KR102441384B1

KR102441384B1 - 피부 미백 물질의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR102441384B1
Application number: KR1020200037427A
Authority: KR
Inventors: 최현정; 조동형; 김형준; 박원석; 박현준; 조두신
Original assignee: (주)아모레퍼시픽; 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2022-09-07
Also published as: KR20210120559A

Abstract

본 개시는 (a) TPC2 및 mCherry-GFP 단백질을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 시험물질이 처리된 세포의 형광을 확인하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 시험물질이 처리된 세포에서 나타나는 형광에 따라 상기 시험물질을 피부 미백 물질로 판단하는 단계를 포함 피부 미백 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다. 상기 스크리닝 방법은 멜라노솜의 자식작용(autophagy) 활성을 확인하여 임의의 물질이 피부 미백 물질인지 여부를 확인할 수 있다.

Description

피부 미백 물질의 스크리닝 방법{METHOD FOR SCREENING THE SKIN WHITENING MATERIALS}

본 명세서는 피부 미백 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

피부색은 멜라닌이라는 색소에 의해 영향을 받는데, 이러한 멜라닌은 자외선 차단의 역할을 하여 진피 이하의 피부기관을 보호해주는 동시에 피부 생체 내에 생겨난 자유 라디칼 등을 잡아주는 역할을 하여 피부내 단백질과 유전자들을 보호해주는 유용한 역할을 한다.

하지만, 멜라닌이 필요 이상으로 많이 만들어지게 되면, 기미, 흑자, 검버섯 등과 같은 피부 과색소 침착증을 유발하여 미관상 원하지 않는 결과가 생길 수도 있고 더 심하게는 피부암 등이 유발되어 생명에 위험을 줄 수도 있다. 또한, 생체 내에는 멜라닌을 분해나는 효소가 없기 때문에 한번 만들어진 멜라닌은 각질과 함께 탈락되기 전까지는 없어지지 않는다.

이러한 이유들로 인하여 멜라닌 합성을 조절할 수 있는 물질을 개발하기 위한 스크리닝 방법의 개발이 필요하다.

한국 공개특허공보 제10-2014-0055401호

일 측면에서, 본 발명은 멜라노솜의 자식작용을 활성화시키는 피부 미백 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하고자 한다.

일 측면에서, 본 발명은 (a) TPC2 및 mCherry-GFP 단백질을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 시험물질이 처리된 세포의 형광을 확인하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 시험물질이 처리된 세포에서 나타나는 형광에 따라 상기 시험물질을 피부 미백 물질로 판단하는 단계를 포함 피부 미백 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 TPC2와 mCherry-GFP 단백질을 발현하는 세포는 서열번호 1의 TPC2-mCherry-GFP 플라스미드에 의해 트랜스펙션(transfection) 된 세포일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 트렌스펙션은 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 공동-침전법, 전기 천공법 및 리포좀 이용법 중 하나 이상으로 수행될 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 (b) 단계에서 세포의 형광 확인은 형광 현미경(Fluorescence microscope)을 이용하여 수행될 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 (b) 단계에서 세포의 형광 확인은 상기 세포에 400-650nm의 파장의 빛을 조사하여 수행될 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 (c) 단계에서 피부 미백 물질로 판단하는 것은, 시험물질이 처리된 세포에서 적색형광을 10% 이상 나타내는 시험물질을 피부 미백 물질로 판단하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 세포는 흑색종 세포, 멜라노사이트 또는 망막 상피 세포일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 피부 미백 물질은 멜라노솜의 자식작용(autophagy)을 유도하여 멜라닌 생성을 억제하는 물질일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 피부 미백 물질은 피부 과색소 침착증을 예방 또는 완화하는 물질일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 피부 과색소 침착증은 기미, 흑자 및 검버섯 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명에 의해 제공되는 피부 미백 물질 스크리닝 방법은 세포에 시험 물질을 처리하고 멜라노솜의 자식작용(autophagy) 활성을 확인하여 임의의 물질이 피부 미백 물질인지 여부를 확인할 수 있다.

도 1은 흑색종 세포(melanoma)에서 멜라노솜의 자식작용(autophahy)에 따른 형광을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 흑색종 세포(melanoma)에서 멜라노솜의 자식작용(autophahy)에 따른 색소형성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 흑색종 세포(melanoma)에서 LC3의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

일 측면에서, 본 발명은 (a) TPC2 및 mCherry-GFP 단백질을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 시험물질이 처리된 세포의 형광을 확인하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 시험물질이 처리된 세포에서 나타나는 형광에 따라 상기 시험물질을 피부 미백 물질로 판단하는 단계를 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명자들은 멜라닌을 만드는 세포 내 소기관인 멜라노솜(melanosome)도 자식작용(autophagy)에 의해 제거될 수 있음을 확인하였다. 그에 따라 멜라닌 생성 세포에 임의의 물질을 처리하고 멜라노솜의 자식작용이 유도되는 것을 확인함으로써 그 임의의 물질이 피부 미백 물질인지 여부를 확인할 수 있다.

