ES2918580T3

ES2918580T3 - Inmunoterapia basada en PD-L1

Info

Publication number: ES2918580T3
Application number: ES12780408T
Authority: ES
Inventors: Mads Hald Andersen
Original assignee: IO Biotech ApS
Current assignee: IO Biotech ApS
Priority date: 2011-10-17
Filing date: 2012-10-17
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2032-10-17
Also published as: LT2768524T; CN103917243B; JP2014534202A; US9669078B2; DK2768524T3; JP6259763B2; WO2013056716A1; CN103917243A; BR112014009526B8; CA2850245A1; PT2768524T; EP4079319A1; SI2768524T1; CN113444165A; BR112014009526A2; EP2768524B1; EP2768524A1; CA2850245C; CY1125453T1; HRP20220924T1

Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de la profilaxis y la terapia de afecciones clínicas que incluyen cáncer, enfermedades autoinmunes y enfermedades infecciosas. En particular, se proporciona composiciones de vacuna que comprenden fragmentos PD-L1 o péptidos de los mismos que son capaces de provocar respuestas inmunes útiles en el tratamiento del cáncer, enfermedades autoinmunes o enfermedades infecciosas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunoterapia basada en PD-L1

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la profilaxis y la terapia de estados clínicos que incluyen cáncer, enfermedades autoinmunitarias y enfermedades infecciosas. En particular, se proporcionan composiciones de vacuna que comprenden PD-L1 o fragmentos peptídicos del mismo que son capaces de provocar respuestas inmunitarias útiles en el tratamiento del cáncer, de enfermedades autoinmunitarias y de enfermedades infecciosas.

Antecedentes de la invención

El sistema inmunitario tiene la capacidad de reconocer y destruir las células neoplásicas; no obstante, a pesar de que la transformación neoplásica está asociada a la expresión de antígenos inmunogénicos, el sistema inmunitario a menudo no responde eficazmente a estos antígenos. El sistema inmunitario se vuelve tolerante a estos antígenos. Cuando esto sucede, las células neoplásicas proliferan descontroladamente dando lugar a la formación de cánceres malignos con mal pronóstico para las personas afectadas. El estado de tolerancia adquirido debe superarse para que la inmunoterapia del cáncer tenga éxito.

Diversas series de indicios sugieren que las células T son las principales efectoras en la respuesta inmunológica contra las células cancerosas. Proteínas inmunorreguladoras como la indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), el antígeno 4 del linfocito T citotóxico (CTLA-4, siglas del inglés Cytotoxic T lymphocyte antigen 4) y el ligando 1 de muerte celular programada 1 (PD-L1, Programmed cell death 1 ligand 1), desempeñan un papel fundamental en la inmunosupresión e inducción de tolerancia de las respuestas inmunitarias contra el cáncer. El CTLA-4 es un regulador negativo clave de las respuestas de las células T, que puede restringir la respuesta inmunitaria antitumoral. Recientemente, el anticuerpo anti-CTLA-4, ipilimumab, fue aprobado por la FDA y la EMEA para el tratamiento del melanoma después de mostrar su efecto en estudios clínicos de fase III. Otro mecanismo central que contrarresta la inmunidad específica del tumor e impide una inmunoterapia anticancerosa eficaz requiere un entorno específico en el que las células dendríticas (CD) tolerogénicas desempeñen un papel esencial al desviar la respuesta inmunitaria de la inmunidad eficaz.

La muerte programada-1 (PD1) es una molécula de superficie reguladora que emite señales inhibidoras importantes para mantener el silencio funcional de las células T frente a sus antígenos afines. Sus ligandos, conocidos como PD-L1 y PD-L2 o B7-H1 y B7-H2, se expresan en las CPA (células presentadoras de antígeno), en las células tumorales, en las células placentarias y no hematopoyéticas que se encuentran en un microambiente inflamatorio. La interferencia con PD-1 o su ligando PD-L1 aumenta la inmunidad antitumoral. Parece que la regulación al alza de PD-L1 es un mecanismo que los cánceres pueden emplear para evadir el sistema inmunitario del hospedador. La expresión de PD-L1 en los tumores se correlaciona con un mal resultado clínico en diversos cánceres, incluido el de páncreas, de células renales, de ovario, de las vías respiratorias y digestivas altas y melanoma (Hamanishi et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 104:3360-3365; Nomi et al., 2007, Clin. Cancer Res. 13:2151-2157; Hino et al., 2010, Cancer.

116:1757-1766. Por tanto, en un análisis de 196 muestras tumorales de pacientes con carcinoma de células renales, se descubrió que una alta expresión tumoral de PD-L1 se asociaba a una mayor agresividad tumoral y a un riesgo 4,5 veces mayor de muerte (Thompson et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 101:17174-17179). Las pacientes con cáncer de ovario con mayor expresión de PD-L1 tuvieron un pronóstico significativamente peor que aquellas con menor expresión de PD-L1. Se observó una correlación inversa entre la expresión de PD-L1 y el recuento de linfocitos T c D8+ intraepiteliales, lo que sugiere que, en las células tumorales, el PD-L1 puede suprimir las células T CD8+ antitumorales (Hamanishi et al., 2007, véase anteriormente).

En el documento WO 2011/066342 se describen composiciones inmunomoduladoras y métodos para el tratamiento de enfermedades tales como cáncer o infecciones, en particular, enfermedades que inducen agotamiento de células T, anergia de células T, o ambas cosas, o enfermedades en las que patógenos intracelulares, p. ej., Leishmania, evaden la respuesta inmunitaria regulando al alza los ligandos de PD-1 en las CPA (p. ej., monocitos, células dendríticas, macrófagos) o en las células epiteliales.

En el documento WO 2011/109789 se describen proteínas de fusión y anticuerpos inmunomoduladores dirigidos para la terapia del cáncer y, más específicamente, la composición y los métodos de proteínas de fusión y anticuerpos inmunoestimuladores o inmunosupresores dirigidos que contrarrestan o inducen la tolerancia inmunitaria de las células cancerosas.

En el documento WO 2009/026472 se describen métodos para inducir tolerancia y promover la aceptación de injertos, que incluyen, administrar a un receptor, células madre hematopoyéticas y un agonista de la Muerte Programada 1 (PD-1).

En el documento WO 2008/085562 se describen usos de un agente que reduce la interacción de B7-H1 con PD-1 y, en particular, anticuerpos monoclonales que se unen a B7-H1 e interfieren con la interacción de B7-H1 con PD-1 junto una vacuna para proporcionar un efecto sinérgico.

En el documento WO 2010/027828 se describen composiciones y métodos para modular la activación de células T, en particular, composiciones y métodos para potenciar la activación de células T.

Sumario de la invención

La presente invención, que se basa en el sorprendente descubrimiento de los inventores con respecto a respuestas inmunitarias citotóxicas espontáneas contra células que expresan PD-L1 en pacientes con cáncer, resuelve el problema de la inmunosupresión del cáncer. Estos hallazgos abren el camino a nuevos enfoques terapéuticos y de diagnóstico que pueden ser de aplicación general en el control de enfermedades cancerosas.

Cabe destacar que, los hallazgos no se limitan al cáncer, sino que también son útiles en otros estados clínicos caracterizados por la presencia de células no deseadas que expresan PD-L1.

La presente invención se dirige a la enfermedad del cáncer eliminando directamente las células cancerosas que expresan PD-L1 y eliminando las células reguladoras que expresan PD-L1. Esto se hace permitiendo que las células T reconozcan a las células que expresan PD-L1. Del mismo modo, cuando el estado clínico es una infección, las células T están capacitadas para destruir a las CPA/CD que expresan PD-L1.

Por tanto, la expresión de la enzima inmunosupresora PD-L1 en células cancerosas y en las CPA es positiva junto con la aplicación del método de la presente invención, que se dirige a estas células que expresan PD-L1. Dado que este enfoque conlleva especialmente la destrucción de las CPA/CD, va en contra de la opinión común en el campo, en la que generalmente se intenta inhibir el PD-L1 para eliminar el medio tolerante en torno a las CPA/CD preservando al mismo tiempo estas células, que se considera que son necesarias para iniciar una respuesta inmunitaria eficaz.

Por otra parte, el hallazgo de respuestas inmunitarias citotóxicas espontáneas contra células que expresan PD-L1, es particularmente sorprendente dado que las células que expresan PD-L1 antagonizan los efectos deseados de otros enfoques inmunoterapéuticos. Por lo tanto, una combinación de inmunoterapias dirigidas a PD-L1 y a tumores es sumamente sinérgica.

La presencia de una respuesta in vivo de células T específica de PD-L1, demuestra que los pacientes con cáncer son capaces de generar respuestas in vivo de células T contra PD-L1 en respuesta a la presencia de péptidos de PD-L1. Por tanto, se cumplen las dos condiciones para generar una respuesta de células T: que las células T están presentes en el paciente con cáncer y que tienen la capacidad de expandirse, lo que se muestra en la solicitud tal y como se presentó. Del conocimiento general en el campo de la inmunología se deduce que proporcionar proteína PD-L1 o péptidos PD-L1 adicionales conducirá a la generación de respuestas de células T específicas de PD-L1.

A diferencia de los anticuerpos unidos a la membrana de las células B, que pueden reconocer al antígeno solo, las células T reconocen un ligando complejo, que comprende un péptido antigénico unido a una proteína denominada complejo principal de histocompatibilidad (MHC, siglas del inglés majorhistocompatibility complex). En el ser humano, esta molécula se conoce como antígeno leucocitario humano (HLA, human leukocyte antigen). Las moléculas HLA de clase I toman muestras de péptidos procedentes de la degradación de proteínas en el interior de la célula y las presentan en la superficie celular a las células T. Por lo tanto, esto permite a las células T buscar alteraciones celulares. Cuando una célula T encuentra un antígeno en el contexto de una molécula HLA, experimenta expansión clonal y se diferencia en células T de memoria y efectoras diversas. Por lo tanto, la identificación de una respuesta inmunitaria espontánea es una prueba de que un antígeno es una diana de las células T. Demuestra que las células T específicas ya se han activado y se han expandido in vivo.

El método ELISPOT utilizado en los Ejemplos 1 y 3 de la presente solicitud es un ensayo muy sensible que demuestra la presencia de respuestas inmunitarias in vivo y no de células T indiferenciadas. Del mismo modo, se han utilizado satisfactoriamente tetrámeros de péptido-MHC para identificar y estudiar células T específicas de antígenos asociados a tumores (AAT) que se desarrollan en los pacientes de forma endógena o después de la vacunación. También se han utilizado tetrámeros para aislar y expandir células T específicas de AAT para inmunoterapia celular adoptiva. La presente solicitud demuestra la presencia de células T específicas de PD-L1-tetrámero (véase el Ejemplo 3) lo que también demuestra una respuesta continua de PD-L1 in vivo.

La presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende

(a) un fragmento peptídico inmunogénicamente activo, que consiste en una secuencia consecutiva de, a lo sumo, 50 aminoácidos de PD-L1 de SEQ ID NO: 1, y que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 o la secuencia VILGAILLCLGVALTFIFRLRKG; y opcionalmente

(b) un adyuvante

para su uso como medicamento.

La presente invención también proporciona un fragmento peptídico inmunogénicamente activo que consiste en una secuencia consecutiva de como máximo 50 aminoácidos de PD-L1 de SEQ ID NO: 1 y que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 o la secuencia VILGAILLCLGVALTFIFRLRKG. La presente invención también proporciona dicho fragmento peptídico inmunogénicamente activo para su uso en un método para el tratamiento o la prevención del cáncer.

En el presente documento se describe una composición de vacuna que comprende PD-L1 de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional del mismo con una identidad de al menos 70 % con el mismo o un fragmento peptídico inmunogénicamente activo que comprende una secuencia consecutiva de al menos 8 aminoácidos de PD-L1 o dicho homólogo funcional del mismo o un ácido nucleico que codifica dicho PD-L1, dicho homólogo funcional del mismo o dicho fragmento peptídico; y un adyuvante para su uso como medicamento.

En el presente documento se describe el efecto sinérgico de una combinación de inmunoterapias basada en la vacuna desvelada anteriormente, como un kit de partes que comprende la composición de vacuna y otra composición inmunoestimuladora.

En el presente documento también se proporciona el aspecto de combinar la vacuna de la presente invención con otros tratamientos contra el cáncer tales como agentes quimioterapéuticos.

En el presente documento también se proporciona el aspecto de combinar la vacuna de la presente invención con otros tratamientos contra infecciones tales como inmunoterapias y/o antibióticos.

Además, en el presente documento se describe un método de tratamiento de un estado clínico, tal como un cáncer o una infección, mediante cualquiera de los medios descritos anteriormente que se encuentra dentro del alcance de la presente invención; incluyendo los medios administrar a un individuo que padece el estado clínico, una cantidad eficaz de la composición de vacuna como se ha desvelado anteriormente o un kit de partes que comprende la vacuna anteriormente mencionada junto con otra composición inmunoestimuladora y/o agente quimioterapéutico.

En el presente documento también se describe el uso de PD-L1 o de un fragmento peptídico inmunogénicamente activo del mismo que comprende una secuencia consecutiva de dicho PD-L1 o un homólogo funcional del mismo o la composición de vacuna anterior en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad cancerosa.

Descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la presencia de respuestas de células T contra PDL101, PDL111 y PDL114 medidas con ELISPOT de IFN-^y. Se calculó el número promedio de puntos específicos de PDL (después de restar los puntos sin péptido añadido) por 5 x 105 CMSP (células mononucleares de sangre periférica) de cada paciente (triángulo de color blanco). Se analizaron CMSP de pacientes con cáncer de mama (CM), carcinoma de células renales (CCR), melanoma maligno (MM) y de donantes sanos (DS). Las células T se estimularon una vez con péptido antes de colocarlas en placas por duplicado a 5*105 células por pocillo con o sin el péptido PDL1.

La figura 2 muestra la presencia de respuestas de células T contra PDL101 medidas con ELISPOT: (a), Se calculó el número promedio de puntos específicos de PDL-101 (después de restar los puntos sin péptido añadido) por 5 x 105 CMSP de cada paciente (triángulo de color blanco). Se analizaron CMSP de pacientes con cáncer de mama (CM), carcinoma de células renales (CCR), melanoma maligno (MM) y de donantes sanos (DS). Las CMSP se aislaron y colocaron en placas por duplicado a 5*105 células por pocillo directamente ex vivo con o sin el péptido PDL101. (b), Respuestas de células T contra PDL101 medidas con ELISPOT de TNF-a. Se calculó el número promedio de puntos específicos de PDL (después de restar los puntos sin péptido añadido) por 5 x 105 CMSP (células mononucleares de sangre periférica) de cada paciente (triángulo de color blanco). Se analizaron CMSP de pacientes con cáncer de mama (CM), carcinoma de células renales (CCR), melanoma maligno (MM) y de donantes sanos (DS). Las células T se estimularon una vez con péptido antes de colocarlas en placas por duplicado a 5*105 células por pocillo con o sin el péptido PDL101.

La figura 3 muestra la capacidad funcional de las células T específicas de PDL101: (a), Lisis de células T2 mediante un cultivo a granel de células T pulsadas con péptido PDL101 (rojo) o con un péptido irrelevante (azul) (VIH-1 pol476-484) a diferentes proporciones de célula efectora con respecto a célula diana según lo medido con un ensayo de liberación de 51Cr. (b), Lisis de la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 mediante un cultivo a granel de células T a diferentes proporciones de célula efectora con respecto a célula diana según lo medido con un ensayo de liberación de 51Cr.

La figura 4 muestra las respuestas naturales de las células T contra PD-L1. (A ), Respuestas de células T contra el péptido PD-L101 (PDL115-23; LLNAFTVTV) medidas con ELISPOT de IFN-^y. Ejemplos de respuestas de ELIs Po T contra PD-L101 de un paciente con carcinoma de células renales (CRR) y de dos pacientes con melanoma maligno (MM). (B), En total, las CMSP de 23 pacientes con cáncer y de 24 donantes sanos, se estimularon una vez con péptido y sus respuestas contra PD-L101 se exploraron utilizando ELISPOT de IFN-^y. Se calculó el número promedio de puntos específicos de PD-L101 (después de restar los puntos sin péptido añadido) por 5 x 105 CMSP de cada paciente. Una prueba de Mann-Whitney arrojó un valor de p = 0,06 con mayor frecuencia de respuestas de células T específicas de PD-L101 en pacientes con cáncer en comparación con donantes sanos. (C), Ejemplos de ELISPOT de IFN-y en respuesta a PD-L101 (barras de color negro) o sin péptido (barras de color gris) en CMSP de seis pacientes con melanoma (MM.03, MM.04, MM.05, MM.13 y MM. 135), de un paciente con cáncer de mama (CM.21) y de un paciente con carcinoma de células renales (CRR.46). (D), ELISPO^tde TNF-a en respuesta a PD-L101 (barras de color negro) o sin péptido (barras de color gris) en CMSP de seis pacientes con melanoma (MM.03, MM.04, MM.05, MM.13 y MM.19), de un paciente con cáncer de mama (CM.21) y de un paciente con carcinoma de células renales (CCR.46). Todos los experimentos se realizaron por triplicado y una prueba de remuestreo sin distribución (RSD) confirmó respuestas significativas contra PD-L101.

La figura 5 muestra las respuestas de células T contra PD-L1 ex vivo. (A), Ejemplo de una respuesta de células T contra el péptido PD-L101 (PDL115-23; LLNAFTVTV) medida con ELISPOT de IFN-y ex vivo en un paciente con melanoma (MM.03). (B), ELISPOT de IFN-y ex vivo en respuesta a PD-L101 (barras de color negro) o sin péptido (barras de color gris) en CMSP de dos pacientes con melanoma maligno (MM.03 y MM.04) y de uno con carcinoma de células renales (CCR.46). Todos los experimentos se realizaron por triplicado y una prueba de remuestreo sin distribución (RSD) confirmó respuestas significativas contra PD-L101. (C), Análisis ELISA del ligando (KILGFVFJV) sensible a UV intercambiado con varios péptidos: CMV/HLA-A2 (pp65 pos495-503; NLVPMVATV), VIH/HLA-A2 (pol476-484; ILKEPVHGV) y PD-L101 (PDL115-23; LLNAFTVTV), Sin UV (no expuesto a luz UV) y Sin péptido (sin péptido de rescate). (D), Análisis de tetrámeros de células T específicas de PD-L101; dos ejemplos de células T CD8 específicas de PD-L101 entre CMSP de un paciente con cáncer de mama (CM.21) (parte superior) y de un paciente con melanoma maligno (MM.05) (parte inferior) visualizados mediante tinción de citometría de flujo utilizando los tetrámeros HLA-A2/Pd -L101-Pe , HLA-A2/VIH-PE, así como el anticuerpo CD8-Pacific Blue/CPA aloficocianina. Las tinciones se realizaron directamente ex vivo (izquierda), después de una estimulación peptídica in vitro (centro) y después de tres estimulaciones con péptido (derecha).

