATCC8095），屎肠球菌（ATCC14025），粪肠球菌（ATCC49452），产气肠杆菌（ATCC13048），霍乱弧菌（SJTU32001），副溶血弧菌（ATCC17802），副溶血弧菌（ATCC33846），创伤弧菌（ATCC27562），单核增生李斯特菌（AB97021），单核增生李斯特菌（ATCC13313），无菌水，M为DNA Marker。

图2是实施列1中PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后的图谱结果。泳道1～44依次为：阪崎克罗诺杆菌（ATCC29544），阪崎克罗诺杆菌（BDCS001），阪崎克罗诺杆菌（BDCS002），阪崎克罗诺杆菌（BDCS003），阪崎克罗诺杆菌（BDCS004），阪崎克罗诺杆菌（BDCS005），阪崎克罗诺杆菌（BDCS006），阪崎克罗诺杆菌（BDCS007），阪崎克罗诺杆菌（BDCS008），阪崎克罗诺杆菌（BDCS009），阪崎克罗诺杆菌（BDCS010），阪崎克罗诺杆菌（BDCS011），阪崎克罗诺杆菌（BDCS012），阪崎克罗诺杆菌（BDCS013），阪崎克罗诺杆菌（BDCS014），阪崎克罗诺杆菌（BDCS015），阪崎克罗诺杆菌（BDCS016），阪崎克罗诺杆菌（BDCS017），阪崎克罗诺杆菌（BDCS018），阪崎克罗诺杆菌（BDCS019），阪崎克罗诺杆菌（BDCS020），阪崎克罗诺杆菌（BDCS021），阪崎克罗诺杆菌（BDCS022），阪崎克罗诺杆菌（BDCS023），阪崎克罗诺杆菌（BDCS024），阪崎克罗诺杆菌（BDCS025），阪崎克罗诺杆菌（BDCS026），阪崎克罗诺杆菌（BDCS027），阪崎克罗诺杆菌（BDCS028），阪崎克罗诺杆菌（BDCS029），阪崎克罗诺杆菌（BDCS030），阪崎克罗诺杆菌（BDCS031），阪崎克罗诺杆菌（BDCS032），阪崎克罗诺杆菌（BDCS033），阪崎克罗诺杆菌（BDCS034），阪崎克罗诺杆菌（BDCS035），阪崎克罗诺杆菌（BDCS036），阪崎克罗诺杆菌（BDCS037），阪崎克罗诺杆菌（BDCS038），阪崎克罗诺杆菌（BDCS039），阪崎克罗诺杆菌（BDCS040），阪崎克罗诺杆菌（BDCS041），阪崎克罗诺杆菌（BDCS042），阪崎克罗诺杆菌（BDCS043），无菌水；M为DNA Marker。

图3是实施例1中PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证引物灵敏度的实验图谱结果。泳道1～10依次为：711.0ng/PCR，71.1ng/PCR，7.11ng/PCR，711pg/PCR，71.1pg/PCR，7.11pg/PCR，711fg/PCR，71.1fg/PCR，7.11fg/PCR，ddH₂O，M为DNA Marker。

图4是实施例2中PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证人工污染实验的图谱结果。

图5是实施例3中PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证实际样品检测的实验图谱结果。其中，泳道1～30依次为：样品1～样品30，泳道31～32：ddH₂O，阪崎克罗诺杆菌（ATCC29544），M为DNA Marker。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中，所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。所用Marker购自天根生化科技（北京）有限公司，产品型号为Marker I（MD101）。

实施例1对阪崎克罗诺杆菌菌株的检测

（1）采用本发明的引物对和检测方法对阪崎克罗诺杆菌属标准菌株ATCC29544进行PCR检测。

所用引物对的序列如下：

SEN2-L：5’-ACTGGCTTGGGGCTAATA-3’（SEQ ID NO:1），

SEN2-R：5’-AGAGGCGGATAAATCTTGT-3’（SEQ ID NO:2）。

采用上述引物对，以阪崎克罗诺杆菌属标准菌株ATCC29544的基因组DNA为模板，进行PCR反应体系和反应程序的建立和优化，经过单因素、多因素试验和杂交试验，从而建立了适用于检测阪崎克罗诺杆菌菌株的反应体系及反应参数。

所述的PCR反应体系为：1×PCR反应缓冲液，10-15mmol/L Mg²⁺，0.2-0.3mmol/L dNTP，0.1-0.3μM引物SEN2-L，0.1-0.3μM引物SEN2-R，Taq酶0.05-0.1U/μL，DNA模板10-100ng/μL。所述的PCR扩增程序为：94-95℃预变性3-5min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：94-95℃变性30-40s，60-62℃退火30-40s，68-72℃延伸30-40s；循环共30-35个；循环结束后，68-72℃延伸7-10min，降温至4-15℃，结束。结果表明，在所述的反应体系和反应程序范围内都能得到单一的498bp的扩增产物。

