CN103952483A

CN103952483A - 利用dpo-pcr方法检测溶藻弧菌的dpo引物序列及检测试剂盒

Info

Publication number: CN103952483A
Application number: CN201410162619.2A
Authority: CN
Inventors: 李丹丹; 徐义刚; 高慎阳; 王绥家
Original assignee: Inspection And Quarantine Center Of Hainan Entry-Exit Inspection And Quarantine
Current assignee: Inspection And Quarantine Center Of Hainan Entry-Exit Inspection And Quarantine
Priority date: 2014-04-21
Filing date: 2014-04-21
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2034-04-21
Also published as: CN103952483B

Abstract

本发明公开了一种利用DPO-PCR方法检测溶藻弧菌的DPO引物序列及检测试剂盒。选择溶藻弧菌collagenase基因为靶基因，设计DPO引物，其核苷酸序列为：VA-DPOF：5′-TCGCGATTGCGACAACATTAAIIIIIACTGGCGT-3′，VA-DPOR：5′-ACAAACGCATCCACTGATTCTTTCIIIIITGGGGTGA-3′；建立DPO-PCR检测方法，可对溶藻弧菌进行精确定性检测。本发明还涉及检测用试剂盒，含有如上所述的DPO引物对、阳性对照品、阴性对照品、TaqDNAPolymerase和PCR反应液，具有检测特异性高、准确性高、灵敏度好的优点。

Description

利用DPO-PCR方法检测溶藻弧菌的DPO引物序列及检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种利用DPO-PCR方法检测溶藻弧菌的DPO引物序列及检测试剂盒。

背景技术

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是一种嗜盐性革兰氏阴性菌，分布于河口和海洋环境中，是引起鱼、虾、贝等多种海水养殖动物致病和死亡的主要致病性弧菌，可引起伤口感染、胃肠炎和败血症等症状，严重威胁着水产养殖业的发展，造成的经济损失巨大。此外该菌对人的致病性也有大量报道，可引起人食物中毒、耳炎、腹渴等，己经引起人们的重视。近年来，国内外报道溶藻弧菌引起急性腹湾和食物中毒病例日益增多。溶藻弧菌在自然界中广泛分布，尤其以海产品中携带率最高，是一种重要的引起细菌性食物中毒的致病菌。世界上各个国家食品卫生法规中均把该菌列入法定检测项目，一经发现禁止进口和出口。

目前，对溶藻弧菌的检测仍主要依靠传统方法，即首先利用选择性培养基增菌，进而结合生化及血清学方法进行鉴定。传统方法检测结果准确，但是存在检测效率低、检测目标单一、灵敏度低且耗时长、操作繁琐等不足。为满足致病菌快速检测的要求，发展了酶联荧光免疫检测法(VIDAS-CHL)、酶免疫法(EIA)、聚合酶链式反应(PCR)、胶体金试纸条法、API生化鉴定试纸条法、环介导恒温扩增(LAMP)技术和实时荧光PCR等方法。其中，VIDAS-CHL法、EIA法、胶体金试纸法和API法均存在特异性差、灵敏度低等缺陷，而没有得到广泛应用；LAMP法，作为一种新兴的检测方法，尽管极大地提高了检测效率，又降低了检测成本，但是产生的假阳性率较高；PCR技术作为一种高度灵敏、快速简便的检测方法在诸多领域得到广泛应用，尤其在病原体检测方面取得了革命性的成果，成为核酸快速检测的一个金标准，并在此基础之上，又发展了DNA探针技术、实时荧光PCR技术和PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术等, 而PCR引物的设计成为了制约该类检测方法成败的关键性因素。常规的PCR引物设计，不仅需要反复比对引物的特异性，而且需要优化引物的各项参数与反应条件，尤其是退火温度，以防止非特异性扩增，特别是涉及多重PCR时，需要大量的实验以验证检测方法的特异性，费时又费力。