La figura 6 muestra la funcionalidad citotóxica de células T específicas de PD-L1. (A), Ensayo de liberación de 51Cr que representa el % de lisis de células T2 pulsadas con péptido PD-L101 (PDL115-23) o con un péptido del VIH irrelevante (VIH-1 pol476-484) mediante cultivo de células T CM.21 después de la tercera estimulación con péptido. (B), Lisis de células T2 pulsadas con péptido PD-L101 (PDL115-23) o con un péptido del VIH irrelevante (VIH-1 pol476-484) mediante cultivo de células T MM.05 después de la tercera estimulación con péptido. (C), Respuestas citolíticas contra PD-L101 medidas con ELISPOT de GrB (Granzima B). Se muestran las respuestas de ELISPOT de GrB en respuesta a PD-L101 (barras de color negro) o sin péptido (barras de color gris) en CMSP de tres pacientes con melanoma (MM.03, MM.53 y MM.135). Todos los experimentos se realizaron por triplicado y una prueba de remuestreo sin distribución (RSD) mostró respuestas significativas contra PD-L101 en dos de los pacientes.

La figura 7 muestra la actividad citolítica contra células cancerosas PD-L1+. (A), Lisis de las líneas celulares de melanoma HLA-A2+ MM.06 (izquierda) o MM.07 (derecha) con o sin tratamiento con IFN-^ymediante un cultivo de células T específicas de PD-L101 (CM.21) a diferentes proporciones de célula efectora con respecto a célula diana mediante ensayo de liberación de 51Cr. (B), Histogramas que muestran la expresión de PD-L1 en la superficie en MM.07 y MM.06 con o sin tratamiento con IFN-y. (C), Lisis de las líneas celulares de melanoma MM.06 (cuadrados) o MM.07 (círculos) HLA-A2+ mediante el cultivo de células T enriquecido con PD-L101.

La figura 8 muestra la lisis dependiente de PD-L1 de células dendríticas. (A-B), Porcentaje de lisis de CDm autólogas sin ARNip (círculos de color negro), mDC transfectadas con ARNip contra PD-L1 (0,05 nmol (cuadrados de color negro), 0,10 nmol (asteriscos de color negro) y 0,25 nmol (triángulos de color negro)) y con ARNip de control (círculos de color blanco) mediante un cultivo de células T específicas de PD-L1 (parte superior). C), Análisis de citometría de flujo que muestra el perfil de expresión de PD-L1 en la superficie en CDm sin transfección, en CDm transfectadas con ARNip contra PD-L1 a tres concentraciones diferentes (0,05 nmol, 0,10 nmol y 0,25 nmol) y en CD transfectadas con ARNip de control.

La figura 9 muestra la presentación cruzada independiente de TAP (Transporters Associated with antigen Processing, transportadores asociados al procesamiento de antígenos) por células presentadoras de antígeno no profesionales. (A), Lisis de la línea de células B transfectadas con VEB (virus de Epstein-Barr) HLA-A2+ (KIG-BCL) pulsada con péptido PD-L101 (PDL115-23) (cuadrados de color negro), con PDLong1 (PD-L19-28; FMTYWHLLNAFTVTVPKDL) (asteriscos de color negro), con PDLong2 (PDL1242-264; VILGAILLCLGVALTFIFRLRKG) (triángulos de color negro), con proteína PD-L1 (cuadrados de color blanco) o con un péptido del VIH irrelevante (VIH-1 pol476-484) (círculos de color gris) mediante un cultivo de células T específicas de PD-L101 medida con un ensayo de liberación de 51Cr estándar (B), Lisis de células T2 transfectadas con péptido PD-L101 (PDL115-23) (cuadrados de color negro), con PDLong1 (PD-L19-28; FMTYWHLLNAFTVTVPKDL) (asteriscos de color negro), con PDLong2 (PDL1242-264; VILGAILLCLGVALTFIFRLRKG) (triángulos de color negro), con proteína PD-L1 (cuadrados de color blanco) o con un péptido del VIH irrelevante (VIH-1 pol476-484) (círculos de color gris) mediante un cultivo de células T específicas de PD-L101 medida con un ensayo de liberación de 51Cr estándar (C), La destrucción restringida por HLA-A2 mediante células T específicas de PD-L1, se evaluó mediante lisis de células T2 pulsadas con anticuerpo bloqueante PDLongl o PDLong1+HLA-A2. (D ), Histogramas que muestran la expresión de PD-L1 en la superficie en las líneas celulares KIG-BCL y T2.

Descripción detallada de la invención

Es un objetivo principal de la presente divulgación proporcionar una composición de vacuna que comprenda PD-L1 o un fragmento polipeptídico inmunológicamente activo del mismo para su uso como un medicamento en la prevención, reducción del riesgo o tratamiento de un estado clínico, en donde dicho estado clínico se selecciona preferentemente del grupo que consiste en cáncer, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunitarias.

Definiciones

Adyuvante: Cualquier sustancia cuya mezcla con PD-L1 o con un fragmento peptídico inmunológicamente activo del mismo, después de su administración a un individuo, aumente la respuesta inmunitaria a PD-L1 o a dicho fragmento peptídico del mismo. Preferentemente, dicho individuo es un ser humano y preferentemente dicha respuesta inmunitaria es una respuesta de células T.

Anticuerpo: Moléculas de inmunoglobulina y partes activas de moléculas de inmunoglobulina. Los anticuerpos son, por ejemplo, moléculas de inmunoglobulina intactas o fragmentos de las mismas que conservan la actividad inmunológica.

Antígeno: Cualquier sustancia que se pueda unir a un receptor inmunitario distribuido de manera clonal (receptor de células T o células B). Por lo general, un péptido, polipéptido o un polipéptido multimérico. Los antígenos son preferentemente capaces de provocar una respuesta inmunitaria.

CPA: Célula presentadora de antígenos. Una CPA es una célula que muestra un antígeno extraño que forma complejo en su superficie con el MHC (complejo principal de histocompatibilidad). Las células T pueden reconocer este complejo utilizando su receptor de células T (TCR, del inglés T-cell receptor). Las CPA se dividen en dos categorías: profesionales, (de las cuales hay tres tipos: células dendríticas, macrófagos y células B) o no profesionales (no expresan de manera constitutiva las proteínas del complejo principal de histocompatibilidad necesarias para la interacción con células T indiferenciadas; estas se expresan solo después de la estimulación de CPA no profesionales mediante determinadas citocinas tales como el IFNy).

Refuerzo: Reforzar con una inyección o dosis de refuerzo es administrar una dosis adicional de un agente inmunizante, tal como una vacuna, administrado en un momento después de la dosis inicial para mantener la respuesta inmunitaria provocada por la dosis anterior del mismo agente.

Cáncer: En el presente documento, cualquier enfermedad preneoplásica o neoplásica, benigna o maligna, donde "neoplásica" se refiere a una proliferación anómala de células.

Transportador: Entidad o compuesto al que se acoplan los antígenos para ayudar en la inducción de una respuesta inmunitaria.

Proteína quimérica: Una proteína genomodificada que está codificada por una secuencia de nucleótidos, creada mediante un corte y empalme de dos o más genes completos o parciales o una serie de ácidos nucleicos aleatorios o no aleatorios.

Estado clínico: Un estado que requiere atención médica, en el presente documento, especialmente estados asociados a la expresión de PD-L1. Como ejemplos de dichos estados se incluyen cánceres, enfermedades infecciosas o autoinmunitarias).

CTL: Linfocito T citotóxico (Cytotoxic Tlymphocyte). Un subgrupo de células T que expresan CD8 junto con el receptor de células T y, por lo tanto, capaz de responder a antígenos presentados por moléculas de clase I.

Citocina: Modulador del crecimiento o de la diferenciación, que, en el presente documento, se utiliza de forma no determinativa, y que no debe limitar la interpretación de la presente invención y de las reivindicaciones. Además de las citocinas, pueden emplearse moléculas de adhesión o accesorias, o cualquier combinación de las mismas, solas o junto con las citocinas.

Vehículo de suministro: Una entidad mediante la cual se puede transportar una secuencia de nucleótidos o un polipéptido, o ambas cosas, desde al menos un medio a otro.

CD: Célula dendrítica. Las CD son células inmunitarias y forman parte del sistema inmunitario de los mamíferos. Su función principal es procesar el material antigénico y presentarlo en la superficie a otras células del sistema inmunitario, funcionando así como células presentadoras de antígeno (CPA).

Fragmento: se utiliza para indicar una parte que no es de longitud completa de un ácido nucleico o un polipéptido. Por tanto, un fragmento es en sí mismo también un ácido nucleico o un polipéptido, respectivamente.

Homólogo funcional: Un homólogo funcional puede ser cualquier polipéptido que presente al menos alguna identidad de secuencia con un polipéptido natural (wild type) y que haya conservado al menos un aspecto de la funcionalidad del polipéptido natural. En el presente documento, un homólogo funcional de PD-L1 tiene la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria de células T contra células que expresan PD-L1.

Individuo: Generalmente cualquier especie o subespecie de ave, mamífero, pez, anfibio o reptil, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano.

Infección: En el presente documento, el término "infección" se refiere a cualquier tipo de estado clínico que dé lugar a una respuesta inmunitaria y, por lo tanto, incluye infecciones, infecciones crónicas, afecciones autoinmunitarias e inflamaciones alérgicas.

Aislado: utilizado junto con los ácidos nucleicos, los polipéptidos y los anticuerpos desvelados en el presente documento, 'aislado' se refiere a que éstos se han identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural, normalmente celular. Preferentemente, los ácidos nucleicos, los polipéptidos y los anticuerpos de la invención están aislados, y las vacunas y otras composiciones de la invención comprenden preferentemente ácidos nucleicos, polipéptidos o anticuerpos aislados.

MHC: Complejo principal de histocompatibilidad, existen dos subclases principales de MHC, la Clase I y la Clase II.

Construcción de ácido nucleico: Por lo general, un ácido nucleico genomodificado comprende varios elementos, tales como genes o fragmentos de los mismos, promotores, potenciadores, terminadores, colas de poliA, enlazadores, polienlazadores, enlazadores operativos, múltiples sitios de clonación (MSC), marcadores, codones de terminación, otros elementos reguladores, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) u otros.

Patógeno: un agente causante específico de enfermedad, especialmente un agente biológico tal como un virus, una bacteria, un prión o un parásito, que puede causar enfermedades a su hospedador, también conocido como agente infeccioso.

CMSP: Una célula mononuclear de sangre periférica (CMSP) es una célula sanguínea que tiene un núcleo redondo, tal como un linfocito o un monocito. Estas células sanguíneas son un componente fundamental del sistema inmunitario para combatir las infecciones y adaptarse a intrusores. La población de linfocitos consiste en células T (CD4 y CD8 positivas -75 %), en células B y células NK (-25 % combinadas).

Transportadores farmacéuticos: también denominados excipientes, o estabilizadores, no son tóxicos para la célula o para el individuo expuesto a los mismos en las dosis y concentraciones empleadas. Con frecuencia, el transportador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa de pH tamponado. Como ejemplos de transportadores fisiológicamente aceptables se incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos, tales como Tween™, polietilenglicol (PEG) y Pluronics™.

Pluralidad: Al menos dos.

Promotor: Un sitio de unión en una cadena de ADN al que se une la ARN polimerasa para iniciar la transcripción del ARN mensajero mediante uno o más genes estructurales cercanos.

Treg: Células T reguladoras/Linfocitos T reguladores

Vacuna: Una sustancia o composición capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un animal. En el presente texto, las vacunas también reciben el nombre de "composiciones de vacunas" o "composiciones inmunogénicas". Según la presente invención, dicha respuesta inmunitaria es preferentemente una respuesta de células T. Una vacuna de la presente invención puede administrarse como un medicamento profiláctico y/o terapéutico.

Variante: una 'variante' de un ácido nucleico o polipéptido de referencia dado se refiere a un ácido nucleico o polipéptido que muestra un determinado grado de identidad de secuencia con dicho ácido nucleico o polipéptido de referencia pero no es idéntico a dicho ácido nucleico o polipéptido de referencia.

PD-L1

PD-L1 según la presente invención es un ligando de "Muerte celular programada 1". El PD-L1 humano es

un PD-L1 que se expresa a altos niveles en células cancerosas, así como en células T reguladoras. Por consiguiente, las composiciones de vacuna según la presente invención son útiles para la profilaxis y/o el tratamiento de estados clínicos caracterizados por la presencia de células no deseadas que expresan altos niveles de PD-L1.

Por lo tanto, no solo el cáncer, sino también las infecciones en general y las infecciones, especialmente las infecciones crónicas, así como las enfermedades autoinmunitarias, son estados clínicos relevantes para la presente invención.

Dado que las células T que expresan PD-L1 antagonizan los efectos deseados de otros enfoques inmunoterapéuticos, el direccionamiento a células que expresan PD-L1, p. ej., mediante vacunación, es, por consiguiente, una acción sumamente sinérgica con la inmunoterapia anticancerosa adicional. En la presente divulgación, se demuestra que los epítopos de PD-L1 definidos por CTL, son sumamente aplicables en vacunaciones terapéuticas y, por lo tanto, desde el punto de vista inmunoterapéutico tienen un valor sustancial.

Por tanto, es un aspecto de la presente divulgación, proporcionar una composición de vacuna que comprenda PD-L1 o un fragmento polipeptídico del mismo inmunológicamente activo para su uso como un medicamento para el tratamiento de un estado clínico. Dicho estado clínico puede ser cáncer y es un aspecto adicional de la presente invención prevenir, reducir el riesgo o tratar el cáncer. Otro aspecto se refiere al uso de la composición de vacuna de la presente invención junto con otros medicamentos tales como medicamentos inmunoterapéuticos y/o agentes quimioterapéuticos. Otro aspecto se refiere al uso de una composición de vacuna como se desvela en el presente documento, para el tratamiento de enfermedades de origen vírico y/o microbiano y además con el uso de dicha vacuna junto con otros medicamentos tales como medicamentos inmunoterapéuticos y/o antibióticos y/o agentes antivíricos.

Las composiciones de vacuna descritas en el presente documento comprenden PD-L1 o un fragmento peptídico inmunogénicamente activo del mismo para su uso en el tratamiento de un estado clínico en un individuo que lo necesite. Preferentemente, dicho PD-L1 es PD-L1 de la especie de dicho individuo. Por tanto, si el individuo que lo necesita es un tipo específico de mamífero, dicho PD-L1 es preferentemente un PD-L1 de dicho tipo específico de mamífero. Las composiciones de vacuna pueden comprender PD-L1 humano de SEQ ID NO: 1 o un fragmento peptídico inmunogénicamente activo del mismo. El PD-L1 humano natural, es decir, la versión no mutada de origen natural del polipéptido, se identifica en la SEQ ID NO: 1. Sin embargo, las composiciones de vacuna de la invención pueden comprender un homólogo funcional de PD-L1 o un fragmento peptídico inmunológicamente activo del mismo como se define más adelante en el presente documento.

Por lo tanto, en el presente documento se describen composiciones de vacuna que comprenden un adyuvante y:

i) PD-L1 de SEQ ID NO:1; o

ii) Un fragmento peptídico inmunológicamente activo de PD-L1 de SEQ ID NO:1; o

iii) Un homólogo funcional de PD-L1 de SEQ ID NO: 1 idéntico al mismo al menos en un 70 %; o

iv) Un fragmento peptídico inmunogénicamente activo de un homólogo funcional de PD-L1 de SEQ ID NO: 1 idéntico al mismo menos en un 70 %, en donde dicho fragmento peptídico inmunogénicamente activo es un fragmento peptídico inmunogénicamente activo de PD-L1 de SEQ ID NO: 1, en donde, a lo sumo, se han sustituido dos aminoácidos, o

v) Un ácido nucleico que codifica cualquiera de i) a iv)

En el presente documento, la expresión fragmento peptídico de, se utiliza para definir cualquier sucesión de restos de aminoácidos que no sea de longitud completa (en comparación con la SEQ ID NO: 1) que proceda directamente de la SEQ ID NO:1 o se sintetice para que sea idéntica a una sucesión de aminoácidos consecutiva de SEQ ID NO:1.

Un homólogo funcional puede definirse como una longitud completa o un fragmento de PD-L1 cuya secuencia difiera de la del PD-L1 de tipo natural, tal como la de PD-L1 humano natural de SEQ ID NO: 1, pero que siga siendo capaz de inducir una respuesta inmunitaria contra células que expresen PD-L1, tales como las células cancerosas y las CD. El PD-L1 expresado en estas células puede ser natural o mutado de manera endógena (tal como un mutante congénito o una mutación inducida durante la división celular u otra). Un homólogo funcional puede ser una versión mutada o una variante de corte y empalme alternativa del PD-L1 natural. En otro aspecto, los homólogos funcionales de lPD-L1 se definen como se describe a continuación en el presente documento. Un homólogo funcional puede ser, pero sin limitación, una versión recombinante de PD-L1 de longitud completa o fragmentada con una o más mutaciones y/o una o más deleciones y/o adiciones de secuencia introducidas ex vivo.

Un homólogo funcional de PD-L1 puede ser cualquier proteína/polipéptido que muestre al menos alguna identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y que tenga la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria contra células que expresen PD-L1.

