JPH11192094A - シゾサッカロミセス・ポンベで使用可能な誘導プロモータ、誘導発現ベクター、およびそれらの利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベで
使用可能な誘導プロモータ、誘導発現ベクター、および
それらを用いたタンパク質の生産方法。 【効果】 特定の栄養源の有無により遺伝子発現を制御
し、目的タンパク質の生産時期が制御可能になる。さら
には、自身の生理活性のために生産量が低いタンパク質
や、他の理由でこれまで生産できなかったタンパク質の
生産が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、分裂酵母シゾサッ
カロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）で
使用可能な誘導プロモータ、誘導発現ベクター、および
それらを用いたタンパク質の生産方法に関し、特に分裂
酵母シゾサッカロミセス・ポンベのインベルターゼプロ
モータを用いることによって特定の栄養源の有無による
遺伝子発現制御を行い、目的タンパク質の生産時期を制
御可能とするタンパク質の生産方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ
（S. pombe）は真核生物でありながら遺伝学、分子生物
学、細胞生物学分野での応用がきわめて容易な単細胞生
物として広く研究されている（Nasim A. et al. eds.,
Molecular biology of the fission yeast, Academic P
ress, 1989）。その培養には炭素源としてブドウ糖（グ
ルコース）や果糖（フルクトース）等の単糖が主に用い
られる。培地中にこれら単糖が存在しない場合、ショ糖
（スクロース）をブドウ糖と果糖に分解する酵素である
インベルターゼの発現が誘導され、生育に必要な炭素源
を獲得することが知られている（Moreno S. et al., Ar
ch. Microbiol. 142, 370, 1985）。

【０００３】分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベにお
いて、インベルターゼは細胞表層に存在しており、分子
量２０５０００の高分子量糖タンパク質である。その６
７％が糖鎖であり、等モルのマンノース残基とガラクト
ース残基から成り立っている。精製酵素のタンパク質分
子量やアミノ酸組成および抗体を用いた実験から、分裂
酵母シゾサッカロミセス・ポンベ由来のインベルターゼ
は出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyce
s cerevisiae）のインベルターゼとタンパク質化学的に
も非常に類似していることが知られている（Moreno S.
et al., Biochem. J. 267,697,1990）。またグルコース
濃度の低下によりインベルターゼの合成抑制が解除され
ることも知られている（Mitchison J. et al., Cell Sc
i 5,373,1969）。

【０００４】出芽酵母サッカロミセス・セレビシエにお
いても同様に、固有のインベルターゼの誘導生産現象
（脱抑制）が知られている。その発現における遺伝子レ
ベルでの制御、生合成経路、糖鎖部分の構造解析等に関
する研究はすでに詳細に行われている。すなわち、出芽
酵母サッカロミセス・セレビシエのインベルターゼ遺伝
子は染色体上に６個重複しており、ＳＵＣ１〜ＳＵＣ５
およびＳＵＣ７という遺伝子によってコードされてい
る。このうちの１つでも活性なＳＵＣ遺伝子を持てばス
クロースとラフィノースの資化性を示すことがわかって
いる（Hohmann S. et al., Curr Genet 11, 217, 1986
）。

【０００５】これに対し分裂酵母シゾサッカロミセス・
ポンベでは、インベルターゼタンパク質の精製について
は報告されているが（Moreno S. et al., 1985）、その
遺伝子に関しては本発明者らのグループの研究によって
最近になってようやく明らかになった。すなわち、分裂
酵母シゾサッカロミセス・ポンベのインベルターゼ遺伝
子は染色体上に２個重複しており、ｉｎｖ０⁺およびｉ
ｎｖ１⁺として同定されている。このうちｉｎｖ０⁺はＯ
ＲＦ（オープンリーディングフレーム）が不完全で偽遺
伝子であると推定された。よって唯一ｉｎｖ１⁺が分裂
酵母シゾサッカロミセス・ポンベのインベルターゼをコ
ードする遺伝子である。分裂酵母シゾサッカロミセス・
ポンベはショ糖を唯一の炭素源として生育することが知
られており（橋谷義孝編、「酵母学」、岩波書店、196
7）、本インベルターゼによってショ糖の資化性を示す
ことが推定できる。

【０００６】単離された遺伝子のプロモーター領域の解
析がなされた結果、１ｂｐから６２０ｂｐの間にある特
別な配列がカタボライト抑制に関与していることが推定
された。

【０００７】出芽酵母サッカロミセス・セレビシエでは
ＳＵＣ２遺伝子から転写開始点が異なる２種類のメッセ
ンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が転写されることが知られ
ている。短い方のｍＲＮＡは構成的な転写であり、細胞
内インベルターゼを発現している。長い方のｍＲＮＡは
分泌型インベルターゼをコードしており、その発現はカ
タボライト抑制を受け、その脱抑制比は２００倍以上で
ある（Carlson M. etal. 、Mol. Cell. Biol. 3、439
、1983）。長い方のｍＲＮＡに対するプロモーター領
域の解析がなされた結果、−６５０ｂｐから−４１８ｂ
ｐの間にある特別な繰り返し配列に転写制御因子が結合
していると考えられている（Salokin L etal.、Mol. Ce
ll. Biol. 6、2314、1986）。また、−４１８位から−
１４０位までの領域がグルコース抑制に必要とされる領
域であることがわかっている。

【０００８】これらの領域とｉｎｖ１⁺遺伝子の上流領
域１位から２８０９位までの領域を比較したところ有意
な相同性は認められなかった。しかしグルコース抑制解
除に必要とされる領域の中には７ｂｐモチーフと呼ばれ
る（Ａ／Ｃ）（Ａ／Ｇ）ＧＡＡＡＴの塩基配列の繰り返
し配列が５箇所確認されており、７ｂｐモチーフがｉｎ
ｖ１⁺遺伝子の上流領域にも多数存在していることが明
らかとなった。その上グルコース抑制により制御される
遺伝子（ＳＵＣ、ＭＡＬ、ＧＡＬ）の上流領域にはステ
ム・アンド・ループ構造と類似したパリンドローム構造
が同じような位置に存在していることが確認されてい
る。シゾサッカロミセス・ポンベにおいてｉｎｖ１⁺遺
伝子の上流領域においてもパリンドローム構造を形成す
る領域が認められた。これらの配列は分裂酵母シゾサッ
カロミセス・ポンベにおけるグルコース抑制に重要な役
割を果たしていると考えられた。

【０００９】分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベは出
芽酵母サッカロミセス・セレビシエとは進化系統的に全
く異なる酵母である。すでに、染色体構造、ゲノム複製
機構、ＲＮＡスプライシング機構、転写機構、翻訳後修
飾等の諸機構が他の酵母と大きく異なり、その一部は動
物細胞と類似していることが知られている。このため真
核生物のモデルとして広く用いられている（Giga-Hama
and Kumagai, eds., Foreign gene expression in fiss
ion yeast Schizosaccharomyces pombe, Springer-Verl
ag, 1997）。

【００１０】分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベは異
種タンパク質遺伝子発現の宿主としても広く用いられて
おり、特にヒトを含む動物細胞由来の遺伝子の発現に適
していることが知られている（特開平５−１５３８０号
公報、特開平７−１６３３７３号公報、ＷＯ９６／２３
８９０）。またゴルジ体や小胞体を含む膜構造の発達が
知られており、このことから膜タンパク質の発現にも用
いられ、高い発現量を示している。発現ベクターとして
は通常構成発現ベクター（ｐＥＶＰ１１、ｐＡＲＴ１、
ｐＴＬ２Ｍ）あるいはｎｍｔ１⁺遺伝子のプロモータ領
域を用いた誘導発現ベクター（ｐＲＥＰ１）が用いられ
ている。出芽酵母サッカロミセス・セレビシエで汎用さ
れるＧＡＬタイプあるいはＳＵＣ２タイプのものは知ら
れていない。

【００１１】分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベにお
いて出芽酵母サッカロミセス・セレビシエのＳＵＣ２遺
伝子を発現させた場合、宿主に依存してガラクトース残
基が含まれるが、カタボライト抑制を受けずに構成的な
発現がなされることが知られている（Zarate, V. et a
l., J Applied Bacteriology, 80,45,1996）。このこと
から、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベと出芽酵母
サッカロミセス・セレビシエとでは、インベルターゼの
カタボライト抑制のメカニズムが異なっている可能性が
ある。このことは重大な意味を含む。すなわち、分裂酵
母シゾサッカロミセス・ポンベでインベルターゼ（ＳＵ
Ｃ２）型の誘導発現ベクターを作製する場合、通常当該
業者が行う方法である出芽酵母サッカロミセス・セレビ
シエのプロモータの流用は、分裂酵母シゾサッカロミセ
ス・ポンベでは行うことができない。このため、長らく
このようなタイプのベクターの開発は遅れていた。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題および課題を解決するた
めの手段】本発明者らは、前述の課題を解決すべく鋭意
研究を重ねた結果、新たに分裂酵母シゾサッカロミセス
・ポンベのインベルターゼ遺伝子のクローニングを行
い、誘導発現ベクターを構築することによって本発明を
完成させた。

【００１３】本発明は、分裂酵母シゾサッカロミセス・
ポンベのインベルターゼ遺伝子中のカタボイライト抑制
に関与している遺伝子領域、この遺伝子領域を利用した
誘導発現ベクター、これを用いた外来遺伝子発現システ
ム等に関する、下記の発明である。

【００１４】分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Sc
hizosaccharomyces pombe）のインベルターゼ遺伝子中
のカタボイライト抑制に関与している遺伝子領域のＤＮ
Ａ。

【００１５】配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第
２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡ。

【００１６】このＤＮＡの配列を含む組換えベクター。

【００１７】このＤＮＡの配列とマルチクローニングサ
イトとを含むマルチクローニングベクター。

【００１８】図９のベクター構築図で表されるマルチク
ローニングベクター。

【００１９】このＤＮＡの配列と異種タンパク質構造遺
伝子とを含む、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベの
形質転換用の発現ベクター。

【００２０】この発現ベクターを含む、分裂酵母シゾサ
ッカロミセス・ポンベからなる形質転換体。

【００２１】この形質転換体を培養し、発現された異種
タンパク質を採取することを特徴とするタンパク質の生
産方法。

【００２２】

【発明の実施の形態】本発明者らはまず、従来その遺伝
子レベルでの実体が不明であった分裂酵母シゾサッカロ
ミセス・ポンベ（以下、「S. pombe」と記す）のインベ
ルターゼ遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定し
た。遺伝子破壊法によりインベルターゼ遺伝子が１種で
すべての活性を担っていることを明らかにした。さらに
カタボライト抑制に関与している遺伝子領域の検討を
し、この領域を用いて誘導発現ベクターを作製した。実
際に緑色螢光タンパク質遺伝子を組込んだ組換えベクタ
ーを作製し、これを用いて S. pombe を形質転換した。
タンパク質の発現を活性並びに免疫学的手法によって確
認した。さらに培地中のグルコースによって発現が抑制
され、グルコースが消費されることによって外来遺伝子
の発現が脱抑制されることを見出した。

