KR20200086902A - 신경세포 분화 추적용 벡터 및 이를 이용한 신경세포로의 분화 추적 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경세포 분화 특이적 프로모터, Creb 5' UTR 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 신경세포로의 분화 추적용 벡터 및 상기 벡터를 이용한 신경세포로의 분화 추적 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 벡터가 형질도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 개체에 이식하면 분화된 신경세포의 표면에 형광 단백질이 발현되어 생체 내에서 신경세포로의 분화 추적이 가능하므로 인비트로(in vitro) 세포 배양 실험 또는 세포 치료(cell therapy)와 같은 임상 등에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신경세포 분화 추적용 벡터 및 이를 이용한 신경세포로의 분화 추적 방법{A VECTOR FOR MONITORING DIFFERENTIATION OF NEURAL CELLS AND METHOD FOR MONITORING THE DIFFERENTIATION INTO NEURAL CELLS USING THE SAME}

본 발명은 신경세포로의 분화를 추적하기 위한 벡터 및 이를 이용한 신경세포로의 분화 추적 방법에 관한 것이다.

배아의 중추 신경계(central nervous system, CNS)로부터 분리된 신경전구세포 (Neural precursor cells, NPC)는 시험관 내에서 확장될 수 있고, 시험관 내 및 생체 내에서는 다양한 신경세포 및 신경 교세포로 분화될 수 있다(비특허문헌 1 및 2). 신경전구세포에 관한 연구는 뇌 발달을 탐색하고 신경세포의 재생 가능한 원천을 개발하는데 유용하다(비특허문헌 3).

또한 줄기세포는 다양한 치료법에 적용되어 왔다. 특히 퇴행성 뇌질환의 경우, 완전히 분화된 신경세포를 이식하는 것보다 신경전구세포를 이식하는 것이 더 효과적이라는 연구 결과가 보고된 바 있다. 그러나, 줄기세포를 이용한 치료는 세포의 낮은 생존율, 줄기세포의 분화 추적의 어려움, 이식 후 낮은 세포 생착률 등을 포함한 많은 문제가 보고되고 있다(비특허문헌 4 및 5).

줄기세포 치료의 경우, 환자에게 주입된 줄기세포가 생체 내에서 제대로 기능하는지 확인할 수 없기 때문에, 이식된 줄기세포의 기능을 평가하는 것이 어렵다. 신경전구세포를 이식한 후 상기 신경전구세포의 신경세포로의 분화를 확인하기 위해서는, 이식 받은 개체를 희생시켜 얻은 조직 시료로부터 분석하여야 한다. 현재까지 이식된 신경전구세포의 분화 여부를 자기공명영상(MRI)으로 관찰하는 방법은 개발되지 않은 상태이다. 이는 분화된 신경세포를 특이적으로 추적할 수 있는 세포 표면 항원이 존재하지 않기 때문이라고 추측된다.

이에, 본 발명자들은 줄기세포의 분화 추적에 대한 문제점을 해결하기 위해, 성숙한 신경세포를 식별하고 추적하기 위한 시냅신(synapsin) 리포터 시스템을 제공하고자 한다. 시냅신은 작은 시냅스 소포에 선택적으로 결합하는 신경세포에 특이적인 인산 단백질 계열이며, 시냅신의 발현은 성숙한 신경세포를 확인하기 위한 마커로 주로 사용되고 있다(비특허문헌 6). 종래의 연구에서는 시냅신 프로모터를 사용하여 리포터 유전자의 발현을 유도하거나 또는 리포터 유전자와의 융합을 유도한다는 점을 밝혔다(비특허문헌 7). 또한, 시냅신 프로모터에 의해 발현하는 리포터 유전자를 세포 표면에서 발현되는 형광 단백질인 Cherrypicker를 사용하여 분화된 신경세포 표면에 항체(antibody)가 결합할 수 있도록 시스템을 구축하였다. 일반적인 형광 단백질의 경우 세포질 내에서 발현하기 때문에 세포가 생존한 상태에서 외부로부터 항체를 이용한 검출은 불가능하다. 하지만 Cherrypicker 형광 단백질은 세포 표면에 발현하는 단백질이므로 항체를 이용한 검출이 가능하다. 현재까지 신경전구세포의 이식 후, 이식된 세포 자체를 검출하기 위한 많은 연구들이 진행되어 왔지만, 생체 내에서 신경세포로의 분화를 관찰하는 방법은 보고된 바 없다.

따라서, 본 발명은 생체 내에서 신경세포로의 분화를 추적하고 관찰하기 위한 시스템을 제공하는 것이다.

