KR20160029124A - Pd－１ 항원 또는 pd－１ 리간드 항원을 포함하는 바이러스 유사 입자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 또는 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원을 포함하는 바이러스 유사 입자, 및 이를 포함하는 조성물 또는 키트, 면역 반응에서의 이의 용도 등을 제공한다.

Description

PD－１ 항원 또는 PD－１ 리간드 항원을 포함하는 바이러스 유사 입자 {VIRUS LIKE PARTICLE COMPRISING PD-1 ANTIGEN OR PD-1 LIGAND ANTIGEN}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 2013 년 7 월 12 일에 출원한 미국 가출원 번호 61/845,712 에 대해 우선권을 주장한다.

기술 분야

본 발명은 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 또는 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원을 포함하는 바이러스 유사 입자, 및 이를 포함하는 조성물 또는 키트, 면역 반응에서의 이의 용도 등에 관한 것이다.

세포예정사 (Programmed Cell Death) 1 또는 PD-1 (또한 PDCD1 로서 나타냄) 은 특정 리간드와 상호작용하여 T 세포 항원 수용체 신호전달을 부정적으로 제어하는 CD28 슈퍼패밀리의 50 내지 55 kDa 유형 I 막관통 수용체이며 자체내성의 유지에 있어서 역할을 담당하는 것으로 제시된다.

PD-1 항원은 자가면역, 종양 면역성, 감염 면역성, 이식 면역성, 알레르기 및 면역적 이점을 포함하는 면역 반응의 거의 모든 양태에 관련된다.

PD-1 은 활성화된 T 세포, B 세포 및 대식세포의 표면에서 발현되며 (Y. Agata et al., International Immunology vol.8, No. 5 p765-772, 1996), 이는 면역계에서 또한 중요한 제어 역할을 하는 CTLA-4 와 비교하여, PD-1 이 보다 광범위하게 면역 반응을 부정적으로 제어한다는 것을 제시한다.

일반적으로, 예를 들어 자가면역 질환, 염증 장애, 알레르기, 이식 거부, 암, 면역 결핍 및 기타 면역계 관련 장애와 같은 면역 장애에 대한 안전하고 효과적인 치료 방법이 필요하다. 이러한 장애에 관련된 면역 반응의 조절은 PD-1 경로의 조작에 의해 달성될 수 있다.

PD-1 은 2 개의 리간드, PD-L1 (PDCD1L1 또는 B7-H1 에 대한 예정사 리간드) 및 PD-L2 (PDCD1L2 또는 B7-DC 에 대한 예정사 리간드 2) 를 가지며, 이는 B7 패밀리 리간드의 일원이다.

한 접근 방식에서, PD-1 뿐 아니라 이의 리간드 (PD-L1, PD-L2 또는 둘 모두) 의 상호작용을 차단하는 것은 종양 및 바이러스 면역치료요법에 대한 효과적인 방법을 제공할 수 있다.

US 5,629,204 및 US 5,698,520 은 상기 단백질을 인코딩하는 인간 PD-1 및 DNA 에 관련된 막 단백질에 관한 것이며, PD-1 단백질이 다양한 감염, 면역학적 침체 또는 가속, 또는 종양 등의 치료에 유용할 수 있다는 것을 나타낸다.

US 7,595,048 및 US 2011/0081341 은 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 에 의해 유도된 면역억제 신호를 저해하는 것을 특징으로 하는 면역강화, 암 또는 감염 치료용 조성물, 및 이를 사용하는 치료요법에 관한 것이다.

여러 대규모 제약회사는 시중에서 최초의 것이 되기 위한 경쟁에서 그들의 PD-1 항체를 서로 겨루고 있다. 여기서 3 개의 단일클론 항체 예컨대 PD-1 에 대항하여 작용하는 인간화 단일클론 IgG4 항체인 Merck 의 람브롤리주맙 (Lambrolizumab) (MK-3475), 완전 항 인간 PD-1 항체인 Bristol-Myers Squibb 의 니볼루맙 (Nivolumab) (BMS-936558) 및 PD-1 을 차단하지 않으나 PD-L1 을 차단하는 Roche Genentech 의 MPDL3280A 가 존재한다.

그러나, PD-1 을 표적화하는 보다 강력하고 안전한 화합물이 대단히 필요하다.

바이러스 유사 입자 (VLP) 는 진본 선천적 바이러스의 구조 및 형태를 모방하지만 바이러스 게놈이 결핍되어 있는, 잠재적으로 더 안전하고 저렴한 백신 후보물을 산출해내는 다중단백질 구조이다. 소수의 예방 VLP-기재 백신은 현재 전세계적으로 시판되고 있다: GlaxoSmithKline 의 Engerix® (헤파티티스 B 바이러스) 및 Cervarix® (인간 파필로마바이러스), 및 Merck and Co., Inc. 의 Recombivax HB® (헤파티티스 B 바이러스) 및 Gardasil® (인간 파필로마바이러스) 가 일부 예이다. 다른 VLP-기재 백신 후보물이 임상 시험 중에 있거나 전임상 평가를 거치고 있다 (예컨대 인플루엔자 바이러스, 파보바이러스, 노워크 (Norwalk) 및 각종 키메라 VLP). 많은 기타의 것들은 전임상 시험에서의 성공에도 불구하고 여전히 소규모 기초 연구에 제한되어 있다. 대규모 VLP 제조의 영향은 공정 제어, 모니터링 및 최적화의 맥락에서 토의된다. 주요 업- 및 다운-스트림 기술적 도전 과제가 확인되고 있으며 이에 따라 토의되고 있다. 성공적인 VLP-기재 대규모 백신이 치료 또는 예방 백신을 위한 키메라 VLP-기재 기법에서의 최근 발전 및 임상 시험으로부터의 최신 결과를 수반하여 간략하게 제시되어 있다 (Expert Rev. Vaccines 9(10), 1149-1176, 2010).

치쿤구니야 (Chikungunya) 바이러스 (CHIKV) 는 이러한 알파바이러스가 2004 년도에 케냐에서 재출현한 이래로 아프리카, 유럽 및 아시아에서 백만명을 감염시켰다. 상기 질환의 심각도 및 이러한 유행성 바이러스의 확산은 백신이나 항바이러스 치료요법의 부재 하에서 심각한 공중 위생의 위협을 드러낸다. 유행성 치쿤구니야 바이러스에 대한 VLP 백신이 감염에 대항하여 비-인간 영장류를 보호한다는 것이 보고되어 있다 (Nat Med. 2010 March; 16(3): 334-338). 미국 특허 공개 번호 2012/0003266 은 감염 또는 이의 하나 이상의 증상에 대한 면역력을 유도하는 치쿤구니야에 대한 백신 또는 항원성 조성물을 제형화하는데 유용한 하나 이상의 치쿤구니야 바이러스 구조 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자 (VLP) 를 개시하고 있다. WO2012/106356 은 개질된 알파바이러스 또는 플라비바이러스 바이러스 유사 입자 (VLP) 및 알파바이러스 및 플라비바이러스-매개 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위해 개질된 VLP 의 제조를 증진시키는 방법을 개시하고 있다 (이러한 인용된 참고문헌은 본원에서 참조로 포함됨).

발명의 개요

제 1 양태에서, 본 발명은 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 입자를 제공한다.

제 2 양태에서, 본 발명은 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 입자를 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

제 3 양태에서, 본 발명은 약학 조성물 및 약학 조성물을 포함하는 키트를 제공하며, 이때 약학 조성물은 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 입자; 또는 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 입자를 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.

제 4 양태에서, 본 발명은 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 입자; 또는 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 입자를 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의, 대상에서의 면역 반응을 조절하고 암을 치료하거나 감염성 질환을 치료하기 위한 약학 조성물 또는 키트의 제조를 위한 용도를 제공한다.

도 1 은 N-말단 PD-1 (1-167aa) 에 결합하는 항체를 검출한 ELISA 의 결과를 나타낸다.
도 2 는 PD-1-Fc 에 결합하는 항체를 검출한 ELISA 의 결과를 나타낸다.

구현예의 설명

(1) 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 입자

제 1 양태에서, 본 발명은 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 입자를 제공한다.

상기 기재한 입자를 조절함으로써 제조할 수 있는 상기 기재한 입자의 유도체가 또한 본 발명에 의해 제공된다. 개질의 예는 비제한적으로, 하나 이상의 아미노산 잔기의 첨가, 결실 또는 대체를 포함한다.

본 발명에 의해 제공된 입자는 i) 하나 이상의 바이러스 구조 단백질 및 ii) PD-1 에서 유래한 하나 이상의 항원 또는 PD-1 의 리간드에서 유래한 하나 이상의 항원으로 이루어지거나 이를 포함하는 입자일 수 있다. 하나 이상의 바이러스 구조 단백질은 1 종 이상의 단백질 또는 펩티드로 이루어질 수 있으며 자발적으로 어셈블리되어 본 발명에 의해 제공된 입자를 형성할 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 입자는 10nm 이상, 예를 들어 20nm 이상, 바람직하게는 50nm 이상의 직경을 갖는다. 한 구현예에서, 입자의 분자량은 100 kDa 내지 100,000 kDa, 바람직하게는 400kDa 내지 30,000kDa 이다.

바람직하게는, 본 발명에 사용한 바이러스 구조 단백질은 알파바이러스 또는 플라비바이러스에서 유래한 바이러스 구조 단백질일 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 제공된 입자는 알파바이러스 또는 플라비바이러스에서 유래한 바이러스 유사 입자를 포함하는 바이러스 유사 입자일 수 있다.

알파바이러스 및 플라비바이러스의 예는 비제한적으로, 아우라 (Aura) 바이러스, 바반키 (Babanki) 바이러스, 바마 삼림 (Barmah Forest) 바이러스 (BFV), 베바루 (Bebaru) 바이러스, 카바수 (Cabassou) 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV), 동부 말 뇌염 (Eastern equine encephalitis) 바이러스 (EEEV), 에일랏 (Eilat) 바이러스, 에버글레이즈 (Everglades) 바이러스, 포트 모건 (Fort Morgan) 바이러스, 게타 (Getah) 바이러스, 하이랜드 J 바이러스, 키질라가크 (Kyzylagach) 바이러스, 마야로 (Mayaro) 바이러스, 메 트리 (Me Tri) 바이러스, 미델부르크 (Middelburg) 바이러스, 모소 다스 페드라스 (Mosso das Pedras) 바이러스, 무캄보 (Mucambo) 바이러스, 엔두무 (Ndumu) 바이러스, 오뇽-뇽 (O'nyong-nyong) 바이러스, 픽수나 (Pixuna) 바이러스, 리오 네그로 (Rio Negro) 바이러스, 로스 리버 (Ross River) 바이러스 (RRV), 연어 췌장 질환 (Salmon pancreas disease) 바이러스, 셈리키 삼림 (Semliki Forest) 바이러스, 신드비스 (Sindbis) 바이러스, 남방 바다코끼리 물범 (Southern elephant seal) 바이러스, 토네이트 (Tonate) 바이러스, 트로카라 (Trocara) 바이러스, 우나 (Una) 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 (Venezuelan equine encephalitis) 바이러스 (VEEV), 서부 말 뇌염 (Western equine encephalitis) 바이러스 (WEEV), 화타로아 (Whataroa) 바이러스, 웨스트 나일 (West Nile) 바이러스, 뎅기 (dengue) 바이러스, 진드기 매개 뇌염 (tick-borne encephalitis) 바이러스 및 황열 (yellow fever) 바이러스를 포함한다.

바이러스 구조 단백질은 캡시드 (capsid) 단백질, 외피 단백질, 이의 단편 또는 이의 복합체일 수 있다. 따라서, 본 발명에 사용한 바이러스 구조 단백질은 캡시드 단백질 및/또는 외피 단백질 및/또는 이의 단편으로 이루어지거나 이를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 바이러스 유사 입자는 캡시드, E2 및 E1 로 이루어지거나 이를 포함한다. 항원은 E2 에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 의해 제공된 바이러스 유사 입자는 240 개 캡시드, 240 개 E1 단백질 및 240 개 E2 단백질을 어셈블리하여 형성될 수 있으며, 이때 PD-1 항원이 각각의 E2 단백질에 삽입된다.

본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "PD-1 항원" 은 PD-1 에서 유래한 항원을 나타낸다. 바람직하게는, PD-1 은 인간 PD-1 이다. PD-1 에서 유래한 항원은 PD-1 의 단편 또는 PD-1 의 단편의 유도체일 수 있다.

본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "PD-1 리간드 항원" 은 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원을 나타낸다. PD-1 의 리간드의 예는 비제한적으로, PD-L1 및 PD-L2 를 포함한다. 바람직하게는, PD-1 의 리간드는 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2 이다. PD-L1 에서 유래한 항원은 PD-L1 또는 PD-L2 의 단편; 또는 PD-L1 또는 PD-L2 의 단편의 유도체일 수 있다.

본 발명에 의해 제공된 입자에 함유된 항원에 사용하기 위한 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 의 단편은 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 및/또는 이의 3 차 구조의 아미노산 서열을 기반으로 선택될 수 있다.

예를 들어, 항원에서 사용하기 위한 단편은 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 의 표면에 위치한 단편으로 이루어지거나 이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 의해 제공된 입자에 함유된 항원에 대항하는 항체는 PD-1 및 PD-L1 또는 PD-1 및 PD-L2 사이의 상호작용을 차단한다. 항원에서 사용하기 위한 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 의 단편은 10-300 개 아미노산 잔기 (예를 들어 10-120, 10-30 또는 15-30 개 아미노산 잔기) 의 길이일 수 있다.

