CN100362106C

CN100362106C - Glyt1功能的转基因动物模型

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Publication number: CN100362106C
Application number: CNB200410042955XA
Authority: CN
Inventors: D·阿尔贝拉蒂-贾尼; H·P·莫勒; M·保利-埃费斯
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2003-06-06
Filing date: 2004-06-04
Publication date: 2008-01-16
Anticipated expiration: 2024-06-04
Also published as: CN1572876A; JP2004357711A; CA2469992A1; US20050026292A1

Abstract

本发明提供了用于产生非人转基因动物的载体构建体和方法，所述非人转基因动物的基因组包含glyt基因内的条件性靶向突变且该动物可进一步用于产生下述的转基因动物，所述动物产生低活性或无活性的GLYT1蛋白。此外，也提供了产生低活性或无活性GLYT1蛋白的转基因动物以及产生该动物的方法。本发明也涉及这些动物的下述用途，所述用途是指用作评价GLYT1功能的工具、用作研究增强突触的NMDA受体功能的效应的模型、用作研究对诱发精神病行为的化合物的易感性的模型，以及涉及用于评估GLYT1功能的体内效应和测试GLYT1抑制剂除GLYT1特异效应外的其它效应的方法。

Description

Glyt1功能的转基因动物模型

技术领域

本发明涉及用于产生非人转基因动物的甘氨酸转运蛋白的载体构建体和方法，并涉及产生低活性或无活性的甘氨酸转运蛋白的转基因动物以及产生该动物的方法。本发明还涉及这些动物的用途以及使用该动物用于评估甘氨酸转运蛋白的体内效应和测试甘氨酸转运蛋白抑制剂的多种效应的方法。

背景技术

甘氨酸是脊髓和脑干中主要的抑制性神经递质并且也是NMDA受体的共同激动剂。甘氨酸的胞外浓度受至少两种Na⁺/Cl^-依赖的甘氨酸转运蛋白(GLYT1和GLYT2)调节，所述转运蛋白在以下方面中起到重要作用，即终止突触后甘氨酸能作用以及通过将甘氨酸再摄入到突触前神经末稍和周围的细神经胶质细胞的过程维持胞外甘氨酸的低浓度。GLYT2在啮齿类动物脊髓、脑干和小脑处以高水平表达，前述表达部位与马钱子碱敏感型甘氨酸受体的存在密切相关(Zafra，F.，等，J Neurosci，1995.(5Pt2)；3952-69页；Luque，J.M.，N.Nelson和J.G.Richards，Neuoscience，1995.64(2)：525-35页；Jursky，F.和N.Nelson，J Neurochem，1995.64(3)：1026-33页)。免疫组织化学分析表明主要定位于推定的甘氨酸能神经元突触前(Zafra，F.，等，J Neurosci，1995.(5Pt2)；3952-69页和Spike，R.C.等，Neuroscience，1997.77(2)：543-51页)，强烈提示在终止glycinerigic抑制性突触传递中起到作用。已克隆了人GLYT2并显示具有类似的表达方式(Morrow，J.A.，等，FEBS Lett，1998.439(3)：334-40页)。GLYT2具有一定程度的异质性。实际上在啮齿类动物脑中已鉴定出两种GLYT2同种型(2a和2b)。

通过其对肌氨酸和甘氨酸的N甲基化衍生物阻断的敏感性可将GLYT1和GLYT2进行药物学区分(Liu，Q.R.等，J Biol Chem，1993.268(30)：22802-8页和Kim，K.M.等，Mol Pharmacol，1994.45(4)：608-17页)。已克隆了人glyt1基因且其编码三种同种型GLYT1a、1b和1c(Kim，K.M.，等，Mol Pharmacol，1994.45(4)：608-17页)而仅鉴定出两种大鼠同种型GLYT1a和GLYT1b(Guasteua，J.，等，Proc Natl Acad Sci USA，1992.89(15)：7189-93页；Smith，K.E.，等，Neuron，1992.8(5)：927-35页和Borowsky，B.，E.Mezey和B.J.Hoffman，Neuron，1993.10(5)：851-63页)。GLYT1似乎在大鼠CNS的神经胶质细胞和神经元中均进行表达(Zafra，F.等，J Neurosci，1995.15(5Pt2)：3952-691页；Smith，K.E.，等，Neuron，1992.8(5)：927-35页；Smith，K.E.，等，Neuron，1992.8(5)：927-35页；Borowsky，B.，E.Mezey和B.J.Hoffman，Neuron，1993.10(5)：851-63页和Zafra，F.，等，Eur J Neurosci，1995.7(6)：1342-52页)，其中GLYT1a显然在灰质以及一些外周组织中表达而GLYT1b仅在CNS的白质中表达(Borowsky，B.，E.Mezey，和B.J.Hoffman，Neuron，1993.10(5)：851-6310页)。在人类中，对所有GLYT1同种型通用的探针揭示出其在多种外周组织中表达，最显著的为肾脏，而GLYT1c似乎为脑特异的表达(Kim，K.M.，等，MolPharmacol，1994.45(4)：608-177页)。GLYT1同种型的区别之处仅在于其氨基末端和5’非编码区(Kim，K.M.，等，Mol Pharmacol，1994.45(4)：608-177页和Borowsky，B.，E.Mezey和B.J.Hoffman，Neuron，1993.10(5)：851-63页)。GLYT1a和GLYT1b源自不同启动子指导的转录而人GLYT1c为GLYT1b转录本的剪接变体(Kim，K.M.，等，Mol Pharmacol，1994.45(4)：608-17页；Adams，R.H.，等，Neurosci，1995.15(3Pt2)：2524-327页以及Borowsky，B.和B.J.Hoffman，J Biol Chem，1998.273(44)：29077-85页)。GLYT1的外周表达以及同种型的不同CNS表达模式上与已发表研究中显然存在的主要差异存在一定程度的争议。在脊髓、脑干和间脑中GLYT1和GLYT2一同表达。有趣的是，GLYT1也在没有发现抑制性甘氨酸能神经元的前脑区如脑皮层、海马和嗅球处进行表达(Zafra，F.，等，JNeurosci，1995.15(5Pt2)：3952-691；Guastella，J.，等，Proc Natl Acad SciUSA，1992.89(15)：7189-93页；Smith，K.E.，等，Neuron，1992.8(5)：927-35页；Borowsky，B.，E.Mezey和B.J.Hoffman，Neuron，1993.10(5)：851-63页和Zafra，F.，等，Eur J Neurosci，1995.7(6)：1342-52页)，因此提示了GLYT1的其它作用，所述作用可能包括调节NMDA受体介导的神经传递(Smith，K.E.，等，Neuron，1992.8(5)：927-359页)。

结合谷氨酸和甘氨酸两者对NMDA受体的激活均为必需。当谷氨酸以活性依赖性方式从突触前端释放的时候，甘氨酸显然以更恒定的水平存在，表明其具有更大的调节功能。胞外和脑脊液中甘氨酸浓度的测定表明其以低的微摩尔级水平存在(Westergren，I.，等，J Neurochem，1994.62(1)：159-6514页)。但是甘氨酸转运蛋白可在NMDA受体的局部微环境中显著降低甘氨酸的浓度。实际上，已显示在非洲爪蟾卵母细胞中表达GLYT1b可降低共表达的NMDA受体处的甘氨酸浓度(Supplisson，S.和C.Bergman，J Neurosci，1997.17(12)：4580-9015和Chen，L.，J Neuophysiol，2003.89(2)：691-703页)。此外，最近的研究已表明甘氨酸摄入机制可调节突触的NMDA受体活性(Berger，A.J.，S.Dieudonne和P.Ascher，J Neurophysiol，1998.80(6)：3336-40页和Bergeron，R.，等，Proc Natl Acad Sci USA，1998.95(26)：15730-4页)。NMDA受体的甘氨酸亲和性受受体NR2亚单位的特性所影响，并且在重组系统中与含NR2B、C或D的受体相比含NR2A的受体呈现的对甘氨酸亲和性显著降低(Ikeda，K.，等，FEBS Lett，1992.313(1)：34-8页；Kutsuwada，T.，等，Nature，1992.358(6381)：36-41页和Priestley，T.，等，Mol Pharmacol，1995.48(5)：841-8页)。已证明在成熟过程中，出现对甘氨酸亲和性明显较低的NMDA受体群，这与NR2A的表达增加相平行(Kew，J.N.，等，J Neurosci，1998.18(6)：1935-4321页)，提示存在正常生理条件下不被甘氨酸饱和的NMDA受体群。谷氨酸神经传递，特别是NMDA受体活性，在突触可塑性、学习和记忆中起到关键作用，因为NMDA受体看来似乎用作门控突触可塑性和记忆形成的界限的分级开关(Hebb，D.，1949，New York：Wiley和Bliss，T.V.和G.L.Collingridge，Nature，1993.361(6407)：31-9页)。过表达NMDA NR2B亚单位的转基因小鼠呈现出增强的突触可塑性和超常的学习和记忆能力(Tang，Y.P.，等，Nature，1999.401(6748)：63-9页)。

NMDA受体活性的提高可通过选择性抑制GLTY1或通过遗传干预降低或消除其功能而实现。该方法将导致局部甘氨酸浓度的提高而GLYT2的抑制性甘氨酸能功能的调节则不受影响。