Brustle et al., (1997) In vitro-generated neural precursors participate in mammalian brain development. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 14809-14814 Davis A.A. and Temple. S. (1994) A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature 372, 263-266 Park et al., (2006) Acquisition of in vitro and in vivo functionality of Nurr1-induced dopamine neurons. FASEB J 20, 2553-2555 Yamashita et al., (2006) Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum. J Neurosci 26, 6627-6636 Arvidsson et al., (2002) Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat Med 8, 963-970 Kugler et al., (2001) Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoter in recombinant adenoviral vectors. Mol Cell Neurosci 17, 78-96 Kugler, Sl., Kilic, E. and Bahr, M. (2003) Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther 10, 337-347

본 발명의 목적은 생체 내에서 신경세포로의 분화를 추적하기 위한 벡터 및 상기 벡터를 이용한 신경세포로의 분화 추적 방법을 제공하고자 한다.

본 발명자들은 신경세포 분화 특이적 프로모터, Creb 5' UTR 서열 및 리포터 유전자를 포함하도록 벡터를 제작하고, 상기 제작된 벡터가 형질도입된 신경전구세포를 생체 내 이식하면 생체 내에서도 신경세포로의 분화 추적이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 신경세포 분화 특이적 프로모터, Creb 5' UTR 서열 및 리포터 유전자를 포함하는, 신경세포로의 분화 추적용 벡터를 제공한다.

본 발명에서, 상기 벡터는 신경세포 분화 특이적 발현을 유도하는 프로모터 및 이와 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자가 삽입 또는 도입될 수 있는 플라스미드, 바이러스성 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다.

본 발명에서, 상기 신경세포 특이적 발현을 유도하는 프로모터는 신경세포에서 특징적으로 발현하는 마커 단백질들의 프로모터를 지칭하며, 이들 프로모터에 전사인자가 결합하여 신경세포 특이적 마커 단백질을 발현시키는 프로모터를 의미한다. 본 발명의 벡터는 신경세포 특이적 발현을 유도하는 프로모터 하위에 리포터 유전자가 작동 가능하도록 연결되는 경우, 상기 리포터 유전자를 신경세포에서만 특이적으로 다량 발현시킬 수 있다. 본 발명에서, "작동 가능하게 연결(operably linked)" 된다는 것은 적절한 유전자 서열이 프로모터 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된다는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 신경세포 특이적 발현을 유도하는 프로모터는 시냅신(synapsin) 프로모터이다. 상기 시냅신 프로모터에 의해 리포터 유전자를 신경세포 특이적으로 발현시킬 수 있다.

상기 플라스미드의 예로는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스성 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV), 렌티바이러스 또는 벡시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스가 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 벡터는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포에 도입시키는데 적합한 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 단백질 발현 유도 및 발현된 단백질의 분리가 용이하도록 디자인된 벡터를 사용할 수 있다.

한 구체예에서, 상기 벡터는 바이러스성 벡터일 수 있으며, 특히 렌티바이러스 벡터일 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 신경세포 특이적 프로모터는 시냅신 프로모터(synapsin promoter)일 수 있다. 시냅신 프로모터는 신경세포로 분화시에만 특이적으로 발현하는 특성을 가지고 있으며, SEQ ID NO: 1의 염기서열로 표현되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 신경세포로의 분화 추적용 벡터에서, 상기 리포터 유전자는 유전자가 전사되어 번역된 단백질을 in vivo 또는 in vitro에서 확인할 수 있는 어떠한 리포터 유전자도 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 벡터에 도입되는 리포터 유전자는 세포 표면 발현 형광 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다. 상기 형광 단백질을 코딩하는 유전자는 적색 형광 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다. 형광 단백질을 코딩하는 리포터 유전자의 경우 발현된 단백질의 유무를 별도의 과정을 거치지 않고 확인할 수 있으므로 신경세포로의 분화를 추적하기 위한 시스템에 바람직하다. 상기 형광 단백질로는 mCherry, tdTomato, J-Red, DsRed, mRuby, mStrawberry, mPlum, GFP 및 YFP로 이루어진 군에서 세포 표면에 발현되도록 돌연변이된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 형광 단백질의 유전자를 리포터 유전자로서 이용하는 경우, 면역염색 또는 공촛점 현미경 등을 이용하는 방법을 사용하여 신경줄기세포에서 신경세포로의 분화를 세포를 사멸시키지 않고도 (또는 비침습적으로) 쉽게 추적 가능하다.