Dual priming oligonucleotide (DPO) 引物设计方法，简化了建立常规PCR方法的操作步骤。该引物的设计分为两部分，中间用多聚次黄嘌呤肌苷连接，5'-端长18-25bp，3'-端长6-15bp。由于该类引物特殊的结构，引物自身以及引物间难形成二级结构且对退火温度不敏感，试验过程中不需要对引物进行筛选以及对退火温度进行优化。同时，DPO引物与模板发生错配的几率小，因为只要有3个以上碱基发生错配，就不会成功扩增，比常规PCR引物的特异性更强，所以利用DPO引物建立的PCR方法，其检测结果比常规PCR方法更为精确。

在此情况下，采用DPO引物建立DPO-PCR方法对致病性微生物实施精准检测，对保障公共卫生安全具有现实意义。本发明根据溶藻弧菌胶原酶collagenase靶基因的保守区设计合成了一对DPO引物，通过反应体系与反应条件的优化，建立了溶藻弧菌DPO-PCR精准检测方法。本发明可用于临床病例的快速诊断和流行病学调查，具有一定的实用性。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的在于提供利用DPO-PCR方法检测溶藻弧菌的DPO引物序列及检测试剂盒。

本发明的目的通过以下技术实现：

一种基于DPO引物精准检测溶藻弧菌的PCR方法检测用引物对，

上引物VA-DPOF：如序列表Seq ID No.1所示，

下引物VA-DPOR：如序列表Seq ID No.2所示。

本发明还具有如下技术特征：

1、一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法制备阳性对照品的PCR扩增引物，

上引物VA-F：如序列表Seq ID No.3所示，

下引物VA-R：如序列表Seq ID No.4所示。

2、一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法阳性对照品pMD-T-collagenase的制备方法，包括以下步骤：

（1）、PCR模板的制备：溶藻弧菌基因组DNA的提取和纯化

（2）、选择溶藻弧菌collagenase基因作为靶基因，设计阳性对照品的PCR扩增引物：上引物VA-F ，如序列表Seq ID No.3所示和下引物VA-R，如序列表Seq ID No.4所示，并进行靶基因的PCR扩增；

（3）、阳性对照品pMD-T-collagenase的制备；

步骤（2）中，靶基因的PCR反应体系如下：

10×PCR Buffer	2.5μL
		dNTP (2.5mM for each)	2.0μL
VA-F(10μM)	1.0μL
		VA-R(10μM)	1.0μL
Taq DNA Polymerase(5U/μL)	0.5μL
		DNA模板	0.5μL
ddH₂O	17.5μL

PCR的反应条件为：95℃ 5min；94℃ 15s、57.6℃ 20s、72℃ 30s，35个循环；72℃延伸10min。

步骤（3）中，阳性对照品的制备过程，包括如下步骤：将步骤（2）中所得PCR产物与克隆载体pMD-19-T vector连接，转化大肠杆菌感受态JM109，获得阳性克隆菌株，并制备质粒pMD-T-collagenase作为阳性对照品。

3、一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR检测方法，检测溶藻弧菌的PCR反应体系如下：

10×PCR Buffer (Mg²⁺ free)	2.5μL
		dNTP	0.2mmol/L
Mg²⁺	2.5mmol/L
		VA-DPOF	0.2μmol/L
VA-DPOR	0.2μmol/L
		Taq DNA Polymerase	1.5U
DNA模板	1μL
		ddH₂O	补充至25μL

PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 15s、48℃～68℃ 20s、72℃ 30s，35个循环；72℃延伸10min。

4、一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法检测用引物对VA-DPOF/VA-DPOR，对退火温度不敏感，有效温度范围为48℃～68℃。

5、一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法检测用试剂盒，

包括引物对：上引物VA-DPOF：如序列表Seq ID No.1所示，

下引物VA-DPOR：如序列表Seq ID No.2所示；

阳性对照品（pMD-T-collagenase）：如序列表Seq ID No.5所示；

阴性对照品(ddH₂O)和

PCR反应液：10×PCR Buffer(Mg²⁺ free)；dNTP，Mg²⁺，上游引物VA-DPOF，下游引物VA-DPOR和Taq DNA Polymerase。