Por tanto, un homólogo funcional de PD-L1 descrito en el presente documento, comparte, preferentemente, una identidad de secuencia de al menos 70 % con PD-L1 de SEQ ID NO: 1 y, por consiguiente, un homólogo funcional tiene, preferentemente, una identidad de secuencia de al menos 75 %, por ejemplo, una identidad de secuencia de al menos 80 %, tal como una identidad de secuencia de al menos 85 %, por ejemplo, una identidad de secuencia de al menos 90 %, tal como una identidad de secuencia de al menos 91 %, por ejemplo, una identidad de secuencia de al menos 91 %, tal como una identidad de secuencia de al menos 92 %, por ejemplo, una identidad de secuencia de al menos 93 %, tal como una identidad de secuencia de al menos 94 %, por ejemplo, una identidad de secuencia de al menos 95 %, tal como una identidad de secuencia de al menos 96 %, por ejemplo, una identidad de secuencia de al menos 97 %, tal como una identidad de secuencia de al menos 98 %, por ejemplo, una identidad de secuencia de 99 % con la secuencia de PD-L1 humano de SEQ ID NO: 1 y tiene la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria contra células que expresan PD-L1.

La identidad de secuencia se determina sobre la secuencia de referencia completa y, por tanto, la identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 se determina sobre la longitud completa de SEQ ID NO:1. La identidad de secuencia puede calcularse utilizando diversos algoritmos bien conocidos y aplicando diversas penalizaciones por huecos diferentes. La identidad de secuencia se calcula en relación con la SEQ ID NO: 1 de longitud completa. Cualquier herramienta de alineación de secuencia, tal como, pero sin limitación, FASTA, BLAST o LALIGN, puede utilizarse para buscar homólogos y calcular la identidad de secuencia. Asimismo, las alineaciones de secuencia pueden realizarse utilizando un intervalo de penalizaciones por apertura y extensión de hueco. Por ejemplo, el algoritmo BLAST puede utilizarse con una penalización por apertura de hueco en el intervalo de 5-12, preferentemente 8, y una penalización por extensión de hueco en el intervalo de 1-2, preferentemente 1.

Los equivalentes funcionales pueden comprender además modificaciones químicas tales como ubiquitinación, marcaje (p. ej., con radionúclidos, diversas enzimas, etc.), pegilación (derivatización con polietilenglicol), o mediante inserción (o sustitución por síntesis química) de aminoácidos (aminoácidos) tales como ornitina, que normalmente no se producen en las proteínas humanas, sin embargo, se prefiere que el equivalente funcional no contenga modificaciones químicas.

Cualquier cambio realizado en la secuencia de restos de aminoácidos en comparación con la de PD-L1 de SEQ ID NO: 1 es preferentemente una sustitución conservativa. Un experto en la materia sabrá cómo realizar y evaluar sustituciones de aminoácidos 'conservativas', mediante las cuales un aminoácido se sustituye por otro con una o más características químicas y/o físicas compartidas. Es menos probable que las sustituciones de aminoácidos conservativas afecten a la funcionalidad de la proteína. Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con características compartidas. Una sustitución de aminoácidos conservativa es una sustitución de un aminoácido dentro de un grupo predeterminado de aminoácidos por otro aminoácido dentro del mismo grupo, en donde los aminoácidos dentro de grupos predeterminados presentan características similares o sustancialmente similares.

El fragmento peptídico inmunogénicamente activo de PD-L1 o el homólogo funcional del mismo descrito en el presente documento puede tener cualquier longitud deseada. El fragmento peptídico inmunogénicamente activo descrito en el presente documento puede consistir en 50 restos de aminoácido o menos, por ejemplo, a lo sumo, 45 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 40 restos de aminoácido, por ejemplo, a lo sumo, 35 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 30 restos de aminoácido, por ejemplo, a lo sumo, 25 restos de aminoácido, tal como de 18 a 25 aminoácidos consecutivos de la PD-L1 como se identifica en la SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional del mismo; siendo el homólogo funcional uno en donde, a lo sumo, se han sustituido tres aminoácidos, tal como dos aminoácidos, tal como un aminoácido, por otro aminoácido, preferentemente mediante una sustitución conservativa.

De manera alternativa, el fragmento de péptido inmunogénicamente activo descrito en el presente documento puede consistir en, a lo sumo, 25 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 24 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 23 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 22 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 21 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 20 restos de aminoácido, por ejemplo, a lo sumo, 19 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 18 restos de aminoácido, por ejemplo, a lo sumo, 17 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 16 restos de aminoácido, por ejemplo, a lo sumo, 15 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 14 restos de aminoácido, por ejemplo, a lo sumo, 13 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 12 restos de aminoácido, por ejemplo, a lo sumo, 11 restos de aminoácido, tal como de 8 a 10 aminoácidos consecutivos de PD-L1 de SEQ ID no 1 o un homólogo funcional del mismo; siendo el homólogo funcional uno en donde, a lo sumo, se han sustituido dos aminoácidos, tal como un aminoácido, preferentemente mediante una sustitución conservativa. Preferentemente, el péptido comprende, a lo sumo, 10 restos de aminoácido consecutivos de PD-L1 de SEQ ID NO: 1, tal como 9 restos de aminoácido consecutivos, tal como 8 restos de aminoácido consecutivos, tal como 7 restos de aminoácido consecutivos de PD-L1 identificados en la SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional del mismo; siendo el homólogo funcional uno en donde, a lo sumo, se han sustituido dos aminoácidos, tal como un aminoácido, por otro aminoácido, preferentemente mediante una sustitución conservativa.

En algunas realizaciones, los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la invención son nonapéptidos (péptidos que comprenden 9 restos de aminoácido) y algunos son decapéptidos (que comprenden 10 restos).

El fragmento peptídico inmunogénicamente activo puede comprender un péptido seleccionado del grupo que consiste en los péptidos enumerados en la Tabla 1, más preferentemente un péptido seleccionado del grupo que consiste en el grupo de SEQ ID NO: 2, 12 y 15. Preferentemente, dicho fragmento peptídico inmunogénicamente activo puede consistir, a lo sumo, en 25 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 24 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 23 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 22 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 21 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 20 restos de aminoácido, por ejemplo, a lo sumo, 19 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 18 restos de aminoácido, por ejemplo, a lo sumo, 17 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 16 restos de aminoácido, por ejemplo, a lo sumo, 15 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 14 restos de aminoácido, por ejemplo, a lo sumo, 13 restos de aminoácido, tal como, a lo sumo, 12 restos de aminoácido, por ejemplo, a lo sumo, 11 restos de aminoácido, tal como 10 aminoácidos, por ejemplo 9 aminoácidos y comprende una secuencia peptídica seleccionada del grupo de péptidos enumerados en la Tabla 1, más preferentemente un péptido seleccionado del grupo que consiste en el grupo de SEQ ID NO: 2, 12 y 15.

Dicho fragmento peptídico inmunogénicamente activo puede seleccionarse del grupo que consiste en los péptidos enumerados en la Tabla 1, y más preferentemente seleccionarse del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 12 y 15.

Tabla 1

Otros fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos descritos en el presente documento pueden comprender (o más preferentemente consistir en) entre 4 y 120, preferentemente entre 8 y 100, más preferentemente entre 10 y 75, incluso más preferentemente entre 12 y 60, aún más preferentemente entre 15 y 40, tal como entre 18 y 25 aminoácidos contiguos de PD-L1 de SEQ ID NO: 1, en donde, a lo sumo, se han sustituido, delecionado o añadido tres aminoácidos en comparación con la secuencia PD-L1 de SEQ ID NO: 1, tal como se han sustituido, delecionado o añadido dos aminoácidos o se ha sustituido, delecionado o añadido un aminoácido.

Por tanto, la composición de vacuna descrita en el presente documento puede comprender un fragmento peptídico inmunogénicamente activo que consiste en una secuencia consecutiva de PD-L1 de SEQ ID NO: 1 en el intervalo de 8 a 50 aminoácidos, preferentemente en el intervalo de 8 a 10 o de 20 a 25 aminoácidos, en donde, a lo sumo, se han sustituido tres aminoácidos, y donde la sustitución es preferentemente conservativa.

MHC

Hay dos tipos de moléculas del MHC; moléculas del MHC de clase I y moléculas del MHC de clase II. Las células T CD8 reconocen moléculas del MHC de clase I, que son las principales células efectoras de la respuesta inmunitaria adaptativa. Las moléculas del MHC de clase II se expresan principalmente en la superficie de las células presentadoras de antígeno (CPA), la más importante de las cuales parecen ser las células dendríticas. Las CPA estimulan a células T indiferenciadas, así como a otras células del sistema inmunitario. Estimulan tanto a células T CD8 como a células T CD4.

Se describen nuevos fragmentos peptídicos restringidos por MHC de clase I que consisten en 8-10 aminoácidos de PD-L1 de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional del mismo, en donde, a lo sumo, se han sustituido dos aminoácidos de SEQ ID NO: 1, que se caracterizan por tener al menos una de diversas características, una de las cuales es la capacidad de unirse a la molécula de HLA de clase I a la que está restringida con una afinidad medida por la cantidad del péptido que es capaz de recuperar la mitad máxima de la molécula de HLA de clase I (valor de C⁵⁰) que a lo sumo es de 50 pM según se determina mediante el ensayo de unión de ensamblaje como se describe en el presente documento. Este ensayo de ensamblaje se basa en la estabilización de la molécula de HLA después de la carga del péptido en la línea celular T2 deficiente en transportador de péptidos. Posteriormente, las cadenas pesadas de HLA estables, plegadas correctamente, se inmunoprecipitan utilizando anticuerpos dependientes de la conformación y se cuantifica la unión del péptido. Estos péptidos pueden comprender (o más preferentemente consisten en) a lo sumo 200, preferentemente a lo sumo 100, más preferentemente a lo sumo 50, aún más preferentemente a lo sumo 25, incluso más preferentemente a lo sumo 20, todavía incluso más preferentemente a lo sumo 15, tal como, a lo sumo 10, por ejemplo, en el intervalo de 8 a 10, aminoácidos contiguos de PD-L1 de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional del mismo, en donde a lo sumo se han sustituido dos aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Este ensayo proporciona un medio sencillo de exploración de péptidos candidatos con respecto a su capacidad para unirse a una molécula de alelo de HLA dada con la afinidad anterior. El fragmento peptídico descrito en el presente documento es uno que tiene un valor de C⁵⁰, que a lo sumo es de 30 pM, tal como un valor de C⁵⁰, que a lo sumo es de 20 pM, incluyendo valores de C⁵⁰a lo sumo de 10 pM, a lo sumo de 5 pM y a lo sumo de 2 pM.

También se describen nuevos fragmentos peptídicos restringidos por MHC de clase II de PD-L1 de SEQ ID NO 1 o un homólogo funcional del mismo, en donde, a lo sumo, se han sustituido dos aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (también denominados, en el presente documento, "péptidos"), que se caracterizan por tener al menos una de las diversas características que se describen a continuación en el presente documento. Estos péptidos pueden comprender (o más preferentemente consisten en) entre 4 y 120, preferentemente entre 8 y 100, más preferentemente entre 10 y 75, incluso más preferentemente entre 12 y 60, aún más preferentemente entre 15 y 40, tal como entre 18 y 25 aminoácidos contiguos de PD-L1 de SEQ ID NO 1 o un homólogo funcional del mismo, en donde, a lo sumo, se han sustituido dos aminoácidos de SEQ ID NO: 1,

Por tanto, se describen nuevos fragmentos peptídicos restringidos por MHC de clase I de 8 a 10 aminoácidos o nuevos fragmentos peptídicos restringidos por MHC de clase II de 18 a 25 aminoácidos de PD-L1 de SEQ ID NO 1 o un homólogo funcional del mismo, en donde, a lo sumo, se han sustituido dos aminoácidos de SEQ ID NO 1, que se caracterizan por tener al menos una de las diversas características que se describen a continuación en el presente documento, una de las cuales es la capacidad de unirse a la molécula de HLA de clase I o clase II a la que está restringida.

En particular, se describen fragmentos peptídicos, que son péptidos restringidos por MHC de clase I o péptidos restringidos por MHC de clase II, que tienen al menos una de las siguientes características:

(i) pueden provocar células productoras de INF-y en una población de CMSP de un paciente con cáncer a una frecuencia de al menos 20 por 105 CMSP según lo determinado con un ensayo ELISPOt , y/o

(ii) pueden detectarse in situ en un tejido tumoral de CTL que son reactivos con el péptido epitópico.

(iii) pueden inducir el crecimiento de células T específicas de PD-L1 in vitro.

Los péptidos más preferidos descritos en el presente documento pueden generar una respuesta específica de células T según lo determinado mediante un ensayo ELISPOT, por ejemplo, el ensayo ELISPOT descrito más adelante en el ejemplo 1 del presente documento. Aunque algunos péptidos no se unen al MHC de clase I o II con elevada afinidad, pueden seguir generando una respuesta de células T según lo determinado por ELISPOT. Otros péptidos que pueden unirse al MHC de clase I o de clase II con elevada afinidad también dan lugar a una respuesta de células T determinada por ELISPOT. Ambos tipos de péptidos son péptidos preferidos descritos en el presente documento.

Por lo tanto, los péptidos preferidos descritos en el presente documento pueden generar una respuesta específica de células T según lo medido por un ensayo ELISPOT, en donde se miden más de 20 puntos específicos de péptido por 108 células, más preferentemente por 107, aún más preferentemente por 106, incluso más preferentemente por 105 células. En particular, los péptidos preferidos pueden generar una respuesta específica de células T de más de 20 puntos específicos de péptido por 108 CMSP, más preferentemente por 107, aún más preferentemente por 106, incluso más preferiblemente por 105 CMSP, cuando se mide mediante el ensayo ELISPOT descrito en el Ejemplo 1, incluida la estimulación una vez con péptido in vitro.

Los péptidos más preferidos de acuerdo con la presente invención son péptidos que pueden provocar una respuesta inmunitaria celular, preferentemente una respuesta de células T en un individuo que padece un estado clínico caracterizado por la expresión de PD-L1, siendo el estado clínico preferentemente un cáncer, una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad infecciosa, y más preferentemente un cáncer.

Como se ha descrito anteriormente, el sistema HLA representa el sistema principal de histocompatibilidad (MHC) humano. En general, los sistemas MHC controlan una serie de características: antígenos de trasplante, respuestas inmunitarias dependientes del timo, determinados factores del complemento y predisposición a determinadas enfermedades. Más específicamente, el MHC codifica tres tipos de moléculas diferentes, es decir, moléculas de Clase I, II y III, que determinan las características más generales del MHC. De estas moléculas, las moléculas de clase I son las denominadas moléculas HLA-A, HLA-B y HLA-C que se presentan en la superficie de la mayoría de las células nucleadas y trombocitos.

Los péptidos descritos en el presente documento se caracterizan por su capacidad para unirse a (estar restringidos por) una molécula HLA de ^mH^cde clase I particular. Por tanto, el péptido puede ser uno que esté restringido por una molécula MHC de clase I HLA-A incluyendo HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A9, HLA-A 10, HLA-A11, HLA-Aw19, HLA-A23(9), HLA-A24(9), HLA-A25(10), HLA-A26(10), HLA-A28, HLA-A29(w19), HLA-A30(w19), HLA-A31(w19), HLA-A32(w19), HLA-Aw33(w19), HLA-Aw34(10), HLA-Aw36, HLA-Aw43, HLA-Aw66(10), HLA-Aw68(28), HLA-A69(28). También se utilizan denominaciones más sencillas a lo largo de la bibliografía, donde solo se utiliza la denominación numérica principal, p. ej., HLA-A19 o HLA-A24 en lugar de HLA-Aw19 y HLA-A24(49), respectivamente. El péptido puede estar restringido a una especie de HLA del MHC de clase I seleccionada del grupo que consiste en HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11 y HLA-A24. El péptido puede estar restringido a una especie de HLA, HLA-A2 o HLA-A3, del MHC de clase I.

El péptido puede estar restringido por una molécula HLA-B del MHC de clase I que incluya cualquiera de las siguientes: HLA-B5, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B12, HLA-B13, HLA-B14, HLA-B15, HLA-B16, HLA-B17, HLA-B18, HLA-B21, HLA-Bw22, HLA-B27, HLA-B35, HLA-B37, HLA-B38, HLA-B39, HLA-B40, HLA-Bw41, HLA-Bw42, HLA-B44, HLA-B45, HLA-Bw46 y HLA-Bw47. La especie HLA-B del MHC de clase I a la que puede unirse el péptido puede seleccionarse de HLA-B7, HLA-B35, HLA-B44, HLA-B8, HLA-B15, HLA-B27 y HLA-B51.

El péptido puede estar restringido por una molécula HLA-C del MHC de clase I que incluya, pero sin limitación, cualquiera de las siguientes: HLA-Cw1, HLA-Cw2, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Cw6, H^lA-C^w7 y HLA-Cw1.

El péptido puede estar restringido por una molécula HLA del MHC de clase II que incluya, pero sin limitación, cualquiera de las siguientes: HLA-DPA-1, HLA-DPB-1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB y todos los alelos de estos grupos y HLA-DM, HLA-DO.

La selección de péptidos que en potencia tienen la capacidad de unirse a una molécula de HLA particular puede realizarse alineando secuencias conocidas que se unan a una molécula de HLA particular dada para exponer así el predominio de unos pocos aminoácidos relacionados en posiciones particulares de los péptidos. Dichos restos de aminoácido predominantes también se denominan en el presente documento "restos de anclaje" o "motivos de restos de anclaje". Siguiendo dicho procedimiento relativamente sencillo basado en datos de secuencia conocidos que se pueden encontrar en bases de datos accesibles, los péptidos pueden obtenerse de PD-L1, que probablemente se unan a una molécula de HLA específica. En la siguiente tabla se dan ejemplos representativos de dichos análisis para una serie de moléculas de HLA:

Tabla 2

continuación

Por tanto, como un ejemplo, los nonapéptidos que en potencia tienen la capacidad de unirse a HLA-A3 tendrían una de las siguientes secuencias: Xaa-L-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-K, Xaa-L-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Y; Xaa-L-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-F o Xaa-V-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-K (indicando Xaa cualquier resto de aminoácido). De manera similar, pueden diseñarse secuencias que en potencia tengan la capacidad de unirse a cualquier otra molécula de HLA. Se apreciará que el experto en la materia podrá identificar más "motivos de restos de anclaje" para una molécula HLA dada.

