CN103952483B - 利用dpo-pcr方法检测溶藻弧菌的dpo引物序列及检测试剂盒 - Google Patents

利用dpo-pcr方法检测溶藻弧菌的dpo引物序列及检测试剂盒 Download PDF

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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明公开了一种利用DPO-PCR方法检测溶藻弧菌的DPO引物序列及检测试剂盒。选择溶藻弧菌collagenase基因为靶基因，设计DPO引物，其核苷酸序列为：VA-DPOF：5ˊ-TCGCGATTGCGACAACATTAA<u>IIIII</u>ACTGGCGT-3ˊ，VA-DPOR：5ˊ-ACAAACGCATCCACTGATTCTTTC<u>IIIII</u>TGGGGTGA-3ˊ；建立DPO-PCR检测方法，可对溶藻弧菌进行精确定性检测。本发明还涉及检测用试剂盒，含有如上所述的DPO引物对、阳性对照品、阴性对照品、Taq？DNA？Polymerase和PCR反应液，具有检测特异性高、准确性高、灵敏度好的优点。

Description

利用DPO-PCR方法检测溶藻弧菌的DPO引物序列及检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种利用DPO-PCR方法检测溶藻弧菌的DPO引物序列及检测试剂盒。
背景技术
溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）是一种嗜盐性革兰氏阴性菌，分布于河口和海洋环境中，是引起鱼、虾、贝等多种海水养殖动物致病和死亡的主要致病性弧菌，可引起伤口感染、胃肠炎和败血症等症状，严重威胁着水产养殖业的发展，造成的经济损失巨大。此外该菌对人的致病性也有大量报道，可引起人食物中毒、耳炎、腹渴等，己经引起人们的重视。近年来，国内外报道溶藻弧菌引起急性腹湾和食物中毒病例日益增多。溶藻弧菌在自然界中广泛分布，尤其以海产品中携带率最高，是一种重要的引起细菌性食物中毒的致病菌。世界上各个国家食品卫生法规中均把该菌列入法定检测项目，一经发现禁止进口和出口。
目前，对溶藻弧菌的检测仍主要依靠传统方法，即首先利用选择性培养基增菌，进而结合生化及血清学方法进行鉴定。传统方法检测结果准确，但是存在检测效率低、检测目标单一、灵敏度低且耗时长、操作繁琐等不足。为满足致病菌快速检测的要求，发展了酶联荧光免疫检测法(VIDAS-CHL)、酶免疫法(EIA)、聚合酶链式反应(PCR)、胶体金试纸条法、API生化鉴定试纸条法、环介导恒温扩增(LAMP)技术和实时荧光PCR等方法。其中，VIDAS-CHL法、EIA法、胶体金试纸法和API法均存在特异性差、灵敏度低等缺陷，而没有得到广泛应用；LAMP法，作为一种新兴的检测方法，尽管极大地提高了检测效率，又降低了检测成本，但是产生的假阳性率较高；PCR技术作为一种高度灵敏、快速简便的检测方法在诸多领域得到广泛应用，尤其在病原体检测方面取得了革命性的成果，成为核酸快速检测的一个金标准，并在此基础之上，又发展了DNA探针技术、实时荧光PCR技术和PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术等,而PCR引物的设计成为了制约该类检测方法成败的关键性因素。常规的PCR引物设计，不仅需要反复比对引物的特异性，而且需要优化引物的各项参数与反应条件，尤其是退火温度，以防止非特异性扩增，特别是涉及多重PCR时，需要大量的实验以验证检测方法的特异性，费时又费力。
Dualprimingoligonucleotide(DPO)引物设计方法，简化了建立常规PCR方法的操作步骤。该引物的设计分为两部分，中间用多聚次黄嘌呤肌苷连接，5'-端长18-25bp，3'-端长6-15bp。由于该类引物特殊的结构，引物自身以及引物间难形成二级结构且对退火温度不敏感，试验过程中不需要对引物进行筛选以及对退火温度进行优化。同时，DPO引物与模板发生错配的几率小，因为只要有3个以上碱基发生错配，就不会成功扩增，比常规PCR引物的特异性更强，所以利用DPO引物建立的PCR方法，其检测结果比常规PCR方法更为精确。