한 구체예에서, 상기 리포터 유전자는 분화된 세포막의 표면에 발현되는 형광 단백질 코딩 유전자일 수 있으며, 구체적으로 mCherry를 코딩하는 유전자인 CherryPicker 유전자일 수 있다. CherryPicker 유전자는 형광 단백질인 mCherry와 트랜스페린 수용체 막 앵커 도메인으로 구성된 융합 단백질이다. 상기 mCherry 단백질은 세포 표면에서 발현되기 때문에, 분화된 신경세포의 표면에 발현 가능하므로 생체 내 도입 시 자기공명영상을 통한 신경세포로의 분화 추적에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터는 상기 시냅신 프로모터와 형광 단백질을 코딩하는 리포터 유전자 사이에 SEQ ID NO: 2의 염기서열로 표현되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 SEQ ID NO: 2의 염기서열로 표현되는 폴리뉴클레오타이드는 마우스의 Creb 5' UTR을 코딩하는 염기서열 중 일부 서열이며, 본 발명의 상기 벡터에서 시냅신 프로모터와 상기 리포터 유전자 사이에 개재되어 시냅신 프로모터의 조직 특이성을 높게 유지시키며 리포터 유전자 발현의 인핸서(enhancer)로서 작용할 수 있다.

하기 실시예에서는, ①시냅신 프로모터와 형광 단백질을 코딩하는 리포터 유전자를 포함하는 구조(CherryPicker-LV2S)의 렌티바이러스 벡터를 기반으로, ②Creb 5' UTR 서열을 포함하는 구조(CherryPicker-LV2S5), ③CMV IE 프로모터를 포함하는 구조(CherryPicker-LV2cS) 및 ④Creb 5' UTR 서열과 CMV IE 프로모터를 모두 포함하는 구조(CherryPicker-LV2cS5)의 벡터를 제작하여 신경전구세포에 형질도입한 후 분화에 따른 형광 단백질의 발현 정도를 비교하였다. 그 결과, ①(CherryPicker-LV2S)의 벡터는 신경세포로의 분화가 진행중임에도 형광 단백질 발현이 매우 약했고, Creb 5' UTR 서열을 포함하는 ②(CherryPicker-LV2S5), ③(CherryPicker-LV2cS) 및 ④(CherryPicker-LV2cS5) 벡터에서는 신경세포로의 분화가 진행됨에 따라 형광 단백질의 발현도 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 종래에 프로모터의 발현율을 높이기 위해 사용되었던 인핸서인 CMV IE 프로모터를 포함하는 ③(CherryPicker-LV2cS) 및 ④(CherryPicker-LV2cS5) 벡터의 경우, 시냅신 프로모터의 발현율을 높일 수는 있으나, 시냅신 프로모터에 대한 특이도를 낮추어 신경세포 이외의 세포에서도 발현될 수 있으므로, 신경세포로의 분화 추적을 위한 벡터로는 배제하였다. 본 발명에서는 상기 실시예에서 확인한 결과로부터 ②(CherryPicker-LV2S5) 벡터를 신경세포로의 분화 추적을 위한 최적의 벡터로 선정하였다.

또한, 본 발명은 상기 벡터가 형질도입되어 신경세포로의 분화시 리포터 유전자가 발현되는 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 제공한다.

본 발명에서 "신경줄기세포(NSC, Neural stem cell)"는 증식을 계속하는 능력, 즉 자기복제능력(self-replication)을 가지고 있으며, 중추 신경계를 구성하는 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 등의 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는 미분화 세포를 의미한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명에서 상기 리포터 유전자를 발현시키는 벡터를 형질도입하는 세포로서 신경줄기세포가 포함되어 있다. 상기 신경줄기세포는 초대 배양(primary cultured) 신경줄기세포 또는 이의 유전적으로 변형된 불사멸화된(immortalized) 신경줄기세포일 수 있다. 신경줄기세포는 "신경전구세포(neural progenitor cell 또는 neural precursor cell)"와 서로 혼용되어 사용될 수 있으며, 경우에 따라서는 신경줄기세포로부터 유래된 세포를 신경전구세포라고 지칭할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 벡터를 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 형질도입시키는 방법은 당업계에 공지된 방법을 적용할 수 있다. 예컨대 상기 벡터의 세포 내 도입은 리포펙타민(Lipofectamine), 칼슘-인산(calcium-phosphate), 양전하성 고분자, 리포좀과 같은 형질도입용 시약을 이용하거나, 나노입자, 뉴클레오펙션(nucleofection), 전기천공법(electroporation), 열충격(heat shock), 마그네토펙션(magnetofection) 또는 바이러스 감염에 의한 방법으로 수행될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 벡터의 도입은 바이러스 감염에 의한 것일 수 있다.

상기 벡터가 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포는 세포 치료를 필요로 하는 환자에 이식한 후, 이식된 신경줄기세포 또는 신경전구세포가 신경세포로의 분화가 어느 정도 진행되었는지 확인하는 것에 이용될 수 있다.

