CN104450930B

CN104450930B - 一种副溶血性弧菌的分子检测方法及其应用

Info

Publication number: CN104450930B
Application number: CN201410803758.9A
Authority: CN
Inventors: 王建昌; 段永生; 李静; 孙晓霞; 胡连霞
Original assignee: Inspection And Quarantine Testing Center Of Hebei Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau
Current assignee: Fangchenggang Fenghe Quchen Agricultural Technology Co ltd
Priority date: 2014-12-23
Filing date: 2014-12-23
Publication date: 2018-04-03
Anticipated expiration: 2034-12-23
Also published as: CN104450930A

Abstract

本发明涉及一种副溶血性弧菌的分子检测方法，采用单引物等温扩增方法，以副溶血性弧菌gyrB基因特异序列为靶序列，SYBER GreenⅡ为荧光染料，实时荧光定量PCR检测扩增信号；本发明还涉及其应用。本发明的检测方法灵敏度高，特异性和敏感性强，对模板DNA要求较低，耗时短，方法简便。

Description

一种副溶血性弧菌的分子检测方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种副溶血性弧菌的分子检测方法及其应用。

背景技术

致病性弧菌(Pathogenic Vibrio)是一类重要的食源性病原菌，广泛地存在于自然水环境，特别是海水中，对海产品有较大程度的污染。在弧菌属中，危害较大或出现频率较高的是O1型霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌。人食用污染有该菌的海产品后可引起急性胃肠炎，严重时还可引起败血症。目前，在中国沿海地区的食物中毒病例中，副溶血性弧菌已成为微生物性食物中毒的首要病原菌。能够快速而准确地从海产食品中将副溶血弧菌鉴定出来，具有非常重要的医学意义。

目前，食品中副溶血性弧菌检验主要依据GB 4789.7-2013，SN/T 0173-2010对食品中的副溶血性弧菌进行检测，大约需要3～7d 的时间，且容易出现交叉污染和假阳性。分子生物学技术具有快速、直观、准确等优势，已在副溶血性弧菌检测中得到广泛应用。随着食品安全检测标准的提高，寻找更加快速、准确、便捷的检测技术显得至关重要。

Ward等（Ward LN, Bej AK.Detection of Vibrio parahaemolyticus inshellfish by use of multiplexed real-time PCR with TaqMan fluorescent probes[ J] .Applied and Environmental Microbiology , 2006, 72 :2031-2042 .）建立基于TaqMan 荧光探针的多重实时PCR方法检测贝类中的VP 的tlh、tdh、trh和ORF8 基因，试验结果证明，该方法可用于检测基因组DNA和细菌纯培养物，其灵敏度分别可达200 pg和1×10⁴ CFU/mL。Wataru 等（Wataru Yamazaki , Yuko umeda, Naoaki Misawa, et al.Development of a Loop-Mediated Isothermal Amplifi cation Assay for Sensitiveand Rapid Detect ion of the tdh and trh Genes of Vibrio parahaemolyti cus andRelatedVibrio Species[ J] .Applied and environmental microbiology ,2010 , 76:820-828 .）建立的检测副溶血弧菌的tdh和trh 基因的LAMP 方法检测tdh、trh1和trh2基因的灵敏度分别可达0.8、21.3、5.0 CFU/反应体系。而且该反应体系特异性强，与20种其他细菌同时检测，无交叉反应。彭帅等（彭帅,石磊.环介导恒温扩增法快速检测海产品中的副溶血弧菌[ J].生物技术通报,2011 (2):184-186.）采用环介导恒温扩增方法(LAMP)，针对副溶血弧菌的gyrB 基因设计特异引物进行对副溶血弧菌的检测，检测最低限可达到10CFU/mL，灵敏度可以达到0.1 pg 副溶血弧菌基因组DNA。