预测该突触NMDA受体功能的提高将产生认知增强效应。作为该策略的支持，已显示NMDA受体甘氨酸位点的部分激动剂D-环丝氨酸有助于老龄大鼠完成水迷宫任务(Aura，J.，M.Riekkinen和P.Riekkinen，Jr.，Eur J Pharmacol，1998.342(1)：15-20页)以及可部分缓解此任务中由中间隔损害所诱发的缺陷(Riekkinen，P.，Jr.，S.Ikonen和M.Riekkinen，Neuroreport，1998.9(7)：1633-7页)。NMDA受体甘氨酸亲和性轻度降低的突变小鼠也呈现出海马LTP缺陷和Morris水迷宫的空间学习缺陷(Kew，J.N.，等，J Neurosci，2000.20(11)：4037-49页)。

已发现NMDA受体功能减退参与了精神分裂症的病理生理过程(Olney，J.W.和N.B.Farber，Arch Gen Psychiatry，1995.52(12)：998-1007页和Hirsch，S.R.等，Pharmacol Biochem Behav，1997.56(4)：797-802)。非竞争性NMDA受体拮抗剂如PCP和氯胺酮可诱发精神分裂症样的精神病(Allen，R.M.和S.J.Young，Am J Psychiary，1978.135(9)：1081-4页；Javitt，D.C.和S.R.Zukin，Am J Psychiatry，1991.148(10)：1301-8页和Krystal，J.H.，等，Arch Gen Psychiatry，1994.51(3)：199-214页)。PCP诱导的啮齿类动物的高反应性可被甘氨酸和其衍生物抑制(Toth，E.和A.Lajtha，Neurochem Res，1986.11(3)：393-400页和Toth，E.等，Comm PsycholPsychiat Behav，1986.11：1-9页)，且有趣的是，也可由甘氨酰十二烷基酰胺(glycyldodecylamide)抑制(Javitt，D.C.，等，Neuropsychopharmacology，1997.17(3)：202-4页)，所述甘氨酰十二烷基酰胺抑制前脑对甘氨酸的摄入(Javitt，D.C.和M.Frusciante，Psychopharmacology(Berl)，1997.129(1)：96-8页)。

最后，也已显示甘氨酸和D-环丝氨酸可显著减轻对精神抑制药部分反应的精神分裂症患者的消极和认知症状(Waziri，R.，Biol Psychiatry，1988.23(2)：210-1页；Javitt，D.C.，等，Am J Psychiatry，1994.151(8)：1234-6页和Goff，D.C.，等，Am J Psychiatry，1995.152(8)：1213-5页)。

GLYT1敲除小鼠提供了评价GLYT1生理学功能的有用工具并且也提供了纯GLYT2表达系统。这些小鼠应在前脑中显示有提高水平的甘氨酸且其可用于回答这样的疑问，即NMDA受体甘氨酸位点占据的活性调节对NMDA受体的生理功能是否重要。

发明详述

本发明提供了用于产生非人转基因动物的载体构建体和方法，所述转基因动物基因组的glyt1基因内包含条件性靶向突变。这些转基因动物可进一步用于生成产生低活性或无活性的GLYT1蛋白质的转基因动物。此外，也提供了产生低活性或无活性GLTY1蛋白质的该转基因动物，以及提供了产生这些动物的方法。本发明也涉及这些动物的以下的用途，用作评价GLYT1功能的工具以及用作研究提高突触NMDA受体功能的效果以及研究对诱发精神病行为的化合物的易感性的模型，以及涉及用于评估GLYT1功能体内效应的方法和测试GLYT1抑制剂的除GLYT1特异效应外的其它效应的方法。

因此本发明提供了包含glyt1基因的全部或部分基因组序列的载体构建体，其中基因组序列包含阳性选择性标记且任选地包含阴性选择性标记且其中至少部分glyt1基因外显子配备有重组酶识别位点。

小鼠glyt1基因的基因组序列包含外显子1a、1b、1c和2到13。载体构建体应包含足够的同源重组所需要的glyt1基因的基因组序列以及包含含有设计为重组酶识别位点的glyt1基因外显子的一部分或glyt1基因的一个或多个外显子的部分基因组序列。载体构建体可包含glyt1基因的所有外显子，优选地包含外显子1c到13。

载体构建体中的基因组序列包含一阳性选择性标记，其中阳性选择性标记可选自新霉素抗性基因和潮霉素抗性基因。阳性选择性标记的两端也可含有重组酶识别位点，所述位点允许在筛选成功的同源重组后切除阳性选择性标记基因。由此，可避免阳性选择性标记表达对glyt1基因表达的任何影响。用于重组酶的识别位点可选自用于flp重组酶的frt位点和用于cre重组酶的lox位点。优选地，阳性选择性标记为新霉素抗性基因。任选地，载体构建体内的基因组序列额外包含阴性选择性标记，其中阴性选择性标记可选自白喉毒素基因和HSV胸苷激酶基因。优选地，阴性选择性标记为白喉毒素基因。

在glyt1基因的基因组序列中，对至少部分的glyt1基因外显子设计有重组酶的识别位点。这样至少部分的glyt1基因外显子可借助重组酶得以删除。用于重组酶的识别位点可选自用于flp重组酶的frt位点和用于cre重组酶的lox位点。因此，在编码为其功能和活性所必需的GLYT1蛋白质的部分氨基酸序列的glyt1基因的部分外显子、一个或多个外显子设计有重组酶的识别位点。在一优选的实施方案中，glyt1基因的外显子5到11设计有重组酶识别位点。

在进一步的实施方案中，提供了如图1中所描述的pGLYT1载体构建体。

在进一步优选的实施方案中，glyt1基因的基因组序列为鼠源序列。

在另一优选的实施方案中，载体构建体包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

本发明进一步提供了产生非人转基因动物的方法，所述转基因动物glyt1基因的一个或两个等位基因含有条件性靶向突变，该方法包括：

(a) 将如上描述的载体构建体导入胚胎干细胞，

(b) 由该胚胎干细胞生成杂合和/或纯合的转基因动物，并由此

(c) 产生非人转基因动物，所述动物的glyt1基因的一个或两个等位基因包含条件性靶向突变。

在所描述方法的步骤(c)中，可产生这样的转基因动物，即其glyt1基因的一个或两个等位基因包含如图2描述的MT1构建体。

此处应用的术语转基因动物包括其基因中含有条件性靶向突变的动物、其基因中含有靶向无意义突变的敲除动物、其基因中含有靶向插入的敲入动物，以及含有随机插入转基因的动物。如此处所用，特定基因中含有条件性靶向突变的动物为这样的动物，即其中该基因以一定方式进行了修饰，使其编码蛋白质的功能未受到损害且通过重组酶的重组在该基因中可产生功能性突变。

在进一步的实施方案中，以上描述的方法额外包括(d)将步骤(c)中产生的转基因动物与下述的重组酶转基因动物杂交，所述重组酶识别对位于glyt1基因的基因组序列中的选择性标记设计的识别位点。

在所描述方法的步骤(d)中，可产生下述的转基因动物，即该动物glyt1基因的一个或两个等位基因包含如图2所描述的MT1.2构建体。

在另一实施方案中，提供了产生非人转基因动物的方法，所述转基因动物的glyt1基因的一个或两个等位基因以表达低活性或无活性GLYT1蛋白的方式被突变和/或截短，该方法包括

(e)将用以上描述的步骤(c)中的方法产生的转基因动物或步骤(d)中产生的转基因动物与重组酶转基因动物杂交，所述重组酶识别对至少部分的glyt1基因外显子设计的识别位点，并由此

(f)产生下述的非人转基因动物，即转基因动物gly1基因的一个或两个等位基因以表达低活性或无活性GLYT1蛋白的方式被突变和/或截短。

在所描述方法的步骤(f)中，可产生下述的转基因动物，即该动物glyt1基因的一个或两个等位基因包含如图2所描述的MT1.1构建体。

可基于特异的条件靶向构建体产生组织特异或可诱导的GLYT1缺陷动物。可对这些动物进行遗传学、组织学、电生理学和行为学分析。

在进一步的实施方案中，对于重组酶转基因的动物，其重组酶可识别对至少部分的glyt1基因外显子设计的识别位点，所述重组酶在组织特异型启动子系统的控制下进行表达。组织特异型启动子系统可为任何的启动子系统，所述系统控制和指导基因以组织特异的方式进行表达，例如在脑组织、肌肉组织、肝脏组织、肾脏组织等中进行表达。已知可诱导在存在于脑的细胞中进行表达的启动子的示例包括金属硫蛋白III启动子、神经元特异的烯醇酶(NSE)启动子、钠通道启动子、神经丝M(NF-M)启动子、神经丝L(NF-L)启动子、神经丝H(NF-H)启动子、神经胶质纤丝酸性蛋白(GFAP)启动子、髓磷脂碱性蛋白(MBP)启动子、蛋白脂质蛋白(Plp)启动子、酪氨酸羟化酶(TH)启动子、醛缩酶C启动子、突触蛋白I启动子、rhombotinI启动子、多巴胺β羟化酶(DBH)启动子、胆碱乙酰基转移酶(ChAT)和浦肯野细胞(Pcp2)启动子。

在另一实施方案中，重组酶转基因的该动物中的重组酶在可调控的启动子系统控制下进行表达。可调控启动子系统可为任何这样的启动子系统，即其以可调控和/或可诱导的方法控制转基因的表达，例如，通过加入特定的诱导物或抑制物。几种可诱导的细菌启动子系统为本领域内已知(Schultze N，Burki Y，Lang Y，Certa U，Bluethmann H；Nat Biotechnol1996；14(4)：499-503；Van der Neut R；靶向的基因破坏：在神经生物学中的应用；J Neurosci Methods 1997；71(1)：19-27；Liu HS，Lee CH，Lee CF，Su IJ，Chang TY；Lac/Tet双诱导系统在哺乳动物细胞系的功能.Biotechniques.1998；24(4)：624-8，630-2)。