상기 신경줄기세포 또는 신경전구세포는 신경계 질환 환자의 뇌실에 직접 투여 또는 이식할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 생착율을 증진시키기 위해 다양한 봉매제(embedding materials), 예컨대 소듐 알지네이트(sodium alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 또는 콜라겐을 세포와 복합체로 형성시켜 이를 이용할 수도 있다. 이후 MRI를 촬영하여 이식된 세포의 분화 진행 여부 및 정도를 확인할 수 있다.

본 발명에 있어서, 신경줄기세포 또는 신경전구세포는 포유동물에서 유래된 것일 수 있다. 상기 포유동물로는 인간, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 소, 염소, 돼지, 마우스 또는 랫트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 신경줄기세포 또는 신경전구세포가 포유동물에서 유래된 경우, 상기 세포는 대뇌 또는 뇌의 피질을 포함한 뇌 조직의 모든 부위에서 유래한 모든 종류의 신경줄기세포 또는 신경전구세포일 수 있다. 또한, 상기 신경줄기세포 또는 신경전구세포는 배아 및 성체를 포함하는 모든 발생단계에서 유래한 것일 수 있으나, 다량의 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 획득하기 위해 신경 발생이 가장 왕성한 시기의 발생 중인 배아에서 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 벡터는 인비트로(in vitro) 세포 배양 실험 또는 세포 치료(cell therapy)와 같은 임상 등 다양한 신경세포에서의 유전자 연구에 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 벡터를 숙주 세포에 형질도입한 후, 숙주 세포에서 리포터 유전자의 발현 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 신경세포로의 분화 모니터링 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 리포터 유전자의 발현 여부를 확인하는 단계는 상기 리포터 유전자, 예컨대 형광 단백질의 발현 여부를 면역염색 또는 공촛점 현미경 등으로 확인함으로써 신경줄기세포의 신경세포로의 특이적인 분화를 모니터링할 수 있다.

또한, 상기 방법에 있어서, 숙주 세포는 신경전구세포 또는 신경줄기세포일 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명은 신경세포 분화 특이적 프로모터, Creb 5' UTR 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 신경세포로의 분화 추적용 벡터 및 상기 벡터를 이용한 신경세포로의 분화 추적 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 벡터가 형질도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 개체에 이식하면 분화된 신경세포의 표면에 형광 단백질이 발현되어 생체 내에서 신경세포로의 분화 추적이 가능하므로 인비트로(in vitro) 세포 배양 실험 또는 세포 치료(cell therapy)와 같은 임상 등에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 마우스 NPC를 면역염색하여 분화 14일째의 TUJ1과 SYNAPSIN1의 발현 정도를 관찰한 결과이다. (A)는 각각의 분화 관련 사이토카인(BDNF, GDNF, DX 및 cAMP)과 음성 대조군(AA 처리 및 B27 처리)을 함께 포함한 분화 배지에서 NPC를 분화시킨 후 TUJ1 및 SYNAPSIN1의 발현 정도를 관찰한 결과이며, (B)는 사이토카인 혼합물(AA, B27, BDNF, GDNF, DX 및 cAMP)에서 사이토카인을 하나씩 제거한 분화 배지에서의 NPC의 TUJ1 및 SYNAPSIN1의 발현 정도를 관찰한 결과이다. (C)는 상기 (A)에 따른 분화 14일째에서의 TUJ1+ 및 SYNAPSIN1+ 신경세포를 계수한 결과이고, (D)는 상기 (B)에 따른 분화 14일째에서의 TUJ1+ 및 SYNAPSIN1+ 신경세포를 계수한 결과이다.
도 2의 (A)는 인간 시냅신 프로모터-CherryPicker 리포터 컨스트럭트(constructs) 구조의 모식도이고, (B)는 4가지 hSYN-Cherrypicker 렌티바이러스 벡터를 NPC에 형질도입하고, 분화 1일 및 14일째의 RFP의 발현 정도를 관찰한 결과이다.
도 3의 (A)는 마우스 NPC의 분화 0일, 1일 및 14일째에서의, TUJ1의 RFP 및 SYNAPSIN1의 RFP의 공동면역염색 결과를 나타낸 것이고, (B)는 분화 1일 및 14일째에서 계수된 양성 세포(TUJ1 또는 RFP)의 비율을 나타낸 것이다. (C)는 이식 2일 및 7일째의 선조체(striatum) 조직에서의 RFP 발현 정도를 관찰한 결과이다.