本发明分别以霍乱弧菌(ATCC 14035)、副溶血弧菌(ATCC 27519)、创伤弧菌(ATCC 33149)、拟态弧菌分离株HC019、嗜水气单胞菌(ATCC 7966)、空肠弯曲菌(ATCC 33560)、金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)、肠出血性大肠杆菌 O157(ATCC 35150)、粘质沙雷菌 (ATCC 14756)、阪崎肠杆菌(ATCC 51329)、变形杆菌(ATCC 49027)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(ATCC 9610)、沙门氏菌(ATCC 10708)、单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC 19111)、威尔斯李斯特氏菌(ATCC 35897)、志贺氏菌(ATCC 12022)、溶藻弧菌(ATCC 33839)的基因组DNA进行试验，以检验该方法的特异性。结果显示，本发明方法能够对溶藻弧菌进行特异性检测，且设计合成的引物对之间以及引物与其他细菌之间无交叉反应，证明本发明方法具有较强的检测特异性。本发明的试剂盒还具有快速简单、精准的优点。

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养的溶藻弧菌（菌体浓度为1.14×10⁷CFU/mL）基因组DNA，进行10倍梯度稀释，从每级稀释液中各取1μL作为模板进行DPO-PCR检测。结果表明，该DPO-PCR方法检测溶藻弧菌的最低浓度为1.14×10²CFU/mL，说明本发明方法具有高度的灵敏性。

利用本发明方法重复30次检测同一阳性标准品，检测结果均相同；两次（时间间隔60天）检测同一批次制备的阳性标准品，检测结果均相同，可见本发明方法具有良好的重复性和稳定性。

将本发明应用于检验检疫实践工作中，其结果与溶藻弧菌国标法（GB 4789.10-2010）作为参考方法进行比较，验证该方法检测的可靠性与实用性。结果显示，利用建立的溶藻弧菌DPO-PCR检测方法对采集的65份牡蛎样本、70份生蚝样本、35份象牙蚌样本、46份螃蟹样本、90份虾样本、35份海蜇样本、82份扇贝样本和76份海产鱼类样本进行了检测，共检出11份溶藻弧菌阳性样本，检测结果与国标法（GB 4789.10-2010）检测结果符合率为100%。

附图说明

图1是溶藻弧菌DPO-PCR检测方法的建立示意图，

其中，M为DNA Marker，1为DPO-PCR阳性结果，2为DPO-PCR阴性结果。

图2为溶藻弧菌DPO-PCR检测方法退火温度不敏感性结果示意图，

其中，M为DNA Marker，1为48.3℃，2为51.4℃，3为56.4℃，4为59.1℃，5为61.7℃，6为64.1℃，7为67.4℃，8为68℃。

图3为溶藻弧菌DPO-PCR检测方法特异性结果示意图，

其中，M为DNA marker 2000。1-17依次为：霍乱弧菌(ATCC 14035)、副溶血弧菌(ATCC 27519)、创伤弧菌(ATCC 33149)、拟态弧菌分离株HC019、嗜水气单胞菌(ATCC 7966)、空肠弯曲菌(ATCC 33560)、金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)、肠出血性大肠杆菌 O157(ATCC 35150)、粘质沙雷菌 (ATCC 14756)、阪崎肠杆菌(ATCC 51329)、变形杆菌(ATCC 49027)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(ATCC 9610)、沙门氏菌(ATCC 10708)、单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC 19111)、威尔斯李斯特氏菌(ATCC 35897)、志贺氏菌(ATCC 12022)、溶藻弧菌(ATCC 33839).