【００２３】本発明者らは、具体的には以下に示す方法
で S. pombe のインベルターゼの前駆体遺伝子を見出
し、その構造を決定した。 （１）S. pombe のｃＤＮＡライブラリーをテンプレー
トとして、他生物種起源のインベルターゼ遺伝子に良く
保存されたアミノ酸配列から作製したプライマーに用い
てＰＣＲ反応を行う。 （２）得られたＰＣＲ産物をプローブとして S. pombe
のゲノムライブラリーからプラークハイブリダイゼーシ
ョン法によりポジティブクローンを選別する。 （３）ポジティブクローンを制限酵素で消化して電気泳
動パターンを確認する。 （４）確認されたポジティブクローンからサザンハイブ
リダイゼーション法を用いて特定長のフラグメントを選
別し、全塩基配列を決定する。 （５）遺伝子破壊法を用いてインベルターゼ活性の有無
を調べる。 （６）S. pombe のインベルターゼ遺伝子における至適
ｐＨ、グルコース抑制、および脱抑制に対するグルコー
ス濃度の影響について測定する。 （７）グルコース抑制に関与している上流領域をサブク
ローニングし、必要領域を決定する。

【００２４】さらに本発明者らは、次に示す方法で、S.
pombe のインベルターゼの誘導発現ベクターを作製
し、具体例として緑色螢光タンパク質の誘導発現を確認
した。 （１）S. pombe 用マルチクローニングベクターｐＴＬ
２Ｍ（特開平７−１６３３７３号公報参照）を改変し
て、インベルターゼプロモータを用いた誘導発現マルチ
クローニングベクターｐＲＩ０Ｍを作製する。 （２）誘導発現マルチクローニングベクターｐＲＩ０Ｍ
をもとに緑色螢光タンパク質変異体誘導発現ベクターｐ
ＲＩ０ＥＧＦＰを作製する。 （３）緑色螢光タンパク質変異体誘導発現ベクターｐＲ
Ｉ０ＥＧＦＰを用いて S. pombe 野生株を形質転換す
る。 （４）緑色螢光タンパク質変異体の発現を活性（螢光）
並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ・ウエスタンブロッティングを
用いて確認する。 （５）培地中のグルコース濃度と発現の相関から、誘導
発現の条件を決定する。

【００２５】配列表の配列番号１はカタボイライト抑制
に関与している遺伝子領域を含むインベルターゼ前駆体
遺伝子の塩基配列である。カタボイライト抑制に関与し
ている遺伝子領域は、塩基番号第１番〜第２８０９番の
塩基配列で表されるＤＮＡ部分ないしその内部のＤＮＡ
部分にある。すなわち、実施例６や図８の解析の結果が
示すように、塩基番号第１番〜第２８０９番の塩基配列
で表されるＤＮＡ部分中で特に重要な領域は塩基番号第
１番から第６２０番までの配列部分、および第１６１０
番から第２６１０番までの配列部分である（なお、図８
は配列表１の第２８１０番を第１番として位置を表
記）。したがって、本発明における誘導プロモータとし
ては、これらのカタボイライト抑制に関与している遺伝
子を含んで誘導プロモータとして機能する限り、塩基番
号第１番〜第２８０９番の全塩基配列で表されるＤＮＡ
に限られるものではない。しかし、現実に S. pombe で
機能していることより、誘導プロモータとしては塩基番
号第１番〜第２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡが
好ましい。

【００２６】上記のようにカタボイライト抑制に関与し
ている遺伝子を含んで誘導プロモータとして機能するＤ
ＮＡ、特に好ましくは塩基番号第１番〜第２８０９番の
塩基配列で表されるＤＮＡ、を以下誘導プロモータ遺伝
子という。この誘導プロモータ遺伝子をベクターに組み
込んでマルチクローニングベクターや発現ベクターなど
の組換えベクターを構築することができる。マルチクロ
ーニングベクターはマルチクローニングサイトを有する
ベクターであり、マルチクローニングサイトに所望の構
造遺伝子を導入することにより発現ベクターを構築する
ことができる。発現ベクターは構造遺伝子を有するベク
ターであり、構造遺伝子でコードされた異種タンパク質
の発現用に用いられる。「異種」タンパク質とは宿主が
本来有していないタンパク質であり、宿主が S. pombe
の場合、S. pombe が本来有していないタンパク質（例
えばヒトタンパク質）である。

【００２７】発現ベクターにおいて、誘導プロモータ遺
伝子は異種タンパク質構造遺伝子の上流部に位置しその
構造遺伝子の発現を制御する。配列番号１で表される塩
基配列において、誘導プロモータ遺伝子がインベルター
ゼ前駆体の構造遺伝子の上流部にあってその発現を制御
しているように、発現ベクターにおいて誘導プロモータ
遺伝子はその下流に位置する異種タンパク質構造遺伝子
の発現を制御する。マルチクローニングベクターにおい
ても、マルチクローニングサイトに異種タンパク質構造
遺伝子が導入されることより、誘導プロモータ遺伝子は
マルチクローニングサイトの上流部に位置する。

【００２８】本発明マルチクローニングベクターの例と
して、図９に実施例で構築したマルチクローニングベク
ターｐＲＩ０Ｍのベクター構築図を示す。またこのｐＲ
Ｉ０Ｍの全塩基配列を配列番号２に示す。Ｉｎｖ１−Ｐ
が上記誘導プロモータ遺伝子部分、ＭＣＳがマルチクロ
ーニングサイトである。本発明発現ベクターの１例とし
て、図１０に実施例で構築した緑色蛍光タンパク質変異
体構造遺伝子（ＥＧＦＰ−ＯＲＦ）導入した緑色螢光タ
ンパク質変異体誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰのベ
クター構築図を示す。またこの発現ベクターｐＲＩ０Ｅ
ＧＦＰの全塩基配列を配列番号１３に示す。

【００２９】本発明における誘導プロモータ遺伝子が
S. pombe が有する誘導プロモータ遺伝子であることよ
り、本発明発現ベクターで形質転換される細胞（宿主）
としては S. pombe が最適である。

【００３０】上記本発明の発現ベクターで形質転換され
た S. pombe をカタボライト抑制条件下で（例えばグル
コース濃度の高い培養液中で）培養することにより異種
タンパク質を発現することなく（あるいは少ない発現量
で）S. pombe を増殖させることができる。この過程で
は、異種タンパク質の発現という負荷がないことより負
荷がある場合に比較して増殖の効率が高い。次に、カタ
ボライト抑制を解除した条件下で（例えばグルコースが
ないあるいはグルコース濃度の低い培養液中で）S. pom
be を培養することにより、カタボライト抑制条件下に
比較して S. pombe の増殖量は少なくなるが、S. pombe
の細胞量が多いことより多量の異種タンパク質が発現
する。このように S. pombe の増殖と異種タンパク質の
発現をカタボライト抑制の制御によって制御することに
より、より効率的に異種タンパク質の生産を行うことが
できる。

【００３１】カタボライト抑制の制御は上記のような積
極的制御はもちろん、消極的な制御を行うこともでき
る。例えば、ある所定量のグルコースを含む培養液中で
形質転換された S. pombe を培養することにより、培養
初期ではグルコース量が多いことよりカタボライト抑制
下で S. pombe の増殖が進行し、培養後期ではグルコー
スが消費されてその量が少なくなることによりカタボラ
イト抑制が解除され異種タンパク質の産生が進行する。
このように積極的にグルコース量を制御することなくし
ても従来に比較して効率的に異種タンパク質の生産を行
うことができる。

【００３２】

【実施例】以下に本発明を具体的な実施例によりさらに
詳細に説明する。

【００３３】［実施例１］ S. pombe のインベルターゼ遺伝子の単離 S. pombeのｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとし
て、他生物種起源のインベルターゼ遺伝子間で良く保存
された配列部分をもとに設計した配列表の配列番号３〜
５に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行
った。その結果、３００ｂｐおよび４００ｂｐの近傍に
増幅されたバンドが得られた。それぞれのＰＣＲ産物を
ＥＡＳＹ ＴＲＡＰ（宝酒造（株）製）を用いて精製し
た。ｐＭＯＳＢｌｕｅＴベクターキット(アマシャムフ
ァルマシアバイオテク社製)を用いて得られたＰＣＲ産
物をベクターに組み込み、塩基配列の決定を行った。そ
の結果、４００ｂｐのＰＣＲ産物をアミノ酸に変換した
部分アミノ酸配列が出芽酵母サッカロミセス・セレビシ
エのＳＵＣ２遺伝子と高い相同性を示した。

【００３４】この４００ｂｐのＰＣＲ産物をプローブと
して S. pombe のゲノムＤＮＡライブラリーからプラー
クハイブリダイゼーション法により全インベルターゼ遺
伝子を含むポジティブクローンの取得を試みた。その結
果、約８０００のプラークから１５個のポジティブクロ
ーンが取得された。このポジティブクローンの２次スク
リーニングを行うため、再びプラークハイブリダイゼー
ションを行った。その結果、４個のポジティブクローン
が得られた。ポジティブクローンのファージＤＮＡを少
量抽出し、種々の制限酵素で処理して切断パターンを比
較したところすべて同一であった。よって、取得された
ポジティブクローンは１種類であることがわかった。

【００３５】インベルターゼ遺伝子の全長は、次の二段
階の方法で取得した。ハイブリッドを形成した３．０ｋ
ｂのＨｉｎｄＩＩＩ消化フラグメントを単離し、プラス
ミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−（東洋紡
（株）製）に組み込んだ。制限酵素地図を作成したとこ
ろ、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩの制限酵素部位が確認さ
れた。そこでこれらの制限酵素を用いてサブクローニン
グを行い、加えてディレーションを併用して塩基配列の
決定を行った。その結果、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント
に遺伝子のＯＲＦをすべて含むことがわかった。しかし
遺伝子発現に関与すると思われる上流領域は約２００ｂ
ｐしか含まなかった。そのため新たに、ハイブリッドを
形成した３．５ｋｂのＢａｍＨＩ消化フラグメントをさ
らにＨｉｎｄＩＩＩ消化によって２．６ｋｂのフラグメ
ントとして単離し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＩＩ ＳＫ−に組み込み、同様にサブクローニングとデ
ィレーションにより塩基配列を決定した。その結果、Ｂ
ａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントには遺伝子発現
に関与する上流配列と思われる領域が含まれていること
がわかった。得られた全長５．６ｋｂの遺伝子をｉｎｖ
１⁺遺伝子と名付けた。その塩基配列およびＯＲＦのア
ミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。この結果、ｉ
ｎｖ１⁺遺伝子にはアスパラギン結合型糖鎖付加部位が
１６箇所存在していることがわかった。また、S. pombe
のｉｎｖ１⁺遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列、
シュワニオミセス・オキシデンタリス（Schwanniomyces
occidentalis）のインベルターゼのアミノ酸配列、出
芽酵母サッカロミセス・セレビシエのＳＵＣ２遺伝子配
列から推定されるアミノ酸配列間の比較を図１に示す。
アスタリスク（＊）で３種間で共通のアミノ酸を示す。
図１から明らかなように、ｉｎｖ１⁺遺伝子配列から推
定されるアミノ酸配列は、他生物種起源のインベルター
ゼであるシュワニオミセス・オシデンタリス由来のもの
や出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ由来のものと高
い相同性を示すことがわかった。このことから、ｉｎｖ
１⁺遺伝子はインベルターゼをコードするものであると
推定された。