单引物等温扩增技术（Single primer isothermal amplification，SPIA）是近年报道的一种新型线性核酸等温扩增技术。该技术具有操作设备简单、高忠实性、高效率和有效防污染等优点。目前应用较成熟的单引物等温扩增技术均以病毒作为对象，其扩增后的检测方法为聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用此种方法检出的灵敏度低，易产生沉淀，且结果假阳性高，尤其不适应于原核微生物的扩增检出。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、耗时短、特异性强、灵敏度高且便于实时监控的副溶血性弧菌的分子检测方法，本发明还提供所述分子检测方法的应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案为：一种副溶血性弧菌的分子检测方法，采用单引物等温扩增方法，以副溶血性弧菌gyrB 基因特异序列为靶序列，SYBER GreenⅡ为荧光染料，实时荧光检测仪检测扩增的实时荧光信号，其具体过程包括如下步骤：

（1）取含副溶血性弧菌的待检样品，提取基因组DNA；

（2）建立阪崎肠杆菌的实时荧光单引物等温扩增25 μL反应体系：

RNA/DNA组合引物 5.6 μmol/L、Blocker 1.0 μmol/L、10×Bst Buffer 2.5μL、Bst DNA 聚合酶 12U、10×RNaseH Buffer 2.5μL、RNaseH 5U、dNTPs 0.2 mmol/L、MgCl25.0 mmol/L、RNase Inhibitor 16U、DNA模板1μL、SYBER GreenⅡ0.5μL，其余用灭菌DEPC水补足体系；

所述SYBER GreenⅡ为300倍稀释；

将DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99℃，90s处理后降温至60℃，迅速加入RNase H和Bst DNA聚合酶，在实时荧光定量PCR仪上57℃ 反应40min，反应过程中实时监测荧光信号；

（3）检测分析：分析检测数据。

优选的，所述引物选用GCGUGAA-GGTTTGACTGCC，5’端7nt碱基为RNA序列，3’端12nt碱基为DNA序列；Blocker CGGCGATGGGTG 3’端用生物素修饰，中间随机加上四个IXNA修饰。

优选的，所述IXNA包括A，C，G，T，U，mC六种堿基中的一种。

优选的，步骤（1）所述提取DNA方法采用普通热裂解法、蛋白酶K法、饱和酚法或商业化试剂盒法。

最优的，所述提取DNA方法采用商业化试剂盒法。

优选的，步骤（2）在实时荧光定量PCR仪上反应为80个循环，每循环30s。

本发明还涉及所述的分子检测方法在海产品食品中副溶血性弧菌检测的应用。

本发明所述XNA，即LNA，又称“锁核酸”（Locked nucleic acid，LNA），是一种经过修饰的类寡核苷酸衍生物，包括A，C，G，T，U，mC六种堿基。XNA结构中β-D-呋喃核糖的2'-O、4’-C位通过缩水作用形成刚性的结构。一般可见于A-DNA或RNA。

本发明的发明构思为：在单引物等温扩增技术的基础上加入荧光染料，建立实时荧光单引物等温扩增方法，可通过实时荧光检测仪对荧光信号进行实时检测，具有操作简单、耗时短、实时监控等优点。编码促旋酶的 gyrB 基因是单拷贝的看家基因，在区分和鉴定细菌近缘种方面，比非蛋白编码基因16S rDNA具有更高的分辨率

本发明的积极效果在于：

SPIA技术相对于其它检测方法有明显优势，首先是等温扩增，其反应无需温度循环等温条件下即可实现扩增反应使反应更方便省时；其次SPIA扩增具有较高的效率，因为在同一个模板分子上RNase H不需要等前一次合成结束即可进行引物RNA切割，新引物可以不断结合引发多个合成反应同时进行；然后该方法可以有效防污染，扩增产物污染造成假阳性的现象是常规核酸扩增技术（如PCR）常常出现的问题，而SPIA能有效防止这种污染，因为SPIA的DNA扩增产物缺少5’端引物区大部分序列，因此这些产物无法与引物结合进行扩增反应，从而有效避免了扩增产物污染的可能性；最后SPIA独特的依赖RNase H的特点，使其对RNA序列无直接扩增作用，因此可以在存在大量mRNA的情况下特异扩增基因组DNA序列，可以用于基因量的准确定量。SPIA技术的缺点是其引物合成相对复杂，因为引物为DNA和RNA组成的混合引物，因此在合成是较常规的单纯DNA或RNA引物合成相对复杂；且需要碱基修饰，因为blocker需要对碱基修饰以增强其与模板的结合力。