图4为溶藻弧菌DPO-PCR检测方法灵敏度结果示意图，

其中，M为DNA Marker 100 ladder；1为模板浓度 1.14×10⁷CFU/mL；2为模板浓度 1.14×10⁶CFU/mL；3为模板浓度1.14×10⁵CFU/mL；4为模板浓度1.14×10⁴CFU/mL；5为模板浓度1.14×10³CFU/mL；6为模板浓度 1.14×10²CFU/mL；7为模板浓度 1.14×10¹CFU/mL。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1 溶藻弧菌DNA模板的制备

参照TIANamp Bacteria DNA Kit 说明书进行细菌基因组DNA的提取和纯化，按顺序加入相应试剂：

（1）取1.5mL菌液，10000r/min 离心1min，弃上清，加入200μL缓冲液GA，彻底悬浮菌体；

（2）加入20μL蛋白酶K (20mg/mL)，并加入220μL 缓冲液GB，充分混匀，70℃水浴作用10min；

（3）加入220μL无水乙醇，充分混匀15s，简短离心后将所得溶液（包括絮状沉淀）转移至吸附柱CB3中，12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；

（4）向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；

（5）向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；

（6）重复上步操作；

（7）将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min离心2min，室温放置2-5min，晾干残留的漂洗液；

（8）将吸附柱CB3转入新的收集管中，在吸附膜中央加入100μL缓冲液TE，室温放置2-5min，12000r/min离心2min，收集DNA洗脱液。

实施例2 PCR引物的设计与合成

选择溶藻弧菌collagenase基因作为靶基因，并经过BLAST分析，设计合成下列引物：

（1）溶藻弧菌collagenase基因阳性对照品制备PCR扩增引物（PCR产物大小为911bp）：

VA-F：5′- CTGAAGATTTTGAGTGTCGCG -3′

VA-R：5′- CTCGCGTTACCCGTATACTTG -3′

（2）溶藻弧菌DPO-PCR方法鉴定用DPO引物（PCR产物大小为526bp）：

VA-DPOF：5′- TCGCGATTGCGACAACATTAAIIIIIACTGGCGT -3′，

VA-DPOR：5′- ACAAACGCATCCACTGATTCTTTCIIIIITGGGGTGA -3′。

实施例3 阳性对照品的制备

利用靶基因扩增引物VA-F/VA-R，采用PCR法扩增溶藻弧菌collagenase基因，PCR的反应体系为：

10×PCR Buffer	2.5μL
		dNTP (2.5mM for each)	2.0μL
VA-F(10μM)	1.0μL
		VA-R(10μM)	1.0μL
TaqDNA Polymerase(5U/μL)	0.5μL
		DNA模板	0.5μL
ddH₂O	17.5μL

经琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，PCR产物大小为911bp。

将PCR产物与pMD-19-T vector连接，转化感受态大肠杆菌JM109，获得阳性重组菌，参照华舜小量质粒DNA提取试剂盒说明书制备阳性质粒：

（1）挑取阳性克隆单菌落，接种于5mL含100μg/mL Amp^r的LB培养基中，37℃培养过夜；

（2）取1～3mL过夜培养菌液，12000r/min离心5min，弃上清，加入250μL 的Buffer P1（含RNase）充分振荡菌体沉淀至其彻底悬浮；

（3）加入250μL 的Buffer P2，立即温和地上下颠倒离心管6-10次，混匀，室温静置2-4min；

（4）加入350μL 的Buffer P3，温和反复颠倒离心管6-10次，混匀，12000r/min离心10min；

（5）将上清液移入吸附柱中，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；

（6）加入500μL B1液，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；

（7）加入500μL W1液（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；

（8）加入500μL W1液（含无水乙醇），室温静置1min，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中，12000r/min空载离心1min；

（9）将吸附柱转移至一个洁净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入150μL去离子水，室温静置2min，12000r/min离心1min，洗脱收集质粒DNA。

将提取的质粒DNA进行定量，作为试剂盒阳性质控标准品-20℃保存备用。定量计算公式为：阳性质粒拷贝数copies/μL= (OD₂₆₀×50×10^-9×稀释倍数×6.02×10²³) / (660×碱基数)，式中：50代表用直径1cm比色杯在OD₂₆₀等于1时相对应的双链DNA浓度为50μg/mL；660代表双链DNA碱基对平均分子量。