【００３６】［実施例２］ ｉｎｖ１⁺遺伝子配列の破壊 プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−の制限
酵素ＣｌａＩ認識部位に S. pombe 由来ｕｒａ４⁺遺伝
子を組み込んだプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで
消化し、末端平滑化の後セルフライゲーション（自己環
状化）させてＨｉｎｄＩＩＩサイトを破壊した。このプ
ラスミドを制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｃＩＩで二重
消化してｕｒａ４⁺フラグメントを取得した。次にプラ
スミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−を制限酵素
ＳｐｅＩで消化して末端平滑化し、さらに制限酵素Ｘｂ
ａＩで消化したベクターに上述のｕｒａ４⁺フラグメン
トを組み込み、制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位をｕｒａ４
⁺の両側に配置したプラスミドを作製した。プラスミド
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ−の制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ認識部位も上述のように制限酵素処理、末端平滑
化、セルフライゲーションにより破壊し、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位にｉｎｖ１⁺遺伝子のＯＲＦ領域を含む３．０ｋ
ｂのフラグメントを組み込んだ。このプラスミドをＢａ
ｍＨＩで消化して挿入フラグメント中の１．４ｋｂのフ
ラグメント（ｉｎｖ１⁺のＯＲＦのＣ末端側領域を含
む）を除き、両側にＢａｍＨＩサイトを持つｕｒａ４⁺
遺伝子を組み込んだ。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ
で消化して両端にｉｎｖ１⁺遺伝子の近傍の領域を含む
ＤＮＡフラグメントを取得した（図２）。図２はｉｎｖ
１⁺遺伝子の制限酵素地図を示し、ｉｎｖ１⁺遺伝子のオ
ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を矢印（ｉｎｖ
１⁺ＯＲＦ）、置換したシゾサッカロミセス・ポンベｕ
ｒａ４⁺遺伝子を長方形（ｕｒａ４⁺）で示した。ＯＲＦ
を含んだｉｎｖ１⁺の１．４Ｋｂ ＢａｍＨＩ−Ｂａｍ
ＨＩフラグメントは、S. pombe ｕｒａ４⁺遺伝子に置き
換えられていることにより、破壊株ができた。

【００３７】このフラグメントで S. pombe の野生株Ｔ
Ｐ４−１Ｄ〔ｈ^-、ｌｅｕ１、ｕｒａ４、ａｄｅ６−Ｍ
２１６、ｈｉｓ２、登田隆博士（Imperial Cancer Rese
archFoundation）より供与〕を形質転換してウラシル無
添加の培地に生育してきたコロニーを得た。オーバーレ
イアッセイによりインベルターゼ活性について検討した
ところ、活性の消失した株は２８株中７株存在してい
た。すなわち得られたｕｒａ４⁺コロニーの中でインベ
ルターゼ活性の消失した株は２５％であった。

【００３８】さらに染色体上のｉｎｖ１⁺遺伝子の破壊
をサザンハイブリダイゼーションによって確認した。イ
ンベルターゼ活性の消失した株からゲノムＤＮＡを抽出
し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩによって二
重消化し、ｉｎｖ１⁺遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓａｌ
Ｉ消化フラグメント（２ｋｂ）をプローブとしてサザン
ハイブリダイゼーションを行った。その結果、図３に示
すようにインベルターゼ活性の消失した株の染色体ＤＮ
Ａ上のｉｎｖ１⁺遺伝子がｕｒａ４⁺遺伝子に置換されて
いることをＳａｌＩ消化により３ｋｂのハイブリッドが
形成されたことから確認した。

【００３９】以上の結果から、S. pombe において発現
しているインベルターゼ遺伝子は、ｉｎｖ１⁺遺伝子唯
一つであることが証明された。

【００４０】［実施例３］ ｉｎｖ１⁺遺伝子によるインベルターゼ活性の回復 S. pombe 用発現ベクターｐＡＵ−ＳＫ（大阪市立大学
理学部下田親博士より供与）に、インベルターゼ遺伝子
ｉｎｖ１⁺を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理したＯＲＦ
全長を含む３．０ｋｂの切断フラグメントを組み込み、
得られた組換えベクターを用いてインベルターゼ欠損株
（実施例２）を形質転換した。得られた形質転換体をＹ
Ｐスクロース培地（１０μｇ／ｍｌのアンチマイシンＡ
および２０μｇ／ｍｌのブロムクレゾールパープル添
加）にストリークして、インベルターゼ活性の有無をオ
ーバーレイアッセイによって調べた。加えてインベルタ
ーゼ遺伝子ｉｎｖ１⁺の上流プロモータ領域を含む２．
６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断フラグメント
をインベルターゼ遺伝子のＯＲＦを含む２．０ｋｂのＨ
ｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ切断フラグメントと連結させた
４．６ｋｂＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ切断フラグメントをｐ
ＡＵ−ＳＫに組込み、得られた組換えベクターを用いて
インベルターゼ欠損株を形質転換し、同様にインベルタ
ーゼ活性の有無をオーバーレイアッセイによって調べ
た。

【００４１】その結果、いずれの形質転換株（ｉｎｖ１
Δ［ｐＡＵ−ＳＫ：：iｎｖ１⁺］）においても、また野
生株ＴＰ４−１Ｄ（ＷＴ）においても、破壊株（ｉｎｖ
１Δ）にはみられない青い染色が観察され、インベルタ
ーゼを発現していることが確認された。さらに上流プロ
モータ領域を付加した場合、染色度がより強く、高いレ
ベルでインベルターゼを発現していることが示唆された
（図４（ａ）、（ｂ））。図４（ａ）はゲルオーバーレ
イアッセイ写真、図４（ｂ）は図４（ａ）の染色部分を
説明する模式図を示す。

【００４２】また、ＹＰスクロース培地（１０μｇ／ｍ
ｌのアンチマイシン含有）における生育を調べた結果、
インベルターゼ欠損株はほとんど生育を示さなかった
が、野生株と形質転換株は３０℃、５日間の培養での生
育を確認した（図５（ａ）、（ｂ））。図５（ａ）はコ
ロニーの形態を示す写真、図５（ｂ）は図５（ａ）を説
明する模式図を示す。

【００４３】以上の結果よりｉｎｖ１⁺遺伝子がインベ
ルターゼを発現して細胞表層にインベルターゼを生産し
ていることが証明された。

【００４４】［実施例４］ 発現抑制培養のためのグルコース濃度の決定 インベルターゼ遺伝子のカタボライト抑制に必要なグル
コース濃度を決定するため、野生株ＴＰ４−１Ｄをそれ
ぞれグルコースを２％、４％、８％、１６％の濃度で含
有する５ｍｌのＭＭ培地に植菌した後、対数増殖期中期
になるまで３０℃で振盪培養した。菌体のインベルター
ゼの酵素活性をＧｏｌｄｓｔｅｉｎらの方法で、培養後
の培地中のグルコース濃度をフェノール硫酸法によって
測定した（図６）。図中、斜線を付したグラフは菌体あ
たりのインベルターゼ活性（Ｕ／ＯＤ）を、白抜きグラ
フは残存グルコース濃度を示す。同図から、インベルタ
ーゼ活性は、８％の濃度がグルコースの減少度も少な
く、発現抑制培養に最も適当であることがわかった。

【００４５】［実施例５］ 誘導生産のためのグルコース濃度の決定 インベルターゼの誘導生産を行うために最も効果のある
グルコース濃度を決定するため、野生株ＴＰ４−１Ｄを
それぞれ、グルコースを０％、０．０１％、０．０５
％、０．１％、０．２５％、０．５％、１．０％、２．
０％の濃度で含有するＭＭ培地に、対数増殖期中期にな
るまで２％グルコースが含まれた培地で生育させた野生
株と形質転換株〔インベルターゼ欠損株（実施例３）を
ｉｎｖ１⁺遺伝子のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ領域を挿入し
たｐＡＵ−ＳＫベクターで形質転換した株〕の前培養菌
体を移し、２７℃で３時間振盪培養してインベルターゼ
活性を測定した（図７）。各点における菌体のインベル
ターゼ活性を１８０分間、３０℃で測定した。インベル
ターゼの１Ｕは３０℃、ｐＨ４．０のもとに、１分間に
ショ糖を１ｎｍｏｌのグルコースに変化させる酵素の量
を示す。

【００４６】その結果、野生株では誘導に最適なグルコ
ース濃度は０．１％であり、形質転換株では０．０５％
であることがわかった。また野生株では、抑制解除時の
インベルターゼ活性は抑制時の４０倍の値を示した。こ
のような結果から S. pombeにおいてカタボライト抑制
が存在していることが明示された。

【００４７】［実施例６］ ｉｎｖ１⁺遺伝子のプロモータ領域の解析 S. pombe のインベルターゼ遺伝子ｉｎｖ１⁺の上流領域
１位、６２０位、１１００位、１６１０位、２６１０位
のそれぞれをｉｎｖ１⁺遺伝子のＯＲＦと連結させたフ
ラグメントを発現ベクターｐＡＵ−ＳＫに組み込んで５
種類の欠失体を作製した。上流領域１位、１６１０位、
２６１０位を連結させたプラスミドは、それぞれｉｎｖ
１⁺遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位、ＳａｃＩ
−ＳａｌＩ部位、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位を含んでい
る。６２０位、１１００位の上流領域を含むプラスミド
はｐＡＵ−ＳＫ：：ｉｎｖ１⁺（ＢａｍＨＩ−Ｓａｌ
Ｉ）をテンプレートとしてそれぞれ配列表の配列番号
６、７に示すプライマーを用いた部位特異的変異を行っ
てＳｐｅＩサイトを作製した。そして、制限酵素Ｓｐｅ
Ｉ処理により上流の一部を除去して６２０位、１１００
位の上流領域を含むｉｎｖ１⁺遺伝子のプラスミドを作
製した。