本发明在普通SPIA的基础上，采用加入特异性结合单链DNA的荧光染料SYBERGreenⅡ，以 gyrB 基因为靶序列，利用荧光仪进行实时监测扩增情况，建立了实时荧光SPIA检测方法。本发明可省去烦琐的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测过程，比PCR技术和普通SPIA技术省时省力，成为可以替代PCR的核酸扩增新技术。本发明应用实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌，建立了一种更为特异、敏感的分子检测实际样品中副溶血性弧菌的新技术，其反应时间仅为40min，实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌纯培养DNA的灵敏度为8.2fg/μL，对副溶血性弧菌菌悬液的检测灵敏度为1.35×10¹CFU/mL；对鳕鱼模拟样品中副溶血性弧菌的检出限是16 CFU/g。本发明的实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌灵敏度高，特异性和敏感性强，对模板DNA要求较低，耗时短，方法简便。

本发明中，当反应体系中只添加组合引物时，SPIA反应仍然能进行。在一些不需要特定位点终止的扩增反应中，可以不加任何引起链终止的序列，如扩增较短的核酸序列时，DNA聚合酶到模板末端自然终止。

本发明选用XNA，即LNA，又称“锁核酸”（Locked nucleic acid，LNA），是一种经过修饰的类寡核苷酸衍生物，这类核酸可以增加引物或探针的融解温度，加强其稳定性。

附图说明

图1本发明实施例中选用Pvrn和Blocker时的副溶血弧菌实时荧光SPIA反应结果；图1中1: Pvrn+Blocker; 2: DEPC H2O。

图2-5为副溶血性弧菌实时荧光SPIA引物特异性检测结果；

图2中，1: 副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus;2-7: 创伤弧菌Vibriovulnificus、霍乱弧菌Vibrio cholerae、拟态弧菌Vibrio mimicus、哈维氏斯弧菌Vibrio harveyi、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、鳗弧菌Vibrio anguillarum;8:空白对照(DEPC H₂O)；

图3中，1:副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus;2-7: 福氏志贺氏菌Shigellaflexneri、单核细胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium、大肠杆菌O157:H7 Escherichia coli O157：H7、蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus、小肠结肠炎耶儿森氏菌Yersinia enterocolitica;8: DEPC H₂O；

图4中，1:副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus;2-7: 大肠埃希氏菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus、弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii、河生肠杆菌Enterobacter amnigenus、粘质沙雷氏菌Serratia marcescens、粪肠球菌Enterococcus faecalis;8: DEPC H₂O；

图5中，1:副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus;2-7:乙型溶血性链球菌Streptococcus hemolytic-β、嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis、恶臭假单胞菌Pseudomonas putida、肺炎克雷伯Klebsiella pneumoniae pneumoniae、奇异变形杆菌Proteus mirabilis ;8: DEPC H₂O。

图6为不同模板DNA提取方法对副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测结果的比较；图6中1:试剂盒法;2:普通热裂解法;3:蛋白酶K法;4:饱和酚提取;5: DEPC H₂O。

图7为副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法的灵敏性试验结果；图7中，1: Vibrio parahaemolyticus; 2-5: 8.2×10²fg/μL、8.2×10¹fg/μL、8.2×10⁰fg/μL、8.2×10^-1fg/μL; 6: DEPC H₂O。

图8为实时荧光SPIA检测模拟样品中副溶血性弧菌的检出限分析结果；图8中，1:Vibrio parahaemolyticus; 2-5: 1.6×10³CFU/ g、1.6×10²CFU/ g、1.6×10¹CFU/ g、1.6×10⁰CFU/ g; 6: DEPC H₂O。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面将结合本发明实施例中的附图和具体实施方式，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实验均由河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心生物实验室完成。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1试验菌株