实施例4 DPO-PCR检测反应体系的建立与优化

反应体系为25μL：10×PCR Buffer (Mg²⁺free) 2.5μL，将Mg²⁺、dNTP、Taq DNA Polymerase和引物制备成不同浓度的组合，用去离子水补充至25μL。Mg²⁺、dNTP、Taq DNA Polymerase和引物的浓度范围依次为：Mg²⁺浓度范围为1.0mmol/L-8.0mmol/L，以0.5mmol/L递增；dNTP浓度范围为0.1 mmol/L-0.8mmol/L，以0.05mmol/L递增；Taq DNA Polymerase浓度范围为0.5U-3.5U，以0.5U单位递增；引物浓度范围为0.1μmol/L-0.6μmol/L，以0.1μmol/L递增，采用矩阵法进行对比试验，以确定最佳反应体系组成。经琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果，如图1所示。确定的溶藻弧菌DPO-PCR检测方法的反应体系为：

10×PCR Buffer (Mg²⁺ free)	2.5μL
		dNTP	0.2mmol/L
Mg²⁺	2.5mmol/L
		VA-DPOF	0.2μmol/L
VA-DPOR	0.2μmol/L
		TaqDNA Polymerase	1.5U
DNA模板	1μL
		ddH₂O	补充至25μL

确定溶藻弧菌DPO-PCR的反应条件为：95℃ 5min；94℃ 15s、48℃～68℃20s、72℃ 30s，35个循环；72℃延伸10min。DPO-PCR对退火温度不敏感，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示。

实施例5 DPO-PCR检测溶藻弧菌特异性试验

利用建立的溶藻弧菌DPO-PCR精准检测方法对霍乱弧菌(ATCC 14035)、副溶血弧菌(ATCC 27519)、创伤弧菌(ATCC 33149)、拟态弧菌分离株HC019、嗜水气单胞菌(ATCC 7966)、空肠弯曲菌(ATCC 33560)、金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)、肠出血性大肠杆菌 O157(ATCC 35150)、粘质沙雷菌 (ATCC 14756)、阪崎肠杆菌(ATCC 51329)、变形杆菌(ATCC 49027)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(ATCC 9610)、沙门氏菌(ATCC 10708)、单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC 19111)、威尔斯李斯特氏菌(ATCC 35897)、志贺氏菌(ATCC 12022)、溶藻弧菌(ATCC 33839)的基因组DNA进行试验，以检验该方法的特异性。结果显示，本发明方法能够对溶藻弧菌进行特异性的检测，且设计合成的引物对之间以及引物与其他细菌之间无交叉反应，证明本发明方法具有较强的检测特异性，结果如图3所示。

实施例6 DPO-PCR检测溶藻弧菌灵敏度试验

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌体浓度约为1.14×10⁷CFU/mL溶藻弧菌的基因组DNA，进行10倍梯度稀释，从每级稀释液中各取1μL作为模板利用建立的DPO-PCR方法进行检测，以确定该方法的检测灵敏性。结果显示，本发明方法具有高度的检测灵敏性，结果如图4所示。

实施例7 DPO-PCR检测溶藻弧菌重复性试验

利用建立的溶藻弧菌DPO-PCR检测方法重复30次检测同一阳性标准品，考察该方法检测的重复性和稳定性。结果显示，每次检测结果均相同。

利用建立的溶藻弧菌DPO-PCR检测方法间隔60天检测同一批次制备的阳性标准品，考察该方法检测的重复性和稳定性。结果显示，两次检测结果均相同。

实施例8 DPO-PCR检测溶藻弧菌实践验证试验

将建立的溶藻弧菌DPO-PCR检测方法应用于检验检疫实践工作中，对采集的65份牡蛎样本、70份生蚝样本、35份象牙蚌样本、46份螃蟹样本、90份虾样本、35份海蜇样本、82份扇贝样本和76份海产鱼类样本进行检测，其结果与溶藻弧菌国标法（GB 4789.10-2010）进行比较，考察该方法检测的可靠性与实用性。结果显示，共检出11份溶藻弧菌阳性样本，检测结果与国标法（GB 4789.10-2010）检测结果符合率为100%，结果如表1所示。