最优的PCR反应体系为：1×PCR反应缓冲液，12.5mmol/L Mg²⁺，0.25mmol/L dNTP，0.2μM引物SEN2-L，0.2μM引物SEN2-R，Taq酶0.04U/μL，DNA模板40ng/μL。最优的PCR扩增程序为：94℃预变性5min，之后开始以下循环，每个循环的程序为：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；循环共35个；循环结束后，72℃延伸10min，降温至12℃，结束。在最优的反应体系和反应程序下，其在498bp左右的扩增产物的产量最高，电泳条带最明显、最清晰。

因此，本发明建立了最优的PCR检测方法如下：先加入16.1μL无菌水到反应管中，再依次加入10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L的Mg²⁺2.0μL，2.5mmol/L的dNTP1.0μL，5μM引物1.0μL，2.5U/μL Taq酶0.4μL，最后加模板溶液2μL，使得体系总体积为25μL，并以无菌水为模板作为反应的阴性对照。然后将反应管离心后，放入PCR反应仪中，按照以下PCR程序进行：在94℃预变性5min，接着作35个循环，每个循环的程序包括94℃变性30s，退火温度63℃，退火时间为30s，然后在72℃延伸30s，循环结束后在72℃延伸10min，最后降温至12℃，结束所有操作程序。

（2）特异性评价试验

取阪崎克罗诺杆菌标准菌株1株及42株分离菌株（如表1所示，表中所示菌株均为本领域的技术人员可通过公开的渠道获得的），按照基因组DNA模板提取方法，分别提取基因组DNA。提取过程如下：将阪崎克罗诺杆菌标准菌株和分离菌株等43株菌株（如表1所示）分别接种至5mL的TSB液体培养基中，在37℃培养8h后，取1mL菌液，放入1.5mL离心管中；之后在5,000r/min离心10min，弃上清液。用无菌双蒸水重新悬浮菌体，再在12,000r/min离心5min，收集菌体。离心洗涤后加入100μL无菌超纯水，在沸水浴中煮10min，立即取出，在-20℃放置10min。在37℃解冻后，12,000r/min离心5min，取上清液放置-20℃备用。

每株菌株的DNA溶液（DNA浓度50ng/μL）均取2μL作为PCR反应模板添加到PCR反应体系中进行扩增反应，反应采用前述最优的反应体系和最优的扩增程序。采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断在498bp位置是否存在单一扩增条带，结果见表1，电泳结果见图1和图2。

从表1中可知，除了阪崎克罗诺杆菌菌株的标准菌株和食品分离株外，其余阴性对照菌株均没有特异扩增条带。表1中，-：PCR结果为阴性；+：PCR结果为阳性。表1中阪崎克罗诺杆菌属(Cronobacter spp)使用了8株标准菌株，代表了该属内所有种的典型标准菌株。属内包括6个种(其中Cronobacter sakazakii称为新组合)，即阪崎克罗诺杆菌ATCC29544，丙二酸盐阳性阪崎克罗诺杆菌DSM18702，穆汀斯阪崎克罗诺杆菌ATCC51329，苏黎世阪崎克罗诺杆菌DSM18703，阪崎克罗诺杆菌基因种1NCTC9529和都柏林阪崎克罗诺杆菌。其中都柏林阪崎克罗诺杆菌包括三个亚种，即都柏林阪崎克罗诺杆菌都柏林亚种DSM18705，都柏林阪崎克罗诺杆菌洛桑亚种DSM18706和都柏林阪崎克罗诺杆菌乳粉亚种DSM18707。阪崎克罗诺杆菌属和肠杆菌属的亲缘关系最近，尤其和肠杆菌属内的阴沟肠杆菌亲缘关系最近。本次试验共使用了肠杆菌属标准菌株12株，志贺氏菌属标准菌株3株，沙雷氏菌属标准菌株2株，克雷伯属标准菌株2株，葡萄球菌属标准菌株2株，假单胞菌属标准菌株3株，李斯特菌属标准菌株2株，弧菌属标准菌株3株及分离菌株1株。所使用的这些菌株都是食源性致病菌，而且绝大多数都属于肠杆菌科的，它们和阪崎克罗诺杆菌菌株具有较近的亲缘关系。如果这些菌株经本发明的引物通过PCR实验后扩增不到特异的片段，那么其它的和阪崎阪崎克罗诺杆菌菌株亲缘关系较远的菌株更加难以扩增到目的片段（498bp），因此经过这些亲缘关系较近的菌株的系统生物学实验验证，充分保证了本发明所述检测方法和引物的特异性。上述结果充分证明本发明的方法能扩增阪崎克罗诺杆菌属内的任何菌株，而不会扩增除阪崎克罗诺杆菌属以外的其它任何菌株。