本实验所用菌株见表1。

表 1试验用菌株

注：ATCC购自美国菌种保藏中心; CICC购自中国工业微生物菌种保藏中心;CMCC购自中国药检所。

1.1.2主要试剂

BstDNA聚合酶、RNase H、RNA酶抑制剂、MgCl₂、dNTPs、SYBER GreenⅡ等购自于上海生工生物工程有限公司；基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；试验中所有培养基均购自北京陆桥有限责任公司；试验中所用到的鳕鱼样品购自当地超市。

1.1.3主要设备

ABI7500实时荧光PCR 仪（美国AB公司）、PCR扩增仪（Whatman T Gradient 基因扩增仪，德国Biometra公司）、核酸蛋白分析仪（Eppendorf Biophotometer plus，德国Eppendorf公司）等。

1.1.4RNA/DNA组合引物和Blocker的设计和合成

根据Genebank中副溶血性弧菌gyrB 基因（基因号：KC542972.1）己知序列，对其进行同源性分析，确定其保守序列，用Primer premier 5.0设计组合引物和相应链终止序列一套，如表2所示。组合引物和Blocker均由大连TAKARA公司合成。

表2实时荧光SPIA设计的引物

注：XNA，即LNA，又称“锁核酸”（Locked nucleic acid，LNA），是一种经过修饰的类寡核苷酸衍生物，包括A，C，G，T，U，mC六种堿基。

1.2 试验方法

1.2.1 副溶血性弧菌的培养

取保藏的副溶血性弧菌（CICC21617）在CHROM ID VIBRIO弧菌显色培养基上进行划线，恒温箱36℃培养12h，传代培养2次。挑取传代培养菌落接种至新鲜无菌的SPB肉汤中，36℃过夜培养。

1.2.2 副溶血性弧菌基因组DNA的提取

采用普通热裂解法、蛋白酶K法、饱和酚提取法和商业化试剂盒法对纯培养的副溶血性弧菌进行基因组DNA的提取，并测定浓度。

本发明所述的普通热裂解法步骤如下：

（1）取1 mL菌液转入1.5 mL Eppendorf离心管中5000-8000 rpm，离心5 min，弃上清。

（2）加入200 uL无菌DEPC水，振荡混匀，5000-8000 rpm，离心5 min，弃上清，重复操作一次。

（3）加入100 uL无菌DEPC水，振荡混匀，100℃水浴10 min，12000 rpm离心10 min，取上清，-20 ℃保存备用。

本发明所述的蛋白酶K法步骤如下：

①将1mL培养液以12，000 rpm，离心10分钟。弃去上清液，沉淀加蛋白酶K消化液50～100 μL，混匀，55℃水浴1～3 h。

②加等体积的饱和酚抽提1～2次，再加等体积的氯仿/异戊醇（49：1）抽提一次。

③上清加1/10体积4℃预冷的3 mol/L NaAC（pH 5.2），加2.5倍体积预冷的无水乙醇或等体积的异丙醇，-20℃放置5～10 min，14，000 rpm,离心15 min。

④小心吸弃或倒掉上清，沉淀加75%冰冷乙醇15，000 rpm，离心5 min洗涤1～2次。

⑤弃去上清，室温干燥后加DEPC水50 μL溶解，-20℃保存备用。

本发明所述的饱和酚提取法步骤如下：

①将1mL培养液以离心12000 rpm，10 min，收集菌体，加入裂解液50 µL，100℃水浴15 min，然后离心12000 rpm，10 min。

②取上清，加入等体积饱和酚混匀，室温15 min，稍加振荡，4℃离心12000 rpm ，30 min，吸取上层水相，此水相反复用酚抽提二次后，吸水相加入0.1 mL，3 mol/L醋酸钠(pH5.5)及0.2 mL 20℃预冷的无水乙醇，混匀后放置于20℃，至少1 h。

③4℃离心12000 rpm ，10 min，小心倒去上清，加入灭菌DEPC水溶解DNA，-20℃保存备用。

商业化试剂盒法：

选用天根细菌基因组DNA提取试剂盒，按试剂盒说明书进行基因组DNA的提取，并测定浓度。

⑴将1mL培养液10,000rpm，离心1min，尽量吸净上清液。

⑵向菌体沉淀中加入200µl 缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。

⑶向管中加入20µlProteinase K 溶液，混匀。

⑷加入220µl缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min, 溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

