KR20230109353A - 유전자 침묵문제를 극복한 신규 유전자 발현유도 스위치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 본 발명은 숙주 세포에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 시스템으로서, 상기 숙주세포는 (i) DNA-결합 도메인; (ii) 전사활성 도메인; 및 (iii) 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인; 을 포함하는 엑디손 수용체 복합체 드라이버, (i) 상기 DNA 결합 도메인에 결합할 수 있는 반응 요소; 및 (iii) 표적 유전자; 를 포함하는 이펙터로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 유도 시스템을 제공함으로써 Gal4-UAS 기반 시스템의 문제점을 극복하여 유전자 침묵 문제와 세포독성으로부터 자유로운 유전자 발현 유도 시스템을 제공함으로써 난치성 질환의 치료기전 및 치료제에 대한 연구에 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 유전자 침묵문제를 극복한 신규 유전자 발현유도 스위치에 관한 것이다.
난치성 질환의 치료기전 및 치료제에 대한 연구는 동물세포실험과 실험동물 연구로부터 시작된다. 따라서 난치병 치료제 개발을 위해서는 완성도 높은 질환동물모델 구축 과정이 필수적이다. 특히, 특정 질환을 표적할 수 있는 유전자 치료를 위한 유전자 발현 유도 시스템으로서의 동물모델은 그 적용 범위가 매우 넓다.
난치성 질환을 모사할 수 있는 동물모델로 꼬마선충, 초파리, 제브라피쉬 등이 연구되고 있으며, 이 중, 제브라피쉬(Zebrafish)는 척추동물의 발생 및 유전자 기능연구에 탁월한 장점을 가지고 있는 모델동물이다. 제브라피쉬는 인체의 유전자와 크기와 수가 비슷하고 유전자 및 단백질간의 상동성이 매우 높으며, 신경계 및 각종 기관형성 과정이 사람과 매우 유사하다. 또한 척추동물로서, 인간유전체 기능연구를 위한 모델동물로서 사용될 수 있으며, 선충이나 초파리처럼 세포생물학적인 실험이나 대규모 유전학적인 연구가 가능하다.
GAL4-UAS 시스템은 1988년 Hitoshi Kakidani 등에 의하여 초파리에서 개발된 유전자 발현 유도 시스템으로, 효모 전사 활성제 단백질 Gal4를 인코딩 하는 Gal4 유전자와 유전자 전사를 활성화하기 위해 GAL4가 특이적으로 결합하는 인핸서인 UAS(Upstream Activation Sequence)의 두 부분으로 구성되는 이원적 전사유도 시스템(binary trans-activation system)이다. GAL4는 UAS 영역에 결합하여 UAS 인근의 모든 유전자를 발현시킬 수 있기 때문에 UAS 뒤에 원하는 유전자를 연결하면 GAL4를 통해 그 유전자를 발현시킬 수 있으며, GFP를 유전자에 붙여 GAL4가 발현되는 세포의 분포양상을 관찰할 수 있다. 대부분의 세포에서는 해당 세포가 GAL4를 생성하지 않기 때문에 아무 일도 일어나지 않으나, GAL4를 생산하는 세포에서는 UAS가 활성화되고 그 옆에 있는 유전자가 켜지고 생성된 단백질을 생산하게된다. 이를 위하여 GAL4 driver 초파리와 UAS effector 초파리를 제작한 후 교배시켜 activator와 타겟을 모두 갖는 자손을 얻어 분석한다. 특히, 적절한 자극 입력을 통하여 이식유전자를 발현시킬 수 있다. 이때 자극은 열 충격, 중금속 또는 호르몬과 같은 화학적인 스트레스일 수 있다. 그러나 Gal4-UAS 시스템은 유전자 이식이 적용된 조직에서 세포독성을 나타내거나, UAS가 척추동물의 후속 세대에서 침묵되는 단점을 갖고 있다. 특히 UAS 인핸서에 존재하는 CpG 부위에서 DNA 메틸화가 발생하면서, 개체의 세대가 거듭될수록 유전자 발현이 불활성화 되는 치명적인 유전자 침묵현상이 나타나게 된다.
이에 따라 Gal4-UAS 기반 시스템의 문제점을 극복하고, 세포독성이 적으면서도 유전자 침묵문제를 극복할 수 있는 새로운 이식 유전자 동물모델의 확립이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 유전자 침묵문제를 극복한 신규 유전자 발현유도 스위치를 제공하는 데 있다.
본 발명은 유전자 침묵문제를 극복한 신규 유전자 발현유도 스위치를 제공한다.
본 발명은 숙주 세포에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 시스템으로서, 상기 숙주세포는
(i) DNA-결합 도메인;
(ii) 전사활성 도메인; 및
(iii) 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인;
을 포함하는 엑디손 수용체 복합체 드라이버,
(i) 상기 DNA 결합 도메인에 결합할 수 있는 반응 요소; 및
(iii) 표적 유전자;
를 포함하는 이펙터로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 유도 시스템을 제공한다. 본 발명에 따른 유전자 발현 유도 시스템은 유전자 침묵 문제를 극복하고 독성이 없어 안전하고 정교하게 이식 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
상기 DNA-결합 도메인은 바람직하게는 전사 과정을 조절하는 전사 인자로, QFDBD(QF DNA binding domain)일 수 있으며, 상기 QFDBD는 이펙터의 QUAS 부위와 결합하여 다운스트림의 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 상기 전사활성 도메인은 활성화도메인(activating domain, AD), minimal 활성화도메인, 중간도메인(middle domain), VP16, VP16 2반복체, VP16 3반복체, VP16 4반복체 등을 포함할 수 있다.
상기 유전자 발현 유도 시스템은 숙주세포의 외부에서 공급하는 엑디손 수용체 리간드의 농도에 따라 발현양이 조절되는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 유도 시스템이다.
상기 엑디손 수용체 리간드는 엑디손 또는 엑디손 길항제인 테부페노자이드(tebufenozide, Teb)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 엑디손 수용체와 결합하여 활성화시킴으로써, 엑디손 수용체 복합체의 세포 내 위치를 변경할 수 있는 리간드이면 제한되지 않는다.
상기 드라이버는 숙주세포 내에 드라이버의 유무 또는 발현을 확인할 수 있는 리포터 단백질을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 이펙터는 상기 DNA 결합 도메인에 결합할 수 있는 반응 요소로 QUAS 반복서열을 포함한다. 구체적으로는 QUAS 서열은 5x, 9x, 13x 및 17x일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더욱 구체적으로 상기 QUAS 반복서열을 포함하는 이펙터는 서열 번호 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 이펙터는 숙주세포 내에 발현을 목적으로 하는 표적 유전자를 더 포함할 수 있다. 상기 표적유전자는 예를 들어 BRAFV600E, laminAΔ37, brafV610E 등이 될 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. 더욱 구체적으로는 QUAS 서열은 상기 QUAS 반복서열을 포함하는 이펙터는 서열 번호 5 내지 8로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 염기서열을 포함할 수 있다.
| 서열번호 | 구성 | 염기서열 |
| 1 | 5xQUAS | GGGTAATCGCTTATCCTCGGATAAACAATTATCCTCACGGGTAATCGCTTATCCGCTCGGGTAATCGCTTATCCTCGGGTAATCGCTTATCC |
| 2 | 9xQUAS | GGGTAATCGCTTATCCTCGGATAAACAATTATCCTCACGGGTAATCGCTTATCCGCTCGGGTAATCGCTTATCCTCTCGGGTAATCGCTTATCCTCGGATAAACAATTATCCTCACGGGTAATCGCTTATCCGCTCGGGTAATCGCTTATCCTCGGGTAATCGCTTATCC |
| 3 | 13xQUAS | GGGTAATCGCTTATCCTCGGATAAACAATTATCCTCACGGGTAATCGCTTATCCGCTCGGGTAATCGCTTATCCTCGGGTAATCGCTTATCCTCGGGTAATCGCTTATCCTCGGATAAACAATTATCCTCACGGGTAATCGCTTATCCGCTCGGGTAATCGCTTATCCTCGGATAAACAATTATCCTCACGGGTAATCGCTTATCCGCTCGGGTAATCGCTTATCCTCGGGTAATCGCTTATCC |
| 4 | 17xQUAS | GGGTAATCGCTTATCCTCGGATAAACAATTATCCTCACGGGTAATCGCTTATCCGCTCGGGTAATCGCTTATCCTCGGGTAATCGCTTATCCTCGGGTAATCGCTTATCCTCGGGTAATCGCTTATCCTCGGATAAACAATTATCCTCACGGGTAATCGCTTATCCGCTCGGGTAATCGCTTATCCTCGGATAAACAATTATCCTCACGGGTAATCGCTTATCCGCTCGGGTAATCGCTTATCCTCGGATAAACAATTATCCTCACGGGTAATCGCTTATCCGCTCGGGTAATCGCTTATCCTCGGGTAATCGCTTATCCTT |
본 발명에서 상기 드라이버는 QF DNA 결합부위(QFDBD), 최소 전사활성 도메인(AD*), minimal Vp16 및 엑디손 수용체(EcR)를 포함하는 복합체일 수 있다. 상기 최소 전사 활성 도메인(AD*)은 2반복 서열로 구성될 수 있다. 상기 드라이버는 구체적으로 서열 번호 9 또는 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 유전자에 의하여 암호화될 수 있다.