한 구현예에서 항원에서 사용하기 위한 단편은, 거리가 항원 또는 항원을 함유하는 자연발생적 단백질 또는 그로부터의 개질된 단백질의 결정에서 측정되는 경우, 항원의 N-말단 잔기와 C-말단 잔기 사이의 공간적 거리가 30Å 이하이도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 의해 제공된 입자에 사용된 항원은 PyMOL (예를 들어 PyMOL v0.99: http:/www.pymol.org) 을 포함하는 무료 소프트웨어를 사용하여 설계될 수 있다. 한 구현예에서, 항원의 N-말단 잔기와 C-말단 잔기 사이의 공간적 거리는 30Å (옹스트롬) 이하, 20Å 이하, 또는 10Å 이하 (예를 들어 5Å 내지 15Å, 5Å 내지 12Å, 5Å 내지 11Å, 5Å 내지 10Å, 5Å 내지 8Å, 8Å 내지 15Å, 8Å 내지 13Å, 8Å 내지 12Å, 8Å 내지 11Å, 9Å 내지 12Å, 9Å 내지 11Å, 9Å 내지 10Å 또는 10Å 내지 11Å) 이다.

항원에서 사용하기 위한 PD-1 의 단편의 예는 비제한적으로, lnwyrmspsnqtdklaaf (SEQ ID No.:4), mlnwyrmspsnqtdklaafs (SEQ ID No.:5), vlnwyrmspsnqtdklaafp (SEQ ID No.:6), gaislhpkakiees (SEQ ID No.:7), cgaislhpkakieec (SEQ ID No.:8), VLNWYRMSPSNQTDKLAAF (SEQ ID No.:9), GAISLAPKAQIKES (SEQ ID No.:10), RNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVT (SEQ ID No.:11) 및 RNDSGIYLCGAISLHPKAKIEESPGAELVVT (SEQ ID No.:12) 를 포함한다. 항원에서 사용하기 위한 PD-L1 의 단편의 예는 비제한적으로, ciisyggadyc (SEQ ID No.:13), CMISYGGADYC (SEQ ID No.:14), LQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVN (SEQ ID No.:15), LQDAGVYRAMISYGGADYKRITVKVN (SEQ ID No.:16), DLAALIVYWEMEDKNIIQFVH (SEQ ID No.:17), DLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGG (SEQ ID No.:18), FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVE (SEQ ID No.:19), Lqdagvycciisyggadykritlkvn (SEQ ID No.: 20), lqdagvyaaiisyggadykritlkvn (SEQ ID No.:21), dllalvvywekedeqviqfva (SEQ ID No.: 22), dllalvvywekedeqviqfvagg (SEQ ID No.: 23) 및 ftitapkdlyvveygsnvtmecrfpve (SEQ ID No.: 24) 를 포함한다.

PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 의 단편의 유도체는 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 의 단편에서의 하나 또는 여러 아미노산 잔기의 첨가, 결실 또는 대체에 의해 제조될 수 있다. 한 구현예에서, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 의 단편의 유도체는 자연발생적 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 의 상응하는 단편에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 한 구현예에서, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 의 단편의 유도체는 자연발생적 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 의 상응하는 단편을 기반으로 최대 10% 의 아미노산이 결실되고, 치환되고/되거나 첨가되는 돌연변이체이다.

본 발명에 의해 제공되는 바와 같은 입자에서, 바이러스 구조 단백질 및 항원은 바이러스 구조 단백질에 존재하는 하나 이상의 제 1 결합 부위 및 항원에 존재하는 하나 이상의 제 2 결합 부위를 통해 연결될 수 있다.

본원에서 사용한 바와 같이, 각각의 "제 1 결합 부위" 및 "제 2 결합 부위" 는 하나 초과의 물질이 서로 연결되는 부위를 나타낸다.

한 구현예에서, 바이러스 구조 단백질 및 항원은 직접적으로 융합된다. 한 구현예에서, 1 또는 2 개의 링커가 항원의 N-말단 잔기와 바이러스 구조 단백질 사이 및/또는 항원의 C-말단 잔기와 바이러스 구조 단백질 사이에 개입될 수 있다.

항원 또는 바이러스 구조 단백질은 절두 (truncated) 될 수 있으며 단길이 링커에 의해 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 또는 바이러스 구조 단백질은 하나 이상의 펩티드 링커를 포함한다. 통상, 링커는 2 내지 25 개 아미노산으로 이루어진다. 보통 이는 2 내지 15 개 아미노산 길이이나, 특정 환경에서는 단 1 개, 예컨대 단일 글리신 잔기일 수 있다.

한 구현예에서, 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 유전적으로 융합되는 핵산 분자는, 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위가 펩티드 결합을 통해 연결되도록 숙주 세포에서 발현된다. 이러한 경우, 바이러스 구조 단백질 및 항원은 펩티드 결합을 통해 연결된다. 이러한 구현예에 관련하여, 제 1 결합 부위 및/또는 제 2 결합 부위는 본래 단백질 또는 항원으로부터 유전적으로 개질될 수 있다. 예를 들어, 제 1 결합 부위는 SG, GS, SGG, GGS 및 SGSG 를 포함하는 링커 펩티드를 통해 단백질이 항원과 접합되도록 바이러스 구조 단백질로부터 개질된다.

바이러스 구조 단백질이 항원과 화학적으로 접합되는 경우, 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위는 화합물인 화학적 가교제를 통해 연결될 수 있다.

가교제의 예는 비제한적으로, SMPH, 술포-MBS, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-SIAB, 술포-SMPB, 술포-SMCC, SVSB, SIA 및 Pierce Chemical Company사에서 시판되는 기타 가교제를 포함한다.

바람직하게는, 항원은 유전공학에 의해 생성된 융합 단백질로서 치쿤구니야 바이러스 구조 단백질 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 구조 단백질에 연결될 수 있다.

본 발명에서 사용한 치쿤구니야 바이러스 구조 단백질 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 구조 단백질은 치쿤구니야 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 외피 단백질 또는 캡시드 또는 하나 이상의 외피 단백질 및/또는 캡시드 단백질의 복합체일 수 있다.

치쿤구니야 바이러스의 예는 비제한적으로, 37997 및 LR2006 OPY-1 의 균주를 포함한다.

베네수엘라 말 뇌염 바이러스의 예는 비제한적으로, TC-83 을 포함한다.

본 발명에서 사용한 치쿤구니야 바이러스 구조 단백질 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 구조 단백질은 자연발생적 바이러스 구조 단백질 또는 이의 개질된 단백질일 수 있다. 개질된 단백질은 자연발생적 바이러스 구조 단백질의 단편일 수 있다. 한 구현예에서, 개질된 단백질은 자연발생적 바이러스 캡시드 및/또는 외피 단백질에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 한 구현예에서, 개질된 단백질은 자연발생적 바이러스 캡시드 및/또는 외피 단백질을 기반으로 최대 10% 의 아미노산이 결실되고, 치환되고/되거나 첨가되는 돌연변이체이다. 예를 들어, K64A 또는 K64N 돌연변이는 본 발명에서 사용한 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 구조 단백질의 캡시드에 도입될 수 있다.

치쿤구니야 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 구조 단백질은 캡시드, E2 및 El 로 이루어지거나 이를 포함할 수 있다.

치쿤구니야 바이러스 구조 단백질의 예는 비제한적으로, 치쿤구니야 바이러스 균주 37997 의 캡시드-E2-E1, 및 치쿤구니야 바이러스 LR2006 OPY-1 의 캡시드-E2-E1 을 포함한다.

베네수엘라 말 뇌염 바이러스 구조 단백질의 예는 비제한적으로, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 균주 TC-83 의 캡시드-E2-E1 을 포함한다.

예시적인 치쿤구니야 바이러스 구조 단백질 서열이 Genbank 접근 번호 ABX40006.1 로 제공되며, 하기에 기재된다 (SEQ ID No.:1):

또 다른 예시적인 치쿤구니야 바이러스 구조 단백질 서열이 Genbank 접근 번호 ABX40011.1 로 제공되며, 하기에 기재된다 (SEQ ID No.:2):

예시적인 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 구조 단백질이 Genbank 접근 번호 L01443.1 (http:"www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/L01443.1) 로 제공되며, 하기에 기재된다 (SEQ ID No.:3):

한 구현예에서, 제 1 결합 부위는 아미노기, 바람직하게는 리신 잔기의 아미노기를 포함한다. 한 구현예에서, 제 2 결합 부위는 술프히드릴기, 바람직하게는 시스테인의 술프히드릴기를 포함한다.

본 발명에 따라서, 치쿤구니야 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드 (예를 들어 PD-L1, PD-L2) 에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원 {이때 상기 치쿤구니야 바이러스 구조 단백질 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 구조 단백질 및 항원은 융합 단백질로서 발현됨} 을 포함하는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 유사 입자가 제공될 수 있다.

PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드 (예를 들어 PD-L1, PD-L2) 에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원은 치쿤구니야 바이러스 구조 단백질 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 구조 단백질의 임의의 부위와 융합될 수 있다. 예를 들어, PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드 (예를 들어 PD-L1, PD-L2) 에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원은 치쿤구니야 바이러스 구조 단백질 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 구조 단백질의 N- 또는 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있거나, PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드 (예를 들어 PD-L1, PD-L2) 에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원은 치쿤구니야 바이러스 구조 단백질 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 구조 단백질에 삽입될 수 있다.

한 구현예에서, PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드 (예를 들어 PD-L1, PD-L2) 에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 항원은 치쿤구니야 바이러스 구조 단백질 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 구조 단백질의 E2 에 삽입된다. 예를 들어, 치쿤구니야 바이러스 구조 단백질에 관련하여, PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드 (예를 들어 PD-L1, PD-L2) 에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 항원은 SEQ ID No.:1 또는 2 의 잔기 519 와 520 사이 (즉, SEQ ID No.:1 또는 2 의 519-위치에서의 G 와 520-위치에서의 Q 사이); SEQ ID No.:1 또는 2 의 잔기 530 과 531 사이 (즉, SEQ ID No.:1 또는 2 의 530-위치에서의 G 와 531-위치에서의 S 사이); SEQ ID No.:1 또는 2 의 잔기 531 과 532 사이 (즉, SEQ ID No.:1 또는 2 의 531-위치에서의 S 와 532-위치에서의 N 사이); SEQ ID No.:1 또는 2 의 잔기 529 와 530 사이 (즉, SEQ ID No.:1 또는 2 의 529-위치에서의 G 와 530-위치에서의 G 사이); 또는 SEQ ID No.:1 또는 2 의 잔기 510 과 511 사이 (즉, SEQ ID No.:1 또는 2 의 510-위치에서의 S 와 511-위치에서의 G 사이); 또는 SEQ ID No.:1 또는 2 의 잔기 511 과 512 사이 (즉, SEQ ID No.:1 또는 2 의 511-위치에서의 G 와 512-위치에서의 N 사이); 또는 SEQ ID No.:1 또는 2 의 잔기 509 와 510 사이 (즉, SEQ ID No.:1 또는 2 의 509-위치에서의 Q 와 510-위치에서의 S 사이) 에 삽입된다. VLP_CHI 532 벡터 (SEQ ID No.: 25) 는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자를 제조하는데 사용될 수 있으며, 이때 항원이 SEQ ID No.1 또는 2 의 잔기 531 과 532 사이에 삽입된다.

예를 들어, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 구조 단백질에 관련하여, PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드 (예를 들어 PD-L1, PD-L2) 에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 항원은 SEQ ID No.:3 의 잔기 517 과 518 사이 (즉, SEQ ID No.:3 의 517-위치에서의 G 와 518-위치에서의 S 사이); SEQ ID No.:3 의 잔기 518 과 519 사이 (즉, SEQ ID No.:3 의 518-위치에서의 S 와 519-위치에서의 S 사이); SEQ ID No.:3 의 잔기 519 와 520 사이 (즉, SEQ ID No.:3 의 519-위치에서의 S 와 520-위치에서의 V 사이); SEQ ID No.:3 의 잔기 515 와 516 사이 (즉, SEQ ID No.:3 의 515-위치에서의 L 과 516-위치에서의 S 사이); SEQ ID No.:3 의 잔기 516 과 517 사이 (즉, SEQ ID No.:3 의 516-위치에서의 S 와 517-위치에서의 G 사이); SEQ ID No.:3 의 잔기 536 과 537 사이 (즉, SEQ ID No.:3 의 536-위치에서의 C 와 537-위치에서의 G 사이); SEQ ID No.:3 의 잔기 537 과 538 사이 (즉, SEQ ID No.:3 의 537-위치에서의 G 와 538-위치에서의 G 사이); SEQ ID No.:3 의 잔기 538 과 539 사이 (즉, SEQ ID No.:3 의 538-위치에서의 G 와 539-위치에서의 T 사이) 에 삽입된다. VLP_VEEV VLP 518 벡터 (SEQ ID No.:26) 는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 유사 입자를 제조하는데 사용될 수 있으며, 이때 항원이 SEQ ID No.3 의 잔기 517 과 518 사이에 삽입된다.