본 명세서에서 "자식작용(autophagy)"은 세포 내부의 세포소기관 (organelle)이 세포 스스로에 의해 제거되는 작용을 의미하는 것으로, 제거 대상 세포소기관은 세포 안에서 이중 막 (double membrane)으로 된 자가포식소체 (autophagosome)라고 불리는 소포 (vesicle) 내에 격리되고, 이 소포는 다시 리소좀 (lysosome)과 결합하여 자가포식리소좀 (autophagolysosome)을 형성하고 그 안에서 리소좀 효소에 의해 분해가 일어난다. 리소좀 내부의 pH는 4.5 ~ 5.0으로 산성이기 때문에 상기 소포와 리소좀이 결합하여 자가포식리소좀을 형성하는 경우 그 내부의 pH는 약 5가 된다.

일 구현예에 있어서, 상기 TPC2와 mCherry-GFP 단백질을 발현하는 세포는 서열번호 1의 TPC2-mCherry-GFP 플라스미드에 의해 트랜스펙션(transfection) 된 세포일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 서열번호 1의 TPC2-mCherry-GFP 플라스미드는 멜라노솜(melanosome)에 특이적으로 존재하는 단백질인 TPC2 (two pore segment channel 2)에 적색 형광 단백질(red fluorescent protein)인 mCherry와 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein)인 GFP가 결합되어 있는 융합 단백질(fusion protein)을 발현할 수 있게 하는 플라스미드이다.

본 명세서에서 "피부"는 동물의 체표를 덮는 조직을 의미하는 것으로서, 얼굴 또는 바디 등의 체표를 덮는 조직뿐만 아니라, 두피와 모발을 포함하는 최광의의 개념이다.

일 구현예에 있어서, 상기 세포는 흑색종 세포(melanoma), 멜라노사이트(melanocyte) 또는 망막 상피 세포(human retinal pigmented epithelial cell) 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 인간 또는 동물에서 멜라닌을 생성하는 멜라닌 생성 세포라면 제한이 없이 사용할 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 트랜스펙션은 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 공동-침전법, 전기 천공법 또는 리포솜 이용법 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 구현예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 세포의 형광 확인은 형광 현미경(Fluorescence microscope)을 이용하여 수행될 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 세포의 형광 확인은 상기 세포에 400-650nm의 파장의 빛을 조사하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 (b) 단계에서 세포의 형광 확인은 상기 세포에 400nm 이상, 410nm 이상, 420nm 이상, 430nm 이상, 440nm 이상, 450nm 이상, 455nm 이상, 460nm 이상, 465nm 이상, 470nm 이상, 475nm 이상, 480nm 이상, 485nm 이상 또는 488nm 이상이면서, 650nm 이하, 640nm 이하, 630nm 이하, 620nm 이하, 615nm 이하, 610nm 이하, 605nm 이하, 600nm 이하, 595nm 이하, 590nm 이하 또는 587nm 이하의 파장의 빛을 조사하여 수행될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명의 일 구현예에 따른 스크리닝 방법은 상기 (b) 단계의 시험물질이 처리된 세포에서 나타나는 형광에 따라 상기 시험물질을 피부 미백 물질로 판단할 수 있다. TPC2-mCherry-GFP 단백질을 발현하는 세포 내의 멜라노솜에는 TPC2-mCherry-GFP 단백질이 존재하며, 이 TPC2-mCherry-GFP 단백질의 mCherry는 적색의 형광을 GFP는 녹색의 형광을 나타낸다. 멜라노솜의 자식작용이 일어나지 않는 경우 pH는 약 7로 mCherry와 GFP 모두에서 형광이 발현되어 합쳐지면 노랑의 형광을 확인할 수 있다. 반면, 멜라노솜의 자식작용이 일어나는 경우 리포솜과 결합하여 pH가 약 5가 되고 GFP는 분해되어 mCherry만 남게 되므로 적색의 형광이 확인된다. 따라서 처리한 시험물질이 멜라노솜의 자식작용을 유도하여 적색의 형광을 확인할 수 있게 되면 해당 물질은 피부 미백 물질로 판단할 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 (c) 단계에서 피부 미백 물질로 판단하는 것은, 시험물질이 처리된 세포에서 적색형광을 10% 이상 나타내는 시험물질을 피부 미백 물질로 판단하는 것일 수 있다. 여기서 적색형광을 10%이상 나타낸다는 것은 형광을 나타내는 전체 면적 중 적색형광을 나타내는 면적이 10%이상인 것을 의미한다.