在进一步的实施方案中，提供了产生非人转基因动物的方法，所述动物的glyt1基因的一个或两个等位基因以表达低活性或无活性GLYT1蛋白的方式被突变和/或截短，该方法包括

(a) 将所描述的载体构建体导入胚胎干细胞，

(b) 进一步将如下的载体构建体导入该胚胎干细胞，即该载体构建体包含编码重组酶的核苷酸序列，所述重组酶识别对至少部分的glyt1基因外显子设计的识别位点，

(c) 由该胚胎干细胞生成杂合的和/或纯合的转基因动物，并由此

(d) 产生非人转基因动物，所述动物的glyt1基因的一个或两个等位基因以表达低活性或无活性GLYT1蛋白的方式被突变和/或截短。

在所描述方法的步骤(d)中，可产生这样的转基因动物，即其glyt1基因的一个或两个等位基因包含如图2描述的MT1.1构建体。

上述方法还可包括在步骤(b)后的步骤

(c)中进一步将如下的载体构建体导入所述胚胎干细胞，即该载体构建体包含编码重组酶的核苷酸序列，所述重组酶识别对位于glyt1基因的基因组序列中的选择性标记设计的识别位点，

(d)由该胚胎干细胞生成杂合的和/或纯合的转基因动物，并由此

(e)产生非人转基因动物，所述动物的glyt1基因的一个或两个等位基因以表达低活性或无活性GLYT1蛋白的方式被突变和/或截短。

包含靶向突变的转基因动物可在本领域内常规获得，如由Capecchi(Capecchi，M.R.，Trends Genet，1989.5(3)：70-6页)和Thomas等(Thomas，K.R.和M.R.Capecchi，Cell，1987.51(3)：503-12页)所提供的。

例如，以上描述方法的杂合和/或纯合转基因动物的产生可通过以下实现，即筛选重组胚胎干细胞克隆、证实重组胚胎干细胞克隆中的靶向突变、将已证实的重组胚胎干细胞注射到囊胚泡中、培育来自囊胚泡的嵌合体动物、研究嵌合体动物靶向突变的种系转化、培育杂合动物以及任选地将这些杂合转基因动物杂交以产生纯合转基因动物。

可通过两种方法制备基于细胞培养的模型。可从转基因动物中分离细胞培养物，也可应用相同的构建体以标准细胞转染技术从已建立的细胞培养物中制备细胞培养物。

可用于本发明方法中的本领域内使用的胚胎干细胞包括，C57BL/6J胚胎干细胞、BALB/c胚胎干细胞、DBA/2J胚胎干细胞、CBA/J胚胎干细胞和小鼠129种系的胚胎干细胞系。

本发明进一步提供由以上描述的任何方法所产生的非人转基因动物。

在本发明的另一实施方案中，提供了这样的非人转基因动物，所述动物的glyt1基因的一个或两个等位基因包含条件性靶向突变。在一优选的实施方案中，条件性靶向突变包含重组酶的下述识别位点，所述识别位点设计为编码GLYT1活性所必需的氨基酸的部分glyt1基因组序列。

在进一步的实施方案中，提供了这样的非人转基因动物，所述动物的glyt1基因的一个或两个等位基因包含如图2所描述的构建体MT1或构建体MT1.2。

基于特异条件靶向的构建体可产生组织特异或可诱导的GLYT1缺陷动物。这些动物可进行遗传学、组织学、电生理学和行为学分析。

本发明进一步涉及这样的非人转基因动物，所述动物的glyt1基因的一个或两个等位基因以表达低活性或无活性GLYT1蛋白的方式被突变和/或截短。在一优选的实施方案中，非人转基因动物所包含glyt1基因的一个或两个等位基因的外显子5到11缺失。在进一步的实施方案中，提供了这样的非人转基因动物，所述动物的glyt1基因的一个或两个等位基因包含如图2所描述的构建体MT1.1。

在另一优选的实施方案中，非人转基因动物在glyt1基因的一个或两个等位基因处包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列而不是天然glyt1基因。

在其glyt1基因的一个或两个等位基因以表达低活性或无活性GLYT1蛋白的方式被突变和/或截短的转基因动物中，预期可通过改变内源甘氨酸水平体内调节NMDA受体活性。由于在海马和脑皮层区缺乏GLYT2受体，预期破坏这些这些区域的GLYT1将导致谷氨酸能突触的甘氨酸水平提高，因此增强NMDA受体功能。在这些动物中可发生认知功能的改变，且也可能改变诱发精神病样症状的易感性。

非人转基因动物可为任何本领域内已知的可用于本发明方法的动物。优选地，本发明的动物为哺乳动物，更优选地本发明的转基因动物为啮齿类动物。最优选地转基因动物为小鼠。

本发明也涉及由本发明提供的非人转基因动物的后代，所述后代通过与相同基因型或另一基因型繁殖而获得。

本发明进一步提供了源自本发明非人转基因动物或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织以及器官型脑切片。

可应用由两到三周龄小鼠的尾部活组织中分离的DNA通过多种方法检测包含条件性靶向突变的转基因的整合，所述方法包括基因组Southern印迹和PCR分析。

本领域内的技术人员将会明晓，存在有大量的可用于检测转基因表达的分析方法，所述方法包括RNA水平的方法和蛋白质水平的方法，其中所述RNA水平的方法包括通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)或通过Northern印迹、原位杂交进行mRNA定量的方法，所述蛋白质水平的方法包括组织化学、免疫印迹分析和体外结合研究。此外可通过本领域内公知的ELISA技术对靶基因表达水平进行定量。

定量测定可应用多种标准试验完成。例如，可应用RT-PCR和杂交方法测定转录本水平，所述杂交方法包括RNase保护、Northern印迹分析和RNA点分析。可通过ELISA、Western印迹分析以及通过比较免疫组化染色的组织切片测定APP和A-β水平。也可应用免疫组化染色和免疫电子显微镜评估GLYT1蛋白的存在与否。此类试验的具体例子在以下提供。

“多核苷酸”和“核酸”指单链或双链分子，可为由核苷碱基A、T、C和G组成的DNA，或由碱基A、U(替换T)、C和G组成的RNA。多核苷酸可代表编码链或其互补链。多核苷酸分子的序列可与天然存在的序列完全相同，或可包括备选密码子，所述备选密码子编码的氨基酸与天然存在序列所编码的氨基酸相同(参见，Lewin“基因V”Oxford UniversityPress，第7章，1994，171-174)。此外，多核苷酸分子可包括如所描述的氨基酸保守替换的密码子。多核苷酸可代表基因组DNA或cDNA。

本发明的转基因动物可通过本领域内已知的方法以及通过表明神经学和认知功能的行为研究进行进一步的表征，所述已知的方法包括免疫组化、电子显微镜、磁共振成像(MRI)。行为测试的示例包括：自发行为、涉及认知功能的行为、药物破坏的行为、握力、导线操作、游泳试验、旋转杆试验、运动活性、Morris水迷宫、Y-迷宫、明-暗喜好、被动和主动避免试验。

本发明的进一步的目的是将以上描述的非人转基因动物或源自转基因动物的细胞系、组织或器官型脑切片用作研究对诱发神经病行为的化合物敏感性的模型。此外，这些转基因动物、源自所述转基因动物的细胞、组织或器官型脑切片培养物可用作研究提高突触NMDA受体功能效应的模型。此外，这些非人转基因动物或源自所述转基因动物的细胞、组织或器官型脑切片培养物可用作评估GLYT1功能的工具。

在进一步的实施方案中，提供了用于评估GLYT1功能体内影响NMDA受体激活的方法，该方法包括在其glyt1基因的一个或两个等位基因以表达低活性或无活性GLYT1蛋白的方式被突变和/或截短的非人转基因动物中测定NMDA受体活性、突触可塑性和包括学习和记忆的行为，并与含天然glyt1基因的动物的NMDA受体活性、突触可塑性和行为进行比较。

在另一实施方案中，提供了这样的方法，即测试GLYT1抑制性化合物除GLYT1特异效应外的其它效应，该方法包括将GLYT1抑制性化合物施用到非人转基因动物，所述动物的glyt1基因的一个或两个等位基因以表达低活性或无活性GLYT1蛋白的方式被突变和/或截短，或施用到源自所述非人转基因动物的细胞系、原代细胞培养物或器官型脑切片培养物，并测定化合物的效应，包括评估行为、电生理学和组织学，并与对照动物的行为、电生理学和组织学进行比较。

可用于本发明方法中的GLYT1抑制性化合物可为本领域内已知的任何GLYT1抑制性化合物，包含ALX5407(NPS Pharmaceuticals/NPS Allelix)和ORG24598(Akzo/Organon)。

对照可包含任何这样的动物、细胞系、原代细胞培养物或器官型脑切片培养物或组织，其中glyt1基因并未以一定方式突变来表达低活性或无活性的GLYT1蛋白，或其中动物、细胞系、原代细胞培养物或器官型脑切片培养物包含天然glyt1基因。行为评估可包括自发行为、涉及认知功能的行为(包含空间短期和长期记忆、目标识别记忆、联想性情感记忆、恐惧条件反射消失)以及包括药学破坏的行为(包括药物诱发的多动、药物诱发的社会退缩、药物诱发的前脉冲抑制缺失和药物诱发的记忆丧失)。

本发明进一步涉及这样的成套材料，该成套材料用于测试GLYT1抑制性化合物除GLYT1特异效应外的其它效应，所述成套材料包含其glyt1基因的一个或两个等位基因以表达低活性或无活性GLYT1蛋白的方式被突变和/或截短的非人转基因动物，或源自该转基因动物的细胞系、原代细胞培养物或组织或器官型脑切片培养物或组织，以及用于测定GLYT1抑制剂是否呈现除GLYT1特异效应外的其它效应的方法。