융합 단백질은 당해 기술 분야에서의 종래의 기법을 사용하여 발현될 수 있다. 다양한 발현 시스템을 융합 단백질 발현에 사용할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 293 세포, Sf9 세포 또는 대장균 (E.coli) 에서 발현될 수 있다.

치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 에서 유래한 단백질은 자연발생적 바이러스 단백질 또는 이의 개질된 단백질일 수 있다.

바이러스에서 유래한 단백질이 항원에서 유래한 단백질과 접합되는 경우, SG, GS, SGG, GGS, SGSG 및 TRGGS 를 포함하는 링커 펩티드가 사용될 수 있다. 바이러스에서 유래한 단백질 (하기에서 "PFV" 로 나타냄) 과 항원에서 유래한 단백질 (하기에서 "PFA" 로 나타냄) 의 접합의 예는 비제한적으로: PFV-SG-PFA-GS-PFV; PFV-SG-PFA-GGS-PFV; PFV-SSG-PFA-GS-PFV; PFV-SGG-PFA-GGS-PFV; PFV-SGSG-PFA-GS-PFV; 및 PFA-SGG-PFA-TRGGS-PFV 를 포함한다.

한 구현예에서, 본 발명은 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 에서 유래한 단백질 및 PD-1 또는 PD-L1 에서 유래한 단백질의 융합 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자를 제공하며, 이때 상기 바이러스 유사 입자는 SEQ ID No.:27-32 로 나타내는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포유류 세포 (예를 들어 293F 세포) 에 트랜스펙션시켜 제조된다. 이러한 구현예에 관련하여, 개질된 융합 단백질은 또한 본 발명에 의해 제공되는 바이러스 유사 입자에 사용될 수 있으며, 이는 SEQ ID No.: 27-32 에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포유류 세포 (예를 들어 293F 세포) 에 트랜스펙션시켜 제조될 수 있다.

한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하거나 이것으로 이루어지는 바이러스 유사 입자를 제공한다:

치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 의 하나 이상의 캡시드;

치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 의 하나 이상의 E1; 및

치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 의 하나 이상의 E2, 이때 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드 (예를 들어 PD-L1, PD-L2) 에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원은 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 의 E2 에 삽입된다. 예를 들어, 본 발명은 하기를 포함하거나 이것으로 이루어지는 바이러스 유사 입자를 제공한다:

치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 의 240 개 캡시드;

치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 의 240 개 E1; 및

치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 의 240 개 E2, 이때 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드 (예를 들어 PD-L1, PD-L2) 에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원은 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 의 각각의 E2 에 삽입된다.

이러한 구현예에서, 항원이 삽입되는 E2 는 SEQ ID No.:33-36 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고; E1 은 SEQ ID No.:37 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며; 캡시드는 SEQ ID No.: 38 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고; 또는

항원이 삽입되는 E2 는 SEQ ID No.:39-42 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고; E1 은 SEQ ID No.:43 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며; 캡시드는 SEQ ID No.:44 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

또한 상기 구현예에 관련하여, 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 의 개질된 캡시드, 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 의 개질된 E1 및 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 의 개질된 E2 를 바이러스 유사 입자에 사용할 수 있다. 예를 들어, 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 의 개질된 캡시드는 SEQ ID No.:38 또는 SEQ ID No.:44 로 나타내는 아미노산 서열에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있고; 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 의 개질된 E1 은 SEQ ID No.:37 또는 SEQ ID No.:43 으로 나타내는 아미노산 서열에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있고/있거나; 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 의 개질된 E2 는 SEQ ID No.:33-36 또는 SEQ ID No.:39-42 로 나타내는 아미노산 서열에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 또한, 개질된 캡시드, E1 또는 E2 는 SEQ ID No.:38 또는 SEQ ID No.:44 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 캡시드; SEQ ID No.:37 또는 SEQ ID No.:43 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 E1; 및/또는 SEQ ID No.:33-36 또는 SEQ ID No.:39-42 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 E2 를 기반으로 최대 10% 의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 첨가되는 돌연변이체일 수 있다.

바이러스 유사 입자는 바이러스 유사 입자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터를 세포 (예를 들어 293 세포) 에 도입하고, 초원심분리 방법을 사용하여 조건화 배지로부터 상기 바이러스 유사 입자를 회수함으로써 제조될 수 있다.

(2) 뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포

제 2 양태에서, 본 발명은 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 개시된 입자를 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명에 의해 제공된 핵산 분자는 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 유사 입자를 발현하기 위한 단리된 핵산 분자일 수 있다.

당업자는 SEQ ID No.:63-64 로 나타내는 외피 및/또는 캡시드를 인코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열을 기반으로 상기 기재한 본 발명에 의해 제공된 핵산 분자를 제조할 수 있다.

예를 들어, 당업자는 PD-1 또는 PD-L1 에서 유래한 항원을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 치쿤구니야 또는 베네수엘라 말 바이러스 구조 단백질의 E2 를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 도입하여, 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자 또는 베네수엘라 말 바이러스 유사 입자가 발현되도록 벡터에 도입되는 핵산 분자를 제조할 수 있다. 항원-유래 서열이 상기 기재한 바와 같이 E2 에 도입되는 뉴클레오티드 서열의 예는 비제한적으로, SEQ ID No.:27 또는 29 로 나타내는 뉴클레오티드 서열 (PD-1 항원을 포함하는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자 발현을 위함); SEQ ID No.:31 로 나타내는 뉴클레오티드 서열 (PD-L1 항원을 포함하는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자 발현을 위함); SEQ ID No.:28 또는 30 으로 나타내는 뉴클레오티드 서열 (PD-1 항원을 포함하는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 유사 입자 발현을 위함); 및 SEQ ID No.:32 로 나타내는 뉴클레오티드 서열 (PD-L1 항원을 포함하는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 유사 입자 발현을 위함) 을 포함한다.

한 구현예에서, 본 발명은 상기 기재한 바와 같이 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하며, 이때 상기 벡터는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 임의로 포함한다.

발현 제어 서열의 예는 비제한적으로, 프로모터 예컨대 CMV 프로모터, 파지 람다 PL 프로모터, 대장균 lac, phoA 및 tac 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터, 및 레트로바이러스 LTR 의 프로모터를 포함한다.

이러한 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 벡터가 본 발명에 의해 제공된 입자를 제조하기 위한 발현 벡터로서 사용될 수 있다.

발현 벡터는 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 WO/2012/006180 을 기반으로 당업자에 의해 제조될 수 있다.

치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 에서 유래한 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원의 융합 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자를 발현하는데 사용할 수 있는 벡터의 예는 VLP31.11 벡터 (SEQ ID No.:45) 및 VLP274.11 벡터 (SEQ ID No.:46) 로 나타낸 벡터를 포함한다.

치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 에서 유래한 단백질 및 PD-L1 에서 유래한 항원의 융합 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자를 발현하는데 사용될 수 있는 벡터의 예는 VLP299.15 벡터 (SEQ ID No.:47) 로 나타낸 벡터를 포함한다.

베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 에서 유래한 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원의 융합 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자를 발현하는데 사용될 수 있는 벡터의 예는 VLP31.21 벡터 (SEQ ID No.:48) 및 VLP274.21 벡터 (SEQ ID No.:49) 로 나타낸 벡터를 포함한다.

베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 에서 유래한 단백질 및 PD-L1 에서 유래한 항원의 융합 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자를 발현하는데 사용될 수 있는 벡터의 예는 VLP299.25 벡터 (SEQ ID No.:50) 로 나타낸 벡터를 포함한다.

SEQ ID No:45-50 중 어느 하나로 나타내는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 핵산 분자 및 SEQ ID No.:45-50 중 어느 하나로 나타내는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자를 기반으로 최대 10% 의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 첨가되는 돌연변이체일 수 있는 핵산 분자가 또한 본 발명에 의해 제공된다.

또한, 상기 기재한 벡터를 숙주 세포에 도입하여 제조된 재조합체 세포가 본 발명에 의해 제공된다. 예를 들어, CHO 세포 또는 293 세포가 숙주 세포로서 사용된다.

(3) 약학 조성물, 키트

제 3 양태에서, 본 발명은 약학 조성물 및 약학 조성물을 포함하는 키트를 제공하며, 이때 상기 약학 조성물은 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 입자; 또는 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 입자를 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.

한 구현예에서, 본 발명은 약학 조성물 또는 약학 조성물을 포함하는 키트를 제공하며, 이때 상기 약학 조성물은 상기 기재한 바와 같은 알파바이러스 또는 플라비바이러스 바이러스 유사 입자 (예를 들어 치쿤구니야 바이러스 유사 입자 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 유사 입자) 또는 상기 기재한 바와 같은 핵산 분자; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 알파바이러스 또는 플라비바이러스 바이러스 유사 입자의 함량 및 핵산 분자의 함량은 약학 조성물의 0.00001-1 w/w% 일 수 있다.

본 발명에 의해 제공된 입자 (예를 들어 CHIKV VLP 또는 VEEV VLP) 의 투약량은 1-500 ㎍/일일 수 있다.

하나 이상의 PD-1 항원 또는 PD-1 리간드 항원을 본 발명에 의해 제공된 하나의 약학 조성물에 사용할 수 있다.

약학 조성물은 아쥬반트 (adjuvant) 를 추가로 포함할 수 있다. 아쥬반트의 예는 비제한적으로, Ribi 용액 (Sigma Adjuvant system, Sigma-Aldrich) 을 포함한다. 본 발명에 의해 제공된 약학 조성물은 완충제 예컨대 이염기성 인산나트륨 수화물, 인산이수소나트륨 및 염화나트륨; 및 보존제 예컨대 티메로살 (thimerosal) 을 함유할 수 있다. 한 구현예에서, 약학 조성물은 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 또는 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 0.001-1 w/w% 의 입자 (예를 들어 CHIKV VLP 또는 VEEV VLP), 1-10 w/w% 의 완충제, 0.01-1 w/w% 의 아쥬반트 및 0.00001-0.001 w/w% 의 보존제를 함유하는 수용액이다.

당업자는 종래의 기법을 사용하여 약학 조성물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 또는 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 입자 (예를 들어 CHIKV VLP 또는 VEEV VLP) 를 생리학적 pH (예를 들어 pH 5-9, pH 7) 를 갖는 완충액과 혼합하여 본 발명에 의해 제공된 약학 조성물을 제조한다.

한 구현예에서, 약학 조성물은 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 입자를 포함하는 백신 또는 면역자극제이다. 예를 들어, 본 발명에 의해 제공된 백신 조성물은 면역치료요법 (예를 들어 암 치료) 에 사용될 수 있다.

한 구현예에서, 약학 조성물은 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 입자를 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 DNA 백신이다. 한 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 DNA 백신은 CpG 함유 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 제 3 양태에서 제공된 약학 조성물은 1 회 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 제 3 양태에서 제공된 약학 조성물은 1 회 초과로 투여되는 경우, 본 발명의 제 1 양태에서 제공된 상이한 입자 (예를 들어 CHIKV VLP 또는 VEEV VLP) 를 각 투여에 사용할 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 제 1 양태에서 제공된 CHIKV VLP 를 사용하는 면역화 및 본 발명의 제 1 양태에서 제공된 VEEV VLP 를 사용하는 면역화의 조합을 이용한다. 예를 들어, 본 발명의 제 1 앙태에서 제공된 CHIKV VLP 는 1 차 면역화에 사용될 수 있고 본 발명의 제 1 양태에서 제공된 VEEV VLP 는 2 차 면역화에 사용될 수 있거나, 본 발명의 제 1 양태에서 제공된 VEEV VLP 는 1 차 면역화에 사용될 수 있고 본 발명의 제 1 양태에서 제공된 CHIKV VLP 는 2 차 면역화에 사용될 수 있다.

당업자는 본 발명에 의해 제공된 조성물 또는 백신을 사용하는 면역화의 시기를 결정할 수 있다. 예를 들어, 2 차 면역화는 1 차 면역 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 주 후에 수행된다.

한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 키트를 제공하며:

(a) 본 발명의 제 1 양태에서 제공된 입자를 포함하는 약학 조성물; 및

(b) 본 발명의 제 1 양태에서 제공된 입자를 포함하는 또 다른 약학 조성물,

이때 (a) 에 포함된 입자는 (b) 에 포함된 입자와 상이한 바이러스 유사 입자이다. 이러한 구현예에서, (a) 에 포함된 입자는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자일 수 있고 (b) 에 포함된 입자는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 유사 입자일 수 있다.

한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 키트를 제공하며:

(a) 본 발명의 제 1 양태에서 제공된 입자를 포함하는 약학 조성물; 및

(b) 본 발명의 제 1 양태에서 제공된 입자를 포함하는 또 다른 약학 조성물,

(c) 각각 본 발명의 제 1 양태에서 제공된 입자를 포함하는 하나 이상의 약학 조성물,

이때 (a) 는 면역화 준비에 사용되고 (b) 및 (c) 는 면역화 증강에 사용되며; (a) 에 포함된 입자는 (b) 에 포함된 입자와 상이한 바이러스 유사 입자이고; (c) 에 포함된 입자는 (a) 및 (b) 에 포함된 입자와 상이하거나, (a) 또는 (b) 에 포함된 입자와 동일하다.

상기 기재한 키트에 포함된 각각의 약학 조성물은 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 제 1 양태에서 제공된 알파바이러스 또는 플라비바이러스 바이러스 유사 입자 (예를 들어 치쿤구니야 바이러스 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스) 또는 본 발명의 제 2 양태에서 제공된 핵산 분자는 본 발명의 제 3 양태에서 제공된 약학 조성물에 사용될 수 있다.