본 발명은 상기 이펙터 염기서열 또는 상기 드라이버를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 이펙터 염기서열 또는 상기 드라이버를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터는 하기 표 2와 같은 구성으로 제작될 수 있다.
| 구분 | 플라스미드 구성 | 서열번호 |
|
Effector |
p5xQUAS-ZsGreen-P2A, α-cry:mCherry | 5 |
| p9xQUAS-ZsGreen-P2A, α-cry:mCherry | 6 | |
| p13xQUAS-ZsGreen-P2A, α-cry:mCherry | 7 | |
| p17xQUAS-Luciferase, α-cry:mCherry | 8 | |
| p5xQUAS-ZsGreen-P2A, α-cry:EGFP | ||
| p10xUAS-ZsGreen-P2A, α-cry:EGFP | ||
| p10xUAS-ZsGreen-P2A, α-cry:mCherry | ||
| p10xUAS-ZsGreen-P2A-Braf V610E, α-cry:EGFP | ||
| p5xQUAS-ZsGreen-P2A-BRAF V600E, α-cry:EGFP | ||
| p5xQUAS-ZsGreen-P2A-BRAF V600E, α-cry:mCherry | ||
| p5xQUAS-ZsGreen-P2A-laminAΔ37, α-cry:EGFP | ||
| p5xQUAS-mCherry, α-cry:mCherry | ||
| p9xQUAS-mCherry, α-cry:mCherry | ||
| p13xQUAS-mCherry, α-cry:mCherry | ||
| p5xQUAS-MCS, α-cry:mCherry | ||
| p9xQUAS-MCS, α-cry:mCherry | ||
| p13xQUAS-MCS, α-cry:mCherry | ||
|
Driver |
pQFDBD-2xAD*-VP16*-EcR, α-cry:EGFP | 9 |
| QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR | 10 | |
| pQFDBD-AD*-MD-AD-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pQFDBD-AD-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pQFDBD-2xAD*-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pQFDBD-AD*-2xVP16*-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pQFDBD-AD*-VP16-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pQFDBD-AD*-VP16*-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pQFDBD-AD*-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pQFDBD-VP16*-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pQFDBD-2xAD*-2x VP16*-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pQFDBD-3xAD*-VP16*-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pQFDBD-2xAD*-VP32-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pQFDBD-2xAD*-VP64-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pubb-QFDBD-AD*-MD-AD-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pubb-QFDBD-AD-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pubb-QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pubb-QFDBD-2xAD*-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pubb-QFDBD-AD*-2xVP16*-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pubb-QFDBD-AD*-VP16-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pubb-QFDBD-AD*-VP16*-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pubb-QFDBD-AD*-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pubb-QFDBD-VP16*-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pubb-QFDBD-2xAD*-2xVP16*-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pubb-QFDBD-3xAD*-VP16*-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pubb-QFDBD-2xAD*-VP32-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pubb-QFDBD-2xAD*-VP64-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pelav3-QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pQFDBD-2xAD*-VP16*, α-cry:EGFP | 11 | |
| QFDBD-2xAD*-VP16* | 12 | |
| pQFDBD-AD*-MD-AD, α-cry:EGFP | ||
| pQFDBD-AD, α-cry:EGFP | ||
| pubb-QFDBD-AD*-MD-AD, α-cry:EGFP | ||
| pubb-QFDBD-AD, α-cry:EGFP | ||
| pubb-QFDBD-2xAD*-VP16*, α-cry:EGFP | ||
| pelav3-QFDBD-2xAD*-VP16*, α-cry:EGFP | ||
| pQFDBD-Gal4AD, α-cry:EGFP | ||
| pQFDBD-Gal4AD-EcR, α-cry:EGFP | ||
| pubb-QFDBD-Gal4AD, α-cry:EGFP | ||
| pubb-QFDBD-Gal4AD-EcR, α-cry:EGFP | ||
| Backbone plasmid | pKY64-miniTol2-opt-CRY-eGFP | |
| 바이너리 IQ-Switch 형질전환을 위한 플라스미드 구조. 모든 이펙터 및 드라이버 플라스미드는 pKY64-miniTol2-opt-CRY-eGFP로 지정된 단일 백본 플라스미드를 기반으로 생성되었습니다. | ||
본 발명은 QUAS 반복서열을 포함하며 서열 번호 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 이펙터 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 표 2에 기재된 요소로 구성된 이펙터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 이펙터는 QUAS 반복서열, ZsGreen, mCherry, Luciferase 및 P2A 요소를 포함하여 구성될 수 있다. 상기 이펙터의 QUAS 반복서열은 5xQUAS 내지 17xQUAS 반복서열일 수 있으며, 바람직하게는 5xQUAS, 9xQUAS, 13xQUAS 또는 17xQUAS이며, 더욱 바람직하게는 9xQUAS 또는 13xQUAS이며, 가장 바람직하게는 13xQUAS이다.
본 발명은 QUAS 반복서열 및 리포터 유전자를 포함하는 상기 서열번호 5 내지 8로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 이펙터 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 QUAS 반복서열에 의하여 발현이 조절되는 표적 유전자를 더 포함하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 상기 QUAS 반복서열에 의하여 발현이 조절되는 표적 유전자는 BRAFV600E, laminAΔ37, brafV610E 일 수 있다.
본 발명은 DNA-결합 도메인, 전사활성 도메인 및 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 복합체를 암호화하는 드라이버 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명에 따른 드라이버 염기서열은 상기 표 2에 기재된 요소로 구성된 드라이버를 암호화하는 염기서열을 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로는 서열번호 9 또는 서열번호 10의 드라이버 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 표 2에 제공된 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공하며, 상기 형질전환된 세포는 원핵생물 또는 진핵생물의 세포를 포함한다. 상기 형질전환된 세포는 포유류 세포일 수 있으며, 제브라피쉬의 생식세포 또는 체세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 발현 유도 시스템으로 형질전환된 제브라피쉬를 제공한다. 상기 형질전환된 제브라피쉬는 상기 서열번호 1 내지 10로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 유전자 발현 유도 시스템으로 형질전환된 제브라피쉬는 하기 표 3의 드라이버 라인 또는 이펙터 라인일 수 있다.
|
Driver
/ Effector |
Transgenic animals |
|
Driver line |
Tg ( ubb:QFDBD - 2xAD *-VP16- EcR , α- cry:EGFP ) |
| Tg ( ubb:QFDBD - 2xAD *-VP16, α- cry:EGFP ) | |
| Tg ( ubb:QFDBD -AD*-MD-AD- EcR , α- cry:EGFP )* | |
| Tg ( ubb:QFDBD -AD- EcR , α- cry:EGFP )* | |
| Tg ( elavl3:QFDBD - 2xAD *-VP16- EcR , α- cry:EGFP ) | |
| Tg ( ubb:Gal4DBD -VP16*- EcR , α- cry:EGFP ) | |
|
Effector line |
Tg ( 5xQUAS:ZsGreen - P2A , α- cry:mCherry ) |
| Tg ( 9xQUAS:ZsGreen - P2A , α- cry:mCherry ) | |
| Tg ( 13xQUAS:ZsGreen - P2A , α- cry:mCherry ) | |
| Tg ( 5xQUAS:ZsGreen - P2A - BRAF V600E , α- cry:mCherry ) | |
| Tg ( 5xQUAS:ZsGreen - P2A - laminA Δ37 , α- cry:EGFP ) | |
| Tg ( 10xUAS:ZsGreen - P2A - braf V610E , α- cry:EGFP ) |
본 발명의 일측면에 의하면 본 발명에 따른 형질전환된 제브라피쉬는 외부 자극 인자의 유무 및 농도에 따라 이식 유전자의 발현이 정교하게 조절될 수 있다.
본 발명의 일측면에 의하면 본 발명에 따른 형질전환된 제브라피쉬는 외부 자극 인자 없이 따라 이식 유전자가 발현될 수 있다.
본 발명은 숙주 세포에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법으로서, 상기 숙주세포에
(i) DNA-결합 도메인;
(ii) 전사활성 도메인; 및
(iii) 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인;
을 포함하는 엑디손 수용체 복합체 드라이버를 도입하는 단계(A);
(i) 상기 DNA 결합 도메인에 결합할 수 있는 반응 요소; 및
(iii) 표적 유전자;
를 포함하는 이펙터를 도입하는 단계(B);
상기 숙주세포에 엑디손 수용체 리간드를 도입하여 상기 표적 유전자의 발현을 조절하는 단계(C);를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 유도 방법을 제공한다.
본 발명은 숙주 세포에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 시스템으로서, 상기 숙주세포는
(i) DNA-결합 도메인;
(ii) 전사활성 도메인; 및
을 포함하는 드라이버,
(i) 상기 DNA 결합 도메인에 결합할 수 있는 반응 요소; 및
(ii) 표적 유전자;
를 포함하는 이펙터로 이루어지는 것을 특징으로 하는 영구 유전자 발현 유도 시스템을 제공한다.
상기 영구 유전자 발현 유도 시스템은 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인이 제거된 형태로 테부페노자이드 존재유무와 무관하게 타깃 유전자발현을 유도할 수 있는 드라이버를 포함하며, 이식유전자 유도를 위하여 외부 자극이 필요하지 않는 점에서 EQ-On(Everlasting QF transgene switch-On)드라이버로 명명하였다.
본 발명에서 상기 이펙터는 QUAS 반복서열을 포함하며 서열 번호 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 염기서열을 포함할 수 있다.
또한 본 발명에서 상기 드라이버는 서열 번호 11 또는 서열번호 12의 염기서열에 의하여 암호화되는 QF DNA 결합부위, 최소 전사활성 도메인 및 minimal Vp16 을 포함하는 복합체일 수 있다.
본 발명은 상기 영구 유전자 발현 유도 시스템으로 형질전환된 제브라피쉬를 제공한다.
본 발명은 QF DNA 결합부위, 최소 전사활성 도메인 및 Vp16를 포함하는 복합체를 암호화하는 서열 번호 11 또는 서열번호 12의 드라이버 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하며, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 상기 형질전환된 세포는 원핵생물 또는 진핵생물의 세포를 포함한다. 상기 형질전환된 세포는 포유류 세포일 수 있으며, 제브라피쉬의 생식세포 또는 체세포일 수 있다.
본 발명은 숙주 세포에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법으로서, 상기 숙주세포에
(i) DNA-결합 도메인;
(ii) 전사활성 도메인; 및
을 포함하는 드라이버를 도입하는 단계(A);
(i) 상기 DNA 결합 도메인에 결합할 수 있는 반응 요소; 및
(ii) 표적 유전자;
를 포함하는 이펙터를 도입하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 영구 유전자 발현 유도 방법을 제공한다.