此外，提供了以下材料用于测试GLYT1抑制性化合物除GLYT1特异效应外的其它效应，所述材料为其glyt1基因的一个或两个等位基因以表达低活性或无活性GLYT1蛋白的方式被突变和/或截短的非人转基因动物，或源自该转基因动物的细胞系、原代细胞培养物或组织或器官型脑切片培养物或组织。

除GLYT1特异效应外的其它效应可为通过GLYT1抑制性化合物与任何其它分子相互作用而产生的任何副作用。

本发明进一步提供了转基因动物、方法、组合物、成套材料和用途，在特别参考前述示例之前基本如此处所描述。

现在已总体上描述了本发明，参考包括于此的特定实施例和随后与之关联的图表本发明将更易于理解，除非另外指出所述实施例仅用于说明的目的且并不意在构成限制。

附图简述：

图1：上端：15kb基因组glyt1克隆的结构和限制性图谱，其包含外显子1c到13。用作文库筛选的探针(A-D)和外显子序列以黑条显示。在基因图的下面给出了限制性位点。下端：基因靶向构建体pGLYT1。外显子以黑条显示，并带有外显子编号，重组位点以三角形表示，且新霉素抗性基因(neo)和白喉毒素(DT)基因以盒子表示。

图2：用于确认重组事件的引物对的示意性图表。

图3：用于在glyt1-基因座定点重组的示意性图表。

图4：A)左：小鼠glyt1基因外显子1c的5’到5’loxP-位点(SEQ IDNO：10和11)的PCR。由突变体等位基因产生的扩增子大小为4494bp，野生型等位基因没有扩增子。A)中间和B)左：小鼠glyt1基因neo-盒子到外显子13的3’(SEQ ID NO：15和14)的PCR。由突变体等位基因产生的扩增子大小为4429bp，野生型等位基因没有扩增子。A)右和B)右：小鼠glyt1基因外显子11到外显子13的3’(SEQ ID No：12和13或14)的PCR。由突变体等位基因产生的扩增子大小为5351(A)或5611(B)bp，由野生型等位基因产生的扩增子大小为3609(A)或3869(B)bp。A1、A2、B7、C6、C8：ES-细胞克隆；WT：野生型B6-DNA；1到6：F1-小鼠；+/-：杂合对照。

图5：Cre-重组后小鼠glyt1基因外显子1c的5’到外显子11的3’(SEQID NO：10和16)的PCR。由cre-突变的等位基因产生的扩增子大小为6238bp，由野生型等位基因产生的扩增子大小为10816bp。1到8：F1-小鼠；+/-：杂合对照；+/+：野生型对照。

图6：左：Flp-重组后小鼠glyt1基因外显子1c的5’到外显子11的3’(SEQ ID NO：10和16)的PCR。由Flp-突变的等位基因产生的扩增子大小为7039bp，由野生型等位基因产生的扩增子大小为10816bp。右：小鼠glyt1基因外显子11到外显子11的3’(SEQ ID NO：12和16)的PCR。由Flp-突变的等位基因产生的扩增子大小为258bp，由野生型等位基因产生的扩增子大小为182bp。1到8：F1-小鼠。

实施例

除非另外指出，实施例中涉及的可商业获得试剂的使用根据生产商的说明书进行。

实施例1：转基因小鼠的产生

A)glyt1的基因组克隆

克隆glyt1基因作为对其进行靶向破坏的先决条件。根据小鼠glyt1基因的部分基因组序列(Adams，R.H.，等，J Neurosci，1995.15(3Pt2)：2524-32页)，通过PCR扩增包含外显子1c到2、外显子3到4、外显子5到11和外显子12到13的四个基因组DNA片段(SEQ ID NO：2和3的引物用于探针A；SEQ ID NO：4和5用于探针B；SEQ ID NO：6和7用于探针C；SEQ ID NO：8和9用于探针D)。扩增的DNA片段用作筛选由ES细胞系mJAX32(129J/Ems)的DNA所构建的基因组文库的探针。分离可与所有四个外显子探针杂交的一个15kb的克隆。对该克隆进行作图和测序，并发现其含有glyt1基因完整的编码序列(图1)。

B)glyt1基因靶向载体的构建

为将glyt1靶向到ES细胞中，构建出条件性基因破坏的载体以获得组织或时间限制的GLYT1缺陷小鼠。

pGLYT1构建体包含与克隆到载体pBluescript中的小鼠glyt1基因(图1，SEQ ID NO：1)同源的总长度为10kb的序列。该载体为置换型基因靶向载体，可允许阳性和阴性筛选。为进行阳性筛选，已将设计含有frt的新霉素抗性基因插入到glyt1基因的外显子11中。为允许进行阴性筛选，已在载体的3’末端加入白喉毒素基因。为达到glyt1基因的条件性破坏，已对5kb的包括外显子5到11的glyt1基因设计插入loxP位点。在pGLYT1小鼠中，可通过Flp介导的重组在frt位点切除新霉素抗性基因以排除任何的基因干扰人工产物(参见E)。

C)B6-glyt1^tm1小鼠的产生

培养C57BL/6J胚胎干细胞(Eurogentec)并用NotI线性化的靶向载体pGLYT1进行转染(Capecchi，M.R.，Trends Genet，1989.5(3)：70-6页)。通过PCR筛选所选择的克隆用于同源重组(图2)。将携带glyt1等位基因突变的正确靶向的克隆(IC6，图4A)注射到Balb/c宿主的囊胚泡中。注射的囊胚泡植入代孕母鼠后出生的雄性嵌合体动物与C57BL/6J雌鼠交配，并通过PCR(SEQ ID NOs：10和15；图4B)分析Glyt1^tml的种系转化。杂合的B6-Glyt1^tml+/-小鼠进行互交以获得纯合的突变动物。杂合动物能够存活且并未显示任何的肉眼可见的表型。

D)B6-glyt1^tml.1小鼠的产生

应用与C)中相同的克隆(IC6)进行Cre-重组以体外切除设计的含有loxP位点的外显子5到11。将ES细胞增殖到1.5×10⁷个细胞并用20μg的超螺旋pMC-Cre(Thomas，K.R.和M.R.Capecchi，Cell，1987.51(3)：503-12页)对细胞进行电穿孔。挑选单克隆并通过PCR(SEQ ID NOs：10和16)筛选位点特异的重组。将glyt1等位基因中携带有缺失的正确重组克隆(IIB2)注射入Balb/c宿主的囊胚泡中。饲养嵌合体动物并按C)所描述方法进行试验(图5)。杂合动物能够存活且并未显示任何的肉眼可见的表型。

E)B6-glyt1^tml.2小鼠的产生

应用与C)中相同的克隆(IC6)进行Flp-重组以体外切除设计的含有frt位点的新霉素抗性基因。将ES细胞增殖到1.5×10⁷个细胞并用20μg用于表达Flp重组酶的超螺旋质粒(Gu，H.，Y.R.Zou，和K.Rajewsky，Cell，1993.73(6)：1155-64页)对细胞进行电穿孔。挑选单克隆并通过PCR(SEQ ID NOs：10、12和16)筛选位点特异的重组。将正确重组的克隆(IIE5)注射到Balb/c宿主的囊胚泡中。饲养嵌合体动物并按C)所描述方法进行试验(图6)。杂合动物能够存活且并未显示任何的肉眼可见的表型。

实施例2：GLYT1突变小鼠的分子分析

1)GLYT1突变小鼠的组织学分析

通过免疫组织化学分析突变小鼠脑中GLYT1的表达，所述分析应用在兔和豚鼠中产生的GLYT1特异性抗体进行。GLYT1突变小鼠和野生型小鼠的GLYT1的表达与NMDA受体的表达模式相关。

2)GLYT1突变小鼠的电生理分析

诱导特定形式的长时程增强(long term potentiation；LTP)需要激活NMDA受体(Bliss，T.V.和G.L.Collingridge，Nature，1993.361(6407)：31-9页)。比较GLYT1突变体和野生型对照的海马切片在强直后期由θ脉冲刺激所诱导的增强，如先前所描述的那们进行(Kew，J.N.，等，J Neurosci，2000.20(11)：4037-49页)。测定与对照相比GLYT1突变小鼠对诱导LTP的敏感性是否提高。

3)前脑和脑干突触体的制备

处死小鼠并在冰上解剖脑组织，且随后的步骤在4℃进行。用玻璃/聚四氟乙烯匀浆器在10倍体积(W/V)含0.32M蔗糖和1mM Pefabloc(蛋白酶抑制剂混合物)的10mM Tris-HCl pH 7.4中(缓冲液A)将组织磨成匀浆(800转/分钟，10次)。将匀浆物于1300xg离心5分钟。小心倒出上清并置于冰上，将沉淀重悬在5倍体积(原始重量的)的缓冲液A中，按如前所述磨成匀浆并离心。第二次获得的上清加到第一次的上清中并于17,000xg离心20分钟。产生的沉淀块(粗制突触体部分)重悬在5倍体积(原始重量的)的含10mM葡萄糖且pH为7.4的Krebs-Ringer溶液(KRB)中。

4)甘氨酸摄入

试验在96孔板中进行。将分装的小鼠前脑(0.1mg)和脑干(0.05mg)突触体制备物在KRB中与120nM[³H]甘氨酸以250μl总体积于22℃孵育30分钟。通过快速过滤到96孔Packard GF/B单滤器板上而终止孵育，随后用冰冷的KRB洗涤三次。加入闪烁溶液后测定孔的放射性含量。