【００４８】得られたそれぞれのプラスミドでインベル
ターゼ欠損株（実施例３）を形質転換した。得られた組
換え体のそれぞれのインベルターゼ活性を測定し、酵素
活性を決定した（図８）。その結果、グルコース抑制に
必要な領域は１位から６２０位までと考えられた。グル
コースの抑制解除に従ってインベルターゼの高い脱抑制
に必要な領域は１６１０位から２６１０位までにあるこ
とが確認された。

【００４９】［実施例７］ インベルターゼプロモータを用いた誘導発現マルチクロ
ーニングベクターｐＲＩ０Ｍの作製 S. pombe のインベルターゼ遺伝子を含むプラスミド
（実施例１）をテンプレートとして、配列番号８および
配列番号９に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣ
Ｒ法によってインベルターゼ遺伝子のプロモータ領域を
含む配列を増幅し、かつ、両末端に制限酵素認識配列を
導入した。制限酵素ＳｐｅＩ（宝酒造（株）製）および
ＥｃｏＲＩ（宝酒造（株）製）による二重消化で末端を
処理し、アガロースゲル電気泳動によって、約３０００
塩基対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹ ＴＲＡＰ
を用いたガラスビーズ法で精製し、挿入フラグメントと
した。

【００５０】S. pombe 用マルチクローニングベクター
ｐＴＬ２Ｍ（特開平７−１６３３７３号）を、制限酵素
ＳｐｅＩおよびＥｃｏＩによる二重消化で末端を処理
し、アガロースゲル電気泳動によって、約４５００塩基
対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹ ＴＲＡＰを用
いたガラスビーズ法で精製し、ベクターフラグメントと
した。

【００５１】これら２本のフラグメントを、ＤＮＡライ
ゲーションキット（宝酒造（株）製）を用いて連結し
た。大腸菌ＤＨ５株（東洋紡（株）製）を形質転換した
後、制限酵素地図の作製および塩基配列決定によって、
図９ならびに配列表の配列番号２に示す誘導発現マルチ
クローニングベクターｐＲＩ０Ｍを保持する大腸菌をス
クリーニングし、このベクターをアルカリ−ＳＤＳ法に
よって大量調製した。

【００５２】［実施例８］ 緑色螢光タンパク質誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧＦＰ
の作製 S. pombe のインベルターゼ遺伝子を含むプラスミド
（実施例１）をテンプレートとして、配列表の配列番号
８および配列番号１０に示すオリゴＤＮＡをプライマー
としたＰＣＲ法によってインベルターゼ遺伝子のプロモ
ータ領域を含む配列を増幅し、かつ、両末端に制限酵素
認識配列を導入した。制限酵素ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩ
（宝酒造（株）製）による二重消化で末端を処理し、ア
ガロースゲル電気泳動によって、約３０００塩基対に相
当するバンドを切出し、ＥＡＳＹＴＲＡＰを用いたガラ
スビーズ法で精製し、挿入プロモータフラグメントとし
た。

【００５３】オワンクラゲの緑色螢光タンパク質変異体
遺伝子を含むプラスミドｐＥＧＦＰ−１（Clonetech
製）をテンプレートとして、配列表の配列番号１１およ
び配列番号１２に示すオリゴＤＮＡをプライマーとした
ＰＣＲ法によって緑色螢光タンパク質変異体遺伝子のＯ
ＲＦを含む領域を増幅した。制限酵素ＮｈｅＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩによる二重消化で末端を処理し、アガロー
スゲル電気泳動によって、約７００塩基対に相当するバ
ンドを切出し、ＥＡＳＹ ＴＲＡＰを用いたガラスビー
ズ法で精製し、挿入ＯＲＦフラグメントとした。

【００５４】S. pombe 用マルチクローニングベクター
ｐＴＬ２Ｍ（特開平７−１６３３７３号）を、制限酵素
ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる二重消化で切断
し、アガロースゲル電気泳動によって、約４５００塩基
対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹ ＴＲＡＰを用
いたガラスビーズ法で精製し、ベクターフラグメントと
した。

【００５５】これら３本のフラグメントを、ＤＮＡライ
ゲーションキットを用いて連結した。大腸菌ＤＨ５株を
形質転換した後、制限酵素地図の作製および塩基配列決
定によって、図１０ならびに配列表の配列番号１３に示
す緑色螢光タンパク質変異体誘導発現ベクターｐＲＩ０
ＥＧＦＰを保持する大腸菌をスクリーニングし、この発
現ベクターをアルカリ−ＳＤＳ法によって大量調製し
た。

【００５６】［実施例９］ S. pombe 形質転換体ＡＳＰ１３８株の作製 緑色螢光タンパク質変異体誘導発現ベクターｐＲＩ０Ｅ
ＧＦＰおよび導入ベクターｐＡＬ７を用いて、S. pombe
野生株 ＡＲＣ００１〔ｌｅｕ１-３２ｈ^-（ＡＴＣＣ
３８３９９と同等）〕を岡崎ら（Okazaki et al., "Nuc
leic Acids Res.", 18, 6485-6489, 1990）の方法に従
って形質転換した。

【００５７】ＹＰＤ液体培地で前培養済みのＡＲＣ００
１培養液 １ｍｌを１００ｍｌの最少培地ＭＢ＋Ｌｅｕ
に植菌し、３０℃で１４時間振盪培養した。菌数１ｍｌ
あたり２．３×１０⁷個の段階で集菌し、水で洗菌後、
１ｍｌの０．１Ｍ酢酸リチウム（ｐＨ５．０）に懸濁
し、３０℃で６０分間インキュベートした。上記懸濁液
１００μｌに、４μｇの誘導発現ベクターｐＲＩ０ＥＧ
ＦＰおよび０．５μｇのＰｓｔＩ消化したｐＡＬ７をＴ
Ｅ １５μｌに溶かして加え、さらに５０％ＰＥＧ４０
００を２９０μｌ加えてよく混合した後、３０℃で６０
分間、４３℃で１５分間、室温で１０分間の順にインキ
ュベートした。ＰＥＧを遠心除去した後、菌体を１ｍｌ
の１／２ＹＥＬ＋Ｌｅｕ培地に懸濁した。１／１０に希
釈したもの１ｍｌを３２℃で２時間インキュベートし、
うち３００μｌを最少寒天培地ＭＭＡにスプレッドし
た。３２℃で３日間培養したところ、約３００個の互い
に独立したコロニーがプレート上に出現した。

【００５８】得られた形質転換体１０個（コロニー）
を、抗生物質Ｇ４１８を１０μｇ／ｍｌの濃度で含有す
る２ｍｌのＹＥＬ培地（ＹＥＬ１０培地）に植菌し、３
２℃で振盪培養した。２日目に６個のクローンが生育し
た。さらに同じＹＥＬ１０培地で継代培養したところ、
３日目に４個のクローンが生育した。これらを目的の形
質転換体候補株、ＡＳＰ１３８株として、グリセロール
凍結保存するとともに、以下の実験に使用した。

【００５９】［実施例１０］ 緑色螢光タンパク質変異体の発現解析 S. pombe 形質転換体 ＡＳＰ１３８株（実施例９）を
１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地（ＹＰＤ
１００培地）に植菌し、３２℃で２日間培養した。蛍光
顕微鏡（励起波長４９０ｎｍ／蛍光波長５３０ｎｍ）で
菌体を観察したところ、個々の菌体が緑色蛍光を発する
ことが観察された。さらに遠心集菌した菌体に紫外線を
照射したところ、やはり緑色蛍光を発することが観察さ
れた。以上のことから、目的の緑色蛍光タンパク質が活
性体として発現していることがわかった。

【００６０】ＡＳＰ１３８株（実施例９）をＹＰＤ１０
０培地５ｍｌに植菌し、３２℃で３日間培養した。集
菌、洗菌後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
で懸濁し、ミニビードビーター（バイオスペック製）を
用いたガラスビーズによる破砕を行った。ガラスビーズ
を除いた後、ＳＤＳ（１％）存在下で８０℃、１５分間
加熱し、抽出液を得た。別にｐＲＩ０Ｍを導入した形質
転換体についても、同じ方法で抽出液を作製し、ネガテ
ィブコントロールとした。

【００６１】５０μｇタンパク質相当の抽出液をＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で解析した（図１
１（ａ）、（ｂ））。クマシーブリリアントブルー（Ｃ
ＢＢ）染色したところ、ポジティブコントロールである
組換え緑色蛍光タンパク質（Clonetech製）と同じ分子
量２５０００付近にネガティブコントロールにない顕著
なバンドが確認された。さらに５０μｇ相当のタンパク
質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、
ＰＶＤＦ膜にブロッティングし、抗緑色蛍光タンパク質
抗体（Clonetech製）を用いたウエスタンブロッティン
グ法で解析した。その結果、ポジティブコントロールと
同じ分子量２５０００付近にネガティブコントロールに
ない顕著なバンドが確認された。以上のことから、目的
の緑色蛍光タンパク質が発現していることが生化学的に
明らかになった。

【００６２】［実施例１１］ 培養方法の最適化（１） S. pombe 形質転換体 ＡＳＰ１３８株（実施例９）を
１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地（ＹＰＤ
１００培地）に植菌し、３２℃で培養した。蛍光付属装
置（励起波長４９０ｎｍ／蛍光波長５３０ｎｍ）付きマ
イクロプレートリーダー（コロナ電気（株）製）で培養
液の発する蛍光値を測定し、緑色蛍光タンパク質の発現
量を調べた（図１２（ａ）、（ｂ））。図中、ＯＤは菌
体濃度を、ＦＬＵ／ＯＤは菌体あたりの蛍光値を、時間
は培養時間をそれぞれ示す。同図に示される結果から、
非誘導型のサイトメガロウイルスプロモータを用いたＡ
ＳＰ１２２株［ｐｈＧＦＰＳ６５Ｔ（Clonetech製）を
もとに特開平７−１６３３７３号公報記載の方法にした
がって作成した緑色蛍光蛋白質Ｓ６５Ｔ変異体発現組換
え体］に比べ、ＡＳＰ１３８株では増殖期中期まで発現
がみられず、グルコースが枯渇する増殖期後期になって
初めて発現が開始することがわかった。これは明らかに
誘導型プロモータであるインベルターゼプロモータがグ
ルコース存在下で抑制され、グルコースが消費されるこ
とによって抑制が解除されるためであり、この機構が異
種タンパク質である緑色蛍光タンパク質の発現にも利用
できることがわかった。