본 발명은 Gal4-UAS 기반 시스템의 문제점을 극복하여 유전자 침묵 문제와 세포독성으로부터 자유로운 유전자 발현 유도 시스템을 제공함으로써 난치성 질환의 치료기전 및 치료제에 대한 연구에 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)의 모식도이다 (A) 외부 자극 인자가 없을 때 (B) 외부 자극 이자에 의하여 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)이 구동될 때
도 2는 드라이버의 독성을 비교한 결과이다. (a) QFDBD-2xAD*-VP16* 또는 QFDBD-Gal4AD10 mRNA를 배아에 압력 주입 후 30 hpf에서 독성관찰. *: 머리가 없는 표현형을 가진 배아. (b) 배아 형태는 30 hpf에서 정상(노란색), 기형(빨간색) 또는 사망(파란색)으로 분류. 스케일 바: 0.5mm
도 3은 포유동물 세포에서 QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR 또는 QFDBD-2xAD*-VP16* 드라이버의 Teb 투여에 따른 세포내 위치 변경을 나타낸 것이다. (a-r) HEK293 세포, 5xQUAS 이펙터, (a, c-j) QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR 드라이버, (b, k-r) QFDBD-2xAD*-VP16* 드라이버, (c-f, k-n) Teb(-) 조건, (g-j, o-r) Teb (+) 조건, (a’-r’) Cos7 세포, 13xQUAS 이펙터 (a’, c’-j’) QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR 드라이버, (b’, k’-r’) QFDBD-2xAD*-VP16* 드라이버, (c’-f’, k’-n’) Teb(-) 조건, (g’-j’, o’-r’) Teb (+) 조건. 약어: Teb; 테부페노자이드. 스케일 바: 100μm
도 4는 이식 유전자 자극 활성을 유지하면서 독성 및 누출에 대한 IQ-Switch 최적화를 보여주는 그림이다. (a) IQ-Switch의 최적화를 위해 테스트된 드라이버 및 이펙터 구성의 모식도. (b) IQ-Switch의 실행 메커니즘의 개략도 및 테부페노자이드 구조식 (c) Tebufenozide(Teb)의 존재(하늘색), 부존재(빨간색) 시, (a)의 이펙터 및 각 드라이버 플라스미드를 HEK293 cell에 형질감염 후 루시퍼레이즈 리포터 활성 결과. (d) Teb 농도에 따른 드라이버 3 및 이펙터의 루시퍼레이즈 리포터 활성 결과. (e) 본 발명에 따른 IQ-Switch의 가역성. (f) Teb의 존재(하늘색), 부존재(빨간색) 시, 드라이버 3 및 10의 루시퍼레이즈 리포터 활성 결과. (각 측정값은 3회 이상 측정됨)
도 5는 IQ-Switch의 활성은 QUAS 메틸화의 영향을 받지 않는 것을 나타낸 결과이다. (a) Tg(10xUAS:ZsGreen-P2A-brafV610E)의 F2 자손과 Tg(5xQUAS:ZsGreen-P2A-BRAFV600E)의 F4 자손으로부터 제조된 게놈 DNA의 이황산수소(bisulfite) 시퀀싱 분석. (b) (c)에서 ChIP 실험의 개략도. (c) 5xQUAS 인핸서 영역의 개략도(앰플리콘; 231bp) 및 항-Myc 및 항-Flag 항체(음성 대조군)를 사용한 배아의 ChIP 분석 결과. q-PCR은 3회 수행되었으며 평균의 표준 오차는 패널에 표시됨 (d) (e)의 드라이버 및 이펙터 교배 실험의 개략도. (e) QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR/5xQUAS의 통제 하에 있는 ZsGreen 리포터는 전체 배아(D1 + E1)에서 유비쿼터스 발현을 보인 반면, Gal4/10xUAS(D2 + E2)에 의해 구동될 때 동일한 리포터가 무작위 조직에서 활성화됨. Gal4에 의해 규제되는 10xUAS는 F2 세대부터 점진적으로 침묵됨(약어: Teb; 테부페노자이드. 스케일 바; 200μm.)
도 6은 본 발명에 따른 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)을 사용한 BRAF(V600E) 과발현 RASopathy disease 모델링 테스트 결과이다. (a) RASopathy disease 모델링 테스트의 실험 시간표. Tg (UBB : QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR, α-cry:EGFP)과 Tg (5xQUAS : ZsGreen-P2A-BRAFV600E, α-cry:mCherry)의 유전적 교배에 저용량 Teb (2.5 μM)을 36hpf에서 60hpf까지 처리함. 15μM의 Vemurafenib을 36hpf에서 72hpf까지 처리하고 살아있는 배아를 72hpf에서 형광현미경으로 관찰. Vemurafenib 화학구조를 아래에 표시 (b-u) 수정체의 녹색 형광은 드라이버 카세트의 존재를, 빨간색은 게놈 내의 이펙터 5xQUAS:ZsGreen-P2A-BRAFV600E 이식유전자의 존재를 나타냄. (b-f) DMSO 운반체 처리. (g-k) 15 μM의 vemurafenib 단독 처리. (l-p) 2.5 μM의 Teb 단독 처리. 배아 전체 조직에서 ZsGreen 리포터 발현. (q-u) Teb(2.5 μM) 및 vemurafenib(15 μM)에 동시 처리. Teb 단독과 유사하게 모든 조직에서 녹색 형광이 검출됨. (v) 배아 기형에 따라 세 그룹(심함:빨강, 약한기형:초록, 정상:파랑)으로 분류됨 (w) 각 군의 배아 기형수를 비교한 그래프. n은 분석된 배아의 수, Teb; 테부페노자이드, Vem; 베무라페닙. 스케일 바; 150μm.
도 7은 다양한 수의 QUAS 요소를 인코딩하는 이펙터 카세트의 인핸서 영역의 서열 정보. 5xQUAS는 qa-1F-qa-1S 변이체(굵은 빨간색)의 단일 사본이 첫 번째 qa-2(굵은 검은색) 바로 뒤에 있는 QUAS의 16bp 길이의 5개의 직렬 반복의 원래 구성을 나타냄. 9x, 13x 및 17x QUAS에는 각각 2, 3 및 4와 같은 다른 수의 qa-1F-qa-1S 변형이 포함되며, Zebrafish βactin 최소 프로모터는 굵은 녹색 유형으로 표시됨.
도 8은 본 발명에 따른 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)의 단계적 이식유전자 과발현을 위한 QUAS 반복의 최적화를 나타낸 것이다. (a) 드라이버 및 이펙터 구성의 개략도. (b) (a)의 드라이버 및 이펙터 조합으로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포에서 측정된 루시퍼레이즈 활성, (c) 4시간 동안 10 μM의 Teb에 노출된 3dpf에서 배아의 대표적인 Z-스태킹 이미지. (d) (c)의 뇌 및 근육의 형광강도를 정량화한 그래프.
도 9는 본 발명에 따른 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)의 QUAS 요소의 반복수에 따른 배아의 Teb 반응성 평가를 나타낸 것이다. (a) F3 Tg(ubb:QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR)와 F2 Tg(5xQUAS:ZsGreen-P2A), Tg(9xQUAS:ZsGreen-P2A) 및 Tg(13xQUAS:ZsGreen-P2A) 각각 간의 유전적 교배에서 얻은 유충의 수정 후 1일 째(1 dpf) 10 μM의 Teb를 24시간 동안 투여한 후 anti-ZsGreen 항체를 이용한 western blot. α-액틴을 로딩 대조군으로 사용. (b) (a) 밴드를 정량화하여 α-actin으로 표준화한 그래프.
도 10은 EcR이 없는 드라이버 구성(EQ-On 드라이버)을 갖는 3개의 각각 배아의 6 hpf에서 공초점 현미경 이미지. (a) F2 암컷 Tg(ubb:QFDBD-2xAD*-VP16*)와 F2 수컷 Tg(5xQUAS:ZsGreen-P2A-laminAΔ37) 간의 유전적 교배. (b) F2 수컷 Tg(ubb:QFDBD2xAD*-VP16*)와 F2 암컷 Tg(5xQUAS:ZsGreen-P2A-lamin AΔ37) 간의 유전적 교배. 스케일 바: 200μm.
도 11은 본 발명에 따른 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)의 조직 특이적 활성화 방법을 나타내는 결과이다. 개별 세포 유형에 따라 특이적 프로모터를 사용함. (a) elavl3 프로모터 및 다양한 반복수의 QUAS를 포함하는 각 이펙터의 제어 하에 있는 드라이버의 개략도. 드라이버 구축물에는 ubb 프로모터 대신 8.7 kb의 elavl3 프로모터가 장착됨. Teb(50 μM)는 5dpf에서 영상화하기 전에 48시간 동안 투여됨. (b) 표시된 F2 이펙터 라인과 F1 Tg(elavl3:QFDBD-2xAD*-VP16-EcR)의 유전적 교배. (c) 표시된 F2 이펙터 라인과 F1 Tg(elavl3:QFDBD-2xAD*-VP16*)의 유전적 교배. 약어: Teb; 테부페노자이드. 스케일 바: 200μm.
도 12는 본 발명에 따른 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)을 이용한 감각 뉴런 발달 추적을 나타낸 것이다. (a) 표시된 발달 단계에서 배아의 대표적인 이미지. F2 Tg(elavl3:QFDBD-2xAD*-VP16*)와 5x 또는 13xQUAS 조절 ZsGreen 리포터 유전자를 갖는 F3 이펙터 라인 사이의 유전적 교배에서 얻음. (b) (a) 5x 및 13xQUAS-ZsGreen 그룹의 배경 형광 강도를 평준화하는 데 사용되는 영역. 약어: AU; 임의의 단위, ns; not significance, Teb; 테부페노자이드. 스케일 바: 200μm.