在此情况下，采用DPO引物建立DPO-PCR方法对致病性微生物实施精准检测，对保障公共卫生安全具有现实意义。本发明根据溶藻弧菌胶原酶collagenase靶基因的保守区设计合成了一对DPO引物，通过反应体系与反应条件的优化，建立了溶藻弧菌DPO-PCR精准检测方法。本发明可用于临床病例的快速诊断和流行病学调查，具有一定的实用性。
发明内容
基于以上不足之处，本发明的目的在于提供利用DPO-PCR方法检测溶藻弧菌的DPO引物序列及检测试剂盒。
本发明的目的通过以下技术实现：
一种基于DPO引物精准检测溶藻弧菌的PCR方法检测用引物对，
上引物VA-DPOF：如序列表SeqIDNo.1所示，
下引物VA-DPOR：如序列表SeqIDNo.2所示。
本发明还具有如下技术特征：
1、一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法制备阳性对照品的PCR扩增引物，
上引物VA-F：如序列表SeqIDNo.3所示，
下引物VA-R：如序列表SeqIDNo.4所示。
2、一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法阳性对照品pMD-T-collagenase的制备方法，包括以下步骤：
（1）、PCR模板的制备：溶藻弧菌基因组DNA的提取和纯化
（2）、选择溶藻弧菌collagenase基因作为靶基因，设计阳性对照品的PCR扩增引物：上引物VA-F，如序列表SeqIDNo.3所示和下引物VA-R，如序列表SeqIDNo.4所示，并进行靶基因的PCR扩增；
（3）、阳性对照品pMD-T-collagenase的制备；
步骤（2）中，靶基因的PCR反应体系如下：
10×PCR Buffer 2.5μL
dNTP (2.5mM for each) 2.0μL
VA-F(10μM) 1.0μL
VA-R(10μM) 1.0μL
Taq DNA Polymerase(5U/μL) 0.5μL
DNA模板 0.5μL
ddH2O 17.5μL
PCR的反应条件为：95℃5min；94℃15s、57.6℃20s、72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。
步骤（3）中，阳性对照品的制备过程，包括如下步骤：将步骤（2）中所得PCR产物与克隆载体pMD-19-Tvector连接，转化大肠杆菌感受态JM109，获得阳性克隆菌株，并制备质粒pMD-T-collagenase作为阳性对照品。
3、一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR检测方法，检测溶藻弧菌的PCR反应体系如下：
10×PCR Buffer (Mg2+ free) 2.5μL
dNTP 0.2mmol/L
Mg2+ 2.5mmol/L
VA-DPOF 0.2μmol/L
VA-DPOR 0.2μmol/L
Taq DNA Polymerase 1.5U
DNA模板 1μL
ddH2O 补充至25μL
PCR反应条件为：95℃5min；94℃15s、48℃～68℃20s、72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。
4、一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法检测用引物对VA-DPOF/VA-DPOR，对退火温度不敏感，有效温度范围为48℃～68℃。
5、一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法检测用试剂盒，
包括引物对：上引物VA-DPOF：如序列表SeqIDNo.1所示，
下引物VA-DPOR：如序列表SeqIDNo.2所示；
阳性对照品（pMD-T-collagenase）：如序列表SeqIDNo.5所示；
阴性对照品(ddH2O)和