【００６３】［実施例１２］ ＡＳＰ１３８株の培養（２） S. pombe 形質転換体 ＡＳＰ１３８株（実施例９）を
１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地（グルコ
ース濃度８％）に植菌し、３２℃で培養した。さらに増
殖期中期に１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤＧ
培地（グルコース濃度０．１％、グリセロール濃度３
％）に培地を交換し、培養を続けた（図１３（ａ）、
（ｂ））。図中、ＯＤは菌体濃度を、ＦＬＵ／ＯＤは菌
体あたりの蛍光値を、時間は培養時間をそれぞれ示す。
同図に示される結果から、培地を交換しないもの（Untr
eated）に比べて、培地を交換したもの（Medium-change
d）では培地交換によって発現が開始することが観察さ
れた。これは培地中のグルコースが除去されることによ
り急速にインベルターゼプロモータの脱抑制がかかり、
発現が誘導されるためであると考えられた。よって低濃
度のグルコースを含む発現培地に交換することによって
高い発現量が得られること、すなわち菌体の増殖と発現
を増殖培地（高グルコース濃度）と発現培地（低グルコ
ース濃度）を用いることによって分離できることがわか
った。これは明らかに誘導型プロモータであるインベル
ターゼプロモータがグルコース存在したで抑制され、グ
ルコースが消費されることによって抑制が解除されるた
めであり、この機構が異種タンパク質である緑色蛍光タ
ンパク質の発現にも利用できることがわかった。

【００６４】［実施例１３］ ＡＳＰ１３８株の培養（３） S. pombe 形質転換体 ＡＳＰ１３８株（実施例９）を
１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地（グルコ
ース濃度８％）に植菌し、３２℃で培養した。さらに増
殖期後期に１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤＧ
培地（グルコース濃度０．１％、グリセロール濃度３
％）に培地を交換し、培養を続けた（図１４（ａ）、
（ｂ））。図中、ＯＤは菌体濃度を、ＦＬＵ／ＯＤは菌
体あたりの蛍光値を、時間は培養時間をそれぞれ示す。
同図に示される結果から、培地を交換しないもの（Untr
eated）に比べて、培地を交換したもの（Medium-change
d）では培地交換によって発現が開始することが観察さ
れた。これは培地中のグルコースが除去されることによ
り急速にインベルターゼプロモータの脱抑制がかかり、
発現が誘導されるためであると考えられた。よって高濃
度のグルコースを含む培地で培養を開始し、グルコース
が消費される前に低濃度のグルコースを含む発現培地に
交換することによって高い発現量が得られること、すな
わち菌体の増殖と発現を増殖培地（高グルコース濃度）
と発現培地（低グルコース濃度）を用いることによって
分離できることがわかった。これは明らかに誘導型プロ
モータであるインベルターゼプロモータがグルコース存
在下で抑制され、グルコースが消費されることによって
抑制が解除されるためであり、この機構が異種タンパク
質である緑色蛍光タンパク質の発現にも利用できること
がわかった。

【００６５】［実施例１４］ リポコルチンＩ誘導発現ベクターｐＲＩ０ＬＰＩの作製 S. pombe のインベルターゼ遺伝子を含むプラスミド
（実施例１）をテンプレートとして、配列表の配列番号
１４および配列番号１５に示すオリゴＤＮＡをプライマ
ーとしたＰＣＲ法によってインベルターゼ遺伝子のプロ
モータ領域を含む配列を増幅し、かつ、両末端に制限酵
素認識配列を導入した。制限酵素ＳｐｅＩおよびＥｃｏ
ＲＩによる二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電
気泳動によって、約３０００塩基対に相当するバンドを
切出し、ＥＡＳＹ ＴＲＡＰを用いたガラスビーズ法で
精製し、挿入プロモータフラグメントとした。

【００６６】ヒトのリポコルチンＩ遺伝子を含む発現ベ
クターｐＴＬ２Ｌ（特開平７−１６３３７３号）を制限
酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる二重消化で
切断し、アガロースゲル電気泳動によって、約１０００
塩基対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹ ＴＲＡＰ
を用いたガラスビーズ法で精製し、挿入ＯＲＦフラグメ
ントとした。

【００６７】S. pombe 用マルチクローニングベクター
ｐＴＬ２Ｍ（特開平７−１６３３７３号）を、制限酵素
ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる二重消化で切断
し、アガロースゲル電気泳動によって、約４５００塩基
対に相当するバンドを切出し、ＥＡＳＹ ＴＲＡＰを用
いたガラスビーズ法で精製し、ベクターフラグメントと
した。

【００６８】これら３本のフラグメントを、ＤＮＡライ
ゲーションキットを用いて連結した。大腸菌ＤＨ５株を
形質転換した後、制限酵素地図の作製および塩基配列決
定によってリポコルチンＩ誘導発現ベクターｐＲＩ０Ｌ
ＰＩを保持する大腸菌をスクリーニングし、このベクタ
ーをアルカリ−ＳＤＳ法によって大量調製した。

【００６９】［実施例１５］ S. pombe 形質転換体ＡＳＰ１３９株の作製 リポコルチンＩ誘導発現ベクターｐＲＩ０ＬＰＩおよび
導入ベクターｐＡＬ７を用いて、S. pombe 野生株ＡＲ
Ｃ００１を前記岡崎らの方法に従って形質転換した。

【００７０】ＹＰＤ液体培地で前培養済みのＡＲＣ００
１培養液 １ｍｌを１００ｍｌの最少培地ＭＢ＋Ｌｅｕ
に植菌し、３０℃で１６時間振盪培養した。菌数１ｍｌ
あたり１．０×１０⁷個の段階で集菌し、水で洗菌後、
１ｍｌの０．１Ｍ酢酸リチウム（ｐＨ５．０）に懸濁
し、３０℃で６０分間インキュベートした。上記懸濁液
１００μｌに、２μｇの組換えベクターｐＲＩ０ＬＰＩ
および１μｇのＰｓｔＩ消化したｐＡＬ７を１５μｌの
ＴＥに溶かして加え、さらに５０％ＰＥＧ４０００を２
９０μｌ加えてよく混合した後、３０℃で６０分間、４
３℃で１５分間、室温で１０分間の順にインキュベート
した。ＰＥＧを遠心除去した後、菌体を１ｍｌの１／２
ＹＥＬ＋Ｌｅｕ培地に懸濁した。１／１０に希釈したも
の１ｍｌを３２℃で２時間インキュベートし、うち３０
０μｌを最少寒天培地ＭＭＡにスプレッドした。３２℃
で３日間培養したところ、約３００個の互いに独立した
コロニーがプレート上に出現した。

【００７１】得られた形質転換体１０個（コロニー）
を、抗生物質Ｇ４１８を１０μｇ／ｍｌの濃度で含有す
る２ｍｌのＹＥＬ培地（ＹＥＬ１０培地）に植菌し、３
２℃で振盪培養した。２日目に３個のクローンが生育し
た。さらに同じＹＥＬ１０培地で継代培養したところ、
３日目に全てのクローンが生育した。これらを目的の形
質転換体候補株、ＡＳＰ１３９株としてグリセロール凍
結保存するとともに、以下の実験に使用した。

【００７２】［実施例１６］ リポコルチンＩの発現解析 S. pombe 形質転換体ＡＳＰ１３９株（実施例１５）を
１００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地（グルコ
ース濃度８％）に植菌し、３２℃で定常状態にいたるま
で培養して集菌し、非誘導培養菌体とした。これとは別
に、同じ培地で培養を開始し、増殖期中期に１００μｇ
／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤＧ培地（グルコース濃度
０．１％、グリセロール濃度３％）に培地を交換して培
養を続け、定常期に集菌し、誘導培養菌体とした。両菌
体を洗浄後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
で懸濁し、ミニビードビーターを用いたガラスビーズに
よる破砕を行った。ガラスビーズを除いた後、ＳＤＳ
（１％）存在下で８０℃、１５分間加熱し、抽出液を得
た。

【００７３】５０μｇタンパク質相当の両抽出液をＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、クマシ
ーブリリアントブルーで染色した。その結果、誘導培養
菌体由来の抽出物において、組換えリポコルチンＩタン
パク質の配列から予想される位置と同じ分子量４５００
０付近に、非誘導培養菌体由来の抽出物にない顕著なバ
ンドが確認された。より感度の高いウエスタン法によっ
て両者のバンドの濃さを比べたところ、誘導培養菌体抽
出物に由来するバンドは非誘導培養菌体抽出物のものに
比べて１０倍以上あることがわかった。以上のことか
ら、培地を交換しないものに比べて、培地を交換したも
のでは培地交換によって発現が開始することが明らかに
なった。これは培地中のグルコースが除去されることに
より急速にインベルターゼプロモータの脱抑制がかか
り、発現が誘導されるためであると考えられた。よって
低濃度のグルコースを含む発現培地に交換することによ
ってた発現量が得られること、すなわち菌体の増殖と発
現を増殖培地（高グルコース濃度）と発現培地（低グル
コース濃度）を用いることによって分離できることがわ
かった。これは明らかに誘導型プロモータであるインベ
ルターゼプロモータがグルコース存在したで抑制され、
グルコースが消費されることによって抑制が解除される
ためであり、この機構が異種タンパク質であるリポコル
チンＩの発現にも利用できることがわかった。

【００７４】

【発明の効果】本発明のタンパク質生産方法を実施する
ことによって、特定の栄養源の有無により遺伝子発現を
制御し、目的タンパク質の生産時期が制御可能になる効
果が認められる。ひいては、自身の生理活性のために生
産量が低いタンパク質や、他の理由でこれまで生産でき
なかったタンパク質を生産可能とする効果が達成され
る。