도 2는 드라이버의 독성을 비교한 결과이다. (a) QFDBD-2xAD*-VP16* 또는 QFDBD-Gal4AD10 mRNA를 배아에 압력 주입 후 30 hpf에서 독성관찰. *: 머리가 없는 표현형을 가진 배아. (b) 배아 형태는 30 hpf에서 정상(노란색), 기형(빨간색) 또는 사망(파란색)으로 분류. 스케일 바: 0.5mm
도 3은 포유동물 세포에서 QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR 또는 QFDBD-2xAD*-VP16* 드라이버의 Teb 투여에 따른 세포내 위치 변경을 나타낸 것이다. (a-r) HEK293 세포, 5xQUAS 이펙터, (a, c-j) QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR 드라이버, (b, k-r) QFDBD-2xAD*-VP16* 드라이버, (c-f, k-n) Teb(-) 조건, (g-j, o-r) Teb (+) 조건, (a’-r’) Cos7 세포, 13xQUAS 이펙터 (a’, c’-j’) QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR 드라이버, (b’, k’-r’) QFDBD-2xAD*-VP16* 드라이버, (c’-f’, k’-n’) Teb(-) 조건, (g’-j’, o’-r’) Teb (+) 조건. 약어: Teb; 테부페노자이드. 스케일 바: 100μm
도 4는 이식 유전자 자극 활성을 유지하면서 독성 및 누출에 대한 IQ-Switch 최적화를 보여주는 그림이다. (a) IQ-Switch의 최적화를 위해 테스트된 드라이버 및 이펙터 구성의 모식도. (b) IQ-Switch의 실행 메커니즘의 개략도 및 테부페노자이드 구조식 (c) Tebufenozide(Teb)의 존재(하늘색), 부존재(빨간색) 시, (a)의 이펙터 및 각 드라이버 플라스미드를 HEK293 cell에 형질감염 후 루시퍼레이즈 리포터 활성 결과. (d) Teb 농도에 따른 드라이버 3 및 이펙터의 루시퍼레이즈 리포터 활성 결과. (e) 본 발명에 따른 IQ-Switch의 가역성. (f) Teb의 존재(하늘색), 부존재(빨간색) 시, 드라이버 3 및 10의 루시퍼레이즈 리포터 활성 결과. (각 측정값은 3회 이상 측정됨)
도 5는 IQ-Switch의 활성은 QUAS 메틸화의 영향을 받지 않는 것을 나타낸 결과이다. (a) Tg(10xUAS:ZsGreen-P2A-brafV610E)의 F2 자손과 Tg(5xQUAS:ZsGreen-P2A-BRAFV600E)의 F4 자손으로부터 제조된 게놈 DNA의 이황산수소(bisulfite) 시퀀싱 분석. (b) (c)에서 ChIP 실험의 개략도. (c) 5xQUAS 인핸서 영역의 개략도(앰플리콘; 231bp) 및 항-Myc 및 항-Flag 항체(음성 대조군)를 사용한 배아의 ChIP 분석 결과. q-PCR은 3회 수행되었으며 평균의 표준 오차는 패널에 표시됨 (d) (e)의 드라이버 및 이펙터 교배 실험의 개략도. (e) QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR/5xQUAS의 통제 하에 있는 ZsGreen 리포터는 전체 배아(D1 + E1)에서 유비쿼터스 발현을 보인 반면, Gal4/10xUAS(D2 + E2)에 의해 구동될 때 동일한 리포터가 무작위 조직에서 활성화됨. Gal4에 의해 규제되는 10xUAS는 F2 세대부터 점진적으로 침묵됨(약어: Teb; 테부페노자이드. 스케일 바; 200μm.)
도 6은 본 발명에 따른 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)을 사용한 BRAF(V600E) 과발현 RASopathy disease 모델링 테스트 결과이다. (a) RASopathy disease 모델링 테스트의 실험 시간표. Tg (UBB : QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR, α-cry:EGFP)과 Tg (5xQUAS : ZsGreen-P2A-BRAFV600E, α-cry:mCherry)의 유전적 교배에 저용량 Teb (2.5 μM)을 36hpf에서 60hpf까지 처리함. 15μM의 Vemurafenib을 36hpf에서 72hpf까지 처리하고 살아있는 배아를 72hpf에서 형광현미경으로 관찰. Vemurafenib 화학구조를 아래에 표시 (b-u) 수정체의 녹색 형광은 드라이버 카세트의 존재를, 빨간색은 게놈 내의 이펙터 5xQUAS:ZsGreen-P2A-BRAFV600E 이식유전자의 존재를 나타냄. (b-f) DMSO 운반체 처리. (g-k) 15 μM의 vemurafenib 단독 처리. (l-p) 2.5 μM의 Teb 단독 처리. 배아 전체 조직에서 ZsGreen 리포터 발현. (q-u) Teb(2.5 μM) 및 vemurafenib(15 μM)에 동시 처리. Teb 단독과 유사하게 모든 조직에서 녹색 형광이 검출됨. (v) 배아 기형에 따라 세 그룹(심함:빨강, 약한기형:초록, 정상:파랑)으로 분류됨 (w) 각 군의 배아 기형수를 비교한 그래프. n은 분석된 배아의 수, Teb; 테부페노자이드, Vem; 베무라페닙. 스케일 바; 150μm.
도 7은 다양한 수의 QUAS 요소를 인코딩하는 이펙터 카세트의 인핸서 영역의 서열 정보. 5xQUAS는 qa-1F-qa-1S 변이체(굵은 빨간색)의 단일 사본이 첫 번째 qa-2(굵은 검은색) 바로 뒤에 있는 QUAS의 16bp 길이의 5개의 직렬 반복의 원래 구성을 나타냄. 9x, 13x 및 17x QUAS에는 각각 2, 3 및 4와 같은 다른 수의 qa-1F-qa-1S 변형이 포함되며, Zebrafish βactin 최소 프로모터는 굵은 녹색 유형으로 표시됨.
도 8은 본 발명에 따른 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)의 단계적 이식유전자 과발현을 위한 QUAS 반복의 최적화를 나타낸 것이다. (a) 드라이버 및 이펙터 구성의 개략도. (b) (a)의 드라이버 및 이펙터 조합으로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포에서 측정된 루시퍼레이즈 활성, (c) 4시간 동안 10 μM의 Teb에 노출된 3dpf에서 배아의 대표적인 Z-스태킹 이미지. (d) (c)의 뇌 및 근육의 형광강도를 정량화한 그래프.
도 9는 본 발명에 따른 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)의 QUAS 요소의 반복수에 따른 배아의 Teb 반응성 평가를 나타낸 것이다. (a) F3 Tg(ubb:QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR)와 F2 Tg(5xQUAS:ZsGreen-P2A), Tg(9xQUAS:ZsGreen-P2A) 및 Tg(13xQUAS:ZsGreen-P2A) 각각 간의 유전적 교배에서 얻은 유충의 수정 후 1일 째(1 dpf) 10 μM의 Teb를 24시간 동안 투여한 후 anti-ZsGreen 항체를 이용한 western blot. α-액틴을 로딩 대조군으로 사용. (b) (a) 밴드를 정량화하여 α-actin으로 표준화한 그래프.
도 10은 EcR이 없는 드라이버 구성(EQ-On 드라이버)을 갖는 3개의 각각 배아의 6 hpf에서 공초점 현미경 이미지. (a) F2 암컷 Tg(ubb:QFDBD-2xAD*-VP16*)와 F2 수컷 Tg(5xQUAS:ZsGreen-P2A-laminAΔ37) 간의 유전적 교배. (b) F2 수컷 Tg(ubb:QFDBD2xAD*-VP16*)와 F2 암컷 Tg(5xQUAS:ZsGreen-P2A-lamin AΔ37) 간의 유전적 교배. 스케일 바: 200μm.
도 11은 본 발명에 따른 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)의 조직 특이적 활성화 방법을 나타내는 결과이다. 개별 세포 유형에 따라 특이적 프로모터를 사용함. (a) elavl3 프로모터 및 다양한 반복수의 QUAS를 포함하는 각 이펙터의 제어 하에 있는 드라이버의 개략도. 드라이버 구축물에는 ubb 프로모터 대신 8.7 kb의 elavl3 프로모터가 장착됨. Teb(50 μM)는 5dpf에서 영상화하기 전에 48시간 동안 투여됨. (b) 표시된 F2 이펙터 라인과 F1 Tg(elavl3:QFDBD-2xAD*-VP16-EcR)의 유전적 교배. (c) 표시된 F2 이펙터 라인과 F1 Tg(elavl3:QFDBD-2xAD*-VP16*)의 유전적 교배. 약어: Teb; 테부페노자이드. 스케일 바: 200μm.
도 12는 본 발명에 따른 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)을 이용한 감각 뉴런 발달 추적을 나타낸 것이다. (a) 표시된 발달 단계에서 배아의 대표적인 이미지. F2 Tg(elavl3:QFDBD-2xAD*-VP16*)와 5x 또는 13xQUAS 조절 ZsGreen 리포터 유전자를 갖는 F3 이펙터 라인 사이의 유전적 교배에서 얻음. (b) (a) 5x 및 13xQUAS-ZsGreen 그룹의 배경 형광 강도를 평준화하는 데 사용되는 영역. 약어: AU; 임의의 단위, ns; not significance, Teb; 테부페노자이드. 스케일 바: 200μm.
본 발명은 유전자 침묵문제를 극복한 신규 유전자 발현유도 스위치(IQ-Switch)를 제공한다. 빵 곰팡이에서 유래한 Q-시스템(QF-QUAS)은 Gal4-UAS 시스템과 유사하게 살아있는 유기체에서 이식유전자를 발현할 수 있는 유전적 도구로, 전사활성인자(QF), 인핸서(QUAS), 억제인자(QS), 및 화학적 억제인자(quinic acid)로 구성된다. Q-시스템은 GAL4/UAS와 마찬가지로 driver에서 전사활성인자 QF가 발현되어 effector의 인핸서인 QUAS 영역에 결합하면 QUAS에 연결된 유전자를 발현시키는 이원 발현 시스템이다. 즉, QF 이식유전자와 QUAS 이식유전자를 모두 가진 자손은 세포의 하위 집합에서 리포터 유전자(GFP 등)를 발현시키게 된다. 이때, 억제인자 QS가 발현하게 되면 QF를 저해하여, QF가 발현되더라도 목적 유전자는 발현되지 않는다. 반면, 화학적 억제인자인 퀸산(quinic acid)은 억제인자 QS와 결합하여 QS의 QF 저해 활성을 억제하여, QUAS 이식유전자 발현을 유도한다. 이와 같이 QS와 퀸산은 Q-시스템이 유전자 발현을 보다 잘 조절할 수 있도록 해준다. 그러나, Q-시스템은 작동과정에서 독성을 나타내는 것이 알려져 있어, 안전하면서 보다 정교하게 이식유전자의 발현을 조절하는 이식 유전자 발현 시스템의 개발이 필요하다.
본 발명자들은, Q-시스템의 작동기작이 Gal4-UAS 시스템과 유사하지만 선행 연구결과의 DNA 메틸화로부터 자유롭다는 연구 결과로부터 유전자 발현 불확실성 문제를 보완할 수 있을 것으로 생각하고 연구를 수행하는 과정에서 본 발명을 안출하였다. 특히 외인성 화합물 의존 방식으로 표적 유전자의 발현 조절이 가능하도록 척추동물에게 무해한 곤충탈피호르몬 수용체(EcR)를 이용하였다.