PCR反应液：10×PCRBuffer(Mg2+free)；dNTP，Mg2+，上游引物VA-DPOF，下游引物VA-DPOR和TaqDNAPolymerase。
本发明分别以霍乱弧菌(ATCC14035)、副溶血弧菌(ATCC27519)、创伤弧菌(ATCC33149)、拟态弧菌分离株HC019、嗜水气单胞菌(ATCC7966)、空肠弯曲菌(ATCC33560)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、肠出血性大肠杆菌O157(ATCC35150)、粘质沙雷菌(ATCC14756)、阪崎肠杆菌(ATCC51329)、变形杆菌(ATCC49027)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(ATCC9610)、沙门氏菌(ATCC10708)、单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC19111)、威尔斯李斯特氏菌(ATCC35897)、志贺氏菌(ATCC12022)、溶藻弧菌(ATCC33839)的基因组DNA进行试验，以检验该方法的特异性。结果显示，本发明方法能够对溶藻弧菌进行特异性检测，且设计合成的引物对之间以及引物与其他细菌之间无交叉反应，证明本发明方法具有较强的检测特异性。本发明的试剂盒还具有快速简单、精准的优点。
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养的溶藻弧菌（菌体浓度为1.14×107CFU/mL）基因组DNA，进行10倍梯度稀释，从每级稀释液中各取1μL作为模板进行DPO-PCR检测。结果表明，该DPO-PCR方法检测溶藻弧菌的最低浓度为1.14×102CFU/mL，说明本发明方法具有高度的灵敏性。
利用本发明方法重复30次检测同一阳性标准品，检测结果均相同；两次（时间间隔60天）检测同一批次制备的阳性标准品，检测结果均相同，可见本发明方法具有良好的重复性和稳定性。
将本发明应用于检验检疫实践工作中，其结果与溶藻弧菌国标法（GB4789.10-2010）作为参考方法进行比较，验证该方法检测的可靠性与实用性。结果显示，利用建立的溶藻弧菌DPO-PCR检测方法对采集的65份牡蛎样本、70份生蚝样本、35份象牙蚌样本、46份螃蟹样本、90份虾样本、35份海蜇样本、82份扇贝样本和76份海产鱼类样本进行了检测，共检出11份溶藻弧菌阳性样本，检测结果与国标法（GB4789.10-2010）检测结果符合率为100%。
附图说明
图1是溶藻弧菌DPO-PCR检测方法的建立示意图，
其中，M为DNAMarker，1为DPO-PCR阳性结果，2为DPO-PCR阴性结果。
图2为溶藻弧菌DPO-PCR检测方法退火温度不敏感性结果示意图，
其中，M为DNAMarker，1为48.3℃，2为51.4℃，3为56.4℃，4为59.1℃，5为61.7℃，6为64.1℃，7为67.4℃，8为68℃。
图3为溶藻弧菌DPO-PCR检测方法特异性结果示意图，
其中，M为DNAmarker2000。1-17依次为：霍乱弧菌(ATCC14035)、副溶血弧菌(ATCC27519)、创伤弧菌(ATCC33149)、拟态弧菌分离株HC019、嗜水气单胞菌(ATCC7966)、空肠弯曲菌(ATCC33560)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、肠出血性大肠杆菌O157(ATCC35150)、粘质沙雷菌(ATCC14756)、阪崎肠杆菌(ATCC51329)、变形杆菌(ATCC49027)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(ATCC9610)、沙门氏菌(ATCC10708)、单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC19111)、威尔斯李斯特氏菌(ATCC35897)、志贺氏菌(ATCC12022)、溶藻弧菌(ATCC33839).