表1.特异性评价所用菌株及试验结果

（3）灵敏度评价试验

提取阪崎克罗诺杆菌属基因组的总DNA，经测定，阪崎克罗诺杆菌属基因组总DNA溶液的浓度为28.20μg/mL，用无菌水作10倍梯度稀释，共稀释10个梯度，每个浓度梯度分别取5μL加入PCR反应体系，采用前述最优的反应体系和最优的扩增程序进行PCR反应，凝胶电泳检测扩增产物，在凝胶成像仪中观察凝胶电泳结果，如图3所示，图中：泳道1～9：DNA模板浓度分别为711.0ng/PCR，71.1ng/PCR，7.11ng/PCR，711pg/PCR，71.1pg/PCR，7.11pg/PCR，711fg/PCR，71.1fg/PCR，7.11fg/PCR；泳道10：ddH₂O；M：DNA marker。由图3可知，在第6条泳道可以看到清晰的条带，所对应DNA浓度为7.11pg/PCR，而第7条泳道之后看不到扩增条带。因此，判定PCR检测灵敏度为7.11pg/PCR，具有较高的灵敏度。

实施例2

人工污染阪崎克罗诺杆菌标准菌株ATCC29544的检测

人工污染样品的制备：将100mL10%的脱脂乳溶液经灭菌后，分别取稀释度为10^-7，10^-8和10^-9的阪崎克罗诺杆菌ATCC29544纯培养菌液（440cfu，44cfu和4.4cfu）各1mL加入上述灭过菌的脱脂乳溶液。放置摇床上，在37℃，180r/min条件下培养，每隔2h取样1次，共培养10h。煮沸法（Chen,W.,S.Yu,C.Zhang,J.Zhang,C.Shi,Y.Hu,B.Suo,H.Cao,and X.Shi，2011，Development of a single base extension-tag microarray for the detection ofpathogenic Vibrio species in seafood.Applied microbiology and biotechnology89(6):1979-1990.）提取基因组DNA，采用前述最优的反应体系和最优的扩增程序进行PCR反应。结果如图4所示，由图4可以明显看出，人工接入440cfu阪崎克罗诺杆菌ATCC29544纯培养液的脱脂乳溶液经增菌培养4h后即可检测到该菌，人工接入44cfu和4.4cfu阪崎克罗诺杆菌ATCC29544纯培养液的脱脂乳溶液经增菌培养6h后即可检测到该菌。

实施例3

30份食品样品（包括奶粉和蔬菜等）均购于上海的农贸市场和大型超市。将50g样品添加到450mL缓冲蛋白胨水（buffer peptone water，BPW，pH8.0）增菌培养基中进行增菌培养，37℃增菌18h后每份样品取1mL放入1.5mL离心管中，并用煮沸法（Chen,W.,S.Yu,C.Zhang,J.Zhang,C.Shi,Y.Hu,B.Suo,H.Cao,and X.Shi，2011，Development of a single base extension-tagmicroarray for the detection of pathogenic Vibrio species in seafood.Appliedmicrobiology and biotechnology89(6):1979-1990.）提取基因组DNA，12，000rpm/min离心5min后取2.5μL上清液作为PCR模板，以无菌水作阴性对照，采用前述最优的反应体系和最优的扩增程序进行PCR检测。每个实验重复3次。同时，样品增菌18～24h后，按国标法GB4789．40—2010进行分离鉴定阪崎克罗诺杆菌，并将最后鉴定结果与PCR方法进行对照。如图5所示，经本方案建立的PCR检测方法进行检测，有7份样品检测到目的条带（498bp），而该7份样品经国标方法也分离到阪崎克罗诺杆菌菌株，由此可见本实验建立的方法具有非常高的可靠性。

Claims

1.一种非疾病的诊断或治疗目的的检测阪崎克罗诺杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反应的反应体系包括：1×PCR反应缓冲液，10-15mmol/L Mg²⁺，0.2-0.3mmol/L dNTP，0.1-0.3μmol/L的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，Taq酶0.01-0.1U/μL，和DNA模板10-100ng/μL；所述PCR反应的反应程序为：①94～95℃，3～5min；②94～95℃，20～40s；③60～62℃，30～40s；④68～72℃，30～40s；步骤②至④共30～35个循环；⑤68～72℃，7～10min；⑥4～15℃保存。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反应的反应体系包括：1×PCR反应缓冲液，12.5mmol/L Mg²⁺，0.25mmol/L dNTP，0.2μmol/L的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，Taq酶0.04U/μL，和DNA模板50ng/μL；所述PCR反应的反应程序为：①94℃，5min；②94℃，30s；③60℃，30s；④72℃，30s；步骤②至④共35个循环；⑤72℃，10min；⑥12℃保存。

4.一种检测阪崎克罗诺杆菌的引物对，其特征在于，其包括序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物。

5.一种检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求4所述的引物对。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括PCR缓冲液，Taq酶，dNTP溶液和Mg²⁺中的一种或多种。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括基因抽提试剂和/或阳性基因组DNA。