⑸加入220µl无水乙醇，充分振荡混匀15sec,此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

⑹将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm离心30sec，弃去收集管中的全部废液。将吸附柱CB3放回收集管中。

⑺向吸附柱CB3中加入500µl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

⑻向吸附柱CB3中加入600µl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

⑼重复操作步骤⑻。

⑽将吸附柱CB3放入收集管中，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

⑾将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200µl洗脱冲液TE，室温放置2-5min，12,000离心,2min，将溶液收集到离心管中。-20℃保存备用。

1.2.3 副溶血性弧菌实时荧光SPIA反应体系和反应条件的建立

建立副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测25 μL反应体系，针对设计的引物和Blocker组合，优化反应体系中RNA/DNA组合引物、Blocker、Bst DNA polymerase、RNaseH、dNTPs、MgCl₂、RNase Inhibitor和SYBER GreenⅡ的使用浓度，以期确定各组分的最佳工作浓度，建立副溶血性弧菌实时荧光SPIA最佳反应体系。

将副溶血性弧菌基因组DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99℃，90s处理后降温至60℃，迅速加入RNase H和Bst DNA聚合酶，在ABI7500实时荧光PCR 仪上55℃-65℃，反应40min（每循环30s，80个循环），反应过程中实时监测荧光信号，以期确定最佳反应温度，建立副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法。

1.2.4副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法的特异性分析

取表1中25株过夜培养菌悬液1 mL, 用热裂解法提取基因组DNA作为模板, 根据1.2.3中所建立的反应体系和条件进行检测，对所建立的实时荧光SPIA方法进行特异性分析。

1.2.5不同模板DNA提取方法对副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测结果的影响

使用1.2.2中四种方法提取副溶血性弧菌基因组DNA，作为模板进行实时荧光SPIA检测，以分析不同的DNA提取方法对检测结果的影响。

1.2.6 副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法的灵敏性分析

挑取CHROM ID VIBRIO弧菌显色培养基上，36 °C培养12 h的副溶血性弧菌单菌落，制备成一定浓度菌悬液。用生理盐水进行10倍系列稀释, 采用稀释平板法, 测定其纯培养物活菌数为1.35×10⁸CFU/mL; 同时取1 mL纯培养物直接用热裂解法提取副溶血性弧菌基因组DNA，测得DNA浓度为8.2×10¹ng/μL，用灭菌DEPC水进行10倍系列稀释，进行SPIA灵敏性试验。

1.2.7副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法在模拟样品中检出限分析

在鳕鱼样品中添加副溶血性弧菌作为模拟污染样品进行检出限分析。进行添加前，鳕鱼样品已按GB 4789.7-2013常规检验法证实副溶血性弧菌阴性。挑取CHROM IDVIBRIO弧菌显色培养基上，36 °C培养12 h的副溶血性弧菌单菌落，制备成一定浓度菌悬液，用生理盐水进行10倍系列稀释后，选取系列稀释浓度菌悬液1mL分别添加到各个鳕鱼样品匀浆中（10 g鳕鱼样品于90 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水中）。混匀，分别取1mL模拟样品，采用稀释平板法, 测定其活菌添加范围为1.6×10⁵CFU/mL-1.6×10^-2CFU/mL。分别取1mL模拟样品，直接用热裂解法提取副溶血性弧菌基因组DNA，进行副溶血性弧菌实时荧光SPIA方法对模拟污染鳕鱼样品的检出限分析。本实验重复3次。

2 结果与分析

2.1副溶血性弧菌实时荧光SPIA反应体系和反应条件的建立

如图1所示，经过各种反应体系和条件的优化，组合引物（Pvrn1+Blocker1）对副溶血性弧菌出现典型的荧光扩增曲线，且最佳反应体系为：RNA/DNA组合Pirmer 5.6 μmol/L、Blocker 1.0 μmol/L、10×Bst Buffer 2.5μL、Bst DNA polymerase 12U、10×RNaseHBuffer 2.5μL、RNaseH 5U、dNTPs 0.2 mmol/L、Mgcl₂ 5.0 mmol/L、RNase Inhibitor 16U、DNA模板1μL、SYBER GreenⅡ0.5μL（300×稀释），其余用灭菌DEPC水补足体系；最佳反应条件为57.0℃，反应40min。