图4为溶藻弧菌DPO-PCR检测方法灵敏度结果示意图，
其中，M为DNAMarker100ladder；1为模板浓度1.14×107CFU/mL；2为模板浓度1.14×106CFU/mL；3为模板浓度1.14×105CFU/mL；4为模板浓度1.14×104CFU/mL；5为模板浓度1.14×103CFU/mL；6为模板浓度1.14×102CFU/mL；7为模板浓度1.14×101CFU/mL。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1溶藻弧菌DNA模板的制备
参照TIANampBacteriaDNAKit说明书进行细菌基因组DNA的提取和纯化，按顺序加入相应试剂：
（1）取1.5mL菌液，10000r/min离心1min，弃上清，加入200μL缓冲液GA，彻底悬浮菌体；
（2）加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)，并加入220μL缓冲液GB，充分混匀，70℃水浴作用10min；
（3）加入220μL无水乙醇，充分混匀15s，简短离心后将所得溶液（包括絮状沉淀）转移至吸附柱CB3中，12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；
（4）向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；
（5）向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；
（6）重复上步操作；
（7）将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min离心2min，室温放置2-5min，晾干残留的漂洗液；
（8）将吸附柱CB3转入新的收集管中，在吸附膜中央加入100μL缓冲液TE，室温放置2-5min，12000r/min离心2min，收集DNA洗脱液。
实施例2PCR引物的设计与合成
选择溶藻弧菌collagenase基因作为靶基因，并经过BLAST分析，设计合成下列引物：
（1）溶藻弧菌collagenase基因阳性对照品制备PCR扩增引物（PCR产物大小为911bp）：
VA-F：5′-CTGAAGATTTTGAGTGTCGCG-3′
VA-R：5′-CTCGCGTTACCCGTATACTTG-3′
（2）溶藻弧菌DPO-PCR方法鉴定用DPO引物（PCR产物大小为526bp）：
VA-DPOF：5′-TCGCGATTGCGACAACATTAAIIIIIACTGGCGT-3′，
VA-DPOR：5′-ACAAACGCATCCACTGATTCTTTCIIIIITGGGGTGA-3′。
实施例3阳性对照品的制备
利用靶基因扩增引物VA-F/VA-R，采用PCR法扩增溶藻弧菌collagenase基因，PCR的反应体系为：
10×PCR Buffer 2.5μL
dNTP (2.5mM for each) 2.0μL
VA-F(10μM) 1.0μL
VA-R(10μM) 1.0μL
TaqDNA Polymerase(5U/μL) 0.5μL
DNA模板 0.5μL
ddH2O 17.5μL
PCR的反应条件为：95℃5min；94℃15s、57.6℃20s、72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。
经琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，PCR产物大小为911bp。
将PCR产物与pMD-19-Tvector连接，转化感受态大肠杆菌JM109，获得阳性重组菌，参照华舜小量质粒DNA提取试剂盒说明书制备阳性质粒：
（1）挑取阳性克隆单菌落，接种于5mL含100μg/mLAmpr的LB培养基中，37℃培养过夜；
（2）取1～3mL过夜培养菌液，12000r/min离心5min，弃上清，加入250μL的BufferP1（含RNase）充分振荡菌体沉淀至其彻底悬浮；
（3）加入250μL的BufferP2，立即温和地上下颠倒离心管6-10次，混匀，室温静置2-4min；
（4）加入350μL的BufferP3，温和反复颠倒离心管6-10次，混匀，12000r/min离心10min；
（5）将上清液移入吸附柱中，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；
（6）加入500μLB1液，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；
（7）加入500μLW1液（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；
（8）加入500μLW1液（含无水乙醇），室温静置1min，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中，12000r/min空载离心1min；
（9）将吸附柱转移至一个洁净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入150μL去离子水，室温静置2min，12000r/min离心1min，洗脱收集质粒DNA。
将提取的质粒DNA进行定量，作为试剂盒阳性质控标准品-20℃保存备用。定量计算公式为：阳性质粒拷贝数copies/μL=(OD260×50×10-9×稀释倍数×6.02×1023)/(660×碱基数)，式中：50代表用直径1cm比色杯在OD260等于1时相对应的双链DNA浓度为50μg/mL；660代表双链DNA碱基对平均分子量。
实施例4DPO-PCR检测反应体系的建立与优化
反应体系为25μL：10×PCRBuffer(Mg2+free)2.5μL，将Mg2+、dNTP、TaqDNAPolymerase和引物制备成不同浓度的组合，用去离子水补充至25μL。Mg2+、dNTP、TaqDNAPolymerase和引物的浓度范围依次为：Mg2+浓度范围为1.0mmol/L-8.0mmol/L，以0.5mmol/L递增；dNTP浓度范围为0.1mmol/L-0.8mmol/L，以0.05mmol/L递增；TaqDNAPolymerase浓度范围为0.5U-3.5U，以0.5U单位递增；引物浓度范围为0.1μmol/L-0.6μmol/L，以0.1μmol/L递增，采用矩阵法进行对比试验，以确定最佳反应体系组成。经琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果，如图1所示。确定的溶藻弧菌DPO-PCR检测方法的反应体系为：
10×PCR Buffer (Mg2+ free) 2.5μL
dNTP 0.2mmol/L
Mg2+ 2.5mmol/L
VA-DPOF 0.2μmol/L
VA-DPOR 0.2μmol/L
TaqDNA Polymerase 1.5U
DNA模板 1μL
ddH2O 补充至25μL
确定溶藻弧菌DPO-PCR的反应条件为：95℃5min；94℃15s、48℃～68℃20s、72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。DPO-PCR对退火温度不敏感，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示。