이에 따라 본 발명의 IQ-스위치의 구동 기작을 도 1에 나타내었다. 본 발명에 따른 IQ-스위치의 EcR은 척추동물에게 무해한 ecdysone 호르몬 또는 ecdysone 길항제인 tebufenozide (Teb)와 결합한다. Teb가 존재하지 않을 경우, EcR은 세포질에만 존재하여 DNA에 결합할 수 없기 때문에 유전자 발현을 유도할 수 없는 반면, Teb 존재 시 EcR은 핵 내부로 이동하여 인핸서와 결합하고 표적 유전자 발현을 유도하게 된다. 이 과정은 Teb의 농도 의존적으로 이루어지기 때문에 이식 유전자의 발현을 매우 정교하게 조절할 수 있으며, 척추동물에서 세포독성을 나타내지 않으면서도 유전자 침묵 문제를 극복할 수 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
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실험예
1.
QF
-Driver의 제작>
제브라피쉬에서 트랜스유전자 자극 활성을 유지하면서 독성 및 누출을 억제할 수 있는 IQ-Switch를 확립하기 위하여 외인성 화학자극에 민감한 새로운 QF-드라이버를 제작하였다.
제브라피쉬에서 Q-시스템 기반의 유도 이식 유전자 발현 스위치(inducible transgene expression switches, ITES)를 구현하기 위하여 발명자들은 드라이버를 표 4와 같이 구성하고, 독성, 누출 및 Teb에 대한 민감성을 확인하였다.
(단, QFDBD:QF-DNA 결합 도메인, MD:중간 도메인, AD:전사 활성화 도메인, VP16:Hsv 단백질 vmw65, VP64: VP16의 4반복, EcR: 엑디손 수용체, (-) 측정되지 않음, (+/-) 측정되나 무시할 수 있는 수준, (+) 측정됨, (++) 중간정도, (+++) 높음, (++++) 더 높음, (+++++) 매우 높음)
드라이버 독성은 각 드라이버를 인코딩하는 mRNA를 시험관 내에서 전사시켜 1-2개의 세포 단계 배아에 압력 주입한 후, 30hpf(수정후 시간)에서 다양한 정도의 기형으로 표시하였다. QFDBD-2xAD*-VP16* 또는 QFDBD-Gal4AD10의 예시를 도 2에 나타내었다. 각 배아 형태는 30hpf에서 사망, 기형 또는 정상으로 분류하여 표 4에 나타내었다.
본 발명에 따른 IQ-스위치의 EcR가 척추동물에게 ecdysone 길항제인 tebufenozide (Teb)와 결합하여 핵 내부로 이동하는지를 확인하였다. HEK293 세포를 표시된 도 3a, 3b의 플라스미드 구조로 형질감염시킨 다음 24시간 동안 배양한 후, 공초점 이미지를 촬영하기 전에 10 μM의 Teb를 12시간 동안 세포 배양 배지에 첨가하였다. 이때 드라이버는 EGFP로 태그되었고 이펙터에는 5xQUAS의 제어하에 mCherry 리포터가 발현되도록 하였다. 도 3c 내지 3f에서 보는 바와 같이, Teb(-) 조건에서 드라이버는 세포질에만 국한되어 있으므로 이펙터를 자극할 수 없으나, Teb를 투여하는 경우, 드라이버가 핵으로 이동하고 mCherry 발현을 자극하였다(도면 3g-3j) 이에 반하여 EcR가 없는 드라이버(EQ-On)의 경우, Teb 자극에 관계없이 mCherry 리포터를 활성화하는 핵에 국한되었다(도 3k-3r). 5xQUAS 대신 13xQUAS를 인코딩하는 이펙터 플라스미드를 사용하여 Cos7 세포에서 (도 3a-3r)과 동일한 실험을 수행했다. Teb 자극 없이 Teb 결합 모듈과 EcR 도메인이 장착된 IQ-Switch의 드라이버는 세포질에만 위치하였으며, 드라이버 조절된 세포 국소화는 EcR 및 Teb 자극의 존재에 절대적으로 의존하는 것을 확인하였다.(도 3a'-3r')
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실험예
2.
QF
-Driver의 최적화>
제브라피쉬에서 트랜스유전자 자극 활성을 유지하면서 독성 및 누출을 억제할 수 있는 IQ-Switch를 확립하기 위하여 외인성 화학자극에 민감한 새로운 QF-드라이버를 제작하였다.
제브라피쉬에서 Q-시스템 기반의 유도 이식 유전자 발현 스위치(inducible transgene expression switches, ITES)를 구현하기 위한 최적 구성을 위하여 본 발명의 발명자들은 드라이버 및 이펙터 유전자를 도 4a와 같이 구성하였다.
QF는 N-말단에 DNA 결합 도메인(QFDBD), 중간 도메인(MD)의 N-말단 부분으로 간주되는 최소 활성화 도메인(AD*) 및 주요 전사 도메인(AD)으로 구성하였다(도 4a). 도 4b에는 드라이버(예시:드라이버 3) 및 이펙터의 IQ-Switch의 실행 메커니즘의 개략도를 나타내었으며, 좌측에 Teb(tebufenozide)의 화학구조를 나타내었다. 5xQUAS 인핸서 요소를 포함하는 동일한 이펙터 및 상기 드라이버 1 내지 10 각각의 드라이버 플라스미드를 HEK293 세포에 형질주입 시킨 후, 루시퍼레이즈 리포터 활성을 측정하고 그 결과를 도 4c에 나타내었다. 24시간 후, 10 μM의 Teb에 추가로 24시간 노출시키고, 루시퍼레이즈 리포터 활성을 측정하였다. Teb에 반응하는 루시퍼레이즈 리포터 활성은 하늘색으로 표시하였으며, 특정 인듀서 플라스미드에 의한 이펙터의 기저 누출은 적갈색으로 표시하였다. 표 4에는 드라이버 15종의 독성, 누출 및 Teb 민감도를 표시하였다.
도 4c에서 보는 바와 같이, 드라이버 2 및 6이 기저 누출이 있었으며, 드라이버 1, 2, 3, 5 6 및 7은 3이 Teb에 의하여 루시퍼레이즈 활성이 높게 발현되는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터 Teb 처리와 상관없이 독성을 나타내지 않으며 루시퍼라제 누출없이 Teb에 매우 잘 조절되는 드라이버 3을 선택하여 이후 실험에 사용하였다. 드라이버 3은 QFDBD, AD*의 2개의 직렬 반복과 최소(minimal) VP16 transactivator(VP16*) 및 EcR(QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR)로 구성되었다.
본 발명의 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)이 외부 조절인자에 의하여 조절 용이성을 확인하였다. 5xQUAS 인핸서 요소를 포함하는 이펙터 및 상기 드라이버 3을 HEK293 세포에 형질주입 시킨 HEK293 세포에 Teb 0 내지 50 μM을 투여하고 24시간 노출시킨 후 루시퍼레이즈의 발현을 측정하여 도 4d에 나타내었다. 도 4d에서 보는 바와 같이, 드라이버 3 및 이펙터를 이용한 이식 유전자 발현 시스템은 Teb 용량 의존적 방식으로 반응성을 나타내었다.
본 발명의 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)의 가역성을 확인하였다. 상기 드라이버 3(ubb:QFDBD - 2xAD * -VP16 * - EcR) 및 이펙터(5xQUAS:ZsGreen - P2A - lamin A Δ37 )로 형질전환 된 형질전환체(Tg)간 유전적 교배를 통해 자손 배아를 획득하고, 50 μM의 Teb를 사용하여 12hpf(hours post-fertilization)에 24시간 동안 배아에 처리하였다. 이 후, ZsGreen 양성 배아를 선택하여 Teb가 없는 조건에서 표시된 기간 동안 배양하고 RT-qPCR으로 ZsGreen의 mRNA 수준을 측정하여 도 4e에 나타내었다. 도 4e에서 보는 바와 같이, Teb가 없는 조건에서 배양시간에 따라 ZsGreen의 mRNA 수준이 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해 외부 조절인자 Teb 처리에 따라 유전자 발현이 가역적으로 조절되는 것을 확인하였다.
본 발명의 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)의 EcR에 대한 Teb의 발현조절을 확인하였다. 도 4a의 드라이버 3 및 EcR이 없는 드라이버 10의 플라스미드로 형질주입 시킨 표시된 플라스미드 조합을 일시적으로 형질주입 시킨 후 HEK293 세포에서 루시퍼에이즈 활성을 측정하여 도 4f에 나타내었다. 실험 조건은 도 2c에서와 동일하였다. 도 4f에서 보는 바와 같이, EcR이 없는 드라이버 10은 Teb의 존재와 상관없이 루시퍼레이즈 리포터 활성을 강력하게 자극했으며, 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 루시퍼레이즈 활성은 3회 이상 측정되었다.
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실험예
3. IQ-Switch의 유전자 침묵문제의 극복>
종래 GAL4/UAS 시스템은 유전자 이식이 적용된 조직에서 척추동물의 후속 세대에서 침묵되는 단점을 갖고 있다. 특히 UAS 인핸서에 존재하는 CpG 부위에서 DNA 메틸화가 발생하면서, 개체의 세대가 거듭될수록 유전자 발현이 불활성화되는 치명적인 유전자 침묵현상이 나타나게 된다.
그러나 5xQUAS의 경우, 5xQUAS에 여러 CpG 디뉴클레오티드의 존재가 QF-Gal4 이종 드라이버의 자극에 의해 GFP 리포터 발현을 방해하지 않았으며 CpG가 없는 인공 5xQUAS가 야생 5xQUAS보다 더 강력한 형광 리포터 유전자 발현을 유도하지는 않는다는 보고에 따라, 본 발명자들은 5xQUAS에서 CpG 디뉴클레오티드의 자연적 특징이 메틸화에 대해 내성이 있을 것이라고 가정하였다. 이에 5xQUAS 요소의 메틸화 상태와 이에 따른 유전자 침묵 여부를 확인하였다.