【００７５】

【配列表】SEQUENCE LISTING <110> Asahi Glass Co., Ltd. <120> Inducible promoters and inducible expression
vectors usable in fission yeast Schizosaccharomyc
es pombe, as well as the use of the same <130> 980775 <150> JP9/314608 <151> 1997-10-31 <160> 15 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００７６】<210> 1 <211> 4748 <212> DNA <213> Schizosaccharomyces pombe <400> 1 ggatcctagt ccgcgaaatc gagatgcttt gaagattaaa attaaattta attttatgcg 60 agactggttt ccttattttt tgtatagtcg catgcaagcg aggttcgcat aatttggaaa 120 ataaaggtag tcaagaagac gttgaattaa ggctgcagtt tcaaagtact ctacaaacga 180 ttccttttaa aaaaaaagat tcaaaaaaaa ggcaaagggt ttaagtaatg cttgttattt 240 caatttacct ccaaacagtt actaatgcaa ttgcaaaaaa aaaacctacc tattgaatca 300 aaatttctag cccatccatc gctcctcaag ataaaggaat cgatattttg agtttaaggg 360 agttgctgat agatttcaga attaaaaatt tttggaaaag gatgtcgaga acaagaagat 420 acgtctagat tgctgatgat gcattctagc agacggaaat acaacgatat gtggacagca 480 cgacttttga tccgttcgga tcaaaaggaa gagaaatatc catctttcaa gaagaatgca 540 ggaaaagcaa taaatgccca tttgattcct aaattatccc caaaaatgaa cattatgaga 600 tcttcttgtg ggagacagga aatttcgcaa ttccaaacga aaattcggct ctttttttta 660 ccccacagtt gcggggtaaa tgatgtaacg gaccttgggg gaaaggatga tgagttagtt 720 gggaagcgga aaaaatggaa aacggaagta agaatagaaa ccagtatggc tgagtgcaat 780 ggcggaaaag attttacaga gatgacaaga atctatttat ctataaggaa aaactttttc 840 caaatttgtc taaaaacgca ttctcctcaa ttgcctctag gtagatgata taacgaattg 900 gaacgagaca tcgctaaccg gttttctttg taaatgacat tttgtagtgg gagtaagttt 960 gaatggaggg atagacagat gaatagtatg agatagaaga atagtatata taatgattaa 1020 gatgaacaaa taaaaattga aagaaaaaag aaattgttgg ctcatttggt tcatacacat 1080 gttggttcat acaactttta cccatcgtaa gtattataag taaaaaatag agtacgaaaa 1140 gctataagta gtgaagcaaa aaaatagaaa aatagaaaaa aaaatatata taaaaaaata 1200 taataaaaat aaaactcata agagacgtaa aacacaagaa ttgtctatca tttgttcttt 1260 aagaagcacc accattctgt aaaactcttc atttctcatt agcaaggacc cttttcattc 1320 cttcctcttt agaatccttt tcattataac gaattggata atacgcaaat aagaacacat 1380 cccctaaata cgatatatcg atccattttt tactttgcct agcttattgc tgtacaattc 1440 catttaaata gtttctcctc aagaaagatc gtcaatggag gcgacaatat accggaattt 1500 aagttgcgga cacagagctt gaaaagactg cattttgtat tgttttcaag taaatgaaac 1560 tgagttttga agtctcaaaa tacatcttat gtattgaaca ttagaagaac atataagata 1620 gatcttgaga gctcaattca tcgacattct agccatcata ctgcgatctt agacattgtc 1680 agcacaacct tagatcgaaa atgaacacgt taccaaacgt tgtctaaaac ttgccgaatc 1740 ttatctccgc attacttccg taatccttag tacatacgct gcaatttcgg aaggtcatga 1800 tcgacttttt gtgtagctat aagtgacgca aatgagaaac atgacaaggt gcgatattta 1860 gcaagatatt atgcatttga tggagaaagg aaatttcgga tgtatatata gtaccgttag 1920 ctgcgctttt tttggtcatc cataattttc aaactcactg ctttcgatca gatttaccgt 1980 ttttaaggtc tttattgctt tgtgatctgt aggttggaac atctatagtt cattttctaa 2040 aagatccttt catcgtttca tcggatagta atcgttcaag aaaaaaaaag aaaaaaagaa 2100 aaagaaaaag aaaagaaaaa taaaccgcta taattcatta cctatttgac tgaaggttct 2160 tcatcttgaa ttgttttgaa tcaaaataaa gaaattatta ttattatttt ttttcttcgc 2220 tttttcttta tccattcgtc gaaactattt ttctgctgat aaaagcaatc attccttttt 2280 cctgcttctc ttgttattcg aattttaaac gacttttttt cctcgtccat tccctaattc 2340 tttgcgacct tttctgattc tatccttggt ttgtactttc gttgtgtaat tgttgagaaa 2400 gtgaactgat tatttaattg ttgtgaaaaa aattctaaaa ctattttgtt tttcttgatc 2460 attcatcctt tgctcgcttg cttgaatatt acagaaattc gtctcccttt caacggaata 2520 tgataatttg ttgaatactc taaatcaatt aacacctatc aaaagctgaa acattaaatc 2580 tattctcacc aaaaaaaaag actcaagctt cttcgttgtt ggccggtctc ttttttgttt 2640 tacgattgtt aaattttata ctcacaactg ccaattctcc acttttgact atttattgat 2700 agtccctatt taattttctg ttcaccgatt atcgtctttt ttgtaaataa tctttcttgg 2760 aaccaaccaa ttaatacgtt ataatcgcta actttgaaga tttgctaca atg ttt ttg 2818 Met Phe Leu 1 aaa tat att tta gct agt ggc att tgc ctc gtc tct ctc tta tca tct 2866 Lys Tyr Ile Leu Ala Ser Gly Ile Cys Leu Val Ser Leu Leu Ser Ser 5 10 15 aca aac gcg gct ccc cgt cac tta tat gta aaa cgt tat cct gtc att 2914 Thr Asn Ala Ala Pro Arg His Leu Tyr Val Lys Arg Tyr Pro Val Ile 20 25 30 35 tat aat gct tcc aac atc act gaa gtc agc aat tct acc acc gtt cct 2962 Tyr Asn Ala Ser Asn Ile Thr Glu Val Ser Asn Ser Thr Thr Val Pro 40 45 50 cct cct cca ttc gta aat aca acg gcc cct aat ggg act tgt ttg ggt 3010 Pro Pro Pro Phe Val Asn Thr Thr Ala Pro Asn Gly Thr Cys Leu Gly 55 60 65 aac tat aac gag tat ctt cct tca gga tat tac aat gct acc gat cgt 3058 Asn Tyr Asn Glu Tyr Leu Pro Ser Gly Tyr Tyr Asn Ala Thr Asp Arg 70 75 80 ccc aaa att cat ttt act cct tct tcc ggt ttc atg aat gat cca aac 3106 Pro Lys Ile His Phe Thr Pro Ser Ser Gly Phe Met Asn Asp Pro Asn 85 90 95 gga ttg gta tat act ggc ggc gtc tat cac atg ttc ttc caa tat tca 3154 Gly Leu Val Tyr Thr Gly Gly Val Tyr His Met Phe Phe Gln Tyr Ser 100 105 110 115 cca aaa act cta aca gcc ggc gaa gtt cat tgg ggt cac aca gtt tcc 3202 Pro Lys Thr Leu Thr Ala Gly Glu Val His Trp Gly His Thr Val Ser 120 125 130 aag gat tta atc cat tgg gag aat tat cct att gcc atc tac ccc gat 3250 Lys Asp Leu Ile His Trp Glu Asn Tyr Pro Ile Ala Ile Tyr Pro Asp 135 140 145 gaa cat gaa aac gga gtt ttg tcc ctc cca ttt agt ggc agt gca gtc 3298 Glu His Glu Asn Gly Val Leu Ser Leu Pro Phe Ser Gly Ser Ala Val 150 155 160 gtc gat gtt cat aat tct tcc ggt ctc ttt tcc aac gac acc att ccg 3346 Val Asp Val His Asn Ser Ser Gly Leu Phe Ser Asn Asp Thr Ile Pro 165 170 175 gaa gag cgc att gtt tta att tat acc gat cat tgg act ggt gtt gct 3394 Glu Glu Arg Ile Val Leu Ile Tyr Thr Asp His Trp Thr Gly Val Ala 180 185 190 195 gag cgt cag gct att gcg tat acc act gat ggt gga tat act ttc aaa 3442 Glu Arg Gln Ala Ile Ala Tyr Thr Thr Asp Gly Gly Tyr Thr Phe Lys 200 205 210 aaa tat tca gga aat ccc gtt ctt gac att aat tca ctt caa ttc cgc 3490 Lys Tyr Ser Gly Asn Pro Val Leu Asp Ile Asn Ser Leu Gln Phe Arg 215 220 225 gac ccc aag gta ata tgg gat ttc gat gct aat cgt tgg gtg atg att 3538 Asp Pro Lys Val Ile Trp Asp Phe Asp Ala Asn Arg Trp Val Met Ile 230 235 240 gta gct atg tct caa aat tat gga att gcc ttt tat tcc tcc tat gac 3586 Val Ala Met Ser Gln Asn Tyr Gly Ile Ala Phe Tyr Ser Ser Tyr Asp 245 250 255 ttg att cac tgg acc gag tta tct gtt ttc tcc act tct ggt tat ttg 3634 Leu Ile His Trp Thr Glu Leu Ser Val Phe Ser Thr Ser Gly Tyr Leu 260 265 270 275 ggg ttg caa tat gaa tgc cct gga atg gct cgt gtg ccc gtt gaa ggc 3682 Gly Leu Gln Tyr Glu Cys Pro Gly Met Ala Arg Val Pro Val Glu Gly 280 285 290 acc gat gaa tac aaa tgg gta ctc ttc at ctc catc aat cct ggc gct 3730 Thr Asp Glu Tyr Lys Trp Val Leu Phe Ile Ser Ile Asn Pro Gly Ala 295 300 305 cca ttg gga gga tcc gtt gtc caa tac ttt gtt ggc gat tgg aat ggt 3778 Pro Leu Gly Gly Ser Val Val Gln Tyr Phe Val Gly Asp Trp Asn Gly 310 315 320 aca aac ttc gtc ccc gat gat ggc caa act aga ttc gta gac ttg ggt 3826 Thr Asn Phe Val Pro Asp Asp Gly Gln Thr Arg Phe Val Asp Leu Gly 325 330 335 aag gac ttt tac gcc agc gct ttg tat cac tcg tct tcc gcc aat gcc 3874 Lys Asp Phe Tyr Ala Ser Ala Leu Tyr His Ser Ser Ser Ala Asn Ala 340 345 350 355 gat gtt att gga gtt gga tgg gct agc aac tgg caa tac acc aac caa 3922 Asp Val Ile Gly Val Gly Trp Ala Ser Asn Trp Gln Tyr Thr Asn Gln 360 365 370 gct cct act caa gtt ttc cgc agt gct atg aca gtt gca cga aaa ttc 3970 Ala Pro Thr Gln Val Phe Arg Ser Ala Met Thr Val Ala Arg Lys Phe 375 380 385 act ctt cgc gac gtt cct cag aac ccc atg acc aac ctt act tct ctc 4018 Thr Leu Arg Asp Val Pro Gln Asn Pro Met Thr Asn Leu Thr Ser Leu 390 395 400 att caa acc cca ttg aat gtt tct ctc tta cga gat gaa aca cta ttt 4066 Ile Gln Thr Pro Leu Asn Val Ser Leu Leu Arg Asp Glu Thr Leu Phe 405 410 415 acc gca ccc gtt atc aat agt tca agt agt ctt tcg ggc tct ccg att 4114 Thr Ala Pro Val Ile Asn Ser Ser Ser Ser Leu Ser Gly Ser Pro Ile 420 425 430 435 act ctt cca agc aat acc gca ttc gag ttc aat gtc aca ctc agt atc 4162 Thr Leu Pro Ser Asn Thr Ala Phe Glu Phe Asn Val Thr Leu Ser Ile 440 445 450 aat tac aca gaa ggc tgc aca aca gga tat tgt ctg ggg cgt att atc 4210 Asn Tyr Thr Glu Gly Cys Thr Thr Gly Tyr Cys Leu Gly Arg Ile Ile 455 460 465 att gat tct gat gat cca tac aga tta caa tcc atc tcc gtg gac gtt 4258 Ile Asp Ser Asp Asp Pro Tyr Arg Leu Gln Ser Ile Ser Val Asp Val 470 475 480 gat ttt gca gct agc act tta gtc att aat cgt gcc aaa gct cag atg 4306 Asp Phe Ala Ala Ser Thr Leu Val Ile Asn Arg Ala Lys Ala Gln Met 485 490 495 gga tgg ttt aat tca ctt ttc acg cct tct ttt gcc aac gat att tac 4354 Gly Trp Phe Asn Ser Leu Phe Thr Pro Ser Phe Ala Asn Asp Ile Tyr 500 505 510 515 att tat gga aac gta act ttg tat ggt att gtt gac aat gga ttg ctt 4402 Ile Tyr Gly Asn Val Thr Leu Tyr Gly Ile Val Asp Asn Gly Leu Leu 520 525 530 gaa ctg tat gtc aat aat ggc gaa aaa act tac act aat gac ttt ttc 4450 Glu Leu Tyr Val Asn Asn Gly Glu Lys Thr Tyr Thr Asn Asp Phe Phe 535 540 545 ttc ctt caa gga gca aca cct gga cag atc agc ttc gct gct ttc caa 4498 Phe Leu Gln Gly Ala Thr Pro Gly Gln Ile Ser Phe Ala Ala Phe Gln 550 555 560 ggc gtt tct ttc aat aat gtt acc gtt acg cca tta aag act atc tgg 4546 Gly Val Ser Phe Asn Asn Val Thr Val Thr Pro Leu Lys Thr Ile Trp 565 570 575 aat tgc taaatatttt gtttcaagtt aggaaagtat aataactttt gtccctgcat 4602 Asn Cys 580 attcaattgt aaagtttagt ttatcctttc atcgtaacca caattgtcac ctaaatctct 4662 aaaaatctct tcacttatct agttaatgtc gtaacaaaaa agtccagtag cttcgggaaa 4722 tgatgcttgg aatcatacaa gtcgac 4748