이하, 본 출원을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 출원을 예시하는 것일 뿐 본 출원의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실험 방법

1. 마우스의 신경전구세포 분리 및 배양

이하 실험에 사용한 동물은 한양대학교 Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC-2016-0084A)의 지침에 따라 수거되고 처리되었다. 마우스 배아의 뇌에서 유래된 마우스 신경전구세포(NPCs)의 배양은 참고문헌 1의 문헌을 일부 수정하여 수행하였다. 신경전구세포는 배아 12일째에 ICR(imprinting control region) 마우스의 피질에서 분리하였다. 피질 조직으로부터 분리한 마우스 신경전구세포를 15㎍/mL 폴리-L-오르니틴(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 1㎍/mL 피브로넥틴으로 미리 코팅한 접시에 20,000cell/cm²로 배양하였다. 세포의 증식을 위해서, 마우스 신경전구세포를 20ng/mL bFGF(basic fibroblast growth factor; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 및 비타민 A가 없는 B-27 보충제(Invitrogen)이 보충된 N2 배지(DMEM/F12, 4.4μM 인슐린, 100mg/L 트렌스페린(transferrin), 30nM 셀레나이트(selenite), 0.6μM 푸트레신(putrescine), 20nM 프로게스테론(progesterone), 200mM L-글루타민, 8.6mM D(+) 글루코오스, 20mM NaHCO₃(Invitrogen, Carlsbad, CA))가 포함된 배지에서 37℃, 5% CO₂ 하에 배양하였다. 이후 세포의 분화를 위해, 마우스 신경전구세포를 0.2mM 아스코르브산(ascorbic acid, AA; Sigma-Aldrich), 20ng/mL BDNF(brain-derived neurotrophic factor; PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA), 20ng/mL GDNF(glial cell line derived neurotrophic factor; Peprotech), 250㎍/mL cAMP(dibutyryl-cyclic AMP; Sigma-Aldrich) 및/또는 B-27 보충제(Invitrogen)이 보충된 N2 배지를 포함하는 다른 배지에서 37℃, 5% CO₂ 배양기 하에서 배양하였다. 배지는 격일로 교체해 주었으며, 유사분열물질(mitogen)을 매일 첨가하였다.

[참고문헌 1]

Park et al. Proneural bHLH neurogenin 2 differentially regulates Nurr1-induced dopamine neuron differentiation in rat and mouse neural precursor cells in vitro. FEBS Lett 582, 537-542, 2008

2. 플라스미드 구축

pLVX-CherryPicker2 벡터(Clontech, Mountain View, CA, USA)를 이용하여 플라스미드 백본을 구축하였다. 요약하면 pLVX-CherryPicker2 벡터 내 CMV IE 프로모터+다중 클로닝 부위+ 리보좀의 삽입 부위는 다음 4가지 유형으로 대체하였다.

유형	벡터
1) S	pLTR + pSYN + ChP + 3'LTR
2) S5	pLTR + pSYN + Creb 5'UTR + ChP + 3'LTR
3) cS	pLTR + pCMV IE + pSYN + ChP + 3'LTR
4) cS5	pLTR + pCMV IE + pSYN + Creb 5'UTR + ChP + 3'LTR

렌티바이러스 컨스트럭트 제조 방법의 세부 내용은 하기와 같다. 본 발명자들은 pLVX-CherryPicker2 (Clontech, CA)의 ClaI~MluI 염기서열 부분 (CMV IE Promoter+MCS+IRES+CherryPicker)을 CherryPicker CXAXXB forward primer (SEQ ID NO: 5)와 CherryPicker PNM reverse primer (SEQ ID NO: 6)를 이용한 PCR product로 대체하여 pLVX-CherryPicker2-CXAXXB/PNM 플라스미드를 제조하였다. 또한 Creb의 5' UTR 서열 및 제한효소 염기서열 (SEQ ID NO: 9)을 합성하여 (GenScript Biotech Corp., NJ) pBluescript II KS(+) 벡터 (Stratagene, CA)에 클로닝하였다. pCMV1 enhancer+pSynapsin 프로모터 염기서열은 pCS XP forward primer (SEQ ID NO: 7)와 pCS AMSX reverse primer (SEQ ID NO: 8)를 이용한 PCR product를 pGEM T Easy (Promega, Madison, WI) 벡터에 클로닝 하였다.

각 서열의 PCR은 High fidelity taq polymerase (Invitrogen)을 사용하여 증폭하였고 이들 서열을 포함하는 pLVX-CherryPicker2-CXAXXB/PNM 렌티바이러스 벡터는 각각의 pGEM T-Easy 중간산물로부터 유래된 적절한 제한 효소 단편을 삽입하여 제조하였다. 그 결과, 첫 번째로, CherryPicker 유전자의 앞에 시냅신 프로모터를 삽입하여 제조하였다(CherryPicker-LV2S). 두 번째로, Creb의 5' UTR 서열의 일부를 삽입하여 제조하였다(CherryPicker-LV2S5). 세 번째로, pCMV 인핸서를 삽입하여 제조하였다(CherryPicker-LV2cS). 마지막으로, Creb의 5' UTR 서열의 일부와 pCMV 인핸서를 삽입하여 제조하였다(CherryPicker-LV2cS5, 도 2A).