El péptido de la invención tiene una secuencia que es una secuencia consecutiva de la secuencia nativa del PD-L1 de SEQ ID NO:1. Sin embargo, los péptidos que tienen una mayor afinidad por cualquier molécula de HLA dada pueden proceder de dicha secuencia nativa modificando la secuencia sustituyendo, delecionando o añadiendo al menos un resto de aminoácido, por lo que se identifican motivos de restos de anclaje con respecto a la molécula de HLA dada.

Por tanto, como polipéptidos útiles se incluyen péptidos, cuyas secuencias comprenden, para cada uno de los alelos de HLA específicos enumerados en la tabla, cualquiera de los restos de aminoácido que se indican en la tabla.

Por tanto, en el presente documento se describen péptidos que pueden ser cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente que comprenden secuencias contiguas de PD-L1, en donde en el intervalo de 1 a 10, preferentemente en el intervalo de 1 a 5, más preferentemente en el intervalo de 1 a 3, aún más preferentemente en el intervalo de 1 a 2, incluso aún más preferentemente se ha intercambiado 1 aminoácido por otro aminoácido, preferentemente de una manera tal que el péptido comprenda uno o más, preferentemente todos los restos de anclaje de un péptido específico de HLA-A dado como se indica en la Tabla 2 anterior.

Los ejemplos de especies de HLA preferidos incluyen, a los que se restringen los péptidos preferidos que incluyen: una especie HLA de MHC de clase I seleccionada del grupo que consiste en HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11 y HLA-A24, más preferentemente, el péptido está restringido por HLA-A3 o HLA-A2. De manera alternativa, una especie de HLA preferida incluye especies HLA-B de MHC de clase I seleccionadas del grupo que consiste en HLA-B7, HLA-B35, HLA-B44, HLA-B8, HLA-B15, HLA-B27 y HLA-B51.

Un enfoque para identificar polipéptidos de la invención incluye las siguiente etapas: seleccionar una molécula de HLA en particular, p. ej., una que aparezca a una tasa elevada en una población dada, llevar a cabo un análisis de alineación como se describió anteriormente para identificar "motivos de restos de anclaje" en la proteína PD-L1, aislar o construir péptidos de un tamaño adecuado que comprendan uno o más de los restos de anclaje identificados y probar los péptidos resultantes para determinar la capacidad de los péptidos para provocar células productoras de INF-y en una población de CMSP de un paciente con cáncer a una frecuencia de al menos 20 por 105 CMSP determinada mediante un ensayo ELISPOT como se describe en el Ejemplo 1 incluyendo una estimulación in vitro con péptido una vez.

En un aspecto de la presente invención, se proporcionan péptidos procedentes de PD-L1 con una longitud mayor de 8 a 10 restos de aminoácido. El proteasoma procesa los polipéptidos con una longitud mayor de 8 a 10 aminoácidos a una longitud más pequeña para unirse a moléculas de HLA. Por tanto, cuando se administra un polipéptido con una longitud mayor de 8 a 10 restos de aminoácido, el proteasoma procesa en el citosol el polipéptido/la proteína/el fragmento de proteína/la variante "largo(a)" de PD-L1 en una serie de péptidos más pequeños. Una ventaja de utilizar un polipéptido más largo que pueda procesar el proteasoma en una variedad de péptidos más cortos diferentes, es que se puede dirigir a más clases de HLA con un péptido que con un péptido de 8 a 10 aminoácidos que está restringido a una clase de HLA particular.

Sorprendentemente, algunos de los péptidos de la presente invención se unen a moléculas de MHC con una afinidad lo suficientemente elevada como para hacer innecesarias las sustituciones y están listos para su uso como antígenos tal como se presentan en el presente documento. Preferentemente, la composición de vacuna descrita en el presente documento comprende uno o más de lo siguiente: Polipéptido PD-L1 de longitud completa (SEQ ID NO: 1), fragmentos polipeptídicos de éste, homólogos funcionales de PD-L1 de longitud completa de SEQ ID NO:1 y fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de PD-L1 en donde se han sustituido, añadido o delecionado uno o dos aminoácidos. Más preferentemente, la composición de vacuna comprende cualquiera de las secuencias enumeradas en el listado de secuencias de la presente divulgación. Muy preferentemente, la composición de vacuna comprende los péptidos PDL101 (SEQ ID NO: 2), PDL111 (SEQ ID NO: 12) y/o PDL114 (SEQ ID NO: 15).

Una característica importante del péptido de la invención es su capacidad para reconocer o provocar células T respondedoras productoras de INF-^y, es decir, linfocitos T citotóxicos (CTL) que reconocen específicamente el péptido particular en una población de CMSP, en una CPA o en células tumorales/neoplásicas de un individuo que padece un cáncer y/o una infección (células diana). Esta actividad se determina fácilmente sometiendo las CMSP, las CPA o las células tumorales de un individuo, a un ensayo ELISPOT. Antes del ensayo, puede ser ventajoso estimular las células que se van a ensayar poniéndolas en contacto con el péptido que se va a probar. Preferentemente, el péptido puede provocar o reconocer células T productoras de INF-^ycon una frecuencia de al menos 20 por 105 CMSP, determinado con un ensayo ELISPOT tal como se utiliza en el presente documento. Más preferentemente, la frecuencia es de al menos 30 por 105 CMSP.

El ensayo ELISPOT representa una potente herramienta para controlar las respuestas de las células T específicas de PD-L1. Una conclusión principal de los hallazgos del presente documento es que los péptidos de la invención se expresan y forman complejos con moléculas de HLA en células cancerosas y/o en CPA que expresan PD-L1. Esto hace que estas células cancerosas sean susceptibles de ser destruidas por los CTL y enfatiza la posible utilidad de la inmunización con PD-L1 para combatir el cáncer y las infecciones. La presencia de respuestas de CTL espontáneas en CMSP de pacientes con carcinoma de células renales, pacientes con melanoma y pacientes con cáncer de mama, a epítopos peptídicos procedentes de PD-L1 restringidos por HLA muestra el potencial inmunoterapéutico de los péptidos inmunogénicos de PD-L1.

En una realización de la presente invención, el fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la invención puede inducir células T específicas de PD-L1 capaces de destruir células, tales como las células cancerosas que expresan PD-L1. En particular, se prefiere que dicho fragmento peptídico pueda inducir células T específicas de PD-L1 capaces de causar la lisis de al menos el 10 % de las células cancerosas, tales como las células MDA-MB231 después de una incubación conjunta in vitro como se describe más adelante en el presente documento en los Ejemplos 1 y 2.

Origen

La proteína de la que se puede obtener el péptido puede ser cualquier polipéptido de PD-L1 de cualquier especie animal en la que se exprese la proteína. La proteína de partida puede ser de una especie de mamífero, incluida una especie de roedor, conejo y una especie de primate tal como de ser humano. Basándose en la secuencia de la proteína seleccionada, el péptido de la invención se obtiene mediante cualquier tratamiento químico o enzimático apropiado del material de partida de la proteína que dé como resultado un péptido de un tamaño adecuado como se indicó anteriormente, o puede sintetizarse mediante cualquier procedimiento convencional de síntesis de péptidos con el que el experto en la materia esté familiarizado. El polipéptido de PD-L1 de la invención procede del PD-L1 humano de SEQ ID NO:1.

individuo

El individuo que se va a tratar con la composición de vacuna descrita en el presente documento es un individuo que padece un estado clínico. El individuo es preferentemente de una especie de mamífero y lo más preferentemente un ser humano. El individuo puede tener cualquier edad, puede ser joven o mayor y puede ser un hombre o una mujer. El estado clínico que padece el individuo puede ser una enfermedad neoplásica tal como un cáncer, o una enfermedad infecciosa tal como una infección intracelular o una infección vírica o una enfermedad autoinmunitaria. Una realización de la presente invención proporciona una vacuna para el tratamiento, reducción del riesgo, estabilización o prevención de un cáncer. En otra realización, la presente invención proporciona una vacuna para el tratamiento, reducción del riesgo, estabilización o prevención de una enfermedad originada de una infección, tal como infección intracelular o una infección vírica. En otra realización más, la invención proporciona composiciones de vacuna para el tratamiento, reducción del riesgo, estabilización o prevención de una enfermedad autoinmunitaria.

Cáncer

La composición de vacuna de la presente invención puede utilizarse para prevenir, reducir el riesgo de o tratar un estado clínico. Preferentemente, el estado clínico está asociado a, o caracterizado por, la expresión de lPD-L1. PD-L1 puede ser PD-L1 identificado en SEQ ID NO: 1 o un homólogo que comparta una identidad de al menos 70 % con la SEQ ID NO: 1. Se entiende por la presente que el nivel de expresión de PD-L1 (siendo la expresión la expresión de ARNhc, ARNm, proteína precursora, proteína completamente procesada, etc.) es igual o mayor que en un individuo que no padece dicho estado clínico.

En una realización preferida de la invención, el estado clínico es cáncer. El cáncer (neoplasia maligna) es una clase de enfermedad en la que un grupo de células muestra los rasgos de crecimiento incontrolado (crecimiento y división más allá de los límites normales), invasión (intrusión sobre, y destrucción de, tejidos adyacentes) y, a veces, metástasis (propagación a otras ubicaciones del cuerpo a través de la linfa o la sangre). Estas tres propiedades malignas de los cánceres los diferencian de los tumores benignos, que son autolimitados, no invaden ni hacen metástasis. La mayoría de los cánceres forman un tumor, pero algunos, como la leucemia, no. El término "cáncer" como se usa en el presente documento pretende incluir cualquier tipo de cáncer, enfermedad neoplásica y preneoplásica.

Un grupo no limitativo de cánceres que se dan como ejemplos de cánceres que pueden tratarse, gestionarse y/o prevenirse mediante la administración de la vacuna de la presente invención incluyen: carcinoma de colon, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de próstata, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangeosarcoma, linfangioendotelioma, sarcoma, sinovioma, mesotelioma, sarcoma de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma epidermoide, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadeocarcinoma, carcinoma bulbar, carcinoma broncógeno, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioblastomas, neuronomas, craneofaringiomas, schwanoma, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemias y linfomas, leucemia linfocítica aguda y policitemia vera mielocítica aguda, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y enfermedad de las cadenas pesadas, leucemia no linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, cáncer de recto, cánceres urinarios, cánceres de útero, cánceres orales, cánceres de piel, cáncer de estómago, tumores cerebrales, cáncer de hígado, cáncer laríngeo, cáncer de esófago, tumores mamarios, leucemia linfoide aguda (LLA) nula en la niñez, LLA tímica, ALL de células B, leucemia mieloide aguda, leucemia mielomonocitoide, leucemia megacariocitoide aguda, linfoma de Burkitt, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica y leucemia de linfocitos T, carcinoma pulmonar microcítico y no microcítico, leucemia granulocítica aguda, tumores de células germinales, cáncer de endometrio, cáncer gástrico, cáncer de vías respiratorias y digestivas altas, leucemia linfoide crónica, tricoleucemia y cáncer de tiroides.

En una realización preferida, la composición de vacuna de acuerdo con la composición de vacuna de la invención puede provocar una respuesta clínica en el sujeto, en donde la respuesta clínica puede caracterizarse por una enfermedad estable, en una realización preferida, la respuesta clínica puede caracterizarse por una respuesta parcial o, preferentemente, la respuesta clínica puede caracterizarse por la remisión completa de un cáncer. Preferentemente, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en; melanoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cánceres hemáticos (tales como leucemias), cánceres de células renales y de colon, más preferentemente del grupo que consiste en melanoma, cáncer de células renales y cáncer de mama.

En un aspecto de la invención, la composición de vacuna puede provocar una respuesta clínica en un individuo. En una realización, la respuesta clínica puede caracterizarse por una enfermedad estable (sin empeoramiento ni progresión adicional), en una realización preferida, la respuesta clínica puede caracterizarse por una respuesta parcial o, preferentemente, la respuesta clínica puede caracterizarse por la remisión completa de un cáncer o infecciones. La respuesta clínica puede determinarse como se describe a continuación en el presente documento.

En otro aspecto de la invención, la composición de vacuna puede provocar una respuesta clínica en el sujeto, en donde la respuesta clínica se caracteriza por una disminución en la suma del diámetro más largo de la lesión diana más grande. La disminución puede determinarse como se describe a continuación en el presente documento.

Todas las lesiones medibles hasta un máximo de cinco lesiones por órgano y 10 lesiones en total, representativas de todos los órganos implicados, deben identificarse como lesiones diana y registrarse y medirse al inicio del estudio.

• Las lesiones diana deben seleccionarse en función de su tamaño (lesiones con el diámetro más largo) y de su idoneidad con respecto a mediciones repetidas exactas (ya sea mediante técnicas de obtención de imágenes o clínicamente).

• Se calculará una suma del diámetro más largo (DL) de todas las lesiones diana y se informará como la suma DL inicial. La suma inicial del DL se utilizará como referencia para caracterizar el tumor diana.

• La restantes lesiones (o sitios de enfermedad) deben identificarse como lesiones no diana y también deben registrarse al inicio del estudio. No se requieren mediciones de estas lesiones, pero debe anotarse la presencia o ausencia de cada una de ellas a lo largo del seguimiento.

Evaluación de las lesiones diana

• Respuesta completa (RC): Desaparición de todas las lesiones diana

• Respuesta parcial (RP): Una disminución de al menos el 30 % en la suma del DL de las lesiones diana, tomando como referencia la suma inicial del DL

• Enfermedad progresiva (EP): Una disminución de al menos el 20 % en la suma del DL de la lesiones diana, tomando como referencia la suma más pequeña del DL registrada desde el inicio del tratamiento o desde la aparición de una o más lesiones nuevas

• Enfermedad estable (EE): Sin ninguna reducción suficiente para calificarla como RP y ningún aumento suficiente para calificarla como EP, tomando como referencia la suma más pequeña del DL desde el inicio del tratamiento

Evaluación de lesiones no diana

• Respuesta completa (RC): Desaparición de todas las lesiones no diana y normalización del nivel del marcador tumoral

• Respuesta incompleta/enfermedad estable (EE): Persistencia de una o más lesiones no diana y/o mantenimiento del nivel del marcador tumoral por encima de los límites normales

• Enfermedad progresiva (EP): Aparición de una o más lesiones nuevas y/o progresión inequívoca de las lesiones no diana existentes

En una realización de la presente invención, la composición de vacuna que comprende cualquiera de las proteínas y/o polipéptidos mencionados en el presente documento es capaz de provocar una respuesta clínica en un sujeto, en donde la respuesta clínica se caracteriza por una disminución en la suma del diámetro más largo de la lesión diana más grande

Se contempla que la composición de vacuna de la invención sea capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra un cáncer que exprese PD-L1 de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional del mismo que tenga una identidad de al menos 70 % con la SEQ ID NO: 1. La composición de vacuna de la invención es capaz de provocar en un individuo vacunado la producción de células T efectoras que tengan un efecto citotóxico contra las células cancerosas, contra CPA que expresen PD-L1 y/o de inducir en un sujeto la infiltración de células T específicas de antígeno en el estroma tumoral.

Además de su capacidad para provocar respuestas inmunitarias en poblaciones de CMSP, también se contempla que los péptidos de la invención sean capaces de provocar respuestas inmunitarias citolíticas in situ, es decir, en tejidos tumorales sólidos. Esto puede demostrarse, por ejemplo, proporcionando complejos de HLA y péptido, p. ej., que estén multimerizados y provistos de un marcador detectable, y utilizando dichos complejos para tinciones inmunohistoquímicas para detectar, en un tejido tumoral, CTL que sean reactivos con los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de la invención. Por consiguiente, otra característica importante del péptido de la invención es que es capaz de detectar in situ, en un tejido tumoral, CTL que sean reactivos con el epítopo peptídico.

También se contempla que los péptidos de la invención, además de su capacidad para unirse a moléculas de HLA que dan como resultado la presentación de complejos de HLA y péptidos en la superficie celular, cuyos complejos a su vez actúan como epítopos o dianas para linfocitos T citolíticos, pueden provocar otros tipos de respuestas inmunitarias, tales como respuestas de células B que dan como resultado la producción de anticuerpos contra los complejos y/o una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH, del inglés "Delayed Type Hypersensitivity"). El último tipo de respuesta inmunitaria se define como enrojecimiento e induración palpable en el sitio de inyección del péptido de la invención.

Es un objeto de la presente divulgación, proporcionar una composición de vacuna que comprenda PD-L1 de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional del mismo que tenga una identidad de al menos 70 % con la SEQ ID NO: 1 o un fragmento peptídico inmunogénicamente activo que comprenda una secuencia consecutiva de dicho PD-L1 o dicho homólogo funcional del mismo o un ácido nucleico que codifique dicho PD-L1 o dicho fragmento peptídico; y un adyuvante, para la prevención, reducción del riesgo o tratamiento del cáncer.

Tratamiento combinado contra el cáncer

En realizaciones de la invención, en donde la invención se refiere a composiciones de vacunas que comprenden PD-L1 o un fragmento peptídico inmunogénicamente activo del mismo para el tratamiento del cáncer, en algunos casos puede ser apropiado combinar el tratamiento con la composición de vacuna de acuerdo con la invención con otro tratamiento convencional contra el cáncer tal como quimioterapia, radioterapia, tratamiento con sustancias inmunoestimuladoras, genoterapia, tratamiento con anticuerpos y tratamiento utilizando células dendríticas.

Dado que la expresión elevada de PD-L1 en las células tumorales conduce a la inhibición del sistema inmunitario, la combinación de una inmunoterapia basada en PD-L1, como se desvela en la presente invención, con quimioterapia citotóxica y u otro tratamiento inmunoterapéutico contra el cáncer, es un enfoque eficaz para tratar el cáncer. Estos remedios también se denominan en el presente documento "segundos principios activos".

Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos que son de relevancia con respecto a la administración (secuencial o simultánea) con la composición de vacuna de la presente divulgación incluyen, pero sin limitación: ácido retinoico, actimida, azacitidina, azatioprina, bleomicina, carboplatino, capecitabina, cisplatino, clorambucilo, ciclofosfamida, citarabina, daunorrubicina, docetaxel, doxifluridina, doxorrubicina, epirrubicina, etopósido, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, idarrubicina, irinotecán, lenalidomida, leucovorina, mecloretamina, melfalán, mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, oxaliplatino, paclitaxel, pemetrexed, revlimid, temozolomida, tenipósido, tioguanina, valrrubicina, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorrelbina. En una realización, un agente quimioterapéutico para su uso en la combinación del presente agente puede, en sí mismo, ser una combinación de diferentes agentes quimioterapéuticos. Las combinaciones adecuadas incluyen FOLFOX e IFL. FOLFOX es una combinación que incluye 5-fluorouracilo (5-FU), leucovorina y oxaliplatino. El tratamiento con IFL incluye irinotecán, 5-FU y leucovorina.

Otro segundo principio activo puede ser un inhibidor de cinasa, para uso por separado, simultáneo o combinado en el tratamiento de tumores. Los inhibidores de cinasa adecuados incluyen los que se ha demostrado que poseen actividad antitumoral (tales como gefitinib (Iressa) y erlotinib (Tarceva) y estos podrían utilizarse en combinación con los péptidos. Los inhibidores de tirosina cinasa receptora, tales como malato de sunitinib y sorafenib, que han demostrado ser eficaces en el tratamiento del carcinoma de células renales, también son adecuados para su uso como segundos principios activos.

Otros ejemplos de segundos principios activos son sustancias inmunoestimuladoras, p. ej., citocinas y anticuerpos. Dichas citocinas pueden seleccionarse del grupo que consiste en, pero sin limitación: GM-CSF, IFN de tipo I, interleucina 21, interleucina 2, interleucina 12 e interleucina 15. El anticuerpo es preferentemente un anticuerpo inmunoestimulador tal como un anticuerpo anti-CD40 o anti-CTLA-4. La sustancia inmunoestimuladora también puede ser una sustancia capaz de reducir las células inmunitarias inhibidoras (p. ej., linfocitos T reguladores) o factores, pudiendo ser dicha sustancia, por ejemplo, ubiquitina ligasas E3. Las ubiquitina ligasas E3 (las proteínas HECT, RING y U-box) han surgido como reguladores moleculares clave de la función de las células inmunitarias, y cada una de ellas puede estar implicada en la regulación de las respuestas inmunitarias durante la infección al dirigirse a moléculas inhibidoras específicas para la destrucción proteolítica. Varias proteínas HECT y RING E3 ahora también se han relacionado con la inducción y el mantenimiento de la autotolerancia inmunitaria: c-Cbl, Cbl-b, GRAIL, Itch y Nedd4 regulan negativamente la producción y proliferación del factor de crecimiento de células T.

En una realización, la composición de vacuna de la presente invención es para su uso en un método en el que se administra en combinación con un segundo principio activo, tal como una sustancia inmunoestimuladora. La sustancia inmunoestimuladora es preferentemente una interleucina tal como IL-21 o IL-2 o un agente quimioterapéutico.

Enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunitarias

La presente invención también se refiere a composiciones de vacuna de la presente invención para su uso en el tratamiento de una infección o una enfermedad autoinmunitaria.

La palabra infección, como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier tipo de estado clínico que dé lugar a una respuesta inmunitaria, tal como una inflamación y, por lo tanto, incluye enfermedades infecciosas, infecciones crónicas, afecciones autoinmunitarias e inflamaciones alérgicas. Por tanto, las infecciones, tales como las enfermedades infecciosas, infecciones crónicas, afecciones autoinmunitarias e inflamaciones alérgicas, son todas ellas estados clínicos de relevancia para la presente invención y se tratan a continuación.

En particular, la infección o la enfermedad autoinmunitaria puede ser una enfermedad asociada a inflamación. La inflamación es la respuesta biológica compleja de los tejidos vasculares a estímulos dañinos, tales como patógenos, células dañadas o irritantes. Es un intento protector del organismo para eliminar los estímulos nocivos e iniciar el proceso de curación del tejido. La inflamación puede clasificarse como aguda o crónica. La inflamación aguda es la respuesta inicial del organismo a un estímulo dañino y se produce por el aumento del movimiento de plasma y leucocitos desde la sangre a los tejidos lesionados. Una cascada de eventos bioquímicos se propaga y madura la respuesta inflamatoria, implicando al sistema vascular local, al sistema inmunitario y a diversas células dentro del tejido lesionado. La inflamación prolongada, conocida como inflamación crónica, da lugar a un cambio progresivo en el tipo de células presentes en el sitio de inflamación y se caracteriza por la destrucción y la curación simultánea del tejido desde el proceso inflamatorio. En cualquier caso, el PD-L1 se expresa en células del sistema inmunitario tales como las CPA y, por lo tanto, las infecciones e inflamaciones son estados clínicos que pueden tratarse, impedirse o cuyo riesgo puede reducirse mediante la administración de la composición de vacuna de la presente invención. La composición de vacuna comprende preferentemente PD-L1 o cualquiera de los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos del mismo descritos anteriormente en el presente documento.

Los ejemplos de trastornos asociados a la inflamación que son relevantes para la presente divulgación incluyen, pero sin limitación: inflamaciones alérgicas, asma, enfermedades autoinmunitarias, inflamaciones crónicas, prostatitis crónica, glomerulonefritis, hipersensibilidades, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias intestinales, enfermedad inflamatoria pélvica, lesión por reperfusión, artritis reumatoide, rechazo de trasplante y vasculitis.

Infecciones e inflamaciones crónicas

En una realización de la presente invención, el estado clínico es una inflamación crónica. En particular, la enfermedad autoinmunitaria a tratar con las composiciones de vacuna de la invención puede ser una inflamación crónica. Una inflamación crónica es un proceso patológico caracterizado por inflamación activa simultánea, destrucción de tejidos e intentos de reparación. El tejido inflamado de manera crónica se caracteriza por la infiltración de células inmunitarias mononucleares (monocitos, macrófagos, linfocitos y células plasmáticas), destrucción de tejidos e intentos de curación, que incluyen angiogénesis y fibrosis.

En la inflamación aguda, la eliminación del estímulo detiene el reclutamiento de monocitos (que se convierten en macrófagos con una activación apropiada) en el tejido inflamado y los macrófagos existentes salen del tejido a través del sistema linfático. Sin embargo, en el tejido inflamado de manera crónica, el estímulo es persistente y, por lo tanto, se mantiene el reclutamiento de monocitos, los macrófagos existentes están anclados en su lugar y se estimula la proliferación de macrófagos (especialmente en placas de ateroma).

Es un objeto de la presente divulgación, proporcionar una composición de vacuna que comprenda PD-L1 de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional del mismo que tenga una identidad de al menos 70 % con la SEQ ID NO: 1 o un fragmento peptídico inmunogénicamente activo que comprenda una secuencia consecutiva de dicho PD-L1 o dicho homólogo funcional del mismo, por ejemplo, cualquiera de los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos descritos anteriormente en el presente documento o un ácido nucleico que codifique dicho PD-L1 o dicho fragmento peptídico; y un adyuvante, para la prevención, reducción del riesgo o tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, por ejemplo, para el tratamiento de una inflamación crónica.

Enfermedades infecciosas

La composición de vacuna de la presente invención puede utilizarse para prevenir, reducir el riesgo de o tratar un estado clínico. En una realización preferida de la invención, el estado clínico es una enfermedad infecciosa. La enfermedad infecciosa puede promoverse por cualquier agente infeccioso tal como bacterias, virus, parásitos y u hongos que son capaces de inducir un aumento de la expresión de PD-L1 en el individuo que padece la enfermedad infecciosa, preferentemente, la enfermedad infecciosa es, o corre el riesgo de convertirse en, una enfermedad crónica. Por lo tanto, es un aspecto de la presente invención proporcionar una composición de vacuna de la presente invención para su uso en el tratamiento, mejora (disminución de la gravedad), estabilización y/o prevención de una enfermedad causada por un agente infeccioso.

Las enfermedades infecciosas pueden producirse por un virus, y las enfermedades víricas contra las cuales puede administrarse la composición de vacuna de la presente divulgación para su tratamiento, incluyen, pero sin limitación, las siguientes enfermedades víricas: VIH, SIDA, complejo relacionado con el SIDA, peste cristal (varicela), resfriado común, infección por citomegalovirus, fiebre del Colorado por garrapatas, fiebre del dengue, fiebre hemorrágica del Ébola, exantema vírico de manos, pies y boca, hepatitis, herpes simple, herpes zóster, VPH (virus del papiloma humano), gripe (Flu, forma abreviada influenza), fiebre de Lassa, sarampión, fiebre hemorrágica de Marburgo, mononucleosis infecciosa, paperas, norovirus, poliomielitis, leucoencefalopatía multifocal progresiva, infección del sistema nervioso causada por un rabdovirus (rabies), rubeola, SRAG (síndrome respiratorio agudo grave), virus de la viruela (viruela), encefalitis vírica, gastroenteritis vírica, meningitis vírica, neumonía vírica, enfermedad del Nilo Occidental y fiebre Amarilla. Preferentemente, la composición de vacuna se administra a individuos que padecen VIH/SIDA e infecciones víricas que pueden causar cáncer. Los principales virus asociados a cánceres humanos son el papilomavirus humano, el virus de la hepatitis B y el virus de la hepatitis C, el virus de Epstein-Barr y el virus linfotrópico de células T humanas; por tanto, es un objeto de la presente invención administrarla como tratamiento o como parte del tratamiento de estas infecciones víricas. Más preferentemente, la enfermedad infecciosa puede ser una infección con un virus seleccionado del grupo que consiste en el VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) y el virus de la hepatitis.

Los ejemplos de infecciones bacterianas de relevancia para la presente invención incluyen, pero sin limitación: carbunco, meningitis bacteriana, botulismo, brucelosis, campilobacteriosis, linfadenitis regional (enfermedad por arañazo de gato), cólera, difteria, tifus epidémico, gonorrea, impétigo, legionelosis, lepra (enfermedad de Hansen), leptospirosis, listeriosis, enfermedad de Lyme, melioidosis, fiebre reumática, infección por SARM (Staphylococcus aureus resistente a la meticilina), nocardiosis, tosferina (tos convulsiva), peste, neumonía neumocócica, psitacosis, fiebre Q, fiebre maculosa de las Montañas Rocosas (FMMR), salmonelosis, escarlatina, shigelosis, sífilis, tétanos, tracoma, tuberculosis, tularemia, fiebre tifoidea, tifus e infecciones urinarias. Es un objeto de la presente invención proporcionar una vacuna para el tratamiento y/o la prevención y/o la reducción del riesgo de una infección bacteriana.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar una composición de vacuna para su uso en el tratamiento y/o la prevención y/o la reducción del riesgo de: Enfermedades infecciosas parasitarias, tales como, pero sin limitación: tripanosomiasis africana, amebiasis, ascariasis, babesiosis, enfermedad de Chagas, clonorquiasis, criptosporidiosis, cisticercosis, difilobotriasis, dracunculiasis, equinococosis, enterobiasis, fascioliasis, fasciolopsiasis, filariasis, infección amebiana independiente, giardiasis, gnatostomiasis, himenolepiasis, isosporiasis, calazar (leishmaniasis visceral), leishmaniasis, malaria, metagonimiasis, miasis, oncocercosis, pediculosis, infección por oxiuros, sarna, esquistosomiasis, teniasis, toxocariasis, toxoplasmosis, triquinosis, triquinosis, tricuriasis, tricomoniasis y tripanosomiasis; Enfermedades infecciosas fúngicas tales como, pero sin limitación: aspergilosis, blastomicosis, candidiasis, coccidioidomicosis, criptococosis, histoplasmosis, tiña del pie; Enfermedades infecciosas por priones tales como, pero sin limitación: encefalopatía espongiforme transmisible, encefalopatía espongiforme bovina, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, insomnio familiar letal de Kuru y síndrome de Alpers; por tanto, es un objeto de la presente invención administrarlas como tratamiento o como parte del tratamiento de estas infecciones causadas por parásitos, hongos o priones.

1. En una realización preferida, las composiciones de vacuna de la invención son para su uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa, que es una infección intracelular, preferentemente una infección intracelular con un patógeno seleccionado del grupo que consiste en L. monocytogenes y plasmodios.

Tratamiento combinado contra enfermedades infecciosas

Además, se prevé que el tratamiento de cualquier enfermedad infecciosa mediante la administración de la composición de vacuna de acuerdo con la presente invención pueda administrarse junto con otro (segundo) principio activo, ya sea secuencialmente en cualquier orden o simultáneamente o junto con otro tratamiento, tal como un tratamiento con antibiótico, quimioterapia, tratamiento con sustancias inmunoestimuladoras, tratamiento utilizando células dendríticas, agentes antivíricos, agentes antiparasitarios, etc.

Los ejemplos de un segundo principio activo que puede utilizarse en el tratamiento de una enfermedad infecciosa junto con la vacuna de la presente invención incluyen, pero sin limitación, antibióticos. En el presente documento el término antibióticos se refiere a sustancias con actividad antibacteriana, antifúngica, antivírica y/o antiparasitaria; como ejemplos de relevancia para la presente invención se incluyen, pero sin limitación: amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, paromomicina, estreptomicina, tobramicina, ertapenem, imipenem, meropenem, cloranfenicol, fluoroquinolonas, ciprofloxacino, gatifloxacino, gemifloxacino, grepafloxacino, levofloxacino, lomefloxacino, moxifloxacino, norfloxacino, ofloxacino, esparfloxacino, trovafloxacino, glucopéptidos, vancomicina, lincosamidas, clindamicina, macrólidos/cetólidos, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, cefadroxilo, cefazolina, cefalexina, cefalotina, cefapirina, cefradina, cefaclor, cefamandol, cefonicid, cefotetan, cefoxitina, cefprozilo, cefuroxima, loracarbef, cefdinir, cefditoreno, cefixima, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuten, ceftizoxima, ceftriaxona, cefepima, monobactámicos, aztreonam, nitroimidazoles, metronidazol, oxazolidinonas, linezolida, penicilinas, amoxicilina, amoxicilina/clavulanato, ampicilina, sulbactam, bacampicilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, mezlocilina, nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V, piperacilina, piperacilina/tazobactam, ticarcilina, ticarcilina/clavulanato, estreptograminas, quinupristina, dalfopristina, sulfonamida/sulfametoxazol, trimetoprima, tetraciclinas, demeclociclina, doxiciclina, minociclina, tetraciclina, antifúngicos azólicos clotrimazol fluconazol, itraconazol, ketoconazol, miconazol, voriconazol, anfotericina B, nistatina, equinocandina, caspofungina, micafungina, ciclopirox, flucitosina, griseofulvina y terbinafina. De mayor relevancia son los antivíricos tales como vidarabina, aciclovir, ganciclovir y valcyte (valganciclovir), inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de nucleósidos (ITIAN): AZT (Zidovudina), ddl (Didanosina), ddC (Zalcitabina), d4T (Estavudina), 3TC (Lamivudina), inhibidores no nucleosídicos de la transcriptasa inversa (INNTI): nevirapina, delavirdina, inhibidores de proteasa: saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, ribavirina, amantadina/rimantadina, relenza y tamiflu, pleconarilo, interferones

La presente divulgación se refiere a una composición de vacuna que comprende PD-L1 de SEQ ID NO: 1, cualquiera de los homólogos funcionales del mismo descritos anteriormente en el presente documento o cualquiera de los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos del mismo descritos anteriormente en el presente documento, para el tratamiento de una enfermedad infecciosa junto con al menos un antibiótico. Preferentemente, la composición de vacuna de la presente invención se utiliza para el tratamiento de infecciones crónicas, p. ej., el VIH y, por lo tanto, se utiliza junto con cualquiera de los antibióticos enumerados anteriormente, tales como agentes antivíricos.

Enfermedades autoinmunitarias

Las enfermedades autoinmunitarias surgen cuando un organismo no reconoce sus propios componentes (hasta los niveles submoleculares) como propios, lo que da como resultado una respuesta inmunitaria contra sus propias células y tejidos. Cualquier enfermedad resultante de dicha respuesta inmunitaria anómala se denomina enfermedad autoinmunitaria y es relevante para la presente invención.

Es un objeto de la presente divulgación proporcionar una composición de vacuna que comprenda PD-L1 de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional del mismo que tenga una identidad de al menos 70 % con la SEQ ID NO: 1 o cualquiera de los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de PD-L1 descritos anteriormente en el presente documento o un ácido nucleico que codifique dicho PD-L1 o dicho fragmento peptídico; y un adyuvante, para la prevención, reducción del riesgo o tratamiento de enfermedades autoinmunitarias. Dichas enfermedades autoinmunitarias pueden seleccionarse preferentemente del grupo que consiste en enfermedad celíaca, diabetes mellitus de tipo 1 (DMDI), lupus eritematoso sistémico (LES), síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple (EM), tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, púrpura trombocitopénica idiopática y artritis reumatoide (a r ). Preferentemente, la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en diabetes, LES y esclerosis.

Tratamiento combinado contra enfermedades autoinmunitarias

Los tratamientos actuales para las enfermedades autoinmunitarias normalmente son inmunosupresores, antiinflamatorios o paliativos. Las terapias no inmunitarias, tales como el reemplazo hormonal en la tiroiditis de Hashimoto o el tratamiento de la diabetes mellitus de tipo 1 produce una respuesta autoagresiva. La manipulación dietética limita la gravedad de la enfermedad celíaca. El tratamiento con esteroides o AINE limita los síntomas inflamatorios de muchas enfermedades. Las preparaciones intravenosas de inmunoglobulina (IGIV) se utilizan para la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC) y el síndrome de Guillain-Barré (SGB). Las terapias inmunomoduladoras más específicas, tales como Etanercept, un antagonista de TNFa, han demostrado ser útiles en el tratamiento de la AR. Estas inmunoterapias pueden estar asociadas a un mayor riesgo de efectos adversos, tales como susceptibilidad a infecciones.

La terapia helmíntica se ha desarrollado basándose en estas observaciones e implica la inoculación del individuo con nematodos intestinales parasitarios (helmintos) específicos. Actualmente se dispone de dos tratamientos estrechamente relacionados, la inoculación con Necator americanus, comúnmente conocido como anquilostomas, o con huevos de Trichuris suis, comúnmente conocido como huevos de látigo de cerdo. Se dispone de investigaciones que demuestran que este enfoque es muy eficaz en el tratamiento de una variedad de trastornos autoinmunitarios, incluyendo enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, asma, alergias, esclerosis múltiple y trastornos inflamatorios crónicos

La vacuna desvelada en el presente documento puede utilizarse junto con un segundo principio activo, tal como cualquiera de los fármacos y tratamientos mencionados anteriormente contra enfermedades autoinmunitarias.