表1 检测方法的实践应用结果

<110>海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>利用DPO-PCR方法检测溶藻弧菌的DPO引物序列及检测试剂盒

<160>5

<210>1

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221> modified_base

<222>(22，23，24，25，26)

<223>I

<400>1

TCGCGATTGC GACAACATTA AIIIIIACTG GCGT 34

<210>2

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221> modified_base

<222>(25，26，27，28，29)

<223>I

<400>2

ACAAACGCAT CCACTGATTC TTTCIIIIIT GGGGTGA 37

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

CTGAAGATTT TGAGTGTCGC G 21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

CTCGCGTTAC CCGTATACTT G 21

<210>5

<211>3603

<212>DNA

<213> pMD-T-collagenase

<400>5

TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA 60

CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG 120

TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC 180

ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC 240

ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT 300

TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT 360

TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGAATT CGAGCTCGGT ACCCGGGGAT 420

CCTCTAGAGA TCTGAAGATT TTGAGTGTCG CGATTGCGAC AACATTAACC AGCACTGGCG 480

TATTTGCGTT AAGCGAGCCA GTTTCTCAAG TTACAGAGCA ACATGCACAT TCGGCTCATA 540

CACACGGTGT TGAATTCAAT CGAGTTGAAT ACCAACCAAC CGCAACTCTC CCAATTCAGC 600

CCTCTAAGGC AACTCGAGTA CAGTCACTTG AAAGCCTTGA TGAGTCGAGC ACTGCTTGTG 660

ATTTGGAGGC ATTGGTTACC GAAAGCAGTA ACCAATTGAT CAGCGAAATT TTAAGTCAGG 720

GCGCGACGTG TGTGAACCAG TTATTCTCTG CTGAAAGTCG GATTCAAGAG TCGGTATTTA 780

GCTCCGATCA TATGTACAAC ATCGCTAAGC ACACTACGAC GTTGGCGAAG GGGTATACGG 840

GTGGCGGGAG CGATGAACTA GAAACGTTGT TCTTATACTT ACGCGCGGGT TATTACGCCG 900

AGTTTTACAA TGACAACATC TCATTTATTG AATGGGTCAC CCCAGCGGTG AAAGAATCAG 960

TGGATGCGTT TGTTAACACA GCAAGCTTCT ACGAGAACAG CGACCGTCAC GGCAAAGTGC 1020

TTAGTGAGGT CATCATCACT ATGGATAGTG CGGGCTTGCA GCACGCGTAC TTACCGCAAG 1080

TGACCCAGTG GCTTACTCGT TGGAATGATC AATACGCCCA GCACTGGTAT ATGCGCAATG 1140

CGGTTAACGG TGTTTTCACT ATTTTGTTTG GTGGGCAGTG GAACGAGCAA TTTGTGCAAA 1200

TAATTGGCAA CCAAACGGAC CTTGCCAAAG CTTTAGGCGA TTTTGCTCTA AGGGCGTCAT 1260

CAATCGGTGC TGAAGATGAG TTTATGGCCG CGAATGCGGG GCGAGAGCTC GGGCGTCTGA 1320

CCAAGTATAC GGGTAACGCG AGATCGTCGA CCTGCAGGCA TGCAAGCTTG GCGTAATCAT 1380

GGTCATAGCT GTTTCCTGTG TGAAATTGTT ATCCGCTCAC AATTCCACAC AACATACGAG 1440

CCGGAAGCAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT GAGCTAACTC ACATTAATTG 1500

CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAACCTGTC GTGCCAGCTG CATTAATGAA 1560

TCGGCCAACG CGCGGGGAGA GGCGGTTTGC GTATTGGGCG CTCTTCCGCT TCCTCGCTCA 1620

CTGACTCGCT GCGCTCGGTC GTTCGGCTGC GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC TCAAAGGCGG 1680

TAATACGGTT ATCCACAGAA TCAGGGGATA ACGCAGGAAA GAACATGTGA GCAAAAGGCC 1740

AGCAAAAGGC CAGGAACCGT AAAAAGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC 1800

CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC CCGACAGGAC 1860

TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GTTCCGACCC 1920

TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCATA 1980

GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC 2040

ACGAACCCCC CGTTCAGCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA 2100

ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ATTAGCAGAG 2160

CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG GCCTAACTAC GGCTACACTA 2220

GAAGAACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAGTTG 2280

GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA CAAACCACCG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC 2340

AGCAGATTAC GCGCAGAAAA AAAGGATCTC AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT 2400

CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA TTATCAAAAA 2460

GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA AATGAAGTTT TAAATCAATC TAAAGTATAT 2520

ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT GCTTAATCAG TGAGGCACCT ATCTCAGCGA 2580

TCTGTCTATT TCGTTCATCC ATAGTTGCCT GACTCCCCGT CGTGTAGATA ACTACGATAC 2640

GGGAGGGCTT ACCATCTGGC CCCAGTGCTG CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG 2700

CTCCAGATTT ATCAGCAATA AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA AGTGGTCCTG 2760

CAACTTTATC CGCCTCCATC CAGTCTATTA ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT 2820

CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG CCATTGCTAC AGGCATCGTG GTGTCACGCT 2880

CGTCGTTTGG TATGGCTTCA TTCAGCTCCG GTTCCCAACG ATCAAGGCGA GTTACATGAT 2940

CCCCCATGTT GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT CCTTCGGTCC TCCGATCGTT GTCAGAAGTA 3000

AGTTGGCCGC AGTGTTATCA CTCATGGTTA TGGCAGCACT GCATAATTCT CTTACTGTCA 3060

TGCCATCCGT AAGATGCTTT TCTGTGACTG GTGAGTACTC AACCAAGTCA TTCTGAGAAT 3120

AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGCC CGGCGTCAAT ACGGGATAAT ACCGCGCCAC 3180

ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG CTCATCATTG GAAAACGTTC TTCGGGGCGA AAACTCTCAA 3240

GGATCTTACC GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTGATCTT 3300

CAGCATCTTT TACTTTCACC AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA AACAGGAAGG CAAAATGCCG 3360

CAAAAAAGGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT GTTGAATACT CATACTCTTC CTTTTTCAAT 3420

ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC TCATGAGCGG ATACATATTT GAATGTATTT 3480

AGAAAAATAA ACAAATAGGG GTTCCGCGCA CATTTCCCCG AAAAGTGCCA CCTGACGTCT 3540

AAGAAACCAT TATTATCATG ACATTAACCT ATAAAAATAG GCGTATCACG AGGCCCTTTC 3600

GTC 3603

Claims

1.一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法检测用引物对，其特征在于，

上引物VA-DPOF：如序列表Seq ID No.1所示，

下引物VA-DPOR：如序列表Seq ID No.2所示。

2.一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法制备阳性对照品的PCR扩增引物对，其特征在于，

上引物VA-F：如序列表Seq ID No.3所示，

下引物VA-R：如序列表Seq ID No.4所示。

3.一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法阳性对照品pMD-T-collagenase的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）、PCR模板的制备：溶藻弧菌基因组DNA的提取和纯化；

（3）、阳性对照品pMD-T-collagenase的制备；

步骤（2）中，靶基因的PCR反应体系如下：

PCR的反应条件为：95℃ 5min；94℃ 15s、57.6℃ 20s、72℃ 30s，35个循环；72℃延伸10min；

4.一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR检测方法，其特征在于，

检测溶藻弧菌的PCR反应体系如下：

5.根据权利要求1所述的一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法检测用引物对，其特征在于，所述的引物对退火温度不敏感，有效温度范围为48℃～68℃。

6.一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法检测用试剂盒，其特征在于，

包括引物对：上引物VA-DPOF：如序列表Seq ID No.1所示，

下引物VA-DPOR：如序列表Seq ID No.2所示；

阳性对照品（pMD-T-collagenase）：如序列表Seq ID No.5所示；

阴性对照品(ddH₂O)和