예를 들어, 치쿤구니야 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 유사 입자는 하기를 포함하거나 이것으로 이루어진다:

치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 의 하나 이상의 (예를 들어 240 개) 캡시드;

치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 의 하나 이상의 (예를 들어 240 개) E1; 및

치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 의 하나 이상의 (예를 들어 240 개) E2, 이때 PD-1 항원은 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 의 E2 에 삽입되어 본 발명의 제 3 양태에서 제공된 조성물 또는 백신을 제조하는데 사용될 수 있다. 항원이 삽입되는 E2 는 SEQ ID No.:33-36 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고; E1 은 SEQ ID No.:37 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고; 캡시드는 SEQ ID No.:38 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고; 또는

항원이 삽입되는 E2 는 SEQ ID No.:39-42 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고; E1 은 SEQ ID No.:43 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고; 캡시드는 SEQ ID No.:44 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

(4) 개시된 입자 등의 용도

제 4 양태에서, 본 발명은 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 입자; 또는 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 입자를 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의, 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방; 포유동물 (예를 들어 인간) 에서의 PD-1 또는 PD-1 의 리간드에 대항하는 항체의 생성; 면역 반응의 조절; 면역자극; PD-1 과 PD-1 의 리간드 사이의 상호작용 억제; 또는 PD-1 활성 억제를 위한 약학 조성물 또는 키트의 제조를 위한 용도를 제공한다. 암 또는 감염성 질환을 치료 또는 예방하고; 포유동물 (예를 들어 인간) 에서 PD-1 또는 PD-1 리간드에 대항하는 항체를 생성하고; 면역 반응을 조절하고; 면역자극하고; PD-1 과 PD-1 의 리간드 사이의 상호작용을 억제하거나; PD-1 활성을 억제하는 방법에서 사용되는 본원에 개시된 입자, 약학 조성물 또는 키트가 또한 제공된다.

약학 조성물은 포유동물 (예를 들어 인간) 에게 근육내 (i.m.), 피부내 (i.c.), 피하 (s.c.), 피내 (i.d.) 또는 복강내 (i.p.) 투여될 수 있다.

한 구현예에서, 약학 조성물은 면역치료요법 (예를 들어 암 치료) 에 적용될 수 있는 백신이다.

치료할 수 있는 암의 예는 비제한적으로, 흑색종, 신장암, 전립선암, 유방암, 결장암 및 비-소세포 폐암을 포함한다. 암의 기타 예는 비제한적으로, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부 암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부 암, 위암, 고환암, 나팔관 암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 외음부 암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병 예컨대 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 아동기 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장 또는 요관암, 신우암종, 중추신경계 (CNS) 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 신생혈관생성, 척추 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 유피암, 편평세포암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유도된 것들을 포함하는 환경적으로 유도된 암, 및 이의 조합을 포함한다.

치료할 수 있는 감염성 질환의 예는 비제한적으로, HIV, 인플루엔자, 헤르페스, 가르디아 (Guardia), 말라리아, 리슈마니아 (Leishmania), 바이러스 헤파티티스 (A, B 및 C), 헤르페스 바이러스 (예를 들어, VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II, 및 CMV, 엡스타인 바 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 (coxsackie) 바이러스, 코르노바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 천연두 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 파필로마바이러스, 물사마귀 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스에 의한 병원성 감염, 박테리아 클라미디아, 리케차 박테리아, 마이코박테리아, 포도상구균, 연쇄상구균, 폐렴구균, 뇌척수막염균 및 코노코쿠스 (conococci), 크렙시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레지오넬라, 디프테리아, 살모넬라, 바실러스, 콜레라, 파상풍, 보툴리눔 식중독, 탄저병, 흑사병, 렙토스피라증 및 라임병 박테리아에 의한 병원성 감염, 진균 칸디다 (Candida) (알비칸스 (albicans), 크루세이 (krusei), 글라브라타 (glabrata), 트로피칼리스 (tropicalis) 등), 크립토코쿠스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 아스페르길루스 (Aspergillus) (푸미가투스 (fumigatus), 니게르 (niger) 등), 털곰팡이 속 (Genus Mucorales) (무코르 (mucor), 압시디아 (absidia), 리조푸스 (rhizophus)), 스포로트릭스 스켄키 (Sporothrix schenkii), 블라스토마이세스 데르마티티디스 (Blastomyces dermatitidis), 파라코키디오이데스 브라실리엔시스 (Paracoccidioides brasiliensis), 코키디오이데스 이미티스 (Coccidioides immitis) 및 히스토플라스마 캡슐라툼 (Histoplasma capsulatum) 에 의한 병원성 감염, 및 기생충 엔타모에바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica), 발란티디움 콜리 (Balantidium coli), 네글레리아파울러리 (Naegleriafowleri), 아칸타모에바 종 (Acanthamoeba sp.), 지아르디아 람비아 (Giardia lambia), 크립토스포리디움 종 (Cryptosporidium sp.), 뉴모시스티스 카리니이 (Pneumocystis carinii), 플라스모디움 비박스 (Plasmodium vivax), 바베시아 마이크로티 (Babesia microti), 트리파노소마 브루세이 (Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi), 리슈마니아 도노바니 (Leishmania donovani), 톡소플라스마 곤디 (Toxoplasma gondi) 및 니포스트론길루스 브라실리엔시스 (Nippostrongylus brasiliensis) 에 의한 병원성 감염을 포함한다.

바이러스 구조 단백질 및 PD-1 또는 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 약학 조성물이 포유동물 (예를 들어 인간) 에게 투여되는 경우, PD-1 또는 PD-1 의 리간드에 대항하는 항체는 포유동물의 혈액 중에서 생성된다. 생성된 항체는 면역 반응을 조절할 수 있고; 면역자극 효과를 나타낼 수 있고; PD-1 과 PD-1 의 리간드 (예를 들어 PD-L1, PD-L2) 사이의 상호작용을 억제할 수 있거나; PD-1 활성을 억제할 수 있다.

생성된 항체는 종래의 기법을 사용하여 인간화될 수 있다. 본 발명의 제 1 양태에서 제공된 입자를 사용하여, 단일클론 항체 또는 다클론 항체를 제조할 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 제 1 양태에서 제공된 입자를 비-인간 포유동물에 투여하고 비-인간 포유동물 생성 항체를 인간화시키는 것을 포함하는, PD-1 또는 PD-1 의 리간드에 대항하는 항체를 생성하는 방법을 제공한다.

본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "항체" 는 에피토프 또는 항원 결정자와 결합할 수 있는 분자를 나타낸다. 상기 용어는 전체 항체 및 이의 항원-결합 단편, 예컨대 단일 사슬 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 항체는 인간 항원 결합 항체 단편을 포함하며, 비제한적으로, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일 사슬 Fv (scFv), 단일 사슬 항체, 디술피드-연결 Fv (sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편을 포함한다. 항체는 조류 및 포유동물을 포함하는 임의의 동물 기원으로부터의 것일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 포유류 예를 들어 인간, 쥐과, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말 등, 또는 기타 적합한 동물 예를 들어 닭으로부터의 것이다. 본원에서 사용한 바와 같이, "인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하며 인간 면역글로불린 라이브러리 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대한 트랜스제닉 동물로부터 단리되고 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 항체를 포함한다 (예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,939,598 에 기재된 바와 같음).

용어 "PD-1 활성" 은 PD-1 과 관련된 하나 이상의 면역조절 활성을 나타낸다. 예를 들어, PD-1 은 TcR/CD28-매개 면역 반응의 부정적 조절자이다. 따라서, 면역 반응 조절의 예는 비제한적으로, TcR/CD28-매개 면역 반응을 증진시키는 것을 포함한다.

한 구현예에서, 본 발명은 입자의 발현을 위해 설계된 벡터를 제조하고; 입자가 발현하도록 벡터로 트랜스펙션된 세포를 배양하고; 입자를 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 제 1 양태에서 제공된 치쿤구니야 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 유사 입자를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 구현예에서, 트랜스펙션은 종래의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 트랜스펙션에 사용하는 세포는 293 세포일 수 있다. VLP 를 회수하는 것은, 세포가 벡터로 트랜스펙션된 후 조건화 배지를 수집하는 것을 포함할 수 있으며, 초원심분리를 사용하여 조건화 배지로부터 VLP 를 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

하기의 예시적 구현예 (1)-(35) 가 본 발명에 의해 추가로 제공된다:

(1) 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 항원을 포함하는 입자;

(2) (1) 에 따른 입자의 유도체인 입자;

(3) (1) 또는 (2) 에 있어서, 항원이 PD-1, PD-L1 또는 PD-L2 에서 유래한 항원인 입자;

(4) (1)-(3) 중 어느 하나에 있어서, 입자를 동물에 투여하는 것이 항원에 대항한 항체를 유도하고 상기 항체가 및 PD-1 및 PD-L1 상호작용 또는 PD-1 및 PD-L2 상호작용을 차단하는 입자;

(5) (1)-(4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 입자가 바이러스 유사 입자인 입자;

(6) (1)-(5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 입자가 알파바이러스 또는 플라비바이러스에서 유래한 바이러스 유사 입자인 입자;

(7) (1)-(6) 중 어느 하나에 있어서, 상기 입자가 치쿤구니야 바이러스 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스에서 유래한 바이러스 유사 입자인 입자;

(8) (1)-(7) 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 구조 단백질이 하나 이상의 제 1 결합 부위를 포함하고, 하나 이상의 항원이 하나 이상의 제 2 결합 부위를 포함하고, 바이러스 구조 단백질 및 항원이 하나 이상의 제 1 결합 부위 및 하나 이상의 제 2 결합 부위를 통해 연결되며, 입자가 바이러스 유사 입자인 입자;

(9) (1)-(8) 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 구조 단백질이 캡시드 및/또는 외피 단백질 E1 및 E2 를 포함하는 입자;

(10) (9) 에 있어서, PD-1 에서 유래한 하나 이상의 항원 또는 PD-L1 에서 유래한 하나 이상의 항원이 외피 단백질의 E2 에 삽입되는 입자;

(11) (1)-(10) 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 구조 단백질이 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 에서 유래한 단백질인 입자;

(12) (1)-(11) 중 어느 하나에 있어서, 입자가 PD-1 에서 유래한 항원이 삽입되는 하나 이상의 외피 단백질 E2, 하나 이상의 외피 단백질 E1 및 하나 이상의 캡시드로 이루어지는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자이며,

PD-1 에서 유래한 항원이 삽입되는 외피 단백질 E2 는 SEQ ID No.:33-35 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고; 외피 단백질 E1 은 SEQ ID No.:37 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고; 캡시드는 SEQ ID No.:38 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 입자;

(13) (1)-(11) 중 어느 하나에 있어서, 입자가 PD-1 에서 유래한 항원이 삽입되는 하나 이상의 외피 단백질 E2, 하나 이상의 외피 단백질 E1 및 하나 이상의 캡시드로 이루어지는 베네수엘라 말 바이러스 유사 입자이며,

PD-1 에서 유래한 항원이 삽입되는 외피 단백질 E2 는 SEQ ID No.:39-41 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고; 외피 단백질 E1 은 SEQ ID No.:43 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고; 캡시드는 SEQ ID No.:44 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 입자;

(14) (1)-(11) 중 어느 하나에 있어서, 입자가 PD-L1 에서 유래한 항원이 삽입되는 하나 이상의 외피 단백질 E2, 하나 이상의 외피 단백질 E1 및 하나 이상의 캡시드로 이루어지는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자이며,

PD-L1 에서 유래한 항원이 삽입되는 외피 단백질 E2 는 SEQ ID No.:36 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고; 외피 단백질 E1 은 SEQ ID No.:37 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고; 캡시드는 SEQ ID No.:38 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 입자;

(15) (1)-(11) 중 어느 하나에 있어서, 입자가 PD-L1 에서 유래한 항원이 삽입되는 하나 이상의 외피 단백질 E2, 하나 이상의 외피 단백질 E1 및 하나 이상의 캡시드로 이루어지는 베네수엘라 말 바이러스 유사 입자이며, PD-L1 에서 유래한 항원이 삽입되는 외피 단백질 E2 는 SEQ ID No.:42 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고; 외피 단백질 E1 은 SEQ ID No.:43 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고; 캡시드는 SEQ ID No.44 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 입자;

(16) (1)-(15) 중 어느 하나에 따른 입자의 아미노산 서열과 90% 이상 (또는 95% 이상) 의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 입자;

(17) (1)-(16) 중 어느 하나에 따른 입자를 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자;

(18) SEQ ID No.:27-32 중 어느 하나로 나타내는 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 단리된 핵산 분자;

(19) (18) 에 있어서, 핵산 분자가 SEQ ID No.:27-32 중 어느 하나로 나타내는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산 분자;

(20) (17)-(19) 중 어느 하나에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 상기 벡터가 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 임의로 포함하는 벡터 (예를 들어 SEQ ID No. 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 으로 나타내는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 벡터);

(21) 하기를 포함하는 약학 조성물:

(a) (1)-(16) 중 어느 하나에 따른 입자, (17)-(19) 중 어느 하나에 따른 핵산 분자 및/또는 (20) 에 따른 벡터; 및

(b) 약학적으로 허용가능한 담체;

(22) (21) 에 있어서, 약학 조성물이 (1)-(16) 중 어느 하나에 따른 입자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물 (예를 들어 백신);