Inflamación alérgica

La alergia es un trastorno del sistema inmunitario que a menudo también se conoce como atopia. Las reacciones alérgicas se producen ante sustancias ambientales conocidas como alérgenos; estas reacciones son adquiridas, predecibles y rápidas. Estrictamente, la alergia es una de las cuatro formas de hipersensibilidad y se denomina hipersensibilidad de tipo I (o inmediata). Se caracteriza por una activación excesiva de determinados glóbulos blancos denominados mastocitos y basófilos por un tipo de anticuerpo, conocido como IgE, que da como resultado una respuesta inflamatoria extrema. Las reacciones alérgicas comunes incluyen eccema, urticaria, rinitis alérgica estacional, asma, alergias alimentarias y reacciones al veneno de insectos que pican tales como avispas y abejas.

La inflamación alérgica es una característica fisiopatológica importante de varias discapacidades o afecciones médicas, incluido el asma alérgica, dermatitis atópica, rinitis alérgica y varias enfermedades alérgicas oculares.

Es un objeto de la presente divulgación proporcionar una composición de vacuna que comprenda PD-L1 de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional del mismo que tenga una identidad de al menos 70 % con la SEQ ID NO: 1 o cualquiera de los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de PD-L1 descritos anteriormente en el presente documento o un ácido nucleico que codifique dicho PD-L1 o dicho fragmento peptídico; y un adyuvante, para la prevención, reducción del riesgo o tratamiento de inflamación alérgica.

Tratamiento combinado contra la inflamación alérgica

Existen dos tipos de tratamientos para el tratamiento de las inflamaciones alérgicas, la farmacoterapia y la inmunoterapia: la farmacoterapia y la inmunoterapia.

La farmacoterapia es el uso de fármacos antagonistas para bloquear la acción de mediadores alérgicos, o para prevenir la activación de células y de procesos de desgranulación. Estos incluyen antihistamínicos, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, epinefrina (adrenalina), teofilina, cromoglicato sódico y antileucotrienos, tales como montelukast (Singulair) o zafirlukast (Accolate); anticolinérgicos, descongestivos, estabilizadores de mastocitos y comúnmente también se utilizan otros compuestos que se cree que alteran la quimiotaxis de eosinófilos.

La inmunoterapia es el tratamiento de desensibilización o hiposensibilización en el que el individuo se vacuna gradualmente con dosis progresivamente mayores del alérgeno en cuestión. Una segunda forma de inmunoterapia implica la inyección intravenosa de anticuerpos monoclonales anti-IgE. Un tercer tipo, la inmunoterapia sublingual, es una terapia administrada por vía oral que aprovecha la tolerancia inmunitaria oral a antígenos no patógenos tales como alimentos y bacterias residentes.

La vacuna divulgada en el presente documento se utiliza junto con un segundo principio activo, tal como cualquiera de los fármacos y tratamientos mencionados anteriormente contra inflamaciones alérgicas.

Composiciones farmacéuticas

La presente divulgación se refiere a composiciones farmacéuticas capaces de tratar, reducir el riesgo y/o prevenir un trastorno clínico asociado a la expresión de PD-L1 en un individuo; en otras palabras, en el presente documento el término vacuna y la expresión composición farmacéutica se usan indistintamente. Las composiciones de vacuna descritas en el presente documento pueden ser composiciones de vacuna "tradicionales" que comprenden antígenos tales como proteínas, polipéptidos y/o moléculas de ácido nucleico. También pueden estar en forma de composiciones que comprenden células, tales como células modificadas que se originan en el individuo y después se procesan, o composiciones que comprenden moléculas complejas tales como anticuerpos o TCR.

En general, una vacuna es una sustancia o composición capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un individuo. La composición puede comprender uno o más de lo siguiente: un "componente activo" tal como uno o más antígenos, (p. ej., proteína, polipéptidos, péptidos, ácidos nucleicos y similares), construcciones de ácido nucleico que comprenden uno o más antígenos entre otros elementos, células, (p. ej., CPA cargadas, células T también para transferencia adoptiva), moléculas complejas (anticuerpos, TCR y complejos MHC y más), transportadores, adyuvantes y transportadores farmacéuticos. A continuación, se desvelan con más detalle los diversos componentes de una composición de vacuna.

La composición de vacuna de la invención puede provocar una respuesta inmunitaria contra un cáncer, CD o CPA que expresan PD-L1 de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional del mismo que tenga una identidad de al menos 70 % con la SEQ ID NO 1, cuando se administra a un individuo que padece cáncer y/o infección (que conduce a la expresión de PD-L1). En una realización preferida, el estado clínico es un cáncer. La composición de vacuna de la invención puede provocar, en un individuo vacunado, la producción de células T efectoras que tienen un efecto citotóxico contra las células cancerosas, CPA y CD que expresan PD-L1 y/o inducen la infiltración de células T específicas de antígeno en el estroma tumoral de un sujeto.

Antígenos y otros componentes activos

Composiciones de vacuna basadas en proteínas/polipéptidos

Los péptidos de la presente invención se unen preferentemente al MHC con alta afinidad y están listos para utilizarse como antígenos tal y como se presentan en el presente documento. Preferentemente, la composición de vacuna descrita en el presente documento comprende uno o más de lo siguiente: PD-L1 (SEQ ID NO: 1), fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos del mismo, homólogos funcionales de PD-L1 de longitud completa y parcial, en particular cualquiera de los fragmentos descritos anteriormente en el presente documento. Más preferentemente, la composición de vacuna comprende cualquiera de las secuencias enumeradas en la lista de secuencias de la presente divulgación. Muy preferentemente, la composición de vacuna comprende los péptidos PDL101 (SEQ ID NO: 2), PDL111 (SEQ ID NO: 12) y/o PDL114 (SEQ ID NO: 15).

La elección del antígeno en la composición de vacuna de la invención dependerá de parámetros determinables por el experto en la materia. Como se ha mencionado, una molécula de HLA particular presenta cada uno de los diferentes péptidos de la invención en la superficie celular. De esta manera, si un sujeto a tratar está tipificado con respecto al fenotipo HLA, se selecciona un péptido/péptidos que se sabe que se une/unen a esa molécula de HLA particular. De manera alternativa, el antígeno de interés se selecciona basándose en la frecuencia de los diversos fenotipos de HLA en una población determinada. Como ejemplo, el fenotipo HLA-A2 es el más frecuente en la población caucásica y, por lo tanto, una composición que contiene un péptido que se une a HLA-A2 será activa en una gran proporción de esa población. Por otra parte, los antígenos/péptidos de la presente invención pueden modificarse de acuerdo con los motivos de restos de anclaje presentados en la tabla 2, para mejorar la unión a moléculas de HLA particulares.

La composición de la invención también puede contener una combinación de dos o más péptidos derivados de PD-L1, interaccionando cada uno de ellos específicamente con una molécula de HLA diferente para cubrir una mayor proporción de la población diana. Por tanto, como ejemplos, la composición farmacéutica puede contener una combinación de un péptido restringido por una molécula de HLA-A y un péptido restringido por una molécula de HLA-B, por ejemplo, incluyendo aquellas moléculas de HLA-A y HLA-B que corresponden a la frecuencia de fenotipos HLA en la población diana, tales como, por ejemplo, HLA-A2 y HLA-B35. Adicionalmente, la composición puede comprender un péptido restringido por una molécula de HLA-C.

En el caso de vacunas basadas en péptidos, los epítopos se pueden administrar en una forma 'lista para el MHC', que permite la presentación a través de una carga exógena independientemente de la captación de antígenos y el procesamiento por las células presentadoras de antígenos del hospedador. Los péptidos de la presente invención comprenden ambos péptidos en una forma corta 'lista para el ^mH^c', y en una forma más larga que requiere el procesamiento por parte del proteasoma, proporcionando así una composición de vacuna más compleja que puede dirigirse a múltiples antígenos tumorales. Cuantos más grupos HLA diferentes sean el objetivo de una vacuna, mayor probabilidad de que la vacuna funcione en poblaciones diversas.

La presente divulgación se refiere a una composición de vacuna que comprende PD-L1 de SEQ ID NO: 1 o un homólogo funcional del mismo que tiene una identidad de al menos 70 % con la SEQ ID NO: 1 o un fragmento peptídico inmunogénicamente activo que comprende una secuencia consecutiva de dicho PD-L1 o dicho homólogo funcional de mismo o un ácido nucleico que codifica dicho PD-L1 o dicho fragmento peptídico; junto con un adyuvante para uso como medicamento. La composición de vacuna puede administrarse para tratar, prevenir o reducir el riesgo asociado a un estado clínico en un individuo.

Composición de vacuna de múltiples epítopos

La presente divulgación también se refiere a vacunas de múltiples epítopos sumamente inmunogénicas. Preferentemente, dichas vacunas deben diseñarse para facilitar un suministro simultánea de los péptidos derivados de PD-L1 más apropiados, opcionalmente junto con otros péptidos y/o adyuvantes adecuados como se describe a continuación en el presente documento. La presente divulgación abarca dichas vacunas de múltiples epítopos que comprenden péptidos derivados de PD-L1, opcionalmente junto con otras proteínas o fragmentos peptídicos que no pertenecen a, ni proceden de, PD-L1 y/o adyuvantes como se describe a continuación en el presente documento. Un factor importante que impulsa el desarrollo de vacunas que tienen una composición más compleja, es el deseo de dirigirse a múltiples antígenos tumorales, p. ej., mediante el diseño de vacunas que comprenden o codifican una colección de epítopos de CTL y de células Th cuidadosamente seleccionada. Por tanto, la divulgación se refiere a composiciones de vacuna que comprenden epítopos de PD-L1 restringidos tanto a la Clase I como a la Clase II.

Por tanto, los péptidos de la presente invención comprenden ambos péptidos en una forma corta 'lista para MHC' (restringida de clase I) y en una forma más larga que requiere el procesamiento por parte del proteasoma (restringida de clase II). Por tanto, la composición puede proporcionarse como una vacuna de múltiples epítopos que comprende un epítopo restringido de clase I y/o epítopos restringidos de clase II como se definió anteriormente en el presente documento.

Composición de vacuna basada en ácido nucleico

La composición de vacuna descrita en el presente documento puede comprender un ácido nucleico que codifica PD-L1 o un fragmento peptídico inmunológicamente activo del mismo, en particular cualquiera de los fragmentos descritos anteriormente en el presente documento. Por tanto, dicho ácido nucleico puede codificar cualquiera de las proteínas y fragmentos peptídicos mencionados anteriormente. El ácido nucleico puede ser, por ejemplo, ADN, ARN, ANB, ANH, APN, preferentemente el ácido nucleico es ADN o ARN.

Los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden estar comprendidos en cualquier vector adecuado, tal como un vector de expresión. Se encuentran disponibles numerosos vectores y el experto en la materia podrá seleccionar un vector útil para el propósito específico. El vector puede, por ejemplo, estar en forma de un plásmido, cósmido, partícula vírica o cromosoma artificial. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector mediante diversos procedimientos, por ejemplo, el ADN puede insertarse en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción apropiados utilizando técnicas bien conocidas en la materia. Aparte de la secuencia de ácido nucleico, el vector puede comprender además una o más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. El vector también puede comprender secuencias adicionales, tales como potenciadores, colas de poli-A, enlazadores, polienlazadores, enlazadores operativos, múltiples sitios de clonación (MSC), codones de terminación, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) y secuencias homologas del hospedador para la integración u otros elementos definidos. En la técnica se conocen bien métodos para diseñar construcciones de ácido nucleico (véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory, 2a edición, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). El vector es, preferentemente, un vector de expresión, que comprende el ácido nucleico unido operativamente a una secuencia reguladora de ácido nucleico que dirige la expresión del mismo en una célula adecuada. En general, dicha secuencia reguladora de ácido nucleico debería ser capaz de dirigir la expresión en una célula de mamífero, preferentemente en una célula humana, más preferentemente en una célula presentadora de antígeno.

El vector puede ser un vector vírico. El vector también puede ser un vector bacteriano, tal como un vector bacteriano atenuado. Para inducir respuestas inmunitarias duraderas en la mucosa en los sitios de infección y persistencia, pueden utilizarse vectores bacterianos atenuados. Como vectores pueden utilizarse diferentes bacterias recombinantes, por ejemplo, el vector bacteriano puede seleccionarse del grupo que consiste en Salmonella, Lactococcus y Listeria. En general, pudo demostrarse inducción de inmunidad al antígeno heterólogo HPV16 L1 o E7, con fuerte inducción de CTL y regresión tumoral en ratones. El vector puede comprender además un ácido nucleico que codifique un polipéptido estimulador de células T.

CPA con carga

En realizaciones útiles, se provoca una respuesta inmunogénica dirigida contra una enfermedad cancerosa administrando el péptido de la invención, ya sea cargando moléculas de MHC de clase I o de clase II en células presentadoras de antígeno (CPA) del individuo, aislando CMSP del individuo e incubando las células con el péptido antes de inyectar las células nuevamente en el individuo o aislando CPA precursoras del individuo y diferenciando las células en CPA profesionales utilizando citocinas y antígeno antes de inyectar las células nuevamente en el individuo.

Por tanto, en el presente documento se describen composiciones de vacuna que comprenden células presentadoras de antígeno que comprenden PD-L1 o cualquiera de sus fragmentos peptídicos inmunológicamente activos descritos anteriormente en el presente documento o un ácido nucleico que codifica dicho PD-L1 o dicho fragmento peptídico inmunológicamente activo. La célula presentadora de antígeno puede ser cualquier célula capaz de presentar un antígeno a una célula T. Las células presentadoras de antígeno preferidas son las células dendríticas. Las células dendríticas (CD) pueden prepararse y utilizarse en procedimientos terapéuticos de acuerdo con cualquier protocolo adecuado, por ejemplo, como se describe a continuación en el presente documento. El experto en la materia apreciará que el protocolo puede adoptarse para su uso en individuos con diferentes tipos de HLA y diferentes enfermedades.

Las células dendríticas (CD) pueden pulsarse con 50 pg/ml de péptido restringido por HLA (sintetizado con calidad GMP) durante 1 h a 37 °C y se administran 5 x 106 células por vía subcutánea los días 1 y 14, posteriormente cada 4 semanas, leucaféresis adicional después de 5 vacunaciones. La generación de CD para uso clínico y control de calidad se puede realizar esencialmente como se describe en Nicolette et al., (2007).

Por tanto, en el presente documento se describe un método para tratar a un individuo que padece un estado clínico caracterizado por la expresión de PD-L1, preferentemente en donde el estado clínico es un cáncer o una infección, es uno en donde el péptido se administra presentando el péptido a las células presentadoras de antígeno (CPA) del individuo ex vivo seguido de la inyección de las CPA así tratadas nuevamente en el individuo. Hay al menos dos formas alternativas de realizar esto. Una alternativa es aislar las CPA del individuo e incubar (cargar) las moléculas de MHC de clase I con el péptido. Cargar las moléculas de MHC de clase I significa incubar las CPA con el péptido para que las CPA con moléculas de MHC de clase I específicas para el péptido se unan al péptido y, por lo tanto, puedan presentarlo a las células T. Posteriormente, las CPA se vuelven a inyectan en el individuo. Otra forma alternativa se basa en los recientes descubrimientos realizados en el campo de la biología de las células dendríticas. En este caso, los monocitos (que son precursores de las células dendríticas) se aíslan del individuo y se diferencian in vitro en CPA (o células dendríticas) profesionales utilizando citocinas y antígeno. Posteriormente, las CD generadas in vitro se pulsan con el péptido y se inyectan en el individuo.

Inmunoterapia adoptiva/ transferencia adoptiva

La presente divulgación también se refiere al cultivo in vitro de células T específicas de PD-L1 y a la transferencia adoptiva de éstas a individuos. La transferencia adoptiva significa que el médico transfiere a un individuo directamente los componentes reales del sistema inmunitario que ya son capaces de producir una respuesta inmunitaria específica.

Uno de los objetivos de la presente divulgación es proporcionar células T específicas de PD-L1, que pueden ser útiles, por ejemplo, para la transferencia adoptiva. Las células T aisladas que comprenden receptores de células T capaces de unirse de manera específica a complejos de péptido PD-L1/m Hc de clase I o péptido PD-L1/MHC de clase II, pueden transferirse adoptivamente a individuos, siendo dichas células T preferentemente células T que se han expandido in vitro, en donde el péptido PD-L1 puede ser cualquiera de los péptidos PD-L1 mencionados anteriormente en el presente documento. El experto en la materia conoce bien métodos de expansión de células T in vitro. La presente divulgación también se refiere a métodos de tratamiento que comprenden la administración de células T que comprenden receptores de células T capaces de unirse específicamente a un complejo de péptido PD-L1 restringido por MHC, a un individuo, tal como un ser humano que padece una enfermedad cancerosa, en donde el péptido derivado de PD-L1 puede ser cualquiera de los péptidos PD-L1 mencionados anteriormente en el presente documento. La presente divulgación se refiere además al uso de células T que comprenden receptores de células T capaces de unirse de manera específica a PD-L1 o a fragmentos peptídicos del mismo para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer o una infección. La transferencia de células T autólogas puede realizarse esencialmente como se describe en Walter et al., (1995).

Transferencia de TCR

Dichas células T podrían irradiarse antes de la transferencia adoptiva para controlar la proliferación en el individuo. Es posible genomodificar la especificidad de las células T mediante transferencia génica de TCR (Engels et al., 2007). Esto permite la transferencia de células T que llevan la especificidad del péptido PD-L1 a los individuos. En general, el uso de linfocitos T para la inmunoterapia adoptiva es atractivo porque permite la expansión de las células linfocitos T en un entorno sin tumores o virus y el análisis de la función de las células T antes de la infusión. La aplicación de células T modificadas con el gen TCR (tal como células T transformadas con una construcción de expresión que dirige la expresión de un TCR heterólogo) en la transferencia adoptiva tiene varias ventajas en comparación con la transferencia de líneas de células T: (i) la generación de células T redirigidas es generalmente aplicable. (ii) los TCR de alta o muy alta afinidad pueden seleccionarse o crearse y utilizarse para diseñar células T. (iii) se pueden generar células T de alta avidez utilizando TCR optimizados con codones o murinizados que permitan una mejor expresión en la superficie de los TCR estabilizados. La genomanipulación de la especificidad de las células T mediante la transferencia génica del receptor de células T (TCR) puede realizarse esencialmente como se describe en Morgan et al., (2006).