【００７７】<210> 2 <211> 7286 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 agcttgaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt 60 tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 120 tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 180 tgtatcttat catgtctgga tcgatcccgg caggttgggc gtcgcttggt cggtcatttc 240 gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc 300 gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc 360 tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc 420 cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag 480 gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg 540 aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga 600 ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg 660 caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc 720 tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc 780 cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg 840 gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg 900 gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag 960 cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga 1020 gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga 1080 tcagatccgg gacctgaaat aaaagacaaa aagactaaac ttaccagtta actttctggt 1140 ttttcagttc ctcgaggagc tttttgcaaa agcctaggcc tccaaaaaag cctcctcact 1200 acttctggaa tagctcagag gccgaggcgg cctcggcctc tgcataaata aaaaaaatta 1260 gtcagccatg gggcggagaa tgggcggaac tgggcggagt taggggcggg atgggcggag 1320 ttaggggcgg gactatggtt gctgactaat tgagatgcat gctttgcata cttctgcctg 1380 ctggggagcc tggggacttt ccacacctgg ttgctgacta attgagatgc atgctttgca 1440 tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacaccc taactgacac acattccaca 1500 ggacattgat tattgactag ttagtccgcg aaatcgagat gctttgaaga ttaaaattaa 1560 atttaatttt atgcgagact ggtttcctta ttttttgtat agtcgcatgc aagcgaggtt 1620 cgcataattt ggaaaataaa ggtagtcaag aagacgttga attaaggctg cagtttcaaa 1680 gtactctaca aacgattcct tttaaaaaaa aagattcaaa aaaaaggcaa agggtttaag 1740 taatgcttgt tatttcaatt tacctccaaa cagttactaa tgcaattgca aaaaaaaaac 1800 ctacctattg aatcaaaatt tctagcccat ccatcgctcc tcaagataaa ggaatcgata 1860 ttttgagttt aagggagttg ctgatagatt tcagaattaa aaatttttgg aaaaggatgt 1920 cgagaacaag aagatacgtc tagattgctg atgatgcatt ctagcagacg gaaatacaac 1980 gatatgtgga cagcacgact tttgatccgt tcggatcaaa aggaagagaa atatccatct 2040 ttcaagaaga atgcaggaaa agcaataaat gcccatttga ttcctaaatt atccccaaaa 2100 atgaacatta tgagatcttc ttgtgggaga caggaaattt cgcaattcca aacgaaaatt 2160 cggctctttt ttttacccca cagttgcggg gtaaatgatg taacggacct tgggggaaag 2220 gatgatgagt tagttgggaa gcggaaaaaa tggaaaacgg aagtaagaat agaaaccagt 2280 atggctgagt gcaatggcgg aaaagatttt acagagatga caagaatcta tttatctata 2340 aggaaaaact ttttccaaat ttgtctaaaa acgcattctc ctcaattgcc tctaggtaga 2400 tgatataacg aattggaacg agacatcgct aaccggtttt ctttgtaaat gacattttgt 2460 agtgggagta agtttgaatg gagggataga cagatgaata gtatgagata gaagaatagt 2520 atatataatg attaagatga acaaataaaa attgaaagaa aaaagaaatt gttggctcat 2580 ttggttcata cacatgttgg ttcatacaac ttttacccat cgtaagtatt ataagtaaaa 2640 aatagagtac gaaaagctat aagtagtgaa gcaaaaaaat agaaaaatag aaaaaaaaat 2700 atatataaaa aaatataata aaaataaaac tcataagaga cgtaaaacac aagaattgtc 2760 tatcatttgt tctttaagaa gcaccaccat tctgtaaaac tcttcatttc tcattagcaa 2820 ggaccctttt cattccttcc tctttagaat ccttttcatt ataacgaatt ggataatacg 2880 caaataagaa cacatcccct aaatacgata tatcgatcca ttttttactt tgcctagctt 2940 attgctgtac aattccattt aaatagtttc tcctcaagaa agatcgtcaa tggaggcgac 3000 aatataccgg aatttaagtt gcggacacag agcttgaaaa gactgcattt tgtattgttt 3060 tcaagtaaat gaaactgagt tttgaagtct caaaatacat cttatgtatt gaacattaga 3120 agaacatata agatagatct tgagagctca attcatcgac attctagcca tcatactgcg 3180 atcttagaca ttgtcagcac aaccttagat cgaaaatgaa cacgttacca aacgttgtct 3240 aaaacttgcc gaatcttatc tccgcattac ttccgtaatc cttagtacat acgctgcaat 3300 ttcggaaggt catgatcgac tttttgtgta gctataagtg acgcaaatga gaaacatgac 3360 aaggtgcgat atttagcaag atattatgca tttgatggag aaaggaaatt tcggatgtat 3420 atatagtacc gttagctgcg ctttttttgg tcatccataa ttttcaaact cactgctttc 3480 gatcagattt accgttttta aggtctttat tgctttgtga tctgtaggtt ggaacatcta 3540 tagttcattt tctaaaagat cctttcatcg tttcatcgga tagtaatcgt tcaagaaaaa 3600 aaaagaaaaa aagaaaaaga aaaagaaaag aaaaataaac cgctataatt cattacctat 3660 ttgactgaag gttcttcatc ttgaattgtt ttgaatcaaa ataaagaaat tattattatt 3720 attttttttc ttcgcttttt ctttatccat tcgtcgaaac tatttttctg ctgataaaag 3780 caatcattcc tttttcctgc ttctcttgtt attcgaattt taaacgactt tttttcctcg 3840 tccattccct aattctttgc gaccttttct gattctatcc ttggtttgta ctttcgttgt 3900 gtaattgttg agaaagtgaa ctgattattt aattgttgtg aaaaaaattc taaaactatt 3960 ttgtttttct tgatcattca tcctttgctc gcttgcttga atattacaga aattcgtctc 4020 cctttcaacg gaatatgata atttgttgaa tactctaaat caattaacac ctatcaaaag 4080 ctgaaacatt aaatctattc tcaccaaaaa aaaagactca agcttcttcg ttgttggccg 4140 gtctcttttt tgttttacga ttgttaaatt ttatactcac aactgccaat tctccacttt 4200 tgactattta ttgatagtcc ctatttaatt ttctgttcac cgattatcgt cttttttgta 4260 aataatcttt cttggaacca accaattaat acgttataat cgctaacttt gaagatttgc 4320 tacaatggca atggtatcag aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct 4380 gcaggcatgc aagcttaaat aggaaagttt cttcaacagg attacagtgt agctacctac 4440 atgctgaaaa atatagcctt taaatcattt ttatattata actctgtata atagagataa 4500 gtccattttt taaaaatgtt ttccccaaac cataaaaccc tatacaagtt gttctagtaa 4560 caatacatga gaaagatgtc tatgtagctg aaaataaaat gacgtcacaa gacaaaaaaa 4620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagta 4680 ccttctgagg cggaaagaac cagccggatc cagacatgat aagatacatt gatgagtttg 4740 gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta 4800 ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt taacaacaac aattgcattc 4860 attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct 4920 acaaatgtgg tatggctgat tatgatccgg ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 4980 aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 5040 gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat 5100 gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag 5160 attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 5220 taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 5280 ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 5340 gataacgcag gaaagaatga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 5400 cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 5460 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 5520 gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 5580 tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 5640 aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 5700 ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 5760 cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 5820 tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 5880 tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 5940 ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 6000 aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 6060 aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 6120 aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 6180 gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 6240 gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 6300 caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 6360 ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta 6420 attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 6480 ccattgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 6540 gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 6600 ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 6660 tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 6720 gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 6780 cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 6840 gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 6900 tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 6960 ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 7020 gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc 7080 tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 7140 catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct 7200 ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga attggtcgac caattctcat 7260 gtttgacagc ttatcatcga taagct 7286

【００７８】<210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 gtttgaattc atgaaygayg gnaaygg 27

【００７９】<210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 gtttgaattc yrytggggnc aygc 24

【００８０】<210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 gtttgaattc acyttnggrt cncgraa 27

【００８１】<210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 gatgggtaaa actagtatga acca 24

【００８２】<210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 ttgcgaatta ctagtctccc aca 23

【００８３】<210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 gggactagtt agtccgcgaa atcgagatg 29

【００８４】<210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 gaggaattct gataccattg ccattgtagc aaatcttcaa ag 42

【００８５】<210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 aaagctagcc attgtagcaa atcttcaaag 30

【００８６】<210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 atggctagca agggcgagga gctgttc 27

【００８７】<210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 cccaagctta cttgtacagc tcgtcca 27