(23) (1)-(16) 중 어느 하나에 따른 입자, (17)-(19) 중 어느 하나에 따른 핵산 분자 및/또는 (20) 에 따른 벡터의, 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방; 포유동물에서의 PD-1 또는 PD-1 의 리간드에 대항하는 항체의 생성; 면역 반응의 조절; 면역자극; PD-1 과 PD-1 의 리간드 사이의 상호작용 억제; 또는 PD-1 활성 억제를 위한 약학 조성물 또는 키트의 제조를 위한 용도;

(24) (23) 에 있어서, 약학 조성물을 투여하여 PD-L1 및/또는 PD-L2 가 PD-1 에 결합하는 것을 억제하는 용도;

(25) (23) 또는 (24) 에 있어서, 암이 흑색종, 신장암, 전립선암, 유방암, 결장암 또는 비-소세포 폐암인 용도;

(26) (23) 또는 (24) 에 있어서, 암이 골암, 췌장암, 피부암, 두경부 암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부 암, 위암, 고환암, 나팔관 암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 외음부 암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병 예컨대 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 아동기 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장 또는 요관암, 신우암종, 중추신경계 (CNS) 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 신생혈관생성, 척추 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 유피암, 편평세포암, T-세포 림프종, 석면에 의해 유도된 것들을 포함하는 환경적으로 유도된 암, 및 이의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 용도;

(27) (23) 또는 (24) 에 있어서, 감염성 질환이 HIV, 인플루엔자, 헤르페스, 가르디아 (Guardia), 말라리아, 리슈마니아 (Leishmania), 바이러스 헤파티티스 (A, B 및 C), 헤르페스 바이러스 (예를 들어, VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II, 및 CMV, 엡스타인 바 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 (coxsackie) 바이러스, 코르노바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 천연두 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 파필로마바이러스, 물사마귀 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스에 의한 병원성 감염, 박테리아 클라미디아, 리케차 박테리아, 마이코박테리아, 포도상구균, 연쇄상구균, 폐렴구균, 뇌척수막염균 및 코노코쿠스 (conococci), 크렙시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레지오넬라, 디프테리아, 살모넬라, 바실러스, 콜레라, 파상풍, 보툴리눔 식중독, 탄저병, 흑사병, 렙토스피라증 및 라임병 박테리아에 의한 병원성 감염, 진균 칸디다 (Candida) (알비칸스 (albicans), 크루세이 (krusei), 글라브라타 (glabrata), 트로피칼리스 (tropicalis) 등), 크립토코쿠스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 아스페르길루스 (Aspergillus) (푸미가투스 (fumigatus), 니게르 (niger) 등), 털곰팡이 속 (Genus Mucorales) (무코르 (mucor), 압시디아 (absidia), 리조푸스 (rhizophus)), 스포로트릭스 스켄키 (Sporothrix schenkii), 블라스토마이세스 데르마티티디스 (Blastomyces dermatitidis), 파라코키디오이데스 브라실리엔시스 (Paracoccidioides brasiliensis), 코키디오이데스 이미티스 (Coccidioides immitis) 및 히스토플라스마 캡슐라툼 (Histoplasma capsulatum) 에 의한 병원성 감염, 및 기생충 엔타모에바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica), 발란티디움 콜리 (Balantidium coli), 네글레리아파울러리 (Naegleriafowleri), 아칸타모에바 종 (Acanthamoeba sp.), 지아르디아 람비아 (Giardia lambia), 크립토스포리디움 종 (Cryptosporidium sp.), 뉴모시스티스 카리니이 (Pneumocystis carinii), 플라스모디움 비박스 (Plasmodium vivax), 바베시아 마이크로티 (Babesia microti), 트리파노소마 브루세이 (Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi), 리슈마니아 도노바니 (Leishmania donovani), 톡소플라스마 곤디 (Toxoplasma gondi) 및 니포스트론길루스 브라실리엔시스 (Nippostrongylus brasiliensis) 에 의한 병원성 감염으로 이루어지는 군에서 선택되는 용도;

(28) 하기를 포함하는 키트로서:

(a) (1)-(16) 중 어느 하나에 따른 입자를 포함하는 약학 조성물; 및

(b) (1)-(16) 중 어느 하나에 따른 입자를 포함하는 또 다른 약학 조성물,

이때, (a) 에 포함된 입자는 (b) 에 포함된 입자와 상이한 바이러스 유사 입자인 키트;

(29) (28) 에 있어서, (a) 에 포함된 입자가 치쿤구니야 바이러스 유사 입자이고 (b) 에 포함된 입자가 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 유사 입자이거나, (a) 에 포함된 입자가 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 유사 입자이고 (b) 에 포함된 입자가 치쿤구니야 바이러스 유사 입자인 키트;

(30) (28) 또는 (29) 에 있어서, (1)-(16) 중 어느 하나에 따른 입자를 각각 포함하는 (c) 하나 이상의 약학 조성물을 추가로 포함하는 키트로서, 이때 (a) 는 면역화 준비에 사용되고 (b) 및 (c) 는 면역화 증강에 사용되며; (c) 에 포함된 입자는 (a) 및 (b) 에 포함된 입자와 상이하거나, (a) 또는 (b) 에 포함된 입자와 동일한 키트;

(31) (28)-(30) 중 어느 하나에 있어서, 각각의 약학 조성물이 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여되는 키트;

(32) 암 또는 감염성 질환을 치료 또는 예방하고; 포유동물에서 PD-1 또는 PD-1 의 리간드에 대항하는 항체를 생성하고; 면역 반응을 조절하고; 면역자극하고; PD-1 과 PD-1 의 리간드 사이의 상호작용을 억제하거나; PD-1 활성을 억제하는 방법에서 사용하기 위한, (1)-(16) 중 어느 하나에 따른 입자, (17)-(20) 중 어느 하나에 따른 핵산 분자, (20) 에 따른 벡터, (21) 또는 (22) 에 따른 약학 조성물 또는 (28)-(31) 중 어느 하나에 따른 키트;

(33) 암이 (25) 또는 (26) 에서 기재된 암에서 선택되는, 암을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한, (1)-(16) 중 어느 하나에 따른 입자, (17)-(20) 중 어느 하나에 따른 핵산 분자, (20) 에 따른 벡터, (21) 또는 (22) 에 따른 약학 조성물 또는 (28)-(31) 중 어느 하나에 따른 키트;

(34) 감염성 질환이 (27) 에서 기재된 감염성 질환에서 선택되는, 감염성 질환을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한, (1)-(16) 중 어느 하나에 따른 입자, (17)-(20) 중 어느 하나에 따른 핵산 분자, (20) 에 따른 벡터, (21) 또는 (22) 에 따른 약학 조성물 또는 (28)-(31) 중 어느 하나에 따른 키트;

(35) 입자가 발현되도록 (20) 에 따른 벡터로 트랜스펙션되는 세포를 배양하고; 초원심분리를 사용하여 상기 입자를 정제하는 것을 포함하는, 치쿤구니야 바이러스 유사 입자 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 유사 입자를 제조하는 방법.

하기 실시예를 참조로 하여 본 발명을 상세히 설명하지만, 이것이 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 항원의 단편을 포함하는 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 유사 입자의 제조

하기 PD-1 의 폴리뉴클레오티드를 VLP_CHI 532 벡터 (SEQ ID No.:25) 에 삽입되는 것으로 사용하였다. N 말단 링커는 아미노산 서열에서 SGG 이며 (핵 서열에서 TCCGGAGGA) C 말단 링커는 아미노산 서열에서 GGS 이다 (핵 서열에서 GGAGGATCC).

1. VLP31 (PD-1 제 1 번 서열): 항원으로 사용한, PD-1 단편 결합 링커의 서열:

핵 서열

아미노산 서열

2. VLP32 (PD-1 제 2 번 서열): 항원으로 사용한, PD-1 단편 결합 링커의 또 다른 서열:

핵 서열

아미노산 서열

3. VLP33 (PD-1 제 3 번 서열): 항원으로 사용한, PD-1 단편 결합 링커의 또 다른 서열:

핵 서열

아미노산 서열

각각의 폴리뉴클레오티드를 SEQ ID No.2 의 531-위치에서의 Ser 를 인코딩하는 코돈과 532-위치에서의 Asn 을 인코딩하는 코돈 사이에 삽입하여, 개질된 PD-1-유래 펩티드가 치쿤구니야 바이러스 구조 단백질의 E2 에 삽입되는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자를 발현하기 위한 플라스미드 (이하, VLP31_11, VLP32_11 또는 VLP33_11 로 나타냄) 를 구축하였다.

293F 세포 (Lifetechnology) 를, PEI (GE Healthcare) 또는 GeneX (ATCC) 를 사용하여 플라스미드로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 4 일 후, 조건화 배지를 수집하고 3000 rpm 에서 15 분 동안 원심분리하여 세포로부터 이를 분리하였다. 상청액을 0.45 ㎛ 필터를 사용하여 여과하여, 바이러스 유사 입자를 수득하였다. 바이러스 유사 입자를 TFF 컬럼을 사용하여 농축하고 QXL 컬럼 (GE Healthcare) 을 사용하여 정제함으로써, 정제된 바이러스 유사 입자를 수득하였다.

치쿤구니야 바이러스 구조 단백질과 접합된 VLP31, 32 또는 33 을 포함하는 VLP 의 발현을, CHIKV (ATCC: VR-1241AF) 에 대해 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다.

실시예 2: 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 항원의 단편을 포함하는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 유사 입자의 제조

실시예 1 에서 사용한 PD-1 의 동일한 폴리뉴클레오티드를 VLP_VEEV VLP 518 벡터 (SEQ ID No.:26) 에 삽입되는 것으로 사용하였다. N 말단 링커 및 C 말단 링커는 실시예 1 에서와 동일하다.

각각의 폴리뉴클레오티드를 SEQ ID No.3 의 518-위치에서의 Ser 를 인코딩하는 코돈과 519-위치에서의 Ser 를 인코딩하는 코돈 사이에 삽입하여, 개질된 PD-1-유래 펩티드가 베네수엘라 말 뇌염 구조 단백질의 E2 에 삽입되는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 유사 입자를 발현하기 위한 플라스미드 (이하, VLP31_21, VLP32_21 또는 VLP33_21 로서 나타냄) 를 구축하였다.

293F 세포를 실시예 1 과 같은 플라스미드로 트랜스펙션하였다. 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 구조 단백질과 접합된 VLP　31, 32 또는 33 을 포함하는 VLP 의 발현을 VEEV 에 대해 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다.

실시예 3: 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 항원 또는 PD-L1 항원의 단편을 포함하는 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 유사 입자 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 유사 입자의 제조

마우스 PD-1 및 마우스 PD-L1 의 하기의 폴리뉴클레오티드를 VLP_CHI 532 벡터 (SEQ ID No.:25) 에 삽입되거나 VLP_VEEV VLP 518 벡터 (SEQ ID No.:26) 에 삽입되는 것으로 사용하였다. N 말단 링커는 아미노산 서열에서 SGG 이며 (핵 서열에서 TCCGGAGGA) C 말단 링커는 아미노산 서열에서 GGS 이다 (핵 서열에서 GGAGGATCC).

1. VLP299 (마우스PD-L1 서열): 항원으로 사용한, 마우스 PD-L1 도메인3S 부착 링커의 단편의 서열:

핵 서열

아미노산 서열

SGG-ciisyggadyC-GGS (SEQ ID No.:58)

2. VLP274 (마우스PD-1 서열): 항원으로 사용한, 마우스 PD-1 도메인2단길이 부착 링커의 단편의 서열:

핵 서열

아미노산 서열

SGG-gaislhpkakiees-GS (SEQ ID No.:60)

3. VLP275 (마우스PD-1 서열): 항원으로 사용한, 마우스 PD-1 도메인2단길이_v2 부착 링커의 단편의 서열:

핵 서열

아미노산 서열

SGG-cgaislhpkakieeC-GGS (SEQ ID No.:62)

각각의 폴리뉴클레오티드를 SEQ ID No.2 의 531-위치에서의 Ser 를 인코딩하는 코돈과 532-위치에서의 Asn 을 인코딩하는 서열 사이에 삽입하여, 개질된 PD-1-유래 펩티드 또는 개질된 PD-L1-유래 펩티드가 치쿤구니야 바이러스 구조 단백질의 E2 에 삽입되는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자를 발현하기 위한 플라스미드 (이하, VLP299-삽입 벡터에 대해서는 VLP299_15, VLP299_25; VLP274-삽입 벡터에 대해서는 VLP274_11, VLP274_15; VLP275-삽입 벡터에 대해서는 VLP275_11, VLP275_15 로 나타냄) 를 구축하였다.

293F 세포를 실시예 1 에서와 같은 플라스미드로 트랜스펙션하였다. 치쿤구니야 바이러스 구조 단백질과 접합된 VLP299, 274　또는 275 를 포함하는 VLP 의 발현을 CHIKV 또는 VEEV 에 대해 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다.

실시예 4:　PD-1 의 면역원성

마우스 PD-1 유전자에서 또한 발견되는 인간 PD-1 의 하기 폴리뉴클레오티드를 VLP_CHI 532 벡터 (SEQ ID No.:25) 에 삽입되거나 VLP_VEEV VLP 518 벡터 (SEQ ID No.:26) 에 삽입되는 것으로 사용하였다. N 말단 링커는 아미노산 서열에서 SGG 이고 (핵 서열에서 TCCGGAGGA) C 말단 링커는 아미노산 서열에서 GGS 이다 (핵 서열에서 GGAGGATCC).