Transfección de TCR

El TCR con reactividad antitumoral conocida puede introducirse genéticamente en linfocitos T humanos primarios. Los genes que codifican las cadenas a y p del TCR de un clon de CTL específico de tumor, pueden transfectarse en células T primarias y, de esta manera, reprogramar las células T con especificidad contra el antígeno tumoral. El ARN del TCR se transfecta en CMSP mediante electroporación (Schaft et al., 2006). De manera alternativa, pueden proporcionarse células T con una nueva especificidad mediante transferencia génica de TCR utilizando vectores retrovíricos (Morgan et al., 2006). Sin embargo, el provirus del vector retrovírico podría integrarse al azar en el genoma de las células transfectadas y posteriormente alterar el crecimiento celular. La electroporación de linfocitos T con ARN que codifica TCR supera esta desventaja, dado que el ARN solo está presente de manera transitoria en las células transfectadas y no puede integrarse en el genoma (Schaft et al., 2006). Por otra parte, la transfección de células se utiliza habitualmente en el laboratorio.

Adyuvantes y transportadores

La composición de vacuna de acuerdo con la invención comprende opcionalmente un adyuvante. A continuación, en el presente documento, se ofrecen ejemplos de adyuvantes y transportadores útiles. Por tanto, el PD-L1 de SEQ ID NO: 1, el homólogo funcional del mismo o el fragmento peptídico inmunogénicamente activo del mismo puede asociarse, en una composición descrita en el presente documento, con un adyuvante y/o un transportador.

Los adyuvantes son cualquier sustancia cuya mezcla en la composición de vacuna aumente o modifique de otro modo la respuesta inmunitaria contra el PD-L1 o fragmento peptídico del mismo, véase a continuación más adelante. Los transportadores son estructuras de soporte, por ejemplo, un polipéptido o un polisacárido, con el que el PD-L1 o fragmento peptídico del mismo es capaz de asociarse y que ayuda especialmente en la presentación de los péptidos de la presente invención.

Muchos de los péptidos de la invención son moléculas relativamente pequeñas y, por lo tanto, en las composiciones descritas en el presente documento puede ser necesario combinar los péptidos con diversos materiales tales como adyuvantes y/o transportadores, para producir vacunas, composiciones inmunogénicas, etc. Los adyuvantes, definidos en términos generales, son sustancias que favorecen la respuesta inmunitaria. Se proporciona un análisis general de adyuvantes en Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (2.a edición, 1986) en las páginas 61-63. Goding indica que, cuando el antígeno de interés tiene bajo peso molecular o es poco inmunogénico, se recomienda el acoplamiento a un transportador inmunogénico. Los ejemplos de dichas moléculas transportadoras incluyen hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina bovina, ovoalbúmina e inmunoglobulina aviar. También se ha sugerido que varios extractos de saponina son útiles como adyuvantes en composiciones inmunogénicas. Se ha propuesto utilizar el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), una citocina bien conocida, como adyuvante (documento WO 97/28816).

Puede haber un transportador independientemente de un adyuvante. La función de un transportador puede ser, por ejemplo, aumentar el peso molecular, en particular, de fragmentos peptídicos, para aumentar su actividad o inmunogenicidad, para conferir estabilidad, para aumentar la actividad biológica o para aumentar la semivida sérica. Por otra parte, un transportador puede ayudar a presentar el polipéptido PD-L1 o dicho fragmento del mismo a las células T. El transportador puede ser cualquier transportador adecuado conocido por un experto en la materia, por ejemplo, una proteína o una célula presentadora de antígeno. Una proteína transportadora podría ser, pero sin limitación, hemocianina de lapa californiana, proteínas séricas tales como transferrina, seroalbúmina bovina, seroalbúmina humana, tiroglobulina u ovoalbúmina, inmunoglobulinas u hormonas, tales como insulina o ácido palmítico. Para la inmunización de seres humanos, el transportador debe ser un transportador fisiológicamente aceptable y seguro para los seres humanos. Sin embargo, en una realización de la invención, el toxoide tetánico y/o el toxoide diftérico son transportadores adecuados. De manera alternativa, el transportador puede ser un dextrano, por ejemplo, sefarosa.

Por tanto, en el presente documento se describen composiciones de vacuna que comprenden PD-L1 de SEQ ID NO: 1, un homólogo funcional del mismo que comparte una identidad de secuencia de al menos 70 % o cualquiera de los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos descritos anteriormente en el presente documento que esté asociado a un transportador, tal como, p. ej., una proteína de las anteriores o una célula presentadora de antígeno tal como, p. ej., una célula dendrítica (CD).

Las composiciones de vacuna de la invención comprenden opcionalmente un adyuvante. Los adyuvantes podrían seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en: AlK(SO4)2, ALNa(SO4)2, AlNH4 (SO⁴), sílice, alumbre, Al(OH)3, Ca3 (PO4)2, caolín, carbono, hidróxido de aluminio, dipéptidos de muramilo, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-DMP), N-acetil-nornuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11687, también conocida como nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-iso-glutaminil-L-alanina-2-(1',2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, también denominada MTP-PE), RIBI (m Pl+Td M+CWS) en una emulsión de escualeno/Tween-80.RTM al 2 %, lipopolisacáridos y sus diversos derivados, incluido el lípido A, adyuvante completo de Freund (FCA), adyuvante incompleto de Freund, adyuvante 65 de Merck, polinucleótidos (por ejemplo, poli IC y poli ácidos AU), cera D de Mycobacterium tuberculosis, sustancias encontradas en Cornyebacterium parvum, Bordetella pertussis o miembros del género Brucella, TiterMax, ISCOM, Quil A, ALUN (véanse los documentos US 58767 y 5.554.372), derivados del lípido A, derivados de la toxina del cólera, derivados de HSP, derivados de LPS, matrices de péptidos sintéticos o GMDP, Interleucina 1, Interleucina 2, Montanide ISA-51 y QS-21. Los adyuvantes preferidos para su uso con la invención incluyen adyuvantes basados en aceite/tensioactivo, tales como adyuvantes Montanide (disponibles en Seppic, Bélgica), preferentemente Montanide ISA-51. Otros adyuvantes preferidos son adyuvantes basados en ADN bacteriano, tales como adyuvantes que incluyen secuencias de oligonucleótidos CpG. Otros adyuvantes incluso preferidos son los adyuvantes basados en ARNbc vírico, tal como poli I:C. Las imidazoquinolinas son otro ejemplo más de adyuvantes preferidos. Los adyuvantes más preferidos son los adyuvantes adecuados para su uso en seres humanos.

Los adyuvantes Montanide (todos disponibles en Seppic, Bélgica), pueden seleccionarse del grupo que consiste en Montanide ISA-51, Montanide ISA-50, Montanide ISA-70, Montanide ISA-206, Montanide ISA-25, Montanide ISA-720, Montanide ISA-708, Montanide ISA-763A, Montanide ISA-207, Montanide ISA-264, Montanide ISA-27, Montanide ISA-35, Montanide ISA 51F, Montanide ISA 016D y Montanide IMS, preferentemente del grupo que consiste en Montanide ISA-51, Montanide IMS y Montanide ISA-720, más preferentemente del grupo que consiste en Montanide ISA-51. Montanide ISA-51 (Seppic, Inc.) es un adyuvante basado en aceite/tensioactivo en el que diferentes tensioactivos se combinan con un aceite mineral no metabolizable, un aceite metabolizable o una mezcla de los dos. Se preparan para su uso como emulsión con una solución acuosa que comprende PD-L1 de SEQ ID NO:1, cualquiera de los homólogos funcionales del mismo descritos anteriormente en el presente documento o cualquiera de los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos del mismo descritos anteriormente en el presente documento. El tensioactivo es oleato de manida. QS-21 (Antigenics; Aquila Biopharmaceuticals, Framingham, MA) es una saponina hidrosoluble sumamente purificada que se comercializa como una solución acuosa. Los adyuvantes QS-21 y Montanide ISA-51 pueden proporcionarse en viales esterilizados de un solo uso.

La citocina GM-CSF bien conocida es otro adyuvante preferido de la presente invención. El GM-CSF se ha utilizado como adyuvante durante una década y puede ser preferentemente GM-CSF como se describe en el documento WO 97/28816.

También se contempla en la invención que las composiciones de vacuna puedan comprender más de un adyuvante diferente y, por tanto, las composiciones de vacuna de la invención pueden comprender una mezcla de los adyuvantes mencionados anteriormente en el presente documento. Por otra parte, en la presente invención se contempla que tanto la composición de vacuna como al menos otro adyuvante, puedan administrarse a un individuo que lo necesite de manera simultánea o secuencial en cualquier orden.

En la siguiente tabla se enumeran las funcionalidades deseables de los adyuvantes que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención.

_________________________________ Tabla 3: Modos de acción adyuvante

Acción Tipo de adyuvante Beneficio

1. Inmunomodulador Generalmente moléculas o proteínas de Regulación al alza de la respuesta pequeño tamaño que modifican la red de inmunitaria. Selección de Th 1 o Th2 citocinas

2. Presentación Generalmente moléculas o complejos Aumento de la respuesta de anticuerpos anfipáticos que interaccionan con el neutralizantes. Mayor duración de la inmunógeno en su conformación nativa respuesta

3. Inducción de CTL • Partículas que pueden unirse a un Procesamiento citosólico de proteína que inmunógeno o rodearlo y que pueden fusionarse produce péptidos restringidos de clase 1 con las membranas celulares o romperlas correctos

• Sin emulsiones para la unión directa del Proceso sencillo si se conocen uno o más péptido a la superficie celular MHC-1 péptidos promiscuos 4. Direccionamiento • Adyuvantes particulados que se unen al Uso eficaz de adyuvantes e inmunógenos inmunógeno. Adyuvantes que saturan las Como anteriormente. También puede células de Kupffer determinar el tipo de respuesta si el

• Adyuvantes de hidratos de carbono que se direccionamiento es selectivo

dirigen a los receptores de lectina en

macrófagos y CD

5. Generación de • Sin emulsión para microesferas o nanoesferas Potencial de eficacia de la vacuna de dosis depósito de corto plazo a largo plazo única

Fuente: Cox, J.C. y Coulter, A.R. (1997). Vaccine 15, 248-56.

Una composición de vacuna de acuerdo con la presente invención puede comprender más de un adyuvante. Por otra parte, en el presente documento se describe una composición terapéutica que comprende además cualquier sustancia adyuvante y/o transportador que incluya cualquiera de los anteriores o combinaciones de los mismos. También se contempla que la proteína PD-L1, el homólogo funcional del mismo o cualquiera de sus fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos y el adyuvante, puedan administrarse por separado en cualquier secuencia apropiada. Preferentemente, las composiciones de vacuna de la presente invención comprenden un adyuvante Montanide tal como Montanide ISA 51 o Montanide ISA 720 o el adyuvante GM-CSF o una mezcla de los mismos.

Por consiguiente, en el presente documento se describe una composición terapéutica que comprende además una sustancia adyuvante que incluye cualquiera de los anteriores o combinaciones de los mismos. También se contempla que el antígeno, es decir, el péptido de la invención y el adyuvante, puedan administrarse de manera simultánea o separada en cualquier secuencia apropiada.

Dosis y administración

La cantidad de PD-L1 o de su fragmento peptídico inmunogénicamente activo en la composición de vacuna puede variar, dependiendo de la aplicación particular. Sin embargo, una sola dosis del PD-L1 o del fragmento peptídico del mismo es preferentemente cualquiera de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 5000 pg, más preferentemente de aproximadamente 50 pg a aproximadamente 2500 pg, tal como de aproximadamente 100 pg a aproximadamente 1000 pg. Los modos de administración incluyen administración intradérmica, subcutánea e intravenosa, implantación en forma de formulación de liberación prolongada, etc. En el presente documento se incluyen todas y cada una de las formas de administración conocidas en la materia. También se incluyen todas y cada una de las formas farmacéuticas convencionales conocidas en la materia que sean apropiadas para formular composiciones peptídicas inmunogénicas inyectables, tales como formas liofilizadas y formas en soluciones, suspensiones o emulsiones que contengan, si se requiere, transportadores, diluyentes, conservantes, adyuvantes, componentes tamponadores, etc. convencionales, farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse y administrarse utilizando cualquier protocolo convencional conocido por un experto en la materia. En el ejemplo 2 se ofrece un ejemplo no limitativo de la preparación de una composición de vacuna de acuerdo con la invención, así como un ejemplo no limitativo de la administración de dicha vacuna. El experto en la materia apreciará que el protocolo se puede adaptar fácilmente a cualquiera de las composiciones de vacuna descritas en el presente documento. En una realización adicional de la invención, la composición farmacéutica de la invención es útil para el tratamiento de un individuo que padece un estado clínico caracterizado por la expresión de PD-L1, tal como un cáncer e infecciones.

El efecto inmunoprotector de la composición de la invención puede determinarse utilizando varios enfoques conocidos por los expertos en la materia. Una respuesta inmunitaria satisfactoria también puede determinarse mediante la aparición de reacciones DTH después de la inmunización y/o la detección de anticuerpos que reconocen de manera específica el péptido o péptidos de la composición de vacuna.

Las composiciones de vacuna de acuerdo con la invención pueden administrarse a un individuo en cantidades terapéuticamente eficaces.

Las composiciones farmacéuticas pueden proporcionarse al individuo mediante diversas vías tales como subcutánea, tópica, oral e intramuscular. La administración de las composiciones farmacéuticas se realiza por vía oral o parenteral. Los métodos de suministro parenteral incluyen la administración tópica, intraarterial (directamente al tejido), intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal o intranasal. La presente divulgación también tiene como objetivo proporcionar formulaciones farmacéuticas tópicas, orales, sistémicas y parenterales adecuadas para su uso en los métodos de profilaxis y tratamiento con la composición de vacuna.

Por ejemplo, las composiciones de vacuna pueden administrarse en formas farmacéuticas orales tales como comprimidos, cápsulas (incluyendo cada una formulaciones de liberación programada y liberación sostenida), píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, soluciones, suspensiones, jarabes y emulsiones, o mediante inyección. Del mismo modo, también pueden administrarse en forma intravenosa (tanto en embolada como o infusión), intraperitoneal, subcutánea, tópica con o sin oclusión o intramuscular, utilizando todas las formas bien conocidas por los expertos en la materia farmacéutica. Una cantidad eficaz pero no tóxica de la vacuna, que comprende cualquiera de los compuestos descritos en el presente documento, puede emplearse como agente profiláctico o terapéutico. También se incluyen todas y cada una de las formas farmacéuticas convencionales conocidas en la materia que sean apropiadas para formular composiciones peptídicas inmunogénicas inyectables, tales como formas liofilizadas y formas en soluciones, suspensiones o emulsiones que contengan, si se requiere, transportadores, diluyentes, conservantes, adyuvantes, componentes tamponadores, etc. convencionales, farmacéuticamente aceptables.

Los modos de administración preferidos de la composición de vacuna de acuerdo con la invención incluyen, pero sin limitación, administración sistémica, tal como administración intravenosa o subcutánea, administración intradérmica, administración intramuscular, administración intranasal, administración oral, administración rectal, administración vaginal, administración pulmonar y generalmente cualquier forma de administración mucosa. Por otra parte, se incluyen los medios para cualquiera de las formas de administración mencionadas en el presente documento.

Una vacuna de acuerdo con la presente invención puede administrarse una vez, o cualquier cantidad de veces, tal como dos, tres, cuatro o cinco veces. En una realización, la administración de la composición de vacuna de la presente invención puede administrarse cualquier cantidad de veces, tal como 1 vez al mes los dos primeros años, en lo sucesivo en el presente documento administrarse una vez cada tres meses durante al menos dos años, tal como tres años, cuatro años o cinco años. La administración de la vacuna más de una vez tiene el efecto de reforzar la respuesta inmunitaria resultante. La vacuna también puede reforzarse administrando la vacuna en una forma o parte del cuerpo diferente de la administración anterior. La inyección de refuerzo es una inyección de refuerzo homóloga o heteróloga. Una inyección de refuerzo homóloga es una donde la primera vacunación y las posteriores comprenden las mismas construcciones y, más específicamente, el mismo vehículo de suministro, especialmente el mismo vector vírico. Una inyección de refuerzo heteróloga es una donde idénticas construcciones están comprendidas dentro de diferentes vectores víricos.

Segundo principio activo

Es un aspecto de la presente invención que la composición de vacuna proporcionada en el presente documento se utilice junto con un segundo principio activo. La administración de la composición de vacuna y el segundo principio activo puede ser secuencial o combinada. Los ejemplos de segundos principios activos se presentan anteriormente tanto para cánceres como para infecciones. Otro aspecto es que la composición de vacuna puede utilizarse junto con otra terapia de relevancia para el estado clínico determinado que se va a tratar. Dicha terapia puede incluir cirugía, quimioterapia o genoterapia, sustancias inmunoestimuladoras o anticuerpos inmunoestimuladores; un experto en la materia puede determinar el tratamiento combinado apropiado en una circunstancia determinada.

En algunos casos, será apropiado combinar el método de tratamiento descrito en el presente documento con un tratamiento médico adicional, tal como quimioterapia, radioterapia, tratamiento con sustancias inmunoestimuladoras, genoterapia, tratamiento con anticuerpos y/o antibióticos y tratamiento utilizando células dendríticas.

Herramientas de diagnóstico y pronóstico

Los péptidos de la presente invención proporcionan la base para desarrollar procedimientos de diagnóstico y pronóstico de amplia aplicación con respecto a enfermedades cancerosas e infecciones. Por tanto, la composición de la invención puede utilizarse para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia de células que expresan PD-L1 en un individuo. El procedimiento de diagnóstico se basa en la detección de células T reactivas a PD-L1 en CMSP o en tejido tumoral.