5)MK801的饱和结合

试验在96孔深板中进行。将分装的小鼠前脑和脑干突触体制备物(0.07mg)在含100μM谷氨酸、30μM甘氨酸以及[³H]MK801浓度逐渐增加(0.03-300nM)的Hepes-KOH，pH7.4中以0.5ml总体积于22℃孵育一小时。非特异结合用10μM的MK801定义。通过快速过滤到96孔PackardGF/C单滤器板而终止孵育，随后用冰冷的20mM Hepes-KOH，pH 7.4洗涤三次。加入闪烁溶液后测定孔的放射性含量。

实施例3：GLYT1缺陷小鼠的行为分析

GLYT1缺陷小鼠中NMDA受体功能的提高可预期对认知功能产生影响并改变对精神分裂症类症状产生功效的药物的敏感性，所述药物包括阿朴吗啡、D-苯丙胺、苯环己哌啶。

1)自发行为

观察GLYT1缺陷小鼠的自然探察行为体征，包括身体姿态、步态和感觉反应(Gossen，M.和H.Bujard，Proc Natl Acad Sci USA，1992.89(12)：5547-51页)。此外，分析动物的运动活性(活性盒子)以及运动协调性(旋转杆试验)。此外，通过将动物暴露于天然令鼠厌恶的刺激(高脚十字迷宫试验和明/暗选择试验)中评估焦虑状态。

2)涉及认知功能的行为

空间短时和长时记忆

延时的匹配空间工作记忆任务的进行如Durkin所描述(Irwin，S.，Psychopharmacologia，1968.13(3)：222-57页)。根据在5臂迷宫中对延时匹配规则(delayed matching rule)的掌握评估工作记忆。基本的学习任务由两阶段组成。每次试验从呈现阶段开始，此期间动物暴露于强制且有奖赏的对准随机选择的一个臂的访问中，其余的四个臂关闭。一旦受到奖赏，即将动物置于等待笼中。在可变的保留间隔后(对于工作记忆为2秒、20秒和40秒延时；对于长时和短时记忆为5分钟、1小时、4小时、24小时)，进行恢复试验阶段，此期间动物暴露于从五个开放臂之中进行选择的情况下。正确选择先前访问的臂将受到奖赏。工作记忆的保留能力表示为保留间隔除以连续试验中正确无误选择的平均百分比，所述连续试验间的试验间间隔固定为10秒。记忆任务通过自动录影跟踪系统进行监控。

备选地，在Morris描述的水迷宫范例(Durkin，T.P.，等，Behav BrainRes，2000.116(1)：39-53页)中评估空间学习和记忆。小鼠置于环形池(直径120cm，高30cm)中，在其中小鼠学习通过定位到隐藏的平台而从乳白色的水(20cm深，20±1℃)中逃脱。该靶平台(直径7cm，低于水表面1cm)置于池特定象限的中心，并在池的周围放置外部视觉提示以利于动物导航。在4天的试验时间内，在四个随机挑选的固定起始位点中的一个，将小鼠放置在面对池壁的水中(每轮三次试验，每天三轮)。应用能动自动录像系统测定小鼠定位目标所需的时间(逃脱潜伏期)、游泳路径和游泳速度。如果动物未能在60秒时间内发现目标，用手将其置于平台上并允许其停留一个试验间隔(10-20秒)。每轮间的间隔为1.5-2小时。第4天的最终试验之后，移除平台，并允许小鼠自由游泳60秒。记录小鼠用于每一象限的时间和其游泳路径。

目标识别记忆任务

视觉空间识别记忆任务修改自最初由Ennaceur和Delacour最初研发的目标识别记忆试验(Morris，R.G.，等，Nature，1986.319(6056)：774-6页)。记忆重现的评估基于对样本规则的延时非匹配。小鼠熟悉试验仪器，所述仪器具有西、东和南向臂的T型方向的迷宫组成，前述臂在空间上由特定的迷宫外提示限定。视觉空间识别记忆部分由两个连续的5分钟试验组成。进行第一个掌握试验时，将小鼠暴露于三个不同的新目标(O1、O2和O3)，所述新目标放置于T型方向迷宫中的不同位置(例如，O1/西、O2/西和O3/南)。测定5分钟内对每一目标的探测次数和持续时间。在可变的试验间保留间隔(1小时、4小时和24小时间隔)后，进行识别试验。将三个熟悉目标(熟悉靶标)中的一个在相同的空间安排(例如，O1/T型迷宫方向的西部)下与两个新目标O4和O5同时摆放以评估与视觉重现相关的记忆。此外，将目标在新的空间安排下摆放(例如，O1/T型迷宫相反的东部)以评估与空间重现相关的记忆。目标和空间识别记忆能力表示为试验间保留间隔除以第一和第二次试验间对熟悉目标探测次数和持续时间的差异。

联想性情感记忆

依赖于NMDA受体的联想性情感记忆在两项行为任务中进行评估：

恐惧增加的惊跳反应：小鼠对与足部电刺激(厌恶性US)相伴的光线(CS)形成条件反射。延时24小时后，用不同声音(90-110dB)刺激，其间伴有或不伴有已形成条件反射的光线刺激，通过所诱发的惊跳反射幅度来评估情感记忆。已形成条件反射的光线刺激的出现导致声音惊跳反射的增强效应(Ennaceur，A.和J.Delacour，Behav Brain Res，1998.31(1)：47-59页)。

情境恐惧条件反射：情境恐惧条件反射为无意识厌恶联想性学习过程，通过该过程初始的中性情境反复与非条件反射的厌恶性刺激(US)相联系后获得对初始中性情境的厌恶。将动物暴露于新的容器，几分钟后对动物进行连续的足部电刺激(US)，可诱导对恐惧的非条件反射(僵硬不动的行为)(Davis，M.，Psychopharmacology(Berl)，1979.62(1)：1-7页)。通过对再暴露于该中性情境中的僵硬不动的量测定情境恐惧条件反射。在训练后的不同时间测试僵硬不动的条件反射以评估短时(1-3小时)和长时(1-10天)情境记忆。

恐惧条件反射的消失

学习获得的恐惧条件反射的消失代表一种形式的行为可塑性，认为所述可塑性依赖于一种新记忆形式的形成而不是原始学习获得的联想的消除(Phillips，R.G.和J.E.LeDoux，Behav Neurosci，1992.106(2)：274-85)。最近已显示恐惧条件反射的消失涉及NMDA受体依赖的过程(Tang，Y.P.，等，Nature，1999.401(6748)：63-9页)。训练后延时24小时后，可通过对连续五天中重复暴露于情境时僵硬不动反应量的时间依赖性减少来评估僵硬不动条件反射的消失。

3)药理学破坏的行为

施用阿朴吗啡、D-苯丙胺或非竞争性NMDA受体拮抗剂PCP可诱发多种不同的精神分裂症类症状，包括多动、前脉冲抑制(PPI)缺失和记忆缺失。在野生型小鼠中应用最小有效剂量进行行为破坏。然后测试GLYT1突变体小鼠对药理学行为破坏是否有抗性、更不敏感还是更加敏感。

药物诱发的多动

在开放区域(活动盒)中评估D-苯丙胺对运动性和定型化行为的影响，所述评估通过记录在开放区域中心的水平运动活性、垂直活性、定型化移动和所花时间进行。

药物诱发的社会退缩

为评估GLYT1突变体所涉及的对D-苯丙胺或PCP的社会行为反应，应用社会探索试验(Falls，W.A.，M.J.Miserendino和M.Davis，J Neurosci，1992.12(3)：854-63页)。单独关闭的雄性小鼠暴露于幼年雌性小鼠5分钟。在施用药物之前和之后通过录像跟踪系统记录社会交互作用，所述交互作用包括肛门生殖器和颈部鼻嗅、异性相互梳理毛发和追逐。施用药物后在不同时间间隔(30分钟、2小时、4小时和24小时)检测药物诱发的社会探索的退化。

药物诱发的前脉冲抑制缺失

通过阿朴吗啡或PCP进行前脉冲抑制的破坏是经常是使用的感觉运动门控缺陷的模型(Crestani，F.，F.Seguy和R.Dantzer，Brain Res，1991.542(2)：330-5页；Kretschmer，B.D.，等，Eur J Pharmacol，1997.331(2-3)：109-16页和Bakshi，V.P.和M.A.Geyer，J Neurosci，1998.18(20)：8394-401)，通过该模型可评估注意力和运动感觉门控。PPI为施加不诱发惊跳的前脉冲刺激后听觉或触觉惊跳反应的减弱。评估听觉刺激后动物的惊跳反应。