2.2副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法的特异性分析

特异性试验结果显示，仅副溶血性弧菌出现典型的荧光扩增曲线，其他细菌检测均未产生扩增曲线。结果表明建立的副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法具有良好的特异性。具体结果如图2-5所示。

2.3不同模板DNA提取方法对副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测结果的影响

如图6所示，使用所建立的副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法对四种不同方法提取的模板DNA进行检测，均出现典型的扩增曲线，Ct值没有明显差异。实验表明，实时荧光SPIA方法检测副溶血性弧菌时对模板质量要求不苛刻，能适应广大的基层和现场检测。

2.5副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法的灵敏性试验

如图7所示，当DNA模板用量为8.2×10²-8.2×10⁰fg/μL时，即副溶血性弧菌浓度为1.35×10²-1.35×10¹CFU/mL时，均出现典型的扩增曲线；当模板用量为8.2×10^-1fg/μL时，即副溶血性弧菌浓度为1.35×10⁰CFU/mL则无扩增曲线。所以建立的实时荧光SPIA检测方法对副溶血性弧菌DNA的检测灵敏度为1.35×10⁰fg/μL，对副溶血性弧菌菌液的检测灵敏度为1.35×10¹CFU/mL。三次重复试验结果一致。

2.6 副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法在模拟样品中的检出限试验

如图8所示，当鳕鱼样品中细菌浓度为1.6×10¹CFU/g时，出现典型的扩增曲线；当鳕鱼样品中细菌浓度为1.6×10⁰CFU/ g时，则无扩增曲线。所以副溶血性弧菌实时荧光SPIA检测方法在鳕鱼模拟样品中检出限为16 CFU/ g。三次重复试验结果一致。

Claims

1.一种非疾病诊断目的的副溶血性弧菌的分子检测方法，其特征在于，采用单引物等温扩增方法，以副溶血性弧菌gyrB 基因特异序列为靶序列，SYBR GreenⅡ为荧光染料，实时荧光检测仪检测扩增的实时荧光信号，

其具体过程包括如下步骤：

（1）取含副溶血性弧菌的待检样品，提取基因组DNA；

（2）建立副溶血性弧菌的实时荧光单引物等温扩增25 μL反应体系：

RNA/DNA组合引物 5.6 μmol/L、Blocker 1.0 μmol/L、10×Bst Buffer 2.5μL、BstDNA 聚合酶 12U、10×RNaseH Buffer 2.5μL、RNaseH 5U、dNTPs 0.2 mmol/L、MgCl₂ 5.0mmol/L、RNase Inhibitor 16U、DNA模板1μL、SYBER GreenⅡ0.5μL，其余用灭菌DEPC水补足体系；

所述SYBR GreenⅡ为300倍稀释；

（3）检测分析：分析检测数据，

所述引物选用GCGUGAA-GGTTTGACTGCC，5’端7nt碱基为RNA序列，3’端12nt碱基为DNA序列；Blocker 选用CGGCGATGGGTG ，3’端用生物素修饰，中间随机加上四个锁核酸XNA修饰，

所述XNA包括A，C，G，T，U，mC六种碱基中的一种。

2.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的副溶血性弧菌的分子检测方法，其特征在于，步骤（1）提取DNA方法采用普通热裂解法、蛋白酶K法、饱和酚法或商业化试剂盒法。

3.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的副溶血性弧菌的分子检测方法，其特征在于，提取DNA方法采用商业化试剂盒法。

4.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的副溶血性弧菌的分子检测方法，其特征在于，步骤（2）在实时荧光定量PCR仪上反应为80个循环，每循环30s。

5.一种权利要求1-4任一项所述的分子检测方法在海产品食品中副溶血性弧菌检测的应用。