【００８８】<210> 13 <211> 7938 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 agcttgaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt 60 tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 120 tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 180 tgtatcttat catgtctgga tcgatcccgg caggttgggc gtcgcttggt cggtcatttc 240 gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc 300 gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc 360 tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc 420 cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag 480 gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg 540 aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga 600 ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg 660 caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc 720 tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc 780 cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg 840 gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg 900 gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag 960 cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga 1020 gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga 1080 tcagatccgg gacctgaaat aaaagacaaa aagactaaac ttaccagtta actttctggt 1140 ttttcagttc ctcgaggagc tttttgcaaa agcctaggcc tccaaaaaag cctcctcact 1200 acttctggaa tagctcagag gccgaggcgg cctcggcctc tgcataaata aaaaaaatta 1260 gtcagccatg gggcggagaa tgggcggaac tgggcggagt taggggcggg atgggcggag 1320 ttaggggcgg gactatggtt gctgactaat tgagatgcat gctttgcata cttctgcctg 1380 ctggggagcc tggggacttt ccacacctgg ttgctgacta attgagatgc atgctttgca 1440 tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacaccc taactgacac acattccaca 1500 ggacattgat tattgactag ttagtccgcg aaatcgagat gctttgaaga ttaaaattaa 1560 atttaatttt atgcgagact ggtttcctta ttttttgtat agtcgcatgc aagcgaggtt 1620 cgcataattt ggaaaataaa ggtagtcaag aagacgttga attaaggctg cagtttcaaa 1680 gtactctaca aacgattcct tttaaaaaaa aagattcaaa aaaaaggcaa agggtttaag 1740 taatgcttgt tatttcaatt tacctccaaa cagttactaa tgcaattgca aaaaaaaaac 1800 ctacctattg aatcaaaatt tctagcccat ccatcgctcc tcaagataaa ggaatcgata 1860 ttttgagttt aagggagttg ctgatagatt tcagaattaa aaatttttgg aaaaggatgt 1920 cgagaacaag aagatacgtc tagattgctg atgatgcatt ctagcagacg gaaatacaac 1980 gatatgtgga cagcacgact tttgatccgt tcggatcaaa aggaagagaa atatccatct 2040 ttcaagaaga atgcaggaaa agcaataaat gcccatttga ttcctaaatt atccccaaaa 2100 atgaacatta tgagatcttc ttgtgggaga caggaaattt cgcaattcca aacgaaaatt 2160 cggctctttt ttttacccca cagttgcggg gtaaatgatg taacggacct tgggggaaag 2220 gatgatgagt tagttgggaa gcggaaaaaa tggaaaacgg aagtaagaat agaaaccagt 2280 atggctgagt gcaatggcgg aaaagatttt acagagatga caagaatcta tttatctata 2340 aggaaaaact ttttccaaat ttgtctaaaa acgcattctc ctcaattgcc tctaggtaga 2400 tgatataacg aattggaacg agacatcgct aaccggtttt ctttgtaaat gacattttgt 2460 agtgggagta agtttgaatg gagggataga cagatgaata gtatgagata gaagaatagt 2520 atatataatg attaagatga acaaataaaa attgaaagaa aaaagaaatt gttggctcat 2580 ttggttcata cacatgttgg ttcatacaac ttttacccat cgtaagtatt ataagtaaaa 2640 aatagagtac gaaaagctat aagtagtgaa gcaaaaaaat agaaaaatag aaaaaaaaat 2700 atatataaaa aaatataata aaaataaaac tcataagaga cgtaaaacac aagaattgtc 2760 tatcatttgt tctttaagaa gcaccaccat tctgtaaaac tcttcatttc tcattagcaa 2820 ggaccctttt cattccttcc tctttagaat ccttttcatt ataacgaatt ggataatacg 2880 caaataagaa cacatcccct aaatacgata tatcgatcca ttttttactt tgcctagctt 2940 attgctgtac aattccattt aaatagtttc tcctcaagaa agatcgtcaa tggaggcgac 3000 aatataccgg aatttaagtt gcggacacag agcttgaaaa gactgcattt tgtattgttt 3060 tcaagtaaat gaaactgagt tttgaagtct caaaatacat cttatgtatt gaacattaga 3120 agaacatata agatagatct tgagagctca attcatcgac attctagcca tcatactgcg 3180 atcttagaca ttgtcagcac aaccttagat cgaaaatgaa cacgttacca aacgttgtct 3240 aaaacttgcc gaatcttatc tccgcattac ttccgtaatc cttagtacat acgctgcaat 3300 ttcggaaggt catgatcgac tttttgtgta gctataagtg acgcaaatga gaaacatgac 3360 aaggtgcgat atttagcaag atattatgca tttgatggag aaaggaaatt tcggatgtat 3420 atatagtacc gttagctgcg ctttttttgg tcatccataa ttttcaaact cactgctttc 3480 gatcagattt accgttttta aggtctttat tgctttgtga tctgtaggtt ggaacatcta 3540 tagttcattt tctaaaagat cctttcatcg tttcatcgga tagtaatcgt tcaagaaaaa 3600 aaaagaaaaa aagaaaaaga aaaagaaaag aaaaataaac cgctataatt cattacctat 3660 ttgactgaag gttcttcatc ttgaattgtt ttgaatcaaa ataaagaaat tattattatt 3720 attttttttc ttcgcttttt ctttatccat tcgtcgaaac tatttttctg ctgataaaag 3780 caatcattcc tttttcctgc ttctcttgtt attcgaattt taaacgactt tttttcctcg 3840 tccattccct aattctttgc gaccttttct gattctatcc ttggtttgta ctttcgttgt 3900 gtaattgttg agaaagtgaa ctgattattt aattgttgtg aaaaaaattc taaaactatt 3960 ttgtttttct tgatcattca tcctttgctc gcttgcttga atattacaga aattcgtctc 4020 cctttcaacg gaatatgata atttgttgaa tactctaaat caattaacac ctatcaaaag 4080 ctgaaacatt aaatctattc tcaccaaaaa aaaagactca agcttcttcg ttgttggccg 4140 gtctcttttt tgttttacga ttgttaaatt ttatactcac aactgccaat tctccacttt 4200 tgactattta ttgatagtcc ctatttaatt ttctgttcac cgattatcgt cttttttgta 4260 aataatcttt cttggaacca accaattaat acgttataat cgctaacttt gaagatttgc 4320 tacaatggct agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct 4380 ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac 4440 ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc 4500 caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat 4560 gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat 4620 cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac 4680 cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg 4740 gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa 4800 gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct 4860 cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa 4920 ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat 4980 ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa 5040 gtaagcttaa ataggaaagt ttcttcaaca ggattacagt gtagctacct acatgctgaa 5100 aaatatagcc tttaaatcat ttttatatta taactctgta taatagagat aagtccattt 5160 tttaaaaatg ttttccccaa accataaaac cctatacaag ttgttctagt aacaatacat 5220 gagaaagatg tctatgtagc tgaaaataaa atgacgtcac aagacaaaaa aaaaaaaaaa 5280 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag taccttctga 5340 ggcggaaaga accagccgga tccagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc 5400 acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta 5460 tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg 5520 tttcaggttc agggggaggt gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt 5580 ggtatggctg attatgatcc ggctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct 5640 gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac 5700 aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt 5760 cacgtagcga tagcggagtg tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact 5820 gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat 5880 caggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 5940 agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 6000 aggaaagaat gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 6060 gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 6120 aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 6180 gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 6240 ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 6300 cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 6360 ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 6420 actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 6480 tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 6540 gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 6600 ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 6660 cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 6720 ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 6780 tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 6840 agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 6900 gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 6960 ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 7020 gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 7080 cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 7140 gcaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 7200 cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 7260 cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 7320 ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 7380 tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 7440 acacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 7500 tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 7560 actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 7620 aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 7680 ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 7740 ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 7800 cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat 7860 aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcaa gaattggtcg accaattctc atgtttgaca 7920 gcttatcatc gataagct 7938

【００８９】<210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 gggactagtt agtccgcgaa atcgagatg 29

【００９０】<210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 gaggaattct gataccattg ccattgtagc aaatcttcaa ag 42

【図面の簡単な説明】

【図１】ｉｎｖ１⁺、シュワニオミセス・オキシデンタ
リスのインベルターゼ遺伝子、出芽酵母のＳＵＣ２のア
ミノ酸配列（部分）の比較を示す図である。

【図２】ｉｎｖ１⁺遺伝子の制限酵素地図を示す。

【図３】ｉｎｖ１⁺遺伝子破壊を示す電気泳動図であ
る。

【図４】図４（ａ）はゲルオーバーレイアッセイによる
インベルターゼ活性を示すコロニーの図面代用写真（生
物の形態）である。図４（ｂ）は図４（ａ）に示すイン
ベルターゼ活性の解析を示す模式図である。

【図５】図５（ａ）はコロニーの形態を示す図面代用写
真（生物の形態）である。図５（ｂ）は図５（ａ）に示
すインベルターゼ活性の解析を示す模式図である。

【図６】インベルターゼ活性とグルコース濃度の関係を
示すグラフである。

【図７】インベルターゼ活性とグルコース濃度の関係を
示すグラフである。

【図８】インベルターゼプロモータの解析図である。

【図９】誘導発現ベクターｐＲＩ０Ｍの構築図である。

【図１０】緑色螢光タンパク質誘導発現ベクターｐＲＩ
０ＥＧＦＰの構築図である。

【図１１】図１１（ａ）、図１１（ｂ）は、それぞれ緑
色蛍光タンパク質の発現解析図である。

【図１２】図１２（ａ）、図１２（ｂ）は、それぞれ培
養時間と緑色蛍光タンパク質の発現との関係を示すグラ
フである。

【図１３】図１３（ａ）、図１３（ｂ）は、それぞれ培
養時間と緑色蛍光タンパク質の発現との関係を示すグラ
フである。

【図１４】図１４（ａ）、図１４（ｂ）は、それぞれ培
養時間と緑色蛍光タンパク質の発現との関係を示すグラ
フである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/30 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Sc
   hizosaccharomyces pombe）のインベルターゼ遺伝子中
   のカタボイライト抑制に関与している遺伝子領域のＤＮ
   Ａ。
2. 【請求項２】配列表の配列番号１の塩基番号第１番〜第
   ２８０９番の塩基配列で表されるＤＮＡ。
3. 【請求項３】請求項１または２記載のＤＮＡ配列を含む
   組換えベクター。
4. 【請求項４】請求項１または２記載のＤＮＡ配列とマル
   チクローニングサイトとを含むマルチクローニングベク
   ター。
5. 【請求項５】図９のベクター構築図で表されるマルチク
   ローニングベクター。
6. 【請求項６】請求項１または２のＤＮＡ配列と異種タン
   パク質構造遺伝子とを含む、分裂酵母シゾサッカロミセ
   ス・ポンベ（S. pombe）の形質転換用の発現ベクター。
7. 【請求項７】請求項６の発現ベクターを含む、分裂酵母
   シゾサッカロミセス・ポンベ（S. pombe）からなる形質
   転換体。
8. 【請求項８】請求項７の形質転換体を培養し、発現され
   た異種タンパク質を採取することを特徴とするタンパク
   質の生産方法。