药物诱发的记忆丧失

PCP或阿朴吗啡诱发的记忆功能的损害用以上描述的延时匹配的空间记忆任务进行评估。

序列表

<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司

<120>Glyt1功能的转基因动物模型

<130>Case 21779

<160>16

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>16057

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gcggccgcga gctcaattaa ccctcactaa agggagtcga ctcgatccgg atgtctttta 60

gaggaactcc tgtcctttca gggccgtagt tcatctctgg gaggctgttg gtgtacaagg 120

acactgtgtg tgtgctgtgt gtatttcttt actggtgact cctagggtcc ttaggcttcc 180

caatgacaat ctcgggcccc tcaagtctgg cttatggtga atgactcaca ctcataacgg 240

gagagggttc agagaggagt ggcttgggga aaggggacac actaagggac tttcagaggt 300

agttctacat ctgaagaagg aactcctcgt ggagtgtcct cagtgggtcc tggacagttt 360

aacccagcac ttcctgcact caggccgaat acccatcagg gattcatctg caggccaccc 420

tctcattcag tgacaccctt tcctggaacc acctctgttt ccttagccag gcctgtcctc 480

agagtctggc acggtgccca cagctctggt ctcctgccta acctcatagc ccagcattct 540

cctgccatgg ctcaggtcag ccccctctga tctctagtgt cttgcccagg tctggtctag 600

cctagatgca cagccccctc ttccacccag gcctgctcac cgtgtgcccc caggaagaag 660

ccttctctag ggataagtct agccaccgcc tgccatgggc atcgtgctta gcctggcgat 720

gtggtaggcg tcgggtgggg ggtagctgtc cggacacagg cccctttgtt tccggcttga 780

cttggctgct tggtatgagg ctcagcttct cctcaggtcc ttagcctgag aggaatggca 840

agggtttaga ggggttaggg ggctcttggc tcaggctccc tcctcagtgt cccctttcct 900

gctgtaacca gctcctcagg tgggctggta tacctggcat ggagtgctga gggctgggca 960

ctgtctggca gctgtacctc tcctctcttc tgccaggctg gccctcaact cttccggccg 1020

agagggagcc ccagggtatg tggcagggtg atgtggaggg ccaaaggaaa accgctggga 1080

gcgactcaga gggtcagaca cggggcacaa atgcctttac tgatggtagc ttctttcctg 1140

tccccacaga atggtgctgt gcccagcgag gccaccaaga aggaccagaa cctcacacgg 1200

ggcaactggg gcaaccagat cgagtttgta ctgacgagcg tgggctatgc cgtgggcctg 1260

ggcaatgtct ggcgtttccc atacctctgc tatcgcaacg ggggaggtac ccagtgggca 1320

cagggcaggg accacccagt tgggtagagc ccacccaccg gggcttgggc caccatctcc 1380

ccagaacagg tgccactcca ggaagaagct ggcctctggc cctggtgttt acccccatcc 1440

cttaggcata ttttgcctaa ggtgcagacc accctcagat cctgccagcc tgttctctgt 1500

gcctgatctg ctagcctgct ccttgaaagc tagaagtaga ggaaaccact tgaatttcct 1560

gggttctctg tcttaacacc ccatatttca acagtctccc agattgtaca gagatatttg 1620

aggatcccag tgacgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgagaga 1680

gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaaa tcaattggtt 1740

aaagcttcaa atcctacccc aacatggcag tccggggcag gatttttctg cagagcagac 1800

ttcctgggga gcctctgttc agttcgaaga cagggcaggc agggaatgtg tgtcagcccc 1860

agacagctgc tcagtgcagg caggctcctg tcccagtact agtgaagcac gaaggtttta 1920

ctgtgggttt ggagaagggg acccagggag gggtacctgg agcctaccct gagccctgcc 1980

tcctcctcct cctctgtgcc aggagccttc atgttcccct acttcatcat gctgatcttc 2040

tgcgggattc ctctcttctt catggagctt tccttcggcc agtttgcaag ccagggctgc 2100

ctgggggtct ggcggatcag ccccatgttc aaaggtgagg ttctggtggg gcacgtgcac 2160

accagatgcg cacgtgtcat acacacacac accccagacg cgcacgtgtg atacacgcac 2220

gcggaggcca ctggcttgtc catctgtaca aacacgagca tccccttggt gctgacccca 2280

agcgcaacat caatggccaa ggccatggac acctgctggc tggagcgcat tcatgtttac 2340

tcggccccca cctctgtctc ccgcctcgca gagacacaaa actcctttcc tcccctaact 2400

taccaaggcc tgaaccttcc catctacaac tctccattag gagccgttaa catttagcta 2460

ggcctgcgag gctggctctc actccatggt gctcaccgtg cctttcccac aggcgtgggc 2520

tatggtatga tggtggtgtc cacatacatt ggcatctactacaacgtggt catctgcatc 2580

gccttctact acttcttctc gtccatgacg cacgtgctgc cctgggcgta ctgcaacaac 2640

ccctggaaca cacctgactg tgccggtgtg ctggacgctt ccaacctcac caatggctcc 2700

cggcccgctg ccctgtctgg caacctgtct cacctgttca actacacctt gcaaaggacc 2760

agccccagcg aggagtactg gaggtgaggg gacctggtgg cagcccttag acctcctacc 2820

cccatctggc agccgtgttt tcatcacctg catgtagtgt ctgccgtgca ggggacagag 2880

gcaggttggg gtggcagata tgcagagggc cgtggaaggc ttggaggtga actgggagtc 2940

cttacagcgt aacagtagac gagggctctg gaaatcttaa ggctccagag gcccagtcag 3000

aacaagggga gagagcatgt gatggagggc gtcatgaggg aggtcccaga ggaccagagg 3060

tcattctcaa agctgtggga gagccctatt gagattcaca tgaatggatg gatcctgtgg 3120

gctttgaggt ggccttgaag gggcactacg ttcacagaga actaaccaga gttaagcttc 3180

ctcttcatac tgtagaacaa aaggagccat gagcattcac taggccaggg atgccaggac 3240

agccaggccc gttctgttca gaggtgacaa agagactagt gtctctgggc cctctgaagg 3300

aaggcaacta ctggaggtgt ctgtctggac caccttatcc caactggcag atggaaggcg 3360

cagtggggta ttcttcctac atcttactgg agagtcctgg ggcaaaggac ctttgcatgt 3420

gggaggtaga cctcatctat ttattctgta ggtgtctgct ctaaaggctc tgtgtgccca 3480

tggcggtgta aaatggtcca gagcctctgt cccgagagag atcacatagt ctatagagaa 3540

acagatagtt cagtgcatta ggagcaggtg ccctgcctgg cacagaagta tggaagtggc 3600

actaagaagg tgctggagac ttctgagaga tggggacaag gggagctggt gataactgcc 3660

cagacatggg aggaaagagt taggaggaat tcacaagtag gtgggcacag aggtccacaa 3720

ggaggcaaac tgacgccaag gttgggaaca aatgggacac tgagaaaaga gacaaggatg 3780

agcaccatca tatggtgcca gcttctacgg cagccaaaag gcttgaccat ttccctgctg 3840

tgtgatggag gccaaaggtg aggtgtgcat ggctctgggc gcacagaagt tgtagcaggt 3900

cctctaaatc cagtgctgaa agtgcaaatc ccacacagct gtggggaggg gccactccca 3960

gagaggagat gaggaagaaa gggagagaga aatctcaccc aatcagatga actgtccacc 4020

aggggtgtga tgcgcacagg atggcccaga cggaaaggca gaatatgaac ttccctggag 4080

ctccccaaaa gcacaaaccc tgcatgccaa ccttagccca ggcagatgct ccagtgttgc 4140

ctgcctcagg ggcaaagctc ctgagactgg agccagtgac aatcagtggg gaatagctct 4200

cagagaatct gcctagcggg gcatactgag gggacagctg ggccctgctc cgcacctggg 4260

gctgtgccag gcctacctac ctagctcagt tcctaccccc caatggctcc ctgctgccac 4320

ctcctggaga gcctggaaag atattttctc cctgctatac tggtgattga ccactgcccc 4380

atgcccagat ccatgcaata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta tgaattctgc 4440

atgccaggca aatgcctcat ccctgagctc tgtccctagc cgccttctta cattttcatt 4500

ttgaggttgg tcttgaactt gtgctcctcc tgcccaagct ctagagctcg ctgtcagagc 4560

tggagcagat ggttaagggt atacctaaca gcttcctgga gggtgcactt ttgataggat 4620

gagtgggcat tcctactgtg gaatgcacgt gaaaggacct gagctgagcc caagcagaga 4680

cttgggagtc atcctgtccc aggaggaaag actagctcaa acttgattta atctctcaga 4740

gcccttgagg gggtgcccag ggcagactgc agggcagagg cctggggtcc tcaaagcagc 4800

ttccgttctc ccacatgcag gcttctgggg tcttgcagca tggggcatgg atcatgagaa 4860

ttggttgctg ggcggcagag gctggccctc agtgacggtc acctccccat ccccaggctg 4920

tatgtgctga agctgtcaga cgacattgga aactttgggg aagtgcggct tcccctccta 4980

ggctgcctcg gcgtctcctg ggtggttgtc ttcctctgtc tcatccgagg agtcaagtct 5040

tcagggaaag caagtagcct ccccaggcag ggtttgttcc caccctgcct ctcctatctg 5100

ggttgccggg gttagggagg taatgcgggg gttggagagg gctctagggg aatccatggc 5160

ccctgtcttg tcccaggtgg tgtacttcac ggccacattc ccctatgtgg tgctgaccat 5220

tctgtttgtt cgtggagtga ccctggaagg agccttcacg ggtatcatgt actacctgac 5280

cccacaatgg gacaagtacc tggaggccaa ggtgggatgt ggagggttga tccccaaagg 5340

gaccaaggcg ggtgcatcta acatctgcct gcagtggctc actggccatc ctttctgcag 5400

gtctgggggg atgcagcctc tcagatcttc tattccctgg gctgtgcatg gggtggcctc 5460

atcaccatgg cgtcctacaa caaatttcac aacaactgct accggtgagt gagcaccccc 5520

cgccccctgc tccctcagcc tggaggcttc ccgtcttccc atcctctccc cagcctgacc 5580

ctggatccac agggccattg ggctccagtg cagctggctg cctcccagtg acctcctgca 5640

cccatgacct tgaagtcttg aggatcttgt atctccagtg tgaaagtaga aggcaaagca 5700

ccagccaaag agggggaatg gggtagatga agggtcagga accctggact cgactttaaa 5760

aggcccagat agacaaggag ttagggttac ctttcttttt agaatatcta atccctgtgt 5820

cttcccctgg cctaaattga ggaaagggaa gcaagctggg tctcctaaac tgtcccgttt 5880

tccctccctc agggacagcg tcattatcag tatcaccaac tgtgctacca gcgtctacgc 5940

cggcttcgtc atcttctcca tcctgggctt catggccaat cacctgggtg tggatgtgtc 6000

tcgggtggca gaccatgggc ctgggctagc ttttgtcgct taccctgagg ctctcacgct 6060

gcttcccatc tctccactct ggtccttatt gtttttcttc atgctcatct tgctggggct 6120

gggtactcag gtatggggtg tgtgtatgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 6180