일 구현예에 있어서, 상기 피부 미백 물질은 멜라노솜의 자식작용(autophagy)을 유도하여 멜라닌 생성을 억제하는 물질일 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 피부 미백 물질은 피부 과색소 침착증을 예방 또는 완화하는 물질일 수 있으며, 상기 피부 과색소 침착증은 기미, 흑자 및 검버섯 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 상기 스크리닝 방법에 의해 피부 미백 물질로 판단된 물질을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 포함한다.

이하, 실시예 등을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명할 것이다.

[실험예 1] TPC2-mCherry-GFP 플라스미드 제작

TPC2-mCherry-GFP 플라스미드 제작을 위해, pEGFP-N3-TPC3(addgene社, Plasmid#80153)을 이용해 PCR을 수행하여 종료 코돈이 없는 5' 및 3'말단에 EcoRI의 외인성 제한 부위를 갖는 TPC2 cDNA를 생성하였다. 그 후 상기 TPC2 cDNA를 제한 효소에 의해 소화시킨 후 그 PCR 단편을 pcDNA3.1/myc-his(-) A 벡터의 EcoRI 부위에 삽입하여 pcDNA3.1 TPC2 백터를 생성하였다. ptfLC3(addgene社, Plasmid#21074)를 이용해 PCR을 수행하여 종료 코돈이 없는 5' 및 3'말단에 HindIII의 외인성 제한 부위를 갖는 mCherry-GFP cDNA를 생성하였다. 그 후 상기 mCherry-GFP cDNA를 제한 효소에 의해 소화시킨 후 그 PCR 단편을 pcDNA3.1 TPC2 벡터의 HindIII 부위에 삽입하여 플라스미드 생성하고, 생성된 플라스미드를 TPC2-mCherry-GFP로 명명하였다.

[실험예 2] 멜라노솜의 자식작용(autophagy) 활성에 따른 형광 확인

Mouse melanoma cell line인 B16 세포(ATCC社, USA)에 Lipofectamine 2000(Invitrogen社, Carlsbad, CA)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 실험예 1의 TPC2-mCherry-GFP 플라스미드를 트랜스펙션하여 세포 안으로 이동시켰다. 트랜스펙션된 B16 세포들을 G418 1.25mg/ml을 포함하는 선별 배지에서 7일 동안 배양한 후, TPC2-mCherry-GFP을 안정적으로 발현하는 B16 세포들을 현광현미경(IX71, Olympus社, Japna)을 통해 선별하였다.

TPC2-mCherry-GFP를 안정적으로 발현하는 B16 세포에 1μM의 α-MSH(alpha-Melanocyte Stimulating Hormone)을 처리하고 24시간 동안 배양하여 멜라닌 생성을 증가시켰다. 그 후 자식작용(autophagy)을 활성화시켜 멜라노솜을 분해한다고 알려진 물질들(IBSB-01: Coumestrol 50μM(sigma社), IBSB-02: 3'-hydroxydaidzein 200μM(아모레퍼시픽), IBSB-03: 8-hydroxydaidzein 50μM(아모레퍼시픽), IBPN-01: Dehydroabietic acid 100μM(sigma社))을 48시간 동안 처리한 후 LSM700 공초점 레이저 주사 현미경(LSM 700; Objective C-Apochromat 40x/1.2 W Corr UV-VIS-IR M27, Carl Zeiss社)으로 형광이미지를 얻어 그 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 형광이미지는 ZEISS Zen 소프트웨어를 사용하여 처리하였다.

도 1에서 확인할 수 있듯이, 멜라노솜의 자식작용을 활성화시키는 물질을 처리하지 않은 대조군에서는 노랑색의 형광만을 확인할 수 있으나, 멜라노솜의 자식작용을 활성화시키는 물질인 Coumestrol, 3'-hydroxydaidzein, 8-hydroxydaidzein, Dehydroabietic acid을 처리한 군에서는 적색의 형광을 확인할 수 있었다.