5xQUAS 제어 하에 인간 BRAF ( V600E ) 이식 유전자를 갖는 이펙터 제브라피쉬 4세대(F4) (Tg, 5xQUAS : ZsGreen-P2A-BRAFV600E)의 이황산수소 시퀀싱 분석을 수행하여 도 5a에 나타내었다. BRAF(V600E)는 흑색종 등의 암에서 발견되는 돌연변이 유전자로 배아 발생과정 중, 기형을 유발한다. 대조군으로 10xUAS 요소, Tg(10xUAS:ZsGreen-P2A-brafV610E) 및 Teb 자극으로 Gal4 드라이버에 반응 Tg(ubb:Gal4-VP16*-EcR)의 제어 하에 제브라피쉬 braf( V610E ) 이식유전자를 갖는 F2 이펙터 라인을 사용하였다.
도 5a에서 보는 바와 같이, Tg(10xUAS:ZsGreen-P2A-brafV610E)의 F2 자손과 Tg(5xQUAS:ZsGreen-P2A-BRAFV600E)의 F4 자손으로부터 제조된 게놈 DNA를 이황산수소 시퀀싱 분석에 적용한 결과 두 인핸서 영역은 연속 세대를 통해 심하게 메틸화된 것을 확인하였다. 메틸 그룹은 10xUAS 및 5xQUAS 요소 모두에서 CpG 디뉴클레오타이드에 많이 침착되는 것이 확인되었다. 이는 5xQUAS 요소의 활성화는 메틸화와 무관하다는 것을 시사한다. 이에 따라 본 발명에 따른 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)의 드라이버가 메틸화된 QUAS에 결합하여 이식 유전자의 발현을 개시할 수 있는지를 ChIP(chromatin immunoprecipitation) 실험을 통해 확인하였다.
도 5b에 CHiP 실험의 개략도를 나타내었다. 6xMyc 태그된 Gal4DBD-VP16*-EcR 및 6xMyc-QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR을 인코딩하는 시험관 내 전사된 mRNA(50 pg)를 Tg(5xQUAS:ZsGreen-P2A-BRAFV600E)의 배아에 도입하고, 주입된 배아를 초기 체절 단계에서 2시간 동안 50 μM의 Teb에 노출시킨 다음 20hpf에 수확하였다. braf( V610E ) 및 BRAF( V600E ) transgenes의 초기 배아 치사율을 피하기 위해 50 μM의 Teb를 도 3b에 표시된 기간 동안 드라이버와 이펙터 라인 사이의 유전적 교배에서 얻은 배아에 처리했다. 도 5c에서 보는 바와 같이, N-말단에 6xMyc 에피토프를 갖는 QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR를 인코딩하는 mRNA를 Tg(5xQUAS:ZsGreen-P2A-BRAFV600E) 이펙터 (F5 세대)에 주입하여 드라이버를 강제 발현시키는 경우, 표시된 시간에 Teb (50 μM)로 자극하였을 때 독특한 배아 기형이 유발되었다. ChIP(chromatin immunoprecipitation) 분석에 의하면, 5xQUAS 요소에 6xMyc 태그된 드라이버가 농축되어 있지만, mRNA를 주입되지 않거나 또는 대조군인 6xMyc-Gal4DBD-VP16*-EcR mRNA를 주입한 경우에도 동일 실험조건에서 통계적으로 유의한 수준으로 chromatin 침전이 일어나지 않았다. 즉, 메틸화된 5xQUAS에 IQ-Switch driver가 농축되는 것은 QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR의 고유한 특징이 아닌 것을 확인하였다. 왜냐하면 이후 실험중 동일 실험 조건에서 5xQUAS에서 6xMyc-QFDBD-Gal4AD-EcR을 사용한 경우에도 유사하게 농축되는 것을 관찰했기 때문이다. 따라서 본 실험을 통하여 QFDBD가 메틸화 상태에 관계없이 특정 시스 조절 요소에 결합하는 것으로 판단하였다. 특히, F3 세대 Tg (ubb : QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR) 드라이버와 F6 세대 Tg (5xQUAS : ZsGreen-P2A-BRAFV600E) 이펙터의 유전적 교배를 통해 얻은 배아에 Teb(50 μM)를 노출시킨 결과 F7 자손에서 ZsGreen 리포터가 배아 전체에 발현되었으며, 심각한 배아 기형이 유도되었다. 이에 반하여 F2 Tg(10xUAS:ZsGreen-P2A-brafV610E) 이펙터와 F2 Tg(ubb:Gal4DBD-VP16*-EcR) 드라이버의 교배는 동일한 Teb 처리 시 다양한 리포터 유전자 발현 및 비교적 약한 배아 결함을 갖는 F3 배아를 생성하였다(도 5e). 즉, 이러한 결과는 QF DNA 결합 도메인이 메틸화 상태와 상관없이 QUAS 요소에 대한 직접 결합을 통해 이식유전자 발현을 자극한다는 것을 강력하게 시사한다.
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실험예
4. IQ-Switch를 이용한
RASopathy
Modeling>
RASopathies로 알려진 RAS 경로 돌연변이와 관련된 발달 장애는 두개안면, 심장, 피부, 근골격 및 안구 이상과 같은 임상 특징을 갖고 있으며, BRAF 등의 돌연변이 유전자를 포함한다. 그러나 RASopathies 연구에서 BRAF(V600E)를 편재적으로 발현하는 유전변이 전달 동물은 기능 돌연변이인 BRAF(V600E)의 높은 독성으로 인해 생명을 유지할 수 없는 문제가 있다. BRAF( V600E ) 종양유전자를 갖는 Cre/LoxP 기반 조건부 유전자 주입(knock-in) 마우스 모델은 질병 진행에 대한 보다 포괄적인 연구에 사용할 수 있으나, CMV-Cre 매개 BRAF( V600E ) 편재 발현으로 인한 태아 치사가 유발되어 치료적 접근을 위한 연구가 어려웠다. 따라서 본 발명의 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)이 BRAF( V600E ) 종양유전자 관련 새로운 약물 스크리닝 플랫폼으로 사용될 수 있는지 테스트하였다.
Tg (ubb : QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR)와 Tg (5xQUAS : ZsGreen-P2A-BRAFV600E) 사이의 유전적 교배 후, 도 6a의 실험 시간표와 같이, FDA 승인 BRAF( V600E ) 특이적 억제제인 Vemurafenib(15 μM) 투여 또는 미투여 조건으로 36 hpf에서 24시간 동안 낮은 용량(2.5μM)의 Teb 처리를 하여 인간 BRAF( V600E ) 종양 유전자가 발현되도록 하고, 결과를 도 6b 내지 6u에 나타내었다.
BRAF(V600E)의 zebrafish 배아 발달의 후기 단계에서의 발현은 두개안면 기형, 심장 기형 및 피부 이상과 같은 가시적 악성 종양을 유발하며, 이들 모두는 BRAF 돌연변이에 의해 일반적으로 발생하는 RASopathy인 심장-얼굴-피부(CFC) 증후군을 나타낸다. 도 6b 내지 6w에서 보는 바와 같이, DMSO 또는 Vemurafenib 처리에 의하여 기형이 없는 정상 배아가 발달하였으며, Teb만을 처리한 경우, 75%의 심한 기형 및 25%의 약한 기형을 나타내어 BRAF(V600E)의 유전자가 발현되는 것을 확인하였다. 그리고 Vemurafenib를 처리에서 Teb로 BRAF(V600E)의 유전자가 발현을 유도한 경우, 15% 이상에서 정상배아가 발생하였으며, 나머지에서 약한 기형이 발생하였고, 심한 기형은 발생하지 않았다. 이러한 결과를 통해 본 발명의 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)에 의해 생성된 GOF 질병 모델이 보다 정교한 치료 접근법을 설계하는 데 도움이 되는 안정적이고 순응적인 약물 스크리닝 플랫폼으로 사용될 수 있음을 확인하였다.
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실험예
5. 이식유전자 활성을 증가시키기 위한
QUAS
반복의 최적화>
5xQUAS가 있는 IQ-Switch가 다른 ITES에 비해 상당한 이점이 있음을 확인하였으나, Teb에 대한 반응성은 Gal4DBD-VP16*-EcR/10xUAS 시스템에 비해 상대적으로 약했다. 따라서 Teb에 대한 감도를 개선하고 IQ-Switch의 이식유전자 발현 수준을 증가시키기 위해 본 발명의 다양한 QUAS반복을 실험하였다. 도 7과 같이 서열번호 1~4를 포함하는 5x, 9x, 13x 및 17xQUAS로 구성된 이펙터를 제작하고, 도 8a와 같이 드라이버 및 5x, 9x, 13x 및 17xQUAS로 구성된 이펙터를 제작하여 HEK293 세포에 형질전환하여 루시퍼레이즈 리포터 활성을 확인하여 도 8b에 나타내었다. 도 8b에서 보는 바와 같이, 제작된 모든 이펙터에서 Teb 부재시 누출은 확인되지 않았으며, Teb 자극에 대한 감도는 QUAS 요소의 수를 증가시킴으로써 점진적으로 개선되었다. 특히 IQ-Switch 드라이버와 함께 13xQUAS는 Teb로 처리될 때 5xQUAS보다 루시퍼라아제 발현량이 7배 이상 증가하는 것을 확인하였다. 동일 조건에서 Cos7 세포에 실험한 경우 13xQUAS는 강력한 mCherry 리포터 유전자 발현을 발생시켰으며, 그 활성은 원래 5xQUAS보다 7.3배 증가하는 것을 확인하였다. 그러나, 최대 17 반복의 QUAS 요소의 추가 증가는 더 강한 리포터 활성을 달성하지 못하고 오히려 9xQUAS와 동등한 루시퍼레이즈 활성을 나타내었다. 특히 QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR과 13xQUAS의 조합은 루시퍼레이즈 분석에서 Gal4DBD-VP16*-EcR/10xUAS보다 4.5배 더 강력했으며 누출은 거의 나타나지 않았다(도 8a 및 8b).
도 8c는 3dpf 에서 24시간 동안 10 μM의 Teb에 노출된 배아의 대표적인 Z-스태킹 이미지를 나타낸 것이며 도 8d는 각 실험군의 ZsGreen 형광강도를 그래프로 나타낸 것이다. Teb 처리 없이 드라이버와 13xQUAS 조절 ZsGreen 이펙터를 모두 포함하는 배아를 음성 대조군으로 사용했다. 도 8c 및 도 8d에서 보는 바와 같이, Teb 처리하지 않은 경우, 대조군 배경 강도 수준의 형광이 검출되었으며, Teb를 처리한 경우, 뇌 및 근육에서 5x, 9x 및 13xQUAS로 QUAS 요소 추가에 따라 형광강도가 증가하는 것을 확인하였다. 상대적 형광 강도를 나타내었다.