tgtgttttga gggagtggtc tgggacaaaa cgcgggccct tattctgata gccgtggctg 6240

tagttctgcc tcctagagac cctggtcact gccattgtgg atgaggtagg gaatgagtgg 6300

attctgcaga agaagaccta cgtgaccttg ggcgtcgctg tggctggctt cttgctgggc 6360

atccccctta ccagccaggt aagaatggag atgtgggggt gaggcggggc tgcaatcgcc 6420

aggcacttgg gaatggatga gtagcctagt ctgtggaacc ctggcttacc tgcccactgg 6480

cccacaggca ggcatctact ggctgctgct gatggacaac tatgcagcca gcttctcctt 6540

ggttgtcatc tcctgtatca tgtgtgtatc catcatgtac atctatggtg agtgctaccc 6600

ttccgtggac tcgagtgtcc gtctcggact ggcccactct gttctcctga gctgctgaca 6660

atatctccca cccctgtctc tccagggcac cgtaactact tccaggacat ccagatgatg 6720

ctaggatttc ccccgcctct cttcttccag atctgttggc gctttgtttc tccggctatc 6780

atctttgtaa gttcctgggg ggggggggct cccaggtagc tctagctttg ggcatctaag 6840

aaggccagat agtcagaggg taccataact tcgtatagca tacattatac gaagttattt 6900

cgaagttcct attctctaga aagtatagga acttcaagct aattctaccg ggtaggggag 6960

gcgcttttcc caaggcagtc tggagcatgc gctttagcag ccccgctggg cacttggcgc 7020

tacacaagtg gcctctggcc tcgcacacat tccacatcca ccggtaggcg ccaaccggct 7080

ccgttctttg gtggcccctt cgcgccacct tctactcctc ccctagtcag gaagttcccc 7140

cccgccccgc agctcgcgtc gtgcaggacg tgacaaatgg aagtagcacg tctcactagt 7200

ctcgtgcaga tggacagcac cgctgagcaa tggaagcggg taggcctttg gggcagcggc 7260

caatagcagc tttgctcctt cgctttctgg gctcagaggc tgggaagggg tgggtccggg 7320

ggcgggctca ggggcgggct caggggcggg gcgggcgcga aggtcctccg gagcccggca 7380

ttctgcacgc ttcaaaagcg cacgtctgcc gcgctgttct cctcttcctc atctccgggc 7440

ctttcgacct gcagccaata tgggatcggc cattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 7500

tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 7560

ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 7620

cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 7680

cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 7740

gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 7800

gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 7860

cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 7920

tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 7980

cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 8040

ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 8100

gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 8160

gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc 8220

gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgaggggatc aattctctag 8280

agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 8340

ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 8400

ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 8460

ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc 8520

tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg gggctcgatc gagatccgaa gttcctattc 8580

tctagaaagt ataggaactt ccctgcacac tcagagaggt gccaggtcct ggccatgggt 8640

taggaagtgg atcttgagcc ctctgtttga ctgaagccag taacatatgc tcagagctgc 8700

aatgtcaggg acacagcctc actccatgcc attacttgcc cagttgcctc caaggggcct 8760

cgggagtcat tgggatcagt gtggcttctg gtctacttta ctgttcacac cttagcccca 8820

tggaaggctg ccctaagcag ggagacacat aggaatgtgg cagcatttct ccacagcccc 8880

aggacctgag ggtacagggc taggagtcag gttgactctg tgatgggact aagccctcaa 8940

aggctgggaa gttgaatggc cttgaaggga gcacccccat ttctttgaac atcaagcatc 9000

aggggaatgt atcagagcac actgcactgc tgataggatt ccctgcaagg ccggtccttc 9060

ctccaccctg ttcacatgtt aacttgagca acactctctg gatcatcaat tctccccact 9120

ctaaggcaca gggtatgtta aataagccca ccccacactt aataaggggc aagaaacctg 9180

ctgcaggcct gtgggctaac ccaggcgcat tttgctgctt ctgtttgaag tgggaggtgg 9240

ggctaatggc ctaatcatca ctatatgaga aaagagggtc agagggctca ctcaatggca 9300

gggcagtgtc cagagctacc tgtgtcttgc tcagttctcc gaattgtgga aagcgctaga 9360

ccagacttcc acactggctc atatttctga aaagaggtcc ctggaggacc gaggcctcca 9420

ccgcatgggg tgtgggatgt tcctgggcct ggcacagaca acagttctgg ccacaggccc 9480

agcattgaaa caggaggagc ggaagtctcc tttcaaggct gagagggcag agagggcggg 9540

aaccactgcc cagcgccatg ccttctgggg gcgtggcatt ggcccagaac caggacgctc 9600

tctgagggct ggggagctgc actttggtac ctgagtttac ccaccaaggg ccttccctgg 9660

gttctgtgga ttgtctaggc agagagattg aatcaggcag tgtccaaaag ctgggttgga 9720

gttacattaa gatgaggaat tcaggccggg cagacatatt tctcttcgga gctttatgtg 9780

cctgtgacag ctcttcttga caaacccctt ccttccttca taactgcagt gaaaaaattc 9840

ctcacataca tcaggctttg ttaagccagg tgcggtggcg ctcgcattta atctcagcct 9900

tggggaggca agccattgtc tgaatttgag gccagcttgg tctacatagg gagttttagg 9960

ttagctaggg tgacacaagt gagaccctgt cctgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaacaaaag 10020

caaacacaca cacacacact cactccacta ggttagtaaa gatgtcacac acatatggtg 10080

ccctaggttc agtgtgggga aggtcagagg aacttaagct ccgggatgcc cctaaatgct 10140

gacaggcatg gcgagtcctt tctacaggtc ctctggtgtg gcctgtgagc cacctggcca 10200

agtctcctgt ttcttttaga tctttagctc tcctctttcc agagaggtat gtgtctgcta 10260

ctggacacag catctgtagc ccctgggcac cctccaagct gtcacaacaa gctggcttgt 10320

tatcacagcc acagtgaggc aagactttac gtagcttgct cctcggcccc cttcctgatc 10380

tgagcatctc ccggtacaaa tcagctcaaa tagataaatg agattgtgca agacctcaga 10440

cccacagtca gtgcggtaac ctcaagtgtc aggccatgca gtacaggaag ccgagtgatt 10500

ttgagttaaa cagatgggag gtgccatgga gaagcctttt aggaggcaga aaatccagaa 10560

aggcttcctg aaagaggtgg cactggctca gggcttgaca ggaatgccga ggatgggtct 10620

gtagaatgaa cagaggcggc taagacggtc tggatgtggt gaacgcctag ggcagggaga 10680

tgggaccagc aaatcacagg ccatcaggca gagctgaagc tacggctagg aaatcatcct 10740

tagctctact gcctagagag gacggctgct tttcaaggtg gcagccgctt acttgttctc 10800

tgccagttca ggactctggc aaaaaccgtg tcttcatgcc cagcccctcc ctggggtcca 10860

acttctttca cgaaggtgtt gacagttgcc tatgccccga gccacaccac cttttgctga 10920

cctaggagga gggccagcct ggggtcccag gaggggcgct actccgcctc acatcatcct 10980

ctctaccctc tctagttcat tctcatcttc acggtgatcc agtaccggcc aatcacctac 11040

aaccactacc agtacccagg ctgggctgtg cgcatcggct tcctcatggc tttgtcgtct 11100

gtcatctgca tcccactgta cgcgctgttc cagctctgcc gcacagatgg ggacacactt 11160

cttcaggtga ggagtgaaga tggactgaac ggggacgctg gacgggacgg gcaggcgaag 11220

tggaaacact tcgagcataa gggttctctt ctgacacgct tttcactgcg ccccctgcct 11280

gcagcgtttg aaaaatgcca caaagccaag cagagactgg ggccccgctc tcctggagca 11340

ccggactggg cgctacgctc ccactacaac cccctctccc gaagacgggt ttgaggtcca 11400

gccactgcac ccggacaagg cccagattcc catcgtgggc agtaacggct ccagccgctt 11460

ccaggactcc cggatatgag cgcaattgtt gcaaggggag aaaccccacc caacccttgc 11520

tcccaccacg gagactggga ggcggacagg tggaggcctg ccccatcaca ccctgtctgg 11580

gatggctgct gtcaccttga ccaccactgc tcatgtcccc agtgtttaca catcctttgg 11640

atgccaagac agcagctggg ggtgggaaag cgatggggga attgggggga gcgggcatgg 11700

ggaagcagtg tccaaagcac tttggaggag gcctgccagg cttcctatgg cctctgatac 11760

cctcatgctc tgccctgagc tgtttcacta tgggataaga ggttctgtgt ccacatccca 11820

ccggttcccc tcagcctcgt gaccagtgtt cctgacccca gaacagaccc tagcctctgc 11880

ccaggaaaat ctgtatcttc ctcctccaga caaggtgagg gcccccgtcg agaccgaaca 11940

actccgccgc gcgcgctccg tgtaggccgg tgcgggcggc cccgtagcgc aagggagggc 12000

gggaaaggaa gggcgggaca caagggcgaa tctataaagg gcgtcactca gccagttctc 12060

tcctcagaag cgccgagagc gcgaccggga cggttggaga agaaggtggc tcccggaagg 12120

gggagagaca aactgccgta acctctgccg ttcaggatct gcgacctgca ggtcctcgcc 12180

atggaccctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 12240

taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 12300

tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagggt tttatagtac cgacaataaa 12360

tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 12420

gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 12480

gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 12540

acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 12600

ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 12660

agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 12720

gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatctctttg tgaaggaaac 12780

cttacttctg tggtgtgaca taattggaca aactacctac agagatttaa agctctaagg 12840

taaatataaa atttttaagt gtataatgtg ttaaactact gattcctaat tgtttgtgta 12900

ttttagattc caacctatgg aactgatgaa tgggagcagt ggtggaatgc agatccacta 12960

ggatctaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat 13020

ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat 13080

gtatcttatc atgtctggat cgtagttcta gagcggactc gacgaatggg ctgcaggaat 13140

tcgatatcaa gcttatcgat accgtcgacc tcgagggggg gcccggtacc cagcttttgt 13200

tccctttagt gagggttaat tgcgcgcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg 13260

tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa 13320

gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 13380

ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 13440

ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 13500

gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 13560

tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 13620

aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 13680

aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 13740

ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 13800

tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 13860

agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 13920

gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 13980

tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 14040

acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc 14100

tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 14160

caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 14220

aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 14280

aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 14340

ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 14400

agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 14460

atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc 14520

cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 14580

aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 14640

cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 14700

aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca 14760

ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 14820

gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 14880

ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 14940

tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 15000

tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 15060

ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 15120

tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 15180

agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 15240

acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 15300

ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 15360

gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctaaattgt aagcgttaat attttgttaa 15420

aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca 15480

aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga 15540

acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc 15600

agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc 15660

gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc 15720

cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg 15780

caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac 15840

agggcgcgtc ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg 15900

cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg 15960

taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgag cgcgcgtaat 16020

acgac tcact atagggcgaa ttggagctct agagctc 16057

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>2

ccctt tcctg gaaccacctc tgtttc 26

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>3

tgcgatagca gaggtatggg aaacgc 26

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>4

catgctgatc ttctgcggga ttcctc 26

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>5

ggctggtcct ttgcaaggtg tagttg 26

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>6

gctgtatgtg ctgaagctgt cagacg 26

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>7

gatgatagcc ggagaaacaa agcgcc 26

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>小家鼠

<400> 8

ctcatcttca cggtgatcca gtaccg 26

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>9

aaaccctagt tctgcacaca ctgggc 26

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ggtctgagag tatgtcagag c 21

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

tgctatacga agttattgca tgg 23

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

ttccaggaca tccagatgat gc 22

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

agacacactg gacccaaggc 20

<210>14

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

cattgaatgg ggttagcacg tc 22

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

acatcgcatc gagcgagcac 20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

tggcacctct ctgagtgtgc 20

Claims

1.包含glyt1基因的全部或部分基因组序列的载体构建体，其中所述基因组序列包含阳性选择性标记，且其中对至少部分的glyt1基因外显子设计有重组酶的识别位点。

2.根据权利要求1的载体构建体，其中基因组序列额外地包含阴性选择性标记。

3.根据权利要求1的载体构建体，其中基因组序列包含glyt1基因的所有外显子。

4.根据权利要求1的载体构建体，其中基因组序列包含新霉素抗性基因作为阳性选择性标记。

5.根据权利要求2的载体构建体，其中阴性选择性标记为白喉毒素基因。

6.根据权利要求2的载体构建体，其中基因组序列包含新霉素抗性基因作为阳性选择性标记且包含白喉毒素基因作为阴性选择性标记。

7.根据权利要求1到6中任意一项所述的载体构建体，其中对阳性选择性标记设计有重组酶的识别位点。

8.根据权利要求1到6中任意一项所述的载体构建体，其中对glyt1基因的外显子5到11设计有重组酶的识别位点。

9.根据权利要求1到6中任意一项所述的载体构建体，其中glyt1基因的基因组序列为鼠源序列。

10.根据权利要求1或2的载体构建体，其包含核苷酸序列SEQ IDNO：1。

11.产生非人转基因动物的方法，所述非人转基因动物glyt1基因的一个或两个等位基因包含条件性靶向突变，该方法包括：

(a)将根据权利要求1到10中任意一项所述的载体构建体导入胚胎干细胞，

(b)从该胚胎干细胞产生杂合和/或纯合的转基因动物，且由此

(c)产生非人转基因动物，所述非人转基因动物glyt1基因的一个或两个等位基因包含条件性靶向突变。

12.根据权利要求11的方法，其还包括

(d)进一步将步骤(c)产生的转基因动物与下述重组酶的转基因动物杂交，所述重组酶识别对位于glyt1基因的基因组序列中的选择性标记设计的识别位点。

13.产生非人转基因动物的方法，其中所述非人转基因动物glyt1基因的一个或两个等位基因以表达低活性或无活性GLYT1蛋白的方式被突变和/或截短，该方法包括根据权利要求11或12方法中的任意步骤，且还包括

(e)将该转基因动物与下述重组酶的转基因动物杂交，所述重组酶识别对至少部分的glyt1基因外显子设计的识别位点，且由此

(f)产生非人转基因动物，所述非人转基因动物glyt1基因的一个或两个等位基因以表达低活性或无活性GLYT1蛋白的方式被突变和/或截短。

14.根据权利要求13的方法，其中在识别对至少部分的glyt1基因外显子设计的识别位点的重组酶转基因动物中，所述重组酶在组织特异型启动子系统的控制下表达。

15.根据权利要求13的方法，其中在识别对至少部分的glyt1基因外显子设计的识别位点的重组酶转基因动物中，所述重组酶在可调控启动子系统的控制下表达。

16.产生非人转基因动物的方法，所述非人转基因动物glyt1基因以表达低活性或无活性GLYT1蛋白的方式被突变和/或截短，该方法包括：

(b)进一步向该胚胎干细胞中导入包含编码下述重组酶的核苷酸序列的载体构建体，所述重组酶识别对至少部分的glyt1基因外显子设计的识别位点，

(c)从该胚胎干细胞产生杂合和/或纯合的转基因动物，且由此

(d)产生非人转基因动物，所述非人转基因动物glyt1基因的一个或两个等位基因以表达低活性或无活性GLYT1蛋白的方式被突变和/或截短。

17.产生非人转基因动物的方法，所述非人转基因动物glyt1基因以表达低活性或无活性GLYT1蛋白的方式被突变和/或截短，该方法包括：

(c)进一步向该胚胎干细胞中导入包含编码下述重组酶的核苷酸序列的载体构建体，所述重组酶识别对位于glyt1基因的基因组序列中的选择性标记设计的识别位点，

(d)从该胚胎干细胞产生杂合和/或纯合的转基因动物，且由此

(e)产生非人转基因动物，所述非人转基因动物glyt1基因的一个或两个等位基因以表达低活性或无活性GLYT1蛋白的方式被突变和/或截短。

18.细胞系或原代细胞培养物、或组织或器官型脑切片培养物，其来自根据权利要求11或12的方法所产生的非人转基因动物或其后代。

19.细胞系或原代细胞培养物、或组织或器官型脑切片培养物，其来自glyt1基因的一个或两个等位基因包含条件性靶向突变的非人转基因动物或其后代。

20.根据权利要求19的细胞系或原代细胞培养物、或组织或器官型脑切片培养物，其中条件性靶向突变包含重组酶的下述识别位点，所述识别位点设计为编码GLYT1活性所必需的氨基酸的部分glyt1基因组序列。

21.根据权利要求18到20中任意一项所述的细胞系或原代细胞培养物、或组织或器官型脑切片培养物，其中动物为啮齿类动物。

22.根据权利要求21的细胞系或原代细胞培养物、或组织或器官型脑切片培养物，其中啮齿类动物为小鼠。

23.细胞系或原代细胞培养物、或组织或器官型脑切片培养物，其来自根据权利要求13到17中任意一项所述的方法产生的非人转基因动物或其后代。

24.细胞系或原代细胞培养物、或组织或器官型脑切片培养物，其来自glyt1基因的一个或两个等位基因以表达低活性或无活性GLYT1蛋白的方式被突变和/或截短的非人转基因动物或其后代。

25.根据权利要求24的细胞系或原代细胞培养物、或组织或器官型脑切片培养物，其中非人转基因动物的基因组包含在glyt1基因的一个或两个等位基因中删除了外显子5到11。

26.根据权利要求25的细胞系或原代细胞培养物、或组织或器官型脑切片培养物，其中非人转基因动物的基因组在glyt1基因的一个或两个等位基因中包含的不是天然glyt1基因而是核苷酸序列SEQ ID NO：1。

27.根据权利要求24到26中任意一项所述的细胞系或原代细胞培养物、或组织或器官型脑切片培养物，其中动物为啮齿类动物。

28.根据权利要求27的细胞系或原代细胞培养物、或组织或器官型脑切片培养物，其中啮齿类动物为小鼠。

29.根据权利要求18-20、22-26和28中任意一项所述的细胞系或原代细胞培养物、或组织或器官型脑切片培养物，其中非人转基因动物的后代是通过与相同基因型或另一基因型的动物繁殖获得的。

30.根据权利要求18到29中任意一项所述的细胞系或原代细胞培养物或组织或器官型脑切片培养物、或所述细胞系或原代细胞培养物或组织或器官型脑切片培养物所来源的非人转基因动物的用途，用作研究增强突触的NMDA受体功能效应的模型。

31.根据权利要求18到29中任意一项所述的细胞系或原代细胞培养物或组织或器官型脑切片培养物、或所述细胞系或原代细胞培养物或组织或器官型脑切片培养物所来源的非人转基因动物的用途，用作评估GLYT1功能的工具。