3. 렌티바이러스 생산 및 신경줄기세포 내 형질도입(transduction)

렌티바이러스는 패키징 플라스미드(packaging plasmid) (pLP1, pLP2, pLP-VSVG, Clontech)를 갖는 293T 세포로부터 생산하였다. 렌티바이러스 플라스미드와 리포펙타민2000 시약(Invtrogen)을 반응시켜 형질감염(transfection) 시켰다. 렌티바이러스 입자를 포함하는 상등액을 형질감염 24시간 후에 수확하였다. 바이러스 상등액을 초원심분리(ultracentrifugation; Optima XL-1, Beckmen, CA, USA)하여 농축시켰다. 농축된 상층액을 1 ㎍/mL 폴리브렌(polybrene, 헥사다이메트린브로마이드(hexadimethrine bromide); Sigma-Aldrich)의 존재 하에 증식 배지에서 마우스의 신경전구세포에 24시간 동안 형질도입하였다.

4. 면역 세포 화학 염색(Immunocytochemistry)

배양된 세포를 4% 파라포름알데하이드(Sigma-Aldrich)를 사용하여 고정시키고, 고정된 세포를 0.1% BSA/PBS(bovine serum albumin/phosphate-buffered saline), 10% NGS(normal goat serum; Pel-Freez, Rogers, AR, USA) 및 0.3% Triton X 100(Sigma-Aldrich)을 1시간동안 사용하여 블로킹(blocking)시켰다. 블로킹된 세포는 다음과 같은 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 반응시켰다: 토끼 항-TUJ1 (1:2000, Covance, Richmond, CA, USA), 토끼 항-RFP(red fluorescent protein; 1:500, Rockland, Limerick, PA, USA), 마우스 항-SYNAPSIN1(1:500, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). 다음 날, 세포를 2차 항체와 컨쥬게이트된 Alexa 488-(Invitrogen), Rhodamine-, 또는 Cy3-(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)와 반응시켰다. 이후, 세포를 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole; Vector Laboratories)과 함께 VECTASHIELD에 고정시키고 형광 현미경(fluorescent microscope; LEICA Microsysem, Welzler, Germany)으로 관찰하고 촬영하였다.

5. 생체 내 세포 이식

성체 ICR 마우스(6주령)는 케타민(ketamine; 100mg/kg, Yuhan Corporation, Seoul)과 자일라진(xylazine; 10mg/kg, Bayer Korea, Seoul)을 복강 내 주사하여 마취하였다. 마우스는 입체 정위 좌표(stereotaxic coordinate)(피질: 브레그마(bregma)로부터 AP+0.5mm; 브레그마로부터 ML-1.7mm; 경질막(dura)으로부터 DV-1.5mm; 및 선조체(striatum): 브레그마로부터 AP+0.5mm; 브레그마로부터 ML-1.7mm; 경질막으로부터 DV-3.5mm)를 이용하여 마우스 신경전구세포(5.0 10⁵ cells/5 μL volume, 0.01 μL/s의 투입률)를 피질내(intracortical) 및 선조체내(intrastriatal)에 주입하였다. 체온은 회복 기간 동안 가열 챔버(heat chamber) 안에서 37℃를 유지하였다.

6. 조직학적 방법

케타민(100mg/kg, i.p.) 및 자일라진(10mg/kg, i.p.) 마취하여 마우스를 희생시키고, 4% 파라포름알데하이드를 심내 관류한 후 뇌를 수확하였다. 뇌는 16㎛ 슬라이드 두께로 저온 절개하였다. 각각의 절편은 토끼 항-RFP(1:500, Rockland, Limerick, PA, USA)를 사용하여 염색하였다. 상기 뇌 절편을 2차 항체인 Alexa Fluor® 594(1:400, Invitrogen)와 함께 배양한 후, DAPI가 있는 Vectashield® 마운팅 배지로 덮었다. 염색된 절편은 공촛점 이미징(LSM700, Zeiss, Gottingen, Germany)으로 평가하였다.

7. 세포 계수 및 통계 분석

세포 계수는 실험조건 당 3개의 웰로, 웰당 5 내지 10개의 미세필드에서 수행되었다. 모든 실험은 3번 반복하였으며, 데이터는 평균 ±SEM으로 표현하였다. 2개 이상의 그룹을 비교할 때는 윈도우용 SigmaPlot version 10.0(Systat Software GmbH, Erkrath, Germany)을 사용하여 paired t-test를 수행하였다.