핵 서열

아미노산 서열

폴리뉴클레오티드를 SEQ ID No.:2 의 531-위치에서의 Ser 를 인코딩하는 코돈과 532-위치에서의 Asn 을 인코딩하는 코돈 사이에 삽입하여, 개질된 PD-1-유래 펩티드가 치쿤구니야 바이러스 구조 단백질의 E2 에 삽입되는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자를 발현하기 위한 플라스미드 (이하, pCHIKV-hPD-1 로 나타냄) 를 구축하였다. 또한, 폴리뉴클레오티드를 SEQ ID No.:3 의 518-위치에서의 Ser 를 인코딩하는 코돈과 519-위치에서의 Ser 를 인코딩하는 코돈 사이에 삽입하여, 개질된 PD-1-유래 펩티드가 베네수엘라 말 뇌염 구조 단백질의 E2 에 삽입되는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 유사 입자를 발현하기 위한 플라스미드 (이하, pVEEV-hPD-1 로 나타냄) 를 구축하였다.

293F 세포 (Lifetechnology) 를 PEI (GE Healthcare) 또는 GeneX (ATCC) 를 사용하여 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 4 일 후, 조건화 배지를 수집하고 3000 rpm 에서 15 분 동안 원심분리하여 세로포부터 이를 분리하였다. 상청액을 0.45 ㎛ 필터를 사용하여 여과함으로써 바이러스 유사 입자를 수득하였다. 바이러스 유사 입자를 TFF 컬럼을 사용하여 농축하고 QXL 컬럼 (GE Healthcare) 을 사용하여 정제함으로써, 정제된 바이러스 유사 입자를 수득하였다. 정제된 바이러스 유사 입자를 회전 컬럼 (분자량-컷오프: 100kDa) 을 사용하여 추가 농축하여, 면역화를 위한 바이러스 유사 입자를 제조하였다 (CHIKV-hPD-1 및 VEEV-hPD-1).

마우스 (4 주령 수컷) 를, 아쥬반트 Ribi 를 근육내 주사하여 VEEV-hPD-1 로 0 및 8 주에서 2 회 (마우스 당 20 ug VLP) 면역화하고, 아쥬반트 Ribi (Sigma Adjuvant system, Sigma-Aldrich) 를 근육내 주사하여 CHIKV-hPD-1 로 4 주에서 1 회 (마우스 당 20 ug VLP) 면역화하였다. 혈액을 제 1 면역화 후 10 주에 채취하였다.

96 웰 ELISA 플레이트를 웰 당 100ul PBS 완충액 중 PD-1 (1-167aa) 또는 PD-1-Fc 접합체의 재조합체 N-말단 단편 50 ng 으로 코팅하였다. 2 시간 인큐베이션 후 플레이트를 0.05% Tween-20 을 함유하는 TBS 완충액으로 3 회 세척하고, 0.05% Tween-20 및 5% 분유를 함유하는 TBS 완충액으로 블로킹하였다. 마우스로부터의 열 불활성화된 희석 혈청을 블로킹 완충액에 첨가하고 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 3 회 세척 후, 퍼옥시다아제 표지된 염소 항-마우스 IgG 를 1:4000 희석물로 첨가하고 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 3 회 세척 후, 퍼옥시다아제 기질을 현상을 위해 첨가하고 10 분 동안 인큐베이션하고 2N H2SO4 를 첨가하여 현상을 중단시켰다. 데이터를 Gen5 (BioTek) 및 GraphPad Prism6 (GraphPad software Inc) 을 사용하여 분석하였다.

면역원성을 도 1 및 2 에 나타낸다. 도 1 및 2 에서 나타낸 바와 같이, PD-1 에 대항한 항체의 유도가 CHIKV-PD-1 및 VEEV-PD-1 로 면역화된 마우스의 혈청에서 발견되었다.

실시예 5: 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 항원의 단편을 포함하는 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 유사 입자 또는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 유사 입자를 포함하는 약학 조성물의 제조

바이러스 구조 단백질 및 PD-1 항원의 단편을 포함하는 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 유사 입자 및 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 항원의 단편을 포함하는 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEEV) 유사 입자를 실시예 4 에 따라 제조하였다.

백신 조성물인 약학 조성물을 제조하기 위해, 80 μg 의 각각의 제조된 입자를 1 ml 의 수크로오스 포스페이트 용액 (pH 7.2, 엔도톡신 불포함) (Teknova, SP buffer) 과 혼합하였다.