이러한 결과에 따라 QUAS 요소 추가 특히 13xQUAS를 포함하는 이펙터가 이식유전자의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다.
QUAS 반복에 따른 이식유전자 발현의 점진적인 증가는 F2 이펙터 계통과 F3 Tg (ubb:QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR ) 드라이버 계통 사이의 유전적 교배로부터 얻은 제브라피쉬 배아에서 웨스턴 블롯팅을 통해 정량적으로 재검증되었다. Tg (5xQUAS:ZsGreen-P2A), Tg (9xQUAS:ZsGreen-P2A) 및 Tg (13xQUAS:ZsGreen-P2A)의 수정 후 1일(dpf)에 개별 유전자 교배의 배아를 24시간 동안 10μM의 Teb로 처리한 다음 항-ZsGreen 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하고 이를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 보는 바와 같이, 5xQUAS, 9xQUAS, 13xQUAS의 순서로 ZsGreen의 수준이 증가하였다. 13xQUAS 이펙터를 갖는 배아는 Teb 자극에 의하여 QUAS 반복이 더 적은 것과 비교하여 ZsGreen 발현 수준이 가장 높았다.
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실험예
6. IQ-Switch 및 EQ-On을 사용하여 점진적인 강도로
ZsGreen의
뉴런 특이적 발현>
본 발명의 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)의 장점은 도 2a의 드라이버 10과 같이 EcR을 제거하는 경우, 조정 가능한 transactivator가 구성적으로 항상 활성화된 형태로 전환된다는 것이다. 이때 QF 이식 유전자는 계속 활성을 유지할 수 있으며, 이식유전자 유도를 위하여 Teb 자극이 필요하지 않게 된다 (EQ-On : Everlasting QF transgene switch-On). 따라서 EQ-On은 주로 핵 내에서 사용할 수 있도록 구성되며, 발현이 2배 이상 강하고 독성이 최소화되었다. 이러한 본 발명의 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)의 EQ-On은 특정 세포 또는 조직의 라벨링에 적용할 수 있다.
상기와 같이 구성적으로 활성인 드라이버는 Teb 자극의 도움 없이 초기 발달 동안 이식유전자 발현을 유발한다. 도 10는 EcR이 없는 드라이버 구성을 갖는 3개의 개별 배아를 6 hpf에서 공초점 현미경으로 이미지화한 것이다. F2 암컷 Tg(ubb:QFDBD-2xAD*-VP16*)와 F2 수컷 Tg(5xQUAS:ZsGreen-P2A-lamin AΔ37) 간의 유전적 교배 배아(a) 및 F2 수컷 Tg(ubb:QFDBD2xAD*-VP16*)와 F2 암컷 Tg(5xQUAS:ZsGreen-P2A-lamin AΔ37) 간의 유전적 교배 배아(b)는 Teb없이 계속 ZsGreen 형광을 발현하였으며, 특히, 암컷 Tg(ubb:QFDBD-2xAD*-VP16*)에서 파생된 배아는 더 강렬한 ZsGreen 형광을 나타냈다. 이는 QFDBD-2xAD*-VP16* 전사 활성제의 모체 침착 때문일 수 있다.
이러한 본 발명의 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system) 및 EQ-On가 특정 세포 또는 조직의 라벨링에 적용 가능한지 테스트하였다.
도 11a와 같이, 드라이버 카세트의 ubb 프로모터를 8.7kb 이하의 elavl3 37으로 대체하여 범뉴런 조직을 시각화했다. F1 Tg (elavl3:QFDBD-2xAD*-VP16*-EcR)와 ZsGreen 이식유전자를 갖는 F2 Tg사이의 유전적 교배된 배아는 다양한 수의 QUAS(5x, 9x, 13x)의 제어 하에 QUAS 반복 순서대로 강한 강도로 ZsGreen 발현을 활성화했으며, 이는 3 dpf에서 48시간 동안 50 μM의 Teb로 자극될 때만 나타났다(도 11a 및 11b). Teb 반응성 드라이버와 Tg(5xQUAS:ZsGreen-P2A) 간의 유사 유전적 교배에서 얻은 자손을 48hpf에서 영상화하기 전 24시간 동안 동일한 용량의 Teb에 노출시켰을 때, ZsGreen 형광이 잘 알려진 elavl3 발현 도메인을 갖는 신경세포를 지배하는 축삭섬유를 포함하여 신경 조직 전체에서 관찰되었다. 이에 반하여, EcR이 없는 드라이버인 Tg (elavl3:QFDBD-2xAD*-VP16*)와 Tg(QUAS:ZsGreen) 간의 유전적 교배에 의해 구동되는 뉴런에서는 ZsGreen은 EQ-On 의존적으로 발현되었다. 특히 상기와 같이 EQ-On 의존적으로 발현되는 형광신호는, 13xQUAS로 가장 강화된 꼬리지느러미의 감각 뉴런을 포함하여 전 뉴론에서 점차로 증가하였다(도 11c, I-III). 꼬리지느러미 축삭 가지가 일반적으로 기존의 Tg(elavl3:EGFP)에서는 관찰되지 않기 때문에 본 발명의 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)의 EQ-On은 프로모터 활성을 강화하여 약한 발현 도메인을 가시화하는 데에 사용할 수 있음을 확인하였다.
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실험예
7. IQ-Switch 및 EQ-On을 이용한 뉴런 발달 추적>
성장하는 배아의 뉴런 발달 과정은 뉴런에 적절한 형광 마커를 표시하여 분석할 수 있다. 그러나 종래에는 감각 뉴런에 라벨을 붙일 적절한 분자 및 유전 도구의 부족으로 인해 그 추적이 쉽지 않았다. 본 발명의 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)을 이용하여 2dpf에서 시작하여 3일 동안 난황의 상피 세포층(epithelial cell layers, ECL)에서 발달하는 감각 뉴런을 추적하였다.
F2 Tg(elavl3:QFDBD-2xAD*-VP16*)와 5x 또는 13xQUAS 조절 ZsGreen 리포터 유전자를 갖는 F3 이펙터 라인 사이의 유전적 교배에서 얻은 배아를 각 발생시간에 따라 관찰하여 도 12a에 나타내었다. 도 12a에서 보는 바와 같이, 발달 과정에 따라 ECL의 문합 네트워크에서 형광 신호가 점진적으로 증가하였으며, 특히 5dpf에서 5xQUAS:ZsGreen과 비교하여 13xQUAS:ZsGreen를 갖는 배아에서 더욱 분명하게 나타났다. 난황에서 형광 신호의 메쉬와 같은 모양과 5xQUAS:ZsGreen 및 13xQUAS:ZsGreen 배아 사이의 배경 노이즈를 감안할 때 ECL에서 관찰된 형광은 단순히 자동 형광 또는 다른 이미징 설정으로 인한 것은 아니었다. 5x 및 13xQUAS-ZsGreen 그룹의 배경 형광 강도를 평준화하는 데 사용되는 영역을 도 12b에 나타내었다. 동일한 공초점 설정에서 5dpf에서 동일한 수의 배아에서 파생된 12개의 단일 이미지로 배경 형광의 종합 수준을 측정하였다. 두 개의 개별 클러치에서 각 12개의 배아를 분석한 결과 식별 가능한 차이는 관찰되지 않았다. 또한, 난황에서 자동 형광의 가능한 출현을 최소화하기 위해 배아를 관찰할 때 인지 가능한 자동 형광을 유도하지 않는 고정 공초점 설정을 사용하였다. 이러한 점을 종합하면, 본 발명에 따른 이식 유전자 발현 시스템(IQ-system)은 다른 드라이버와 이펙터를 결합하여 시공간적 방식으로 전이유전자 발현을 조정할 수 있으며, 또한 EQ-On은 상대적으로 약한 프로모터로도 강제 리포터 유전자 발현을 가능하게 하는 것을 확인할 수 있다.