실험결과

1. in vitro 에서 NPC 분화 효율의 최적화

이전에 개발된 마우스 1차 신경전구세포 분리(참고문헌 1)와 분화(참고문헌 2) 프로토콜을 사용하여, 다양한 사이토카인(AA, BDNF, GDNF, cAMP, B-27 보충제 및 독시사이클린(DX))이 NPC가 신경세포로 분화될 때 어떤 역할을 하는지 확인하였다. 결과적으로, 분화와 관련된 사이토카인 혼합물을 이용하여, 분화에 기여하는 핵심적인 사이토카인을 결정하였다. 신경세포로의 분화는 AA 및 B-27 보충물이 보충된 조건 배지에서 배양된 NPC에서 수행되었다. 또한, 핵심 사이토카인을 결정하기 위해, NPC를 각각의 사이토카인을 포함하는 배지에서 분화시켰다. 마우스 NPC는 분화 배지에서 14일 동안 배양시키고, 면역형광 분석으로 확인하였다(도 1A). 신경세포는 각각 초기 신경세포 마커인 TUJ1 및 SYNAPSIN1의 발현에 따라 모니터링되었다. 다른 사이토카인이 단독으로 사용될 때 검출된 TUJ1+ 세포의 비율이 20% 미만인 것과 비교하여, 오직 cAMP 처리군에서만 신경세포 분화 효율이 전체 세포의 50% 이상으로 크게 증가하였다(도 1C). 또한, 분화 관련 사이토카인 혼합물에서 각각 하나의 사이토카인을 제거하여 가장 효과적인 분화 사이토카인 혼합물을 결정하였다. 결과적으로, 신경세포의 수는 여러 사이토카인으로 처리할 때 증가하였다(도 1B). 그러나, 모든 사이토카인을 사용할 때 TUJ1+ 세포가 50% 이상인 결과와 비교하여, cAMP를 제거하면 TUJ1+ 세포가 전체 세포의 10% 미만으로 측정되므로 신경세포 분화 효율이 감소하는 것을 알 수 있다. 또한, 모든 사이토카인을 사용할 때 50% 이상의 TUJ1+ 세포가 측정된 결과와 비교하여, 독시사이클린(DX)이 결핍된 사이토카인 혼합물은 TUJ1+ 세포가 전체 세포의 75% 이상으로 나타나므로 신경세포 분화 효율이 증가하였다(도 1D). 이러한 결과는 분화 사이토카인 혼합물 및 cAMP가 NPC 배양에서 신경세포의 분화를 촉진시키는데 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었다.

[참고문헌 2]

Chambers et al., (2009) Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol 27, 275-280

2. in vitro 에서 신경세포 분화-특이적 표면 단백질 발현

이전 연구에서 신경세포 마커로서의 시냅신 프로모터의 용도를 보고한 바 있다. 본 발명자들은 HIV-1로부터 유래된 자가-비활성화된 렌티바이러스인 pLVX-CherryPicker2를 기반으로 신경세포를 특이적으로 식별하기 위한 몇 가지 벡터를 개발하였다. 본 발명자들은 pLVX-CherryPicker2의 CMV IE 프로모터 부위를 인간 시냅신 프로모터로 대체하였다. SYNAPSIN1은 작은 시냅스 소포에 선택적으로 결합하는 신경세포-특이적 인산 단백질이다. 또한, Creb의 5' UTR 부위와 CMV 인핸서를 사용하여 시냅신 프로모터의 특이적 발현 기능을 향상시켰다. 시냅신 프로모터(pSYN-RFP)의 제어 하에서 막-타겟 RFP(CHERRYPICKER)의 발현을 기반으로 네 가지 컨스트럭트(constructs)를 제조하였다. 첫 번째로, CherryPicker 유전자의 앞에 시냅신 프로모터를 삽입하여 제조하였다(CherryPicker-LV2S). 두 번째로, Creb의 5' UTR 서열의 일부를 삽입하여 제조하였다(CherryPicker-LV2S5). 세 번째로, pCMV 인핸서를 삽입하여 제조하였다(CherryPicker-LV2cS). 마지막으로, Creb의 5' UTR 서열의 일부와 pCMV 인핸서를 삽입하여 제조하였다(CherryPicker-LV2cS5, 도 2A). 렌티바이러스를 이용하여 네 가지 pSYN-RFP 컨스트럭트 플라스미드를 마우스 NPC에 각각 형질도입하였고, 14일동안 신경세포로 분화시켰으며, 면역형광 분석법으로 동정하였다. 그 결과, 마우스 NPC에서 pSYN-RFP의 네 가지 컨스트럭트 모두 항-RFP 항체에 양성이었으며, 이는 pSYN-CherryPicker 리포터 시스템이 제대로 작동하고 있음을 나타낸다. 그러나, pSYN-CherryPicker는 증식하는 NPC에서 유전자 발현이 현저히 약화되는 것을 보였다. 특히, 네 가지 컨스트럭트 중에서, CherryPicker-LV2S5는 특히 높은 역가와 특이적인 발현을 보였다. CherryPicker-LV2S5로 NPC를 신경세포로 14일동안 분화시켰을 때, 면역형광 분석법은 0일째(분화 전)에서 RFP 발현을 보이지 않았다; 그러나, 3일째부터, 몇몇 세포는 RFP를 발현하기 시작했고, 그 발현 수준은 분화가 진행됨에 따라 증가했다. 흥미롭게도, 분화 중인 NPC에서 RFP-양성 세포는 대부분 SYNAPSIN1과 TUJ1+ 세포와 중복되었다(도 3A 및 3B). 분화 1일째에서, 총 세포 중에서 RFP+ 세포는 5% 미만이었고, 14일째에서 RFP+ 세포는 50% 이상 증가하였다(도 2B). CherryPicker-LV2cS5이 형질도입된 NPC는 높은 역가의 RFP를 나타냈다; 그러나, 이들의 형태는 pCMV 인핸서의 비-특이적인 구동력으로 인해 미성숙했다. 따라서, 신경세포 분화-특이적 RFP 발현 벡터에 대한 CherryPicker-LV2S5 컨스트럭트를 선택하였다.