SEQUENCE LISTING <110> VLP THERAPEUTICS, LLC <120> VIRUS LIKE PARTICLE COMPRISING PD-1 ANTIGEN OR PD-1 LIGAND ANTIGEN <130> 672050 <150> US 61/845712 <151> 2013-07-12 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1248 <212> PRT <213> Chikungunya virus <400> 1 Met Glu Phe Ile Pro Thr Gln Thr Phe Tyr Asn Arg Arg Tyr Gln Pro 1 5 10 15 Arg Pro Trp Thr Pro Arg Pro Thr Ile Gln Val Ile Arg Pro Arg Pro 20 25 30 Arg Pro Gln Arg Gln Ala Gly Gln Leu Ala Gln Leu Ile Ser Ala Val 35 40 45 Asn Lys Leu Thr Met Arg Ala Val Pro Gln Gln Lys Pro Arg Arg Asn 50 55 60 Arg Lys Asn Lys Lys Gln Lys Gln Lys Gln Gln Ala Pro Gln Asn Asn 65 70 75 80 Thr Asn Gln Lys Lys Gln Pro Pro Lys Lys Lys Pro Ala Gln Lys Lys 85 90 95 Lys Lys Pro Gly Arg Arg Glu Arg Met Cys Met Lys Ile Glu Asn Asp 100 105 110 Cys Ile Phe Glu Val Lys His Glu Gly Lys Val Thr Gly Tyr Ala Cys 115 120 125 Leu Val Gly Asp Lys Val Met Lys Pro Ala His Val Lys Gly Thr Ile 130 135 140 Asp Asn Ala Asp Leu Ala Lys Leu Ala Phe Lys Arg Ser Ser Lys Tyr 145 150 155 160 Asp Leu Glu Cys Ala Gln Ile Pro Val His Met Lys Ser Asp Ala Ser 165 170 175 Lys Phe Thr His Glu Lys Pro Glu Gly Tyr Tyr Asn Trp His His Gly 180 185 190 Ala Val Gln Tyr Ser Gly Gly Arg Phe Thr Ile Pro Thr Gly Ala Gly 195 200 205 Lys Pro Gly Asp Ser Gly Arg Pro Ile Phe Asp Asn Lys Gly Arg Val 210 215 220 Val Ala Ile Val Leu Gly Gly Ala Asn Glu Gly Ala Arg Thr Ala Leu 225 230 235 240 Ser Val Val Thr Trp Asn Lys Asp Ile Val Thr Lys Ile Thr Pro Glu 245 250 255 Gly Ala Glu Glu Trp Ser Leu Ala Ile Pro Val Met Cys Leu Leu Ala 260 265 270 Asn Thr Thr Phe Pro Cys Ser Gln Pro Pro Cys Thr Pro Cys Cys Tyr 275 280 285 Glu Lys Glu Pro Glu Glu Thr Leu Arg Met Leu Glu Asp Asn Val Met 290 295 300 Arg Pro Gly Tyr Tyr Gln Leu Leu Gln Ala Ser Leu Thr Cys Ser Pro 305 310 315 320 His Arg Gln Arg Arg Ser Thr Lys Asp Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala 325 330 335 Thr Arg Pro Tyr Leu Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser 340 345 350 Cys His Ser Pro Val Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp 355 360 365 Gly Thr Leu Lys Ile Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp 370 375 380 Asp Ser His Asp Trp Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Asn His Met Pro 385 390 395 400 Ala Asp Ala Glu Arg Ala Gly Leu Phe Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys 405 410 415 Thr Ile Thr Gly Thr Met Gly His Phe Ile Leu Ala Arg Cys Pro Lys 420 425 430 Gly Glu Thr Leu Thr Val Gly Phe Thr Asp Ser Arg Lys Ile Ser His 435 440 445 Ser Cys Thr His Pro Phe His His Asp Pro Pro Val Ile Gly Arg Glu 450 455 460 Lys Phe His Ser Arg Pro Gln His Gly Lys Glu Leu Pro Cys Ser Thr 465 470 475 480 Tyr Val Gln Ser Thr Ala Ala Thr Thr Glu Glu Ile Glu Val His Met 485 490 495 Pro Pro Asp Thr Pro Asp Arg Thr Leu Met Ser Gln Gln Ser Gly Asn 500 505 510 Val Lys Ile Thr Val Asn Gly Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys 515 520 525 Gly Gly Ser Asn Glu Gly Leu Thr Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn 530 535 540 Cys Lys Val Asp Gln Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Lys Trp 545 550 555 560 Gln Tyr Asn Ser Pro Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Leu Gly Asp Arg 565 570 575 Lys Gly Lys Ile His Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg 580 585 590 Val Pro Lys Ala Arg Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val 595 600 605 Ile Met Leu Leu Tyr Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn 610 615 620 Met Gly Glu Glu Pro Asn Tyr Gln Glu Glu Trp Val Met His Lys Lys 625 630 635 640 Glu Val Val Leu Thr Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly 645 650 655 Asn Asn Glu Pro Tyr Lys Tyr Trp Pro Gln Leu Ser Thr Asn Gly Thr 660 665 670 Ala His Gly His Pro His Glu Ile Ile Leu Tyr Tyr Tyr Glu Leu Tyr 675 680 685 Pro Thr Met Thr Val Val Val Val Ser Val Ala Thr Phe Ile Leu Leu 690 695 700 Ser Met Val Gly Met Ala Ala Gly Met Cys Met Cys Ala Arg Arg Arg 705 710 715 720 Cys Ile Thr Pro Tyr Glu Leu Thr Pro Gly Ala Thr Val Pro Phe Leu 725 730 735 Leu Ser Leu Ile Cys Cys Ile Arg Thr Ala Lys Ala Ala Thr Tyr Gln 740 745 750 Glu Ala Ala Ile Tyr Leu Trp Asn Glu Gln Gln Pro Leu Phe Trp Leu 755 760 765 Gln Ala Leu Ile Pro Leu Ala Ala Leu Ile Val Leu Cys Asn Cys Leu 770 775 780 Arg Leu Leu Pro Cys Cys Cys Lys Thr Leu Ala Phe Leu Ala Val Met 785 790 795 800 Ser Val Gly Ala His Thr Val Ser Ala Tyr Glu His Val Thr Val Ile 805 810 815 Pro Asn Thr Val Gly Val Pro Tyr Lys Thr Leu Val Asn Arg Pro Gly 820 825 830 Tyr Ser Pro Met Val Leu Glu Met Glu Leu Leu Ser Val Thr Leu Glu 835 840 845 Pro Thr Leu Ser Leu Asp Tyr Ile Thr Cys Glu Tyr Lys Thr Val Ile 850 855 860 Pro Ser Pro Tyr Val Lys Cys Cys Gly Thr Ala Glu Cys Lys Asp Lys 865 870 875 880 Asn Leu Pro Asp Tyr Ser Cys Lys Val Phe Thr Gly Val Tyr Pro Phe 885 890 895 Met Trp Gly Gly Ala Tyr Cys Phe Cys Asp Ala Glu Asn Thr Gln Leu 900 905 910 Ser Glu Ala His Val Glu Lys Ser Glu Ser Cys Lys Thr Glu Phe Ala 915 920 925 Ser Ala Tyr Arg Ala His Thr Ala Ser Ala Ser Ala Lys Leu Arg Val 930 935 940 Leu Tyr Gln Gly Asn Asn Ile Thr Val Thr Ala Tyr Ala Asn Gly Asp 945 950 955 960 His Ala Val Thr Val Lys Asp Ala Lys Phe Ile Val Gly Pro Met Ser 965 970 975 Ser Ala Trp Thr Pro Phe Asp Asn Lys Ile Val Val Tyr Lys Gly Asp 980 985 990 Val Tyr Asn Met Asp Tyr Pro Pro Phe Gly Ala Gly Arg Pro Gly Gln 995 1000 1005 Phe Gly Asp Ile Gln Ser Arg Thr Pro Glu Ser Lys Asp Val Tyr 1010 1015 1020 Ala Asn Thr Gln Leu Val Leu Gln Arg Pro Ala Val Gly Thr Val 1025 1030 1035 His Val Pro Tyr Ser Gln Ala Pro Ser Gly Phe Lys Tyr Trp Leu 1040 1045 1050 Lys Glu Arg Gly Ala Ser Leu Gln His Thr Ala Pro Phe Gly Cys 1055 1060 1065 Gln Ile Ala Thr Asn Pro Val Arg Ala Val Asn Cys Ala Val Gly 1070 1075 1080 Asn Met Pro Ile Ser Ile Asp Ile Pro Glu Ala Ala Phe Thr Arg 1085 1090 1095 Val Val Asp Ala Pro Ser Leu Thr Asp Met Ser Cys Glu Val Pro 1100 1105 1110 Ala Cys Thr His Ser Ser Asp Phe Gly Gly Val Ala Ile Ile Lys 1115 1120 1125 Tyr Ala Ala Ser Lys Lys Gly Lys Cys Ala Val His Ser Met Thr 1130 1135 1140 Asn Ala Val Thr Ile Arg Glu Ala Glu Ile Glu Val Glu Gly Asn 1145 1150 1155 Ser Gln Leu Gln Ile Ser Phe Ser Thr Ala Leu Ala Ser Ala Glu 1160 1165 1170 Phe Arg Val Gln Val Cys Ser Thr Gln Val His Cys Ala Ala Glu 1175 1180 1185 Cys His Pro Pro Lys Asp His Ile Val Asn Tyr Pro Ala Ser His 1190 1195 1200 Thr Thr Leu Gly Val Gln Asp Ile Ser Ala Thr Ala Met Ser Trp 1205 1210 1215 Val Gln Lys Ile Thr Gly Gly Val Gly Leu Val Val Ala Val Ala 1220 1225 1230 Ala Leu Ile Leu Ile Val Val Leu Cys Val Ser Phe Ser Arg His 1235 1240 1245 <210> 2 <211> 1248 <212> PRT <213> Chikungunya virus <400> 2 Met Glu Phe Ile Pro Thr Gln Thr Phe Tyr Asn Arg Arg Tyr Gln Pro 1 5 10 15 Arg Pro Trp Ala Pro Arg Pro Thr Ile Gln Val Ile Arg Pro Arg Pro 20 25 30 Arg Pro Gln Arg Gln Ala Gly Gln Leu Ala Gln Leu Ile Ser Ala Val 35 40 45 Asn Lys Leu Thr Met Arg Ala Val Pro Gln Gln Lys Pro Arg Arg Asn 50 55 60 Arg Lys Asn Lys Lys Gln Arg Gln Lys Lys Gln Ala Pro Gln Asn Asp 65 70 75 80 Pro Lys Gln Lys Lys Gln Pro Pro Gln Lys Lys Pro Ala Gln Lys Lys 85 90 95 Lys Lys Pro Gly Arg Arg Glu Arg Met Cys Met Lys Ile Glu Asn Asp 100 105 110 Cys Ile Phe Glu Val Lys His Glu Gly Lys Val Met Gly Tyr Ala Cys 115 120 125 Leu Val Gly Asp Lys Val Met Lys Pro Ala His Val Lys Gly Thr Ile 130 135 140 Asp Asn Ala Asp Leu Ala Lys Leu Ala Phe Lys Arg Ser Ser Lys Tyr 145 150 155 160 Asp Leu Glu Cys Ala Gln Ile Pro Val His Met Lys Ser Asp Ala Ser 165 170 175 Lys Phe Thr His Glu Lys Pro Glu Gly Tyr Tyr Asn Trp His His Gly 180 185 190 Ala Val Gln Tyr Ser Gly Gly Arg Phe Thr Ile Pro Thr Gly Ala Gly 195 200 205 Lys Pro Gly Asp Ser Gly Arg Pro Ile Phe Asp Asn Lys Gly Arg Val 210 215 220 Val Ala Ile Val Leu Gly Gly Ala Asn Glu Gly Ala Arg Thr Ala Leu 225 230 235 240 Ser Val Val Thr Trp Asn Lys Asp Ile Val Thr Lys Ile Thr Pro Glu 245 250 255 Gly Ala Glu Glu Trp Ser Leu Ala Leu Pro Val Leu Cys Leu Leu Ala 260 265 270 Asn Thr Thr Phe Pro Cys Ser Gln Pro Pro Cys Thr Pro Cys Cys Tyr 275 280 285 Glu Lys Glu Pro Glu Ser Thr Leu Arg Met Leu Glu Asp Asn Val Met 290 295 300 Arg Pro Gly Tyr Tyr Gln Leu Leu Lys Ala Ser Leu Thr Cys Ser Pro 305 310 315 320 His Arg Gln Arg Arg Ser Thr Lys Asp Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala 325 330 335 Thr Arg Pro Tyr Leu Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser 340 345 350 Cys His Ser Pro Ile Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp 355 360 365 Gly Thr Leu Lys Ile Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp 370 375 380 Asp Ser His Asp Trp Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Ser His Thr Pro 385 390 395 400 Ala Asp Ala Glu Arg Ala Gly Leu Leu Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys 405 410 415 Thr Ile Thr Gly Thr Met Gly His Phe Ile Leu Ala Arg Cys Pro Lys 420 425 430 Gly Glu Thr Leu Thr Val Gly Phe Thr Asp Ser Arg Lys Ile Ser His 435 440 445 Thr Cys Thr His Pro Phe His His Glu Pro Pro Val Ile Gly Arg Glu 450 455 460 Arg Phe His Ser Arg Pro Gln His Gly Lys Glu Leu Pro Cys Ser Thr 465 470 475 480 Tyr Val Gln Ser Thr Ala Ala Thr Ala Glu Glu Ile Glu Val His Met 485 490 495 Pro Pro Asp Thr Pro Asp Arg Thr Leu Met Thr Gln Gln Ser Gly Asn 500 505 510 Val Lys Ile Thr Val Asn Gly Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys 515 520 525 Gly Gly Ser Asn Glu Gly Leu Thr Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn 530 535 540 Cys Lys Ile Asp Gln Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Asn Trp 545 550 555 560 Gln Tyr Asn Ser Pro Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Leu Gly Asp Arg 565 570 575 Lys Gly Lys Ile His Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg 580 585 590 Val Pro Lys Ala Arg Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val 595 600 605 Thr Met Leu Leu Tyr Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn 610 615 620 Met Gly Gln Glu Pro Asn Tyr His Glu Glu Trp Val Thr His Lys Lys 625 630 635 640 Glu Val Thr Leu Thr Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly 645 650 655 Asn Asn Glu Pro Tyr Lys Tyr Trp Pro Gln Met Ser Thr Asn Gly Thr 660 665 670 Ala His Gly His Pro His Glu Ile Ile Leu Tyr Tyr Tyr Glu Leu Tyr 675 680 685 Pro Thr Met Thr Val Val Ile Val Ser Val Ala Ser Phe Val Leu Leu 690 695 700 Ser Met Val Gly Thr Ala Val Gly Met Cys Val Cys Ala Arg Arg Arg 705 710 715 720 Cys Ile Thr Pro Tyr Glu Leu Thr Pro Gly Ala Thr Val Pro Phe Leu 725 730 735 Leu Ser Leu Leu Cys Cys Val Arg Thr Thr Lys Ala Ala Thr Tyr Tyr 740 745 750 Glu Ala Ala Ala Tyr Leu Trp Asn Glu Gln Gln Pro Leu Phe Trp Leu 755 760 765 Gln Ala Leu Ile Pro Leu Ala Ala Leu Ile Val Leu Cys Asn Cys Leu 770 775 780 Lys Leu Leu Pro Cys Cys Cys Lys Thr Leu Ala Phe Leu Ala Val Met 785 790 795 800 Ser Ile Gly Ala His Thr Val Ser Ala Tyr Glu His Val Thr Val Ile 805 810 815 Pro Asn Thr Val Gly Val Pro Tyr Lys Thr Leu Val Asn Arg Pro Gly 820 825 830 Tyr Ser Pro Met Val Leu Glu Met Glu Leu Gln Ser Val Thr Leu Glu 835 840 845 Pro Thr Leu Ser Leu Asp Tyr Ile Thr Cys Glu Tyr Lys Thr Val Ile 850 855 860 Pro Ser Pro Tyr Val Lys Cys Cys Gly Thr Ala Glu Cys Lys Asp Lys 865 870 875 880 Ser Leu Pro Asp Tyr Ser Cys Lys Val Phe Thr Gly Val Tyr Pro Phe 885 890 895 Met Trp Gly Gly Ala Tyr Cys Phe Cys Asp Ala Glu Asn Thr Gln Leu 900 905 910 Ser Glu Ala His Val Glu Lys Ser Glu Ser Cys Lys Thr Glu Phe Ala 915 920 925 Ser Ala Tyr Arg Ala His Thr Ala Ser Ala Ser Ala Lys Leu Arg Val 930 935 940 Leu Tyr Gln Gly Asn Asn Ile Thr Val Ala Ala Tyr Ala Asn Gly Asp 945 950 955 960 His Ala Val Thr Val Lys Asp Ala Lys Phe Val Val Gly Pro Met 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insert <400> 61 tccggaggat gtggcgccat cagcctgcac cccaaggcca agatcgagga aggaggatcc 60 <210> 62 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VLP275 insert <400> 62 Ser Gly Gly Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala Lys Ile Glu 1 5 10 15 Glu Cys Gly Gly Ser 20 <210> 63 <211> 3747 <212> DNA <213> Chikungunya virus <400> 63 atggagttca tcccaaccca aactttttac aataggaggt accagcctcg accctggact 60 ccgcgcccta ctatccaagt catcaggccc agaccgcgcc ctcagaggca agctgggcaa 120 cttgcccagc tgatctcagc agttaataaa ctgacaatgc gcgcggtacc acaacagaag 180 ccacgcagga atcggaagaa taagaagcaa aagcaaaaac aacaggcgcc acaaaacaac 240 acaaatcaaa agaagcagcc acctaaaaag aaaccggctc aaaagaaaaa gaagccgggc 300 cgcagagaga ggatgtgcat gaaaatcgaa aatgattgta ttttcgaagt caagcacgaa 360 ggtaaggtaa caggttacgc gtgcctggtg ggggacaaag taatgaaacc agcacacgta 420 aaggggacca tcgataacgc ggacctggcc aaactggcct ttaagcggtc atctaagtat 480 gaccttgaat gcgcgcagat acccgtgcac atgaagtccg acgcttcgaa gttcacccat 540 gagaaaccgg aggggtacta caactggcac cacggagcag tacagtactc aggaggccgg 600 ttcaccatcc ctacaggtgc tggcaaacca ggggacagcg gcagaccgat cttcgacaac 660 aagggacgcg tggtggccat agtcttagga ggagctaatg aaggagcccg tacagccctc 720 tcggtggtga cctggaataa agacattgtc actaaaatca cccccgaggg ggccgaagag 780 tggagtcttg ccatcccagt tatgtgcctg ttggcaaaca ccacgttccc ctgctcccag 840 cccccttgca cgccctgctg ctacgaaaag gaaccggagg aaaccctacg catgcttgag 900 gacaacgtca tgagacctgg gtactatcag ctgctacaag catccttaac atgttctccc 960 caccgccagc gacgcagcac caaggacaac ttcaatgtct ataaagccac aagaccatac 1020 ttagctcact gtcccgactg tggagaaggg cactcgtgcc atagtcccgt agcactagaa 1080 cgcatcagaa atgaagcgac agacgggacg ctgaaaatcc aggtctcctt gcaaatcgga 1140 ataaagacgg atgacagcca cgattggacc aagctgcgtt atatggacaa ccacatgcca 1200 gcagacgcag agagggcggg gctatttgta agaacatcag caccgtgtac gattactgga 1260 acaatgggac acttcatcct ggcccgatgt ccaaaagggg aaactctgac ggtgggattc 1320 actgacagta ggaagattag tcactcatgt acgcacccat ttcaccacga ccctcctgtg 1380 ataggtcggg aaaaattcca ttcccgaccg cagcacggta aagagctacc ttgcagcacg 1440 tacgtgcaga gcaccgccgc aactaccgag gagatagagg tacacatgcc cccagacacc 1500 cctgatcgca cattaatgtc acaacagtcc ggcaacgtaa agatcacagt caatggccag 1560 acggtgcggt acaagtgtaa ttgcggtggc tcaaatgaag gactaacaac tacagacaaa 1620 gtgattaata actgcaaggt tgatcaatgt catgccgcgg tcaccaatca caaaaagtgg 1680 cagtataact cccctctggt cccgcgtaat gctgaacttg gggaccgaaa aggaaaaatt 1740 cacatcccgt ttccgctggc aaatgtaaca tgcagggtgc ctaaagcaag gaaccccacc 1800 gtgacgtacg ggaaaaacca agtcatcatg ctactgtatc ctgaccaccc aacactcctg 1860 tcctaccgga atatgggaga agaaccaaac tatcaagaag agtgggtgat gcataagaag 1920 gaagtcgtgc taaccgtgcc gactgaaggg ctcgaggtca cgtggggcaa caacgagccg 1980 tataagtatt ggccgcagtt atctacaaac ggtacagccc atggccaccc gcatgagata 2040 attctgtatt attatgagct gtaccccact atgactgtag tagttgtgtc agtggccacg 2100 ttcatactcc tgtcgatggt gggtatggca gcggggatgt gcatgtgtgc acgacgcaga 2160 tgcatcacac cgtatgaact gacaccagga gctaccgtcc ctttcctgct tagcctaata 2220 tgctgcatca gaacagctaa agcggccaca taccaagagg ctgcgatata cctgtggaac 2280 gagcagcaac ctttgttttg gctacaagcc cttattccgc tggcagccct gattgttcta 2340 tgcaactgtc tgagactctt accatgctgc tgtaaaacgt tggctttttt agccgtaatg 2400 agcgtcggtg cccacactgt gagcgcgtac gaacacgtaa cagtgatccc gaacacggtg 2460 ggagtaccgt ataagactct agtcaataga cctggctaca gccccatggt attggagatg 2520 gaactactgt cagtcacttt ggagccaaca ctatcgcttg attacatcac gtgcgagtac 2580 aaaaccgtca tcccgtctcc gtacgtgaag tgctgcggta cagcagagtg caaggacaaa 2640 aacctacctg actacagctg taaggtcttc accggcgtct acccatttat gtggggcggc 2700 gcctactgct tctgcgacgc tgaaaacacg cagttgagcg aagcacacgt ggagaagtcc 2760 gaatcatgca aaacagaatt tgcatcagca tacagggctc ataccgcatc tgcatcagct 2820 aagctccgcg tcctttacca aggaaataac atcactgtaa ctgcctatgc aaacggcgac 2880 catgccgtca cagttaagga cgccaaattc attgtggggc caatgtcttc agcctggaca 2940 cctttcgaca acaaaattgt ggtgtacaaa ggtgacgtct ataacatgga ctacccgccc 3000 tttggcgcag gaagaccagg acaatttggc gatatccaaa gtcgcacacc tgagagtaaa 3060 gacgtctatg ctaatacaca actggtactg cagagaccgg ctgtgggtac ggtacacgtg 3120 ccatactctc aggcaccatc tggctttaag tattggctaa aagaacgcgg ggcgtcgctg 3180 cagcacacag caccatttgg ctgccaaata gcaacaaacc cggtaagagc ggtgaactgc 3240 gccgtaggga acatgcccat ctccatcgac ataccggaag cggccttcac tagggtcgtc 3300 gacgcgccct ctttaacgga catgtcgtgc gaggtaccag cctgcaccca ttcctcagac 3360 tttgggggcg tcgccattat taaatatgca gccagcaaga aaggcaagtg tgcggtgcat 3420 tcgatgacta acgccgtcac tattcgggaa gctgagatag aagttgaagg gaattctcag 3480 ctgcaaatct ctttctcgac ggccttagcc agcgccgaat tccgcgtaca agtctgttct 3540 acacaagtac actgtgcagc cgagtgccac cccccgaagg accacatagt caactacccg 3600 gcgtcacata ccaccctcgg ggtccaggac atctccgcta cggcgatgtc atgggtgcag 3660 aagatcacgg gaggtgtggg actggttgtt gctgttgccg cactgattct aatcgtggtg 3720 ctatgcgtgt cgttcagcag gcactaa 3747 <210> 64 <211> 3765 <212> DNA <213> Venezuelan equine encephalitis virus <400> 64 atgttcccgt tccagccaat gtatccgatg cagccaatgc cctatcgcaa cccgttcgcg 60 gccccgcgca ggccctggtt ccccagaacc gacccttttc tggcgatgca ggtgcaggaa 120 ttaacccgct cgatggctaa cctgacgttc aagcaacgcc gggacgcgcc acctgagggg 180 ccatccgcta ataaaccgaa gaaggaggcc tcgcaaaaac agaaaggggg aggccaaggg 240 aagaagaaga agaaccaagg gaagaagaag gctaagacag ggccgcctaa tccgaaggca 300 cagaatggaa acaagaagaa gaccaacaag aaaccaggca agagacagcg catggtcatg 360 aaattggaat ctgacaagac gttcccaatc atgttggaag ggaagataaa cggctacgct 420 tgtgtggtcg gagggaagtt attcaggccg atgcatgtgg aaggcaagat cgacaacgac 480 gttctggccg cgcttaagac gaagaaagca tccaaatacg atcttgagta tgcagatgtg 540 ccacagaaca tgcgggccga tacattcaaa tacacccatg agaaacccca aggctattac 600 agctggcatc atggagcagt ccaatatgaa aatgggcgtt tcacggtgcc gaaaggagtt 660 ggggccaagg gagacagcgg acgacccatt ctggataacc agggacgggt ggtcgctatt 720 gtgctgggag gtgtgaatga aggatctagg acagcccttt cagtcgtcat gtggaacgag 780 aagggagtta ccgtgaagta tactccggag aactgcgagc aatggtcact agtgaccacc 840 atgtgtctgc tcgccaatgt gacgttccca tgtgctcaac caccaatttg ctacgacaga 900 aaaccagcag agactttggc catgctcagc gttaacgttg acaacccggg ctacgatgag 960 ctgctggaag cagctgttaa gtgccccgga aggaaaagga gatccaccga ggagctgttt 1020 aatgagtata agctaacgcg cccttacatg gccagatgca tcagatgtgc agttgggagc 1080 tgccatagtc caatagcaat cgaggcagta aagagcgacg ggcacgacgg ttatgttaga 1140 cttcagactt cctcgcagta tggcctggat tcctccggca acttaaaggg caggaccatg 1200 cggtatgaca tgcacgggac cattaaagag ataccactac atcaagtgtc actctataca 1260 tctcgcccgt gtcacattgt ggatgggcac ggttatttcc tgcttgccag gtgcccggca 1320 ggggactcca tcaccatgga atttaagaaa gattccgtca gacactcctg ctcggtgccg 1380 tatgaagtga aatttaatcc tgtaggcaga gaactctata ctcatccccc agaacacgga 1440 gtagagcaag cgtgccaagt ctacgcacat gatgcacaga acagaggagc ttatgtcgag 1500 atgcacctcc cgggctcaga agtggacagc agtttggttt ccttgagcgg cagttcagtc 1560 accgtgacac ctcctgatgg gactagcgcc ctggtggaat gcgagtgtgg cggcacaaag 1620 atctccgaga ccatcaacaa gacaaaacag ttcagccagt gcacaaagaa ggagcagtgc 1680 agagcatatc ggctgcagaa cgataagtgg gtgtataatt ctgacaaact gcccaaagca 1740 gcgggagcca ccttaaaagg aaaactgcat gtcccattct tgctggcaga cggcaaatgc 1800 accgtgcctc tagcaccaga acctatgata accttcggtt tcagatcagt gtcactgaaa 1860 ctgcacccta agaatcccac atatctaatc acccgccaac ttgctgatga gcctcactac 1920 acgcacgagc tcatatctga accagctgtt aggaatttta ccgtcaccga aaaagggtgg 1980 gagtttgtat ggggaaacca cccgccgaaa aggttttggg cacaggaaac agcacccgga 2040 aatccacatg ggctaccgca cgaggtgata actcattatt accacagata ccctatgtcc 2100 accatcctgg gtttgtcaat ttgtgccgcc attgcaaccg tttccgttgc agcgtctacc 2160 tggctgtttt gcagatctag agttgcgtgc ctaactcctt accggctaac acctaacgct 2220 aggataccat tttgtctggc tgtgctttgc tgcgcccgca ctgcccgggc cgagaccacc 2280 tgggagtcct tggatcacct atggaacaat aaccaacaga tgttctggat tcaattgctg 2340 atccctctgg ccgccttgat cgtagtgact cgcctgctca ggtgcgtgtg ctgtgtcgtg 2400 ccttttttag tcatggccgg cgccgcaggc gccggcgcct acgagcacgc gaccacgatg 2460 ccgagccaag cgggaatctc gtataacact atagtcaaca gagcaggcta cgcaccactc 2520 cctatcagca taacaccaac aaagatcaag ctgataccta cagtgaactt ggagtacgtc 2580 acctgccact acaaaacagg aatggattca ccagccatca aatgctgcgg atctcaggaa 2640 tgcactccaa cttacaggcc tgatgaacag tgcaaagtct tcacaggggt ttacccgttc 2700 atgtggggtg gtgcatattg cttttgcgac actgagaaca cccaagtcag caaggcctac 2760 gtaatgaaat ctgacgactg ccttgcggat catgctgaag catataaagc gcacacagcc 2820 tcagtgcagg cgttcctcaa catcacagtg ggagaacact ctattgtgac taccgtgtat 2880 gtgaatggag aaactcctgt gaatttcaat ggggtcaaaa taactgcagg tccgctttcc 2940 acagcttgga caccctttga tcgcaaaatc gtgcagtatg ccggggagat ctataattat 3000 gattttcctg agtatggggc aggacaacca ggagcatttg gagatataca atccagaaca 3060 gtctcaagct ctgatctgta tgccaatacc aacctagtgc tgcagagacc caaagcagga 3120 gcgatccacg tgccatacac tcaggcacct tcgggttttg agcaatggaa gaaagataaa 3180 gctccatcat tgaaatttac cgcccctttc ggatgcgaaa tatatacaaa ccccattcgc 3240 gccgaaaact gtgctgtagg gtcaattcca ttagcctttg acattcccga cgccttgttc 3300 accagggtgt cagaaacacc gacactttca gcggccgaat gcactcttaa cgagtgcgtg 3360 tattcttccg actttggtgg gatcgccacg gtcaagtact cggccagcaa gtcaggcaag 3420 tgcgcagtcc atgtgccatc agggactgct accctaaaag aagcagcagt cgagctaacc 3480 gagcaagggt cggcgactat ccatttctcg accgcaaata tccacccgga gttcaggctc 3540 caaatatgca catcatatgt tacgtgcaaa ggtgattgtc accccccgaa agaccatatt 3600 gtgacacacc ctcagtatca cgcccaaaca tttacagccg cggtgtcaaa aaccgcgtgg 3660 acgtggttaa catccctgct gggaggatca gccgtaatta ttataattgg cttggtgctg 3720 gctactattg tggccatgta cgtgctgacc aaccagaaac ataat 3765 1/