实施例5DPO-PCR检测溶藻弧菌特异性试验
利用建立的溶藻弧菌DPO-PCR精准检测方法对霍乱弧菌(ATCC14035)、副溶血弧菌(ATCC27519)、创伤弧菌(ATCC33149)、拟态弧菌分离株HC019、嗜水气单胞菌(ATCC7966)、空肠弯曲菌(ATCC33560)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、肠出血性大肠杆菌O157(ATCC35150)、粘质沙雷菌(ATCC14756)、阪崎肠杆菌(ATCC51329)、变形杆菌(ATCC49027)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(ATCC9610)、沙门氏菌(ATCC10708)、单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC19111)、威尔斯李斯特氏菌(ATCC35897)、志贺氏菌(ATCC12022)、溶藻弧菌(ATCC33839)的基因组DNA进行试验，以检验该方法的特异性。结果显示，本发明方法能够对溶藻弧菌进行特异性的检测，且设计合成的引物对之间以及引物与其他细菌之间无交叉反应，证明本发明方法具有较强的检测特异性，结果如图3所示。
实施例6DPO-PCR检测溶藻弧菌灵敏度试验
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌体浓度约为1.14×107CFU/mL溶藻弧菌的基因组DNA，进行10倍梯度稀释，从每级稀释液中各取1μL作为模板利用建立的DPO-PCR方法进行检测，以确定该方法的检测灵敏性。结果显示，本发明方法具有高度的检测灵敏性，结果如图4所示。
实施例7DPO-PCR检测溶藻弧菌重复性试验
利用建立的溶藻弧菌DPO-PCR检测方法重复30次检测同一阳性标准品，考察该方法检测的重复性和稳定性。结果显示，每次检测结果均相同。
利用建立的溶藻弧菌DPO-PCR检测方法间隔60天检测同一批次制备的阳性标准品，考察该方法检测的重复性和稳定性。结果显示，两次检测结果均相同。
实施例8DPO-PCR检测溶藻弧菌实践验证试验
将建立的溶藻弧菌DPO-PCR检测方法应用于检验检疫实践工作中，对采集的65份牡蛎样本、70份生蚝样本、35份象牙蚌样本、46份螃蟹样本、90份虾样本、35份海蜇样本、82份扇贝样本和76份海产鱼类样本进行检测，其结果与溶藻弧菌国标法（GB4789.10-2010）进行比较，考察该方法检测的可靠性与实用性。结果显示，共检出11份溶藻弧菌阳性样本，检测结果与国标法（GB4789.10-2010）检测结果符合率为100%，结果如表1所示。
表1检测方法的实践应用结果
<110>海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>利用DPO-PCR方法检测溶藻弧菌的DPO引物序列及检测试剂盒
<160>5
<210>1
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>modified_base
<222>(22，23，24，25，26)
<223>I
<400>1
TCGCGATTGCGACAACATTAAIIIIIACTGGCGT34
<210>2
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>modified_base
<222>(25，26，27，28，29)
<223>I
<400>2
ACAAACGCATCCACTGATTCTTTCIIIIITGGGGTGA37
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
CTGAAGATTTTGAGTGTCGCG21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
CTCGCGTTACCCGTATACTTG21
<210>5
<211>3603
<212>DNA
<213>pMD-T-collagenase
<400>5
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCA60
CAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTG120
TTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGC180
ACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCC240
ATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTAT300
TACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGT360
TTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGAT420
CCTCTAGAGATCTGAAGATTTTGAGTGTCGCGATTGCGACAACATTAACCAGCACTGGCG480
TATTTGCGTTAAGCGAGCCAGTTTCTCAAGTTACAGAGCAACATGCACATTCGGCTCATA540
CACACGGTGTTGAATTCAATCGAGTTGAATACCAACCAACCGCAACTCTCCCAATTCAGC600
CCTCTAAGGCAACTCGAGTACAGTCACTTGAAAGCCTTGATGAGTCGAGCACTGCTTGTG660
ATTTGGAGGCATTGGTTACCGAAAGCAGTAACCAATTGATCAGCGAAATTTTAAGTCAGG720
GCGCGACGTGTGTGAACCAGTTATTCTCTGCTGAAAGTCGGATTCAAGAGTCGGTATTTA780
GCTCCGATCATATGTACAACATCGCTAAGCACACTACGACGTTGGCGAAGGGGTATACGG840
GTGGCGGGAGCGATGAACTAGAAACGTTGTTCTTATACTTACGCGCGGGTTATTACGCCG900
AGTTTTACAATGACAACATCTCATTTATTGAATGGGTCACCCCAGCGGTGAAAGAATCAG960
TGGATGCGTTTGTTAACACAGCAAGCTTCTACGAGAACAGCGACCGTCACGGCAAAGTGC1020
TTAGTGAGGTCATCATCACTATGGATAGTGCGGGCTTGCAGCACGCGTACTTACCGCAAG1080
TGACCCAGTGGCTTACTCGTTGGAATGATCAATACGCCCAGCACTGGTATATGCGCAATG1140
CGGTTAACGGTGTTTTCACTATTTTGTTTGGTGGGCAGTGGAACGAGCAATTTGTGCAAA1200
TAATTGGCAACCAAACGGACCTTGCCAAAGCTTTAGGCGATTTTGCTCTAAGGGCGTCAT1260
CAATCGGTGCTGAAGATGAGTTTATGGCCGCGAATGCGGGGCGAGAGCTCGGGCGTCTGA1320
CCAAGTATACGGGTAACGCGAGATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCAT1380
GGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAG1440
CCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTG1500
CGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAA1560
TCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCA1620
CTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGG1680
TAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCC1740
AGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCC1800
CCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGAC1860
TATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCC1920
TGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATA1980
GCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGC2040
ACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCA2100
ACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAG2160
CGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTA2220
GAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTG2280
GTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGC2340
AGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGT2400
CTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAA2460
GGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATAT2520
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGA2580
TCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATAC2640
GGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGG2700
CTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTG2760
CAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTT2820
CGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCT2880
CGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGAT2940
CCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTA3000
AGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCA3060
TGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAAT3120
AGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCAC3180
ATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAA3240
GGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTT3300
CAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCG3360
CAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAAT3420
ATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTT3480
AGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCT3540
AAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTC3600
GTC3603

Claims (4)

1.一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法检测用引物对，其特征在于，
上引物VA-DPOF：如序列表SeqIDNo.1所示，
下引物VA-DPOR：如序列表SeqIDNo.2所示。
2.一种用于非疾病诊断目的的基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR检测方法，其特征在于，
检测溶藻弧菌的PCR反应体系如下：
；
PCR反应条件为：95℃5min；94℃15s、48℃～68℃20s、72℃30s，35个循环；72℃延伸10min；
所述的上引物VA-DPOF：如序列表SeqIDNo.1所示，下引物VA-DPOR：如序列表SeqIDNo.2所示。
3.根据权利要求1所述的一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法检测用引物对，其特征在于，所述的引物对退火温度不敏感，有效温度范围为48℃～68℃。
4.一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法检测用试剂盒，其特征在于，
包括引物对：上引物VA-DPOF：如序列表SeqIDNo.1所示，
下引物VA-DPOR：如序列表SeqIDNo.2所示；
阳性对照品pMD-T-collagenase：如序列表SeqIDNo.5所示；
阴性对照品ddH2O和
PCR反应液：Mg2+free的10×PCRBuffer；dNTP，Mg2+，上游引物VA-DPOF，下游引物VA-DPOR和TaqDNAPolymerase。
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