3. in vivo 에서의 분화-특이적 표면 단백질 발현

앞선 실험을 통해, 마우스에 pSYN-Cherrypicker NPC를 이식하여 생체 내에서 리포터 시스템이 제대로 작동하고 있음을 확인하였다. 면역형광 분석법을 통해 이식 후 2일 및 7일 째에서 이종이식물(xenografts)에서의 RFP 발현을 확인하였다(도 3C). In vitro 발현 패턴과 유사하게, 생체 내 이식된 NPC는 2일 째에 RFP를 발현하지 않았다; 그러나 RFP는 신경세포로 분화됨에 따라 이식 7일째에는 발현되었다.

<110> INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION HANYANG UNIVERSITY <120> A VECTOR FOR MONITORING DIFFERENTIATION OF NEURAL CELLS AND METHOD FOR MONITORING THE DIFFERENTIATION INTO NEURAL CELLS USING THE SAME <130> P18U10C0961 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 480 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synapsin promoter_pSYN <400> 1 ctagactgca gagggccctg cgtatgagtg caagtgggtt ttaggaccag gatgaggcgg 60 ggtgggggtg cctacctgac gaccgacccc gacccactgg acaagcaccc aacccccatt 120 ccccaaattg cgcatcccct atcagagagg gggaggggaa acaggatgcg gcgaggcgcg 180 tgcgcactgc cagcttcagc accgcggaca gtgccttcgc ccccgcctgg cggcgcgcgc 240 caccgccgcc tcagcactga aggcgcgctg acgtcactcg ccggtccccc gcaaactccc 300 cttcccggcc accttggtcg cgtccgcgcc gccgccggcc cagccggacc gcaccacgcg 360 aggcgcgaga taggggggca cgggcgcgac catctgcgct gcggcgccgg cgactcagcg 420 ctgcctcagt ctgcggtggg cagcggagga gtcgtgtcgt gcctgagagc gcagtcggga 480 480 <210> 2 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Creb 5' UTR <400> 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tttgggatcc ggaatcgcga gggtcgacca attgaagagc 240 tcaacaattg ggtcgcgagc ttctcgagtt gataataatc ggggcctagg ttgtcgacga 300 ggttaacgga tgcatgaagg catgcggatt taaatggggc tagcggttaa ttaaggaaag 360 atctggtcta gatttgcggc cgctaggatc cttttgaatt cggggcgcgc caacaattga 420 agggcccaag gtaccattgg 440

Claims (6)

1. 시냅신 프로모터(synapsin promoter); Creb 5'UTR; 및 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 추적용 벡터.
2. 제1항에 있어서,
   상기 형광 단백질을 코딩하는 유전자는 시냅신 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것인 벡터.
3. 제1항에 있어서,
   형광 단백질은 mCherry, tdTomato, DSRed, J-Red, mStrawberry, mRuby, mPlum, GFP 및 YFP로 이루어진 군에서 선택된, 세포 표면에 발현되도록 돌연변이된 것인 벡터.
4. 제1항에 있어서,
   상기 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV), 렌티바이러스, 벡시니아 바이러스, 배큘로바이러스 또는 플라스미드로 이루어진 군에서 선택된 것인 벡터.
5. 제1항에 따른 벡터가 형질도입된, 신경세포로의 분화 추적용 신경줄기세포.
6. 제1항에 따른 벡터를 신경줄기세포에 형질도입한 후, 상기 신경줄기세포에서 리포터 유전자의 발현 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 추적 방법.

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