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Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
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gggtaatcgc ttatcctcgg ataaacaatt atcctcacgg gtaatcgctt atccgctcgg 60
gtaatcgctt atcctcgggt aatcgcttat cc 92
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 2
gggtaatcgc ttatcctcgg ataaacaatt atcctcacgg gtaatcgctt atccgctcgg 60
gtaatcgctt atcctctcgg gtaatcgctt atcctcggat aaacaattat cctcacgggt 120
aatcgcttat ccgctcgggt aatcgcttat cctcgggtaa tcgcttatcc 170
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 13x QUAS
<400> 3
gggtaatcgc ttatcctcgg ataaacaatt atcctcacgg gtaatcgctt atccgctcgg 60
gtaatcgctt atcctcgggt aatcgcttat cctcgggtaa tcgcttatcc tcggataaac 120
aattatcctc acgggtaatc gcttatccgc tcgggtaatc gcttatcctc ggataaacaa 180
ttatcctcac gggtaatcgc ttatccgctc gggtaatcgc ttatcctcgg gtaatcgctt 240
atcc 244
<210> 4
<211> 322
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 17x QUAS
<400> 4
gggtaatcgc ttatcctcgg ataaacaatt atcctcacgg gtaatcgctt atccgctcgg 60
gtaatcgctt atcctcgggt aatcgcttat cctcgggtaa tcgcttatcc tcgggtaatc 120
gcttatcctc ggataaacaa ttatcctcac gggtaatcgc ttatccgctc gggtaatcgc 180
ttatcctcgg ataaacaatt atcctcacgg gtaatcgctt atccgctcgg gtaatcgctt 240
atcctcggat aaacaattat cctcacgggt aatcgcttat ccgctcgggt aatcgcttat 300
cctcgggtaa tcgcttatcc tt 322
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<211> 7203
<212> DNA
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<223> p5xQUAS-ZsGreen-P2A, alpha-cry:mCherry
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ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccca 660
gaggtgtaaa aagtactcaa aaattttact caagtgaaag tacaagtact tagggaaaat 720
tttactcaat taaaagtaaa agtatctggc tagaatctta cttgagtaaa agtaaaaaag 780
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aaacttgcat tggtaaatag tttcagccta tgcatatgta gttattcaaa ctgtaatgac 2940
tatcttacag tattatatgt ttataatagt ttgatccaat aaatccagat ttatatgctt 3000
ttcaacataa aattgtgaaa tgcacagaat gtacatatac aatacatttc ctacaataat 3060
gctctctttt ctattaatag tgtgcattca gtgcaggatg ttatgtattt attttctgta 3120
gtgcaaactt tttcaaagaa ttttccagtc taagcttttc agtcaagaaa aaaaaaagcg 3180
attgattatc tgtgatattt aaaaaaatta gctcttaaat ctggtgaacc aagtggccac 3240
aacacattaa atactgacgt tctacagcca tgtagcttca tctggtctgg tttgttttgg 3300
caggcactta ttttccggtg atagttggcc acaagagtat tgtctgagcc attcagtgct 3360
agactgtcat tctcaggtca gagtccaccc cgctgattct gctgacaaca ctgttcccac 3420
catgagataa tgccattcca gagagatcca tttgtaagcc cctctttctg cagcacaggt 3480
atataaccag gggtctgcct ccactaaggc cggcacacat catttgggga tctttgtact 3540
gtggatccac cggtcgccac catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg 3600
cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag 3660
ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag 3720
ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc 3780
cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac 3840
gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg 3900
aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag 3960
gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc 4020
atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag 4080
gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc 4140
gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac 4200
gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc 4260
atggacgagc tgtacaagta aagcggccgg ccgcgactct agatcataat cagccatacc 4320
acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa 4380
cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa 4440
taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt 4500
ggtttgtcca aactcatcaa tgtatctaag ccgcggtgga gctcaagtga tctccaaaaa 4560
ataagtactt tttgactgta aataaaattg taaggagtaa aaagtacttt tttttctaaa 4620
aaaatgtaat taagtaaaag taaaagtatt gatttttaat tgtactcaag taaagtaaaa 4680
atccccaaaa ataatactta agtacagtaa tcaagtaaaa ttactcaagt actttacacc 4740
gagctccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattgcg cgcttggcgt aatcatggtc 4800
atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 4860
aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 4920
gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 4980
ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 5040
ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 5100
acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 5160
aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 5220
tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 5280
aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 5340
gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 5400
acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 5460
accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 5520
ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 5580
gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 5640
gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 5700
ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 5760
gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 5820
cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 5880
cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 5940
gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 6000
tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 6060
gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 6120
agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 6180
tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 6240
agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 6300
gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 6360
catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 6420
ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 6480
atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 6540
tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 6600
cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 6660
cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 6720
atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 6780
aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 6840
ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 6900
aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccac 6947
<210> 12
<211> 765
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> QFDBD - 2x AD* - VP16*
<400> 12
atgccgccta aacgcaagac actcaatgcc gctgccgaag ccaatgccca cgctgatggc 60
catgctgatg gcaatgctga tggtcatgtc gctaacactg cagcaagcag caacaacgcc 120
cgttttgcgg acttgaccaa cattgacaca cccggcctcg gccctaccac gacgacgtta 180
cttgtcgagc ccgctcgttc gaaacgccag agagtctcga gggcctgtga tcagtgtcga 240
gctgcacgtg aaaagtgtga tggaatccag ccggcttgct tcccctgtgt gtcgcagggc 300
cggtcgtgta cctaccaggc cagtcccaag aagcgaggag tccagacggg ctacatccgc 360
actctcgaac tggctctggc ttggatgttc gagaacgttg cccgcagcga ggacgccctc 420
cacaatcttt tggtccgtga tgctggccag ggcagcgctc tcctggtcgg caaagactcg 480
cctgctgcag aacgcctgca tgcaagatgg gcgacgagtc gagtcaacaa aagcatcacc 540
cgtcttctct caggtcaggc cgcacaagat ccatctgaag acggccaatc cccgtccgaa 600
gacataaatg tccaagatca ggccgcacaa gatccatctg aagacggcca atccccgtcc 660
gaagacataa atgtccaaga tgagttcctg gatatggccg acttcgagtt tgagcagatg 720
tttaccgatg cccttggaat tgacgagtac ggtgggctgc agtga 765
Claims (23)
- 숙주 세포에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 시스템으로서, 상기 숙주세포는
(i) DNA-결합 도메인;
(ii) 전사활성 도메인; 및
(iii) 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인;
을 포함하는 엑디손 수용체 복합체 드라이버,
(i) 상기 DNA 결합 도메인에 결합할 수 있는 반응 요소; 및
(ii) 표적 유전자;
를 포함하는 이펙터로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 유도 시스템. - 제1항에 있어서,
상기 이펙터의 상기 (i) DNA 결합 도메인에 결합할 수 있는 반응 요소는 5xQUAS, 9xQUAS, 13xQUAS 및 17xQUAS로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 유도 시스템. - 제1항에 있어서,
상기 이펙터의 상기 (i) DNA 결합 도메인에 결합할 수 있는 반응 요소는 서열 번호 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 유도 시스템. - 제1항에 있어서,
상기 이펙터는 QUAS 반복서열을 포함하며 서열 번호 5 내지 8로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 유도 시스템. - 제1항에 있어서,
상기 드라이버의 (i) DNA-결합 도메인은 QFDBD(QF DNA binding domain)이며, 상기 (ii) 전사활성 도메인은 활성화도메인(activating domain, AD), minimal 활성화도메인, 중간도메인(middle domain), VP16, VP16 2반복체, VP16 3반복체 및 VP16 4반복체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 유도 시스템. - 제1항에 있어서,
상기 드라이버는 서열 번호 9 또는 10의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 유도 시스템. - 제1항에 있어서,
상기 유전자 발현 유도 시스템은 숙주세포의 외부에서 공급하는 엑디손 수용체 리간드의 농도에 따라 발현량이 조절되는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 유도 시스템. - 제7항에 있어서,
상기 엑디손 수용체 리간드는 엑디손 또는 테부페노자이드(tebufenozide, Teb)인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 유도 시스템. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 유전자 발현 유도 시스템으로 형질전환된 제브라피쉬.
- QUAS 반복서열을 포함하며 서열 번호 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 이펙터 염기서열을 포함하는 재조합 벡터.
- QUAS 반복서열을 포함하며 서열 번호 5 내지 8로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 이펙터 염기서열을 포함하는 재조합 벡터.
- DNA-결합 도메인, 전사활성 도메인 및 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 복합체를 암호화하는 서열 번호 9 또는 10의 드라이버 염기서열을 포함하는 재조합 벡터.
- 제10항 내지 제12항 중 어느 하나의 재조합 벡터로 형질전환된 세포.
- 제13항에 있어서,
상기 형질전환된 세포는 제브라피쉬의 생식세포 또는 체세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 세포. - 숙주 세포에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법으로서, 상기 숙주세포에
(i) DNA-결합 도메인;
(ii) 전사활성 도메인; 및
(iii) 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인;
을 포함하는 엑디손 수용체 복합체 드라이버를 도입하는 단계(A);
(i) 상기 DNA 결합 도메인에 결합할 수 있는 반응 요소; 및
(ii) 표적 유전자;
를 포함하는 이펙터를 도입하는 단계(B);
상기 숙주세포에 엑디손 수용체 리간드를 도입하여 상기 표적 유전자의 발현을 조절하는 단계(C);를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 유도 방법. - 숙주 세포에서 표적 유전자를 영구 발현하는 시스템으로서, 상기 숙주세포는
(i) DNA-결합 도메인;
(ii) 전사활성 도메인; 및
을 포함하는 드라이버,
(i) 상기 DNA 결합 도메인에 결합할 수 있는 반응 요소; 및
(ii) 표적 유전자;
를 포함하는 이펙터로 이루어지는 것을 특징으로 하는 영구 유전자 발현 유도 시스템. - 제16항에 있어서,
상기 이펙터는 QUAS 반복서열을 포함하며 서열 번호 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 영구 유전자 발현 유도 시스템. - 제16항에 있어서,
상기 드라이버는 서열 번호 11 또는 12의 유전자에 의하여 암호화되는 QF DNA 결합부위, 최소 전사활성 도메인 및 Vp16 을 포함하는 복합체인 것을 특징으로 하는 영구 유전자 발현 유도 시스템. - 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항의 영구 유전자 발현 유도 시스템으로 형질전환된 제브라피쉬.
- DNA-결합 도메인 및 전사활성 도메인을 포함하는 복합체를 암호화하는 서열 번호 11 또는 12의 드라이버 염기서열을 포함하는 재조합 벡터.
- 제20항의 재조합 벡터로 형질전환된 세포.
- 제21항에 있어서,
상기 형질전환된 세포는 제브라피쉬의 생식세포 또는 체세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 세포. - 숙주 세포에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법으로서, 상기 숙주세포에
(i) DNA-결합 도메인;
(ii) 전사활성 도메인; 및
을 포함하는 드라이버를 도입하는 단계(A);
(i) 상기 DNA 결합 도메인에 결합할 수 있는 반응 요소; 및
(ii) 표적 유전자;
를 포함하는 이펙터를 도입하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 영구 유전자 발현 유도 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020220005219A KR20230109353A (ko) | 2022-01-13 | 2022-01-13 | 유전자 침묵문제를 극복한 신규 유전자 발현유도 스위치 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220005219A KR20230109353A (ko) | 2022-01-13 | 2022-01-13 | 유전자 침묵문제를 극복한 신규 유전자 발현유도 스위치 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230109353A true KR20230109353A (ko) | 2023-07-20 |
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ID=87426402
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220005219A KR20230109353A (ko) | 2022-01-13 | 2022-01-13 | 유전자 침묵문제를 극복한 신규 유전자 발현유도 스위치 |
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230109353A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101687318B1 (ko) | 2015-01-30 | 2016-12-16 | 충남대학교산학협력단 | 액디손 수용체-기반 전이유전자 유도성 벡터 |
-
2022
- 2022-01-13 KR KR1020220005219A patent/KR20230109353A/ko unknown
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR101687318B1 (ko) | 2015-01-30 | 2016-12-16 | 충남대학교산학협력단 | 액디손 수용체-기반 전이유전자 유도성 벡터 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 한국등록특허 제101685152호, 초파리 Apolipoprotein D-GAL4 이중 돌연변이체 및 그 제조방법, 2016년12월05일 등록. |
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