[실험예 3] 멜라노솜의 자식작용(autophagy)에 의한 색소형성 감소

B16 세포(ATCC社, USA)에 1μM의 α-MSH을 처리하고 24시간 동안 배양한 후, ARP101 10μM 및 상기 실험예 2에서 멜라노솜의 자식작용을 활성화시키는 물질로 확인된 IBSB-01: Coumestrol(50μM, 100μM), IBSB-02: 3'-hydroxydaidzein(200μM, 400μM), IBSB-03: 8-hydroxydaidzein(50μM, 100μM), IBPN-01: Dehydroabietic acid(50μM, 100μM) 각각을 α-MSH와 함께 48시간동안 처리하였다. 그 후, 각각의 물질이 처리된 세포를 PBS 완충액 5ml을 이용하여 워싱(washing)한 뒤, 스크리퍼를 이용하여 펠렛에 세포를 수집하고 색깔을 관찰하여 색소 형성정도를 비교하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

B16 세포에 1μM의 α-MSH을 처리하고 24시간 동안 배양한 후, ARP101 10μM 및 상기 실험예 2에서 멜라노솜의 자식작용을 활성화시키는 물질로 확인된 IBSB-01: Coumestrol 50μM, IBSB-02: 3'-hydroxydaidzein 200μM, IBSB-03: 8-hydroxydaidzein 50μM, IBPN-01: Dehydroabietic acid 100μM 각각을 α-MSH와 함께 48시간동안 처리하였다. 각각의 물질이 처리된 세포를 수집하여 2×Laemmli 샘플 완충액(Bio-Rad社)을 처리한 후, Bradford 용액(Bio-Rad社)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 총 단백질의 양을 정량하였다. 정량한 단백질로 웨스턴 블로팅을 수행하였다. 이때 항체로는 LC3에 특이적인 항체(NOVUS Biologicals社의 NB100-2220) 및 Actin의 특이적인 항체(NOVUS Biologicals社의 NB600-501)을 이용하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

이 결과, 상기 실험예 2에서 적색의 형광이 확인된 물질인 IBSB-01: Coumestrol, IBSB-02: 3'-hydroxydaidzein, IBSB-03: 8-hydroxydaidzein, IBPN-01: Dehydroabietic acid가 멜라노솜의 자식작용의 활성 지표인 LC3의 발현을 증가시키는 것을 알 수 있었으며, 이러한 물질들이 처리된 경우에는 색소 형성이 현저히 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 스크리닝 방법은 멜라노솜의 자식작용을 유도하여 멜라닌 생성을 억제하는 피부 미백 물질을 스크리닝 할 수 있다.

<110> AMOREPACIFIC CORPORATION <120> METHOD FOR SCREENING THE SKIN WHITENING MATERIALS <130> 20P015IND <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9219 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPC2-mCherry-GFP <400> 1 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 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gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa 4920 ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca 4980 gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg 5040 cttctgaggc ggaaagaacc agctggggct ctagggggta tccccacgcg ccctgtagcg 5100 gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg 5160 ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc 5220 cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc 5280 tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga 5340 cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa 5400 ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga 5460 tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattaattct 5520 gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat 5580 gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc 5640 aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac 5700 tccgcccatc 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ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg 6600 tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat 6660 cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc 6720 gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc acgagatttc 6780 gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc 6840 tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc caacttgttt 6900 attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca 6960 tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc 7020 tgtataccgt cgacctctag ctagagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg 7080 tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa 7140 gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 7200 ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 7260 ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 7320 gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 7380 tcaggggata 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gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 8280 atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc 8340 cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 8400 aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 8460 cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 8520 aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca 8580 ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 8640 gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 8700 ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 8760 tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 8820 tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 8880 ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 8940 tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 9000 agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 9060 acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 9120 ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 9180 gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtc 9219

Claims

(a) TPC2 및 mCherry-GFP 단백질을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 시험물질이 처리된 세포의 형광을 확인하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 시험물질이 처리된 세포에서 나타나는 형광에 따라 상기 시험물질을 피부 미백 물질로 판단하는 단계를 포함하고,
상기 TPC2와 mCherry-GFP 단백질을 발현하는 세포는 서열번호 1의 TPC2-mCherry-GFP 플라스미드에 의해 트랜스펙션(transfection) 된 세포인, 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 트랜스펙션은 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 공동-침전법, 전기 천공법 및 리포좀 이용법 중 하나 이상으로 수행되는, 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 세포의 형광 확인은 형광 현미경(Fluorescence microscope)을 이용하여 수행되는, 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 세포의 형광 확인은 상기 세포에 400-650nm의 파장의 빛을 조사하여 수행되는, 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 (c) 단계에서 피부 미백 물질로 판단하는 것은, 시험물질이 처리된 세포에서 적색형광을 10% 이상 나타내는 시험물질을 피부 미백 물질로 판단하는 것인, 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 세포는 흑색종 세포, 멜라노사이트 또는 망막 상피 세포인 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 피부 미백 물질은 멜라노솜의 자식작용(autophagy)을 유도하여 멜라닌 생성을 억제하는 물질인, 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 피부 미백 물질은 피부 과색소 침착증을 예방 또는 완화하는 물질인, 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
제9항에 있어서,
상기 피부 과색소 침착증은 기미, 흑자 및 검버섯 중 하나 이상을 포함하는, 피부 미백 물질 스크리닝 방법.