Claims (16)

1. 바이러스 구조 단백질 및 PD-1 에서 유래한 항원 및 PD-1 의 리간드에서 유래한 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 항원을 포함하는 입자.
2. 제 1 항에 있어서, 바이러스 구조 단백질이 캡시드 및/또는 외피 단백질 E1 및 E2 를 포함하는 입자.
3. 제 2 항에 있어서, PD-1 에서 유래한 하나 이상의 항원 또는 PD-L1 에서 유래한 하나 이상의 항원이 외피 단백질의 E2 에 삽입되는 입자.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 입자가 PD-1에서 유래한 항원이 삽입되는 하나 이상의 외피 단백질 E2, 하나 이상의 외피 단백질 E1 및 하나 이상의 캡시드로 이루어지는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자이며,
   PD-1 에서 유래한 항원이 삽입되는 외피 단백질 E2 가 SEQ ID No.:33-35 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고; 외피 단백질 E1 이 SEQ ID No.:37 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고; 캡시드가 SEQ ID No.:38 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 입자.
5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 입자가 PD-1 에서 유래한 항원이 삽입되는 하나 이상의 외피 단백질 E2, 하나 이상의 외피 단백질 E1 및 하나 이상의 캡시드로 이루어지는 베네수엘라 말 바이러스 유사 입자이며,
   PD-1 에서 유래한 항원이 삽입되는 외피 단백질 E2 가 SEQ ID No.:39-41 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고; 외피 단백질 E1 가 SEQ ID No.:43 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고; 캡시드가 SEQ ID No.:44 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 입자.
6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 입자가 PD-L1 에서 유래한 항원이 삽입되는 하나 이상의 외피 단백질 E2, 하나 이상의 외피 단백질 E1 및 하나 이상의 캡시드로 이루어지는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자이며,
   PD-L1 에서 유래한 항원이 삽입되는 외피 단백질 E2 가 SEQ ID No.:36 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고; 외피 단백질 E1 가 SEQ ID No.:37 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고; 캡시드가 SEQ ID No.:38 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 입자.
7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 입자가 PD-L1 에서 유래한 항원이 삽입되는 하나 이상의 외피 단백질 E2, 하나 이상의 외피 단백질 E1 및 하나 이상의 캡시드로 이루어지는 베네수엘라 말 바이러스 유사 입자이며, PD-L1 에서 유래한 항원이 삽입되는 외피 단백질 E2 가 SEQ ID No.:42 에 의해 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고; 외피 단백질 E1 이 SEQ ID No.:43 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고; 캡시드가 SEQ ID No.:44 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 입자.
8. 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 입자의 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 입자.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 입자를 발현하기 위한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
10. SEQ ID No.:27-32 으로 나타내는 뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 단리된 핵산 분자.
11. 제 9 항 또는 제 10 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 상기 벡터가 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 임의로 포함하는 벡터.
12. 하기를 포함하는 약학 조성물:
    (a) 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 입자, 제 9 항 또는 제 10 항에 따른 핵산 분자 및/또는 제 11 항에 따른 벡터; 및
    (b) 약학적으로 허용가능한 담체.
13. 제 12 항에 있어서, 약학 조성물이 백신인 약학 조성물.
14. 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방; 포유동물에서의 PD-1 또는 PD-1 의 리간드에 대항하는 항체의 생성; 면역 반응의 조절; 면역자극; PD-1 과 PD-1 의 리간드 사이의 상호작용 억제; 또는 PD-1 활성의 억제를 위한 약학 조성물 또는 키트의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 입자, 제 9 항 또는 제 10 항에 따른 핵산 분자 및/또는 제 11 항에 따른 벡터의 용도.
15. 하기를 포함하는 키트로서:
    (a) 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 입자를 포함하는 약학 조성물; 및
    (b) 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 입자를 포함하는 또 다른 약학 조성물,
    (a) 에 포함된 입자가 (b) 에 포함된 입자와 상이한 바이러스 유사 입자인 키트.
16. 제 15 항에 있어서, (a) 에 포함된 입자가 치쿤구니야 바이러스 유사 입자이고 (b) 에 포함된 입자가 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 유사 입자이거나, (a) 에 포함된 입자가 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 유사 입자이고 (b) 에 포함된 입자가 치쿤구니야 바이러스 유사 입자인 키트.

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