Por consiguiente, se describe un kit de diagnóstico para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia de células T reactivas a PD-L1 en CMSP o en tejido tumoral de un individuo, que comprende uno o más péptidos de la invención, y un método para detectar en un individuo la presencia de dichas células T reactivas, comprendiendo el método, poner en contacto un tejido tumoral o una muestra de sangre con un complejo de un péptido de la invención y una molécula de HLA de clase I o de clase II o un fragmento de dicha molécula y detectar la unión del complejo con el tejido o las células sanguíneas. En el presente documento se describe un complejo de un péptido de la invención y una molécula de HLA de Clase I o Clase II o un fragmento de dicha molécula, que es útil como un reactivo de diagnóstico tal como se describe en el presente documento. Dicho complejo puede ser monomérico o multimérico.

Otro enfoque diagnóstico o pronóstico útil se basa en la generación de anticuerpos en una especie animal heteróloga, p. ej. anticuerpos murinos dirigidos contra PD-L1 humano, que después pueden utilizarse, p. ej., para diagnosticar la presencia de células cancerosas que presentan el péptido. Para dichos fines de inmunización, la cantidad de péptido puede ser menor que la utilizada en el ciclo de una terapia in vivo, tal como se ha mencionado anteriormente. En general, una dosis preferida puede variar de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 750 pg de péptido. También es posible producir anticuerpos monoclonales basándose en la inmunización con un péptido de la invención. Por consiguiente, la presente divulgación también se refiere a una molécula, en particular, un anticuerpo monoclonal o policlonal que incluye un fragmento del mismo, que sea capaz de unirse específicamente a un péptido de la invención y a una molécula que sea capaz de bloquear dicha unión, p. ej., un anticuerpo producido contra el anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra un péptido de la invención. Por otra parte, la divulgación se refiere a receptores de células T aisladas capaces de unirse específicamente a un péptido o a una proteína de la invención así como a ácidos nucleicos aislados que los codifican. Dichos receptores de células T pueden clonarse, por ejemplo, a partir de células T específicas de proteínas o péptidos utilizando técnicas estándar bien conocidas por el experto.

En el presente documento también se describen células T aisladas que comprenden receptores de células T capaces de unirse específicamente a PD-L1 y/o a cualquiera de los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos del mismo descritos en el presente documento. Los linfocitos T aislados pueden ser células T CD8 o células T CD4. Las células T aisladas son, preferentemente, células T que se han expandido in vitro.

El experto en la materia conoce bien métodos de expansión de células T in vitro. Dichas células T pueden ser útiles, en particular, en el tratamiento del cáncer mediante transferencia adaptativa o transferencia de células autólogas. Por tanto, la divulgación también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden células T, así como a métodos de tratamiento que comprenden la administración de células T que comprenden receptores de células T capaces de unirse específicamente a PD-L1 o a fragmentos peptídicos del mismo a un individuo que lo necesite, tal como un individuo que padezca cáncer y/o infecciones. La transferencia de células autólogas puede realizarse esencialmente como describen Walter et al., (1995).

La presente divulgación proporciona los medios para tratar, prevenir, aliviar o curar un estado clínico, caracterizado por la expresión de PD-L1, tales como cánceres e infecciones, preferentemente un cáncer, que comprende administrar a un individuo que padece la enfermedad, una cantidad eficaz de una composición como se define en el presente documento, una molécula que es capaz de unirse específicamente a un fragmento peptídico, que puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o un receptor de células T o el kit de piezas descrito en el presente documento. Por consiguiente, en el presente documento también se desvela un método para tratar un estado clínico asociado a la expresión de PD-L1 de SEQ ID NO: 1.

Control de la inmunización

La composición farmacéutica descrita en el presente documento puede ser una composición de vacuna. Por lo tanto, es de interés controlar la inmunización en un individuo al que se le administra la composición de vacuna de la presente invención. Por tanto, la composición de vacuna puede ser capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra un cáncer y/o una infección. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "composición de vacuna" se refiere a una composición que provoca al menos un tipo de respuesta inmunitaria dirigida contra células que expresan PD-L1, tales como células cancerosas, CPA o CD. Por tanto, dicha respuesta inmunitaria puede ser cualquiera de las siguientes: Una respuesta de CTL donde se generan CTL que son capaces de reconocer el complejo de HLA/péptido presentado en las superficies celulares, lo que da como resultado la lisis celular, es decir, la vacuna provoca en el sujeto vacunado la producción de células T efectoras que tienen un efecto citotóxico contra las células cancerosas; una respuesta de células B que da lugar a la producción de anticuerpos contra el cáncer; y/o un tipo de respuesta inmunitaria DTH. Un objetivo de la presente divulgación es controlar la inmunización de un individuo mediante el control de cualquiera de las reacciones anteriores después de administrar la composición de la presente invención a dicho individuo.

En el presente documento se describen métodos para controlar la inmunización, comprendiendo dicho método las etapas de

i) proporcionar una muestra de sangre de un individuo

ii) proporcionar PD-L1 de SEQ ID NO: 1, cualquiera de los homólogos funcionales del mismo descritos anteriormente en el presente documento o cualquiera de los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos descritos anteriormente en el presente documento,

iii) determinar si dicha muestra de sangre comprende anticuerpos o células T que comprendan receptores de células T que se unan específicamente a la proteína o al péptido iv) determinar así si se ha producido una respuesta inmunitaria contra dicha proteína o péptido en dicho individuo.

El sujeto es preferentemente un ser humano, por ejemplo, un ser humano que se ha inmunizado con PD-L1 o un fragmento peptídico del mismo o un ácido nucleico que codifique dicha proteína o péptido.

Kit de piezas

En el presente documento también se describe un kit de piezas que comprende

• cualquiera de las composiciones de vacuna descritas en el presente documento y/o

• un PD-L1 de SEQ ID NO: 1 o cualquiera de los homólogos funcionales del mismo descritos anteriormente y/o • cualquiera de los fragmentos polipeptídicos inmunogénicamente activos de PD-L1 descritos anteriormente en el presente documento, y/o

• cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de los dos puntos anteriores e instrucciones sobre cómo utilizar el kit de piezas.

En el presente documento se describe adicionalmente un kit de piezas que comprende

• un PD-L1 de SEQ ID NO: 1 o cualquiera de los homólogos funcionales del mismo descritos anteriormente y/o • cualquiera de los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos de PD-L1 descritos anteriormente en el presente documento y/o

• cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de los dos puntos anteriores y un segundo principio activo.

Preferentemente, el segundo principio activo se elige en correspondencia con el estado clínico que se va a tratar, de modo que en el caso de que se trate un cáncer, el segundo principio activo se elige, por ejemplo, entre los agentes quimioterapéuticos enumerados anteriormente. Del mismo modo, si está tratando una infección microbiana/vírica, el segundo principio activo es preferentemente un antibiótico y/o un agente antivírico.

Los componentes del kit de piezas están preferentemente incluidos en composiciones individuales, sin embargo, todos los componentes del kit de piezas están incluidos en la misma composición. Por tanto, los componentes del kit de piezas pueden administrarse de manera simultánea o secuencial en cualquier orden.

Ejemplos

Ejemplo 1

Pacientes

Se extrajeron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de pacientes con cáncer (carcinoma de células renales, melanoma y cáncer de mama) y de controles sanos. Se extrajeron muestras de sangre un mínimo de cuatro semanas después de finalizar cualquier tipo de terapia contra el cáncer. Las CMSP se aislaron utilizando la separación de medios Lymphoprep, se tipificó el HLA (siglas del inglés Human Leukocyte Antigen, antígenos leucocitarios humanos) (Department of Clinical Immunology, University Hospital, Copenhague, Dinamarca) y se congelaron en FCS con DMSO al 10 %. El Comité de Ética de la Investigación de la región de la capital de Dinamarca aprobó el protocolo y se llevó a cabo de acuerdo con las disposiciones de la declaración de Helsinki. Antes de su inscripción en el estudio, se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes.

Ensayo ELISPOT

El ensayo ELISPOT (siglas del inglés, enzyme-linked immunosorbent spot, enzimoinmunoanálisis de recuento de puntos o ELISA de recuento de puntos), se utilizó para cuantificar células efectoras liberadoras de IFN-y específicas de péptido como se ha descrito anteriormente (Andersen et al., 2001, Cancer Res. 61:869-872). En algunos experimentos, las CMSP se estimularon una vez in vitro con péptido antes del análisis como se describe (McCutcheon et al., 1997, J Immunol Methods 210:149-166) para ampliar la sensibilidad del ensayo. Resumiendo, placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45; Millipore) se recubrieron durante la noche con mAb de IFN-^yde captura (Mabtech). Los pocilios se lavaron, se bloquearon con medio X-vivo y las células efectoras (CMSP extraídas y, cuando se indicó, estimuladas como se ha descrito anteriormente) se añadieron por duplicado a diferentes concentraciones celulares, con o sin péptido 10 pM. Las placas se incubaron durante la noche. Al día siguiente, el medio se descartó y los pocillos se lavaron antes de añadir el Ab (anticuerpo) secundario biotinilado relevante (Mabtech). Las placas se incubaron a temperatura ambiente (TA) durante 2 horas, se lavaron y a cada pocillo se añadió conjugado de avidina-enzima (AP-Avidina; Calbiochem/Invitrogen Life Technologies). Las placas se incubaron a TA durante 1 hora y a cada pocillo se añadió el sustrato enzimático NBT/BCIP (Invitrogen Life Technologies) y se incubó a TA durante 5-10 min. Después de la aparición de puntos de color púrpura oscuro, la reacción finalizó lavando con agua corriente. Los puntos se contaron utilizando el analizador ImmunoSpot Serie 2.0 (CTL Analyzers).

Establecimiento de cultivos y clones de células T específicas de antígeno

Se estimularon CMSP de un paciente con melanoma con CD autólogas, irradiadas (20 Gy), cargadas con péptido PD-L101 (proporción de CMSP:CD = 3*106: 3*105). Al día siguiente, se añadió IL-7 (5 ng/ml) e IL-12 (10 ng/ml) (PeproTech, Londres, RU). La estimulación de los cultivos se llevó a cabo cada 10 días con CD autólogas, irradiadas, cargadas con PDL101 (2x), seguido de CMSP autólogas, irradiadas, cargadas con I^kB10 (3x). Después de cada estimulación, se añadieron ciento veinte U/ml de IL-2 (PeproTech, Londres, RU). Después de un mes, se analizó la especificidad de los cultivos en crecimiento en ensayo de liberación de 51Cr estándar.

Ensayo de citotoxicidad

Para determinar la citotoxicidad mediada por CTL, se realizaron ensayos de liberación de 51Cr convencionales como se describe en cualquier otra parte (Andersen et al., 1999). Las células diana eran células T2 con y sin PDL101 (figura 3a) y la línea celular de cáncer de mama HLA-A2+ era la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 (figura 3b) (disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, American Type Culture Collection)).

Resultados

Respuesta inmunitarias restringidas por HLA-A2 contra PD-L1

La secuencia de aminoácidos de la proteína PD-L1 se exploró para determinar los epítopos peptídicos nonaméricos y decaméricos de HLA-A2 más probables de los principales restos de anclaje específicos de HLA-A2 (véase la Tabla 2). Se seleccionaron 17 péptidos derivados de PD-L1 y posteriormente se sintetizaron. Utilizando el ensayo de secreción ELISPOT de IFN-y, se examinaron CMSP de pacientes con cáncer y de individuos sanos para detectar la presencia de respuestas específicas de células T contra estos péptidos derivados de PDL1. Las CMSP de pacientes con cáncer HLA-A2+ en fase avanzada (cáncer de mama, melanoma y carcinoma de células renales) se estimularon una vez con los diferentes péptidos in vitro antes de examinarlas mediante ELISPOT. Se detectaron respuestas ELISPOT contra PDL101, (LLNAFTVTV; PD-L^115-23, SEQ ID NO:2)), PDL111 (CLGVALTFI; PDL^1250-258, SEQ ID NO:12) y PDL114 (VILGAILLCL; PDL^1242-251, SEQ ID NO: 15). Además, se examinaron CMSP de individuos sanos para determinar la reactividad contra estos tres péptidos derivados de PDL1. Los resultados se muestran en la figura 1, que muestra puntos específicos de PDL1 por 5*105 CMSP según lo determinado después de la estimulación una vez in vitro con péptido como se ha descrito anteriormente en el presente documento.

Además de determinar la presencia de células T específicas utilizando IFNy como marcador, también se utilizó TNFa como marcador. Por tanto, se realizó un ensayo ELISPOT esencialmente como se describe anteriormente con el péptido PDL101 que incluye una estimulación una vez in vitro con dicho péptido, excepto que se utilizaron anticuerpos contra TNFa en lugar de anticuerpos contra IFN^y. En la figura 2B se muestran los resultados.

Detección de células T restringidas por HLA-A2 reactivas a PD-L 1 en pacientes con cáncer

Mientras que la frecuencia de las células T reactivas a PD-L1 aumentó notablemente mediante estimulación in vitro, las células T reactivas a PDL1 también fueron fácilmente detectables ex vivo en pacientes seleccionados: En seis pacientes con fuertes respuestas después de estimulación in vitro, también se detectó una reactividad respectiva ex vivo. Los resultados se muestran en la figura 2A, que muestra puntos específicos de PDL1 por 5*105 CMSP según lo determinado en CMSP directamente después de la extracción, es decir, sin estimulación in vitro.

Capacidad funcional de células T específicas de PD-L1

Habiendo identificado pacientes portadores de respuestas contra el péptido PDL101, se utilizaron CMSP de dichos pacientes para generar cultivos in vitro de células T específicas contra este péptido. Las CMSP se estimularon con células dendríticas (CD), autólogas, pulsadas con PD-L1, como se ha descrito anteriormente. Después de cuatro rondas de estimulación, la especificidad del péptido se probó en ensayos de liberación de 51Cr estándar. Para ello, células T2 no cargadas o células T2 cargadas con el péptido I^kB10, actuaron como dianas. Este ensayo reveló que solo se destruyeron células T2 pulsadas con PD-L101 (figura 3). A continuación, los cultivos de células T específicas de PD-L1 se utilizaron adicionalmente para probar la capacidad de destruir las líneas de células cancerosas positivas a HLA-A2.

A continuación, mediante dilución limitante, se establecieron clones de CTL a partir de los cultivos de células T específicas. Después de una breve etapa de expansión, la especificidad de los clones en crecimiento se analizó en ensayos de liberación de 51Cr estándar. El clon 9 causó eficazmente la lisis de las células T2 pulsadas con PD-L1. Del mismo modo, el clon 9 generado a partir del cultivo a granel específico fue capaz de destruir células de cáncer de mama MDA-MB-231.

Ejemplo 2

Composición de vacuna

Se mezclan 500 |jg de péptido PD-L1 (PDL101, PDL111 o PDL115) en 500 pl de tampón fosfato con 500 j l de adyuvantes Montanide (Seppic, Francia) y se administran al paciente. Además, 75 jg de Leukine (Sargramostim; GM-CSF - disponible en Genzyme, Estados Unidos) para estimular el sistema inmunitario. Tanto la composición de vacuna como el GM-CSF se administran mediante inyección subcutánea. Además, para aumentar la respuesta inmunitaria local, el área de vacunación se trata por vía tópica con Aldara (Imiquimod, disponible en MEDA AB, Suecia).

Ejemplo 3

Pacientes

Se extrajeron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de individuos sanos y de pacientes con cáncer (melanoma, carcinoma de células renales y cáncer de mama). Se extrajeron muestras de sangre un mínimo de cuatro semanas después de finalizar cualquier tipo de terapia contra el cáncer. Las CMSP se aislaron utilizando la separación de medios Lymphoprep, se tipificó el h La y se congelaron en FCS con DMSO al 10 %. El Comité de Ética de la Investigación de la región de la capital de Dinamarca aprobó el protocolo y se llevó a cabo de acuerdo con las disposiciones de la declaración de Helsinki. Antes de su inscripción en el estudio, se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes.

Predicción de péptidos de unión a HLA-A2 de PD-L1

Para identificar epítopos de CTL restringidos por HLA-A2 para PD-L1, la secuencia de aminoácidos de PD-L1 se analizó utilizando la "Base de datos SYFPEITHIP" (15) disponible en Internet. El nonámero (9mero) (denominado en el presente documento "PD-L101") PDL^115-23; (LLⁿA^fTVTV) obtuvo una puntuación de 30 con el algoritmo SYFPEITHI y resultó ser el principal epítopo candidato. Se produjeron el péptido PD-L101 y dos polipéptidos largos (long) de PD-L1; PDLong1: PDL19-28, FMTYWHLLNAFTVTVPKDL y PDLong2: PDL1242-264, VILGAILLCLGVALTFIFLRKG. Solo el primero (PDLong1) incluía la secuencia de PD-L101. El epítopo de unión de alta afinidad por HLA-A2, VIH-1 pol476-484 (ILKEPVHGV) y CMV pp65 pos495-503 (NLVPMVATV) se utilizó como controles irrelevantes.

Ensayo ELISPOT

En el presente estudio, el ELISPOT se realizó de acuerdo con las directrices proporcionadas por el CIP (http://cimt.eu/cimt/files/dl/cip_guidelines.pdf). En algunos experimentos, las CMSP se estimularon una vez in vitro con péptido antes del análisis como se describe para ampliar la sensibilidad del ensayo. Resumiendo, placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (Multiscreen ^mA ⁱP N45; Millipore) se recubrieron durante la noche con los anticuerpos relevantes. Los pocillos se lavaron, se bloquearon con medio X-vivo y las células efectoras se añadieron, si era posible, por triplicado, de lo contrario, por duplicado a diferentes concentraciones celulares, con o sin péptido. Las placas se incubaron durante la noche. Al día siguiente, el medio se descartó y los pocillos se lavaron antes de añadir el Ab (anticuerpo) secundario biotinilado relevante (Mabtech), seguido del conjugado Avidina-enzima (AP-Avidina; Calbiochem/Invitrogen Life Technologies) y finalmente el sustrato enzimático NBT/BCIP (Invitrogen Life Technologies). Los puntos se contaron utilizando el analizador ImmunoSpot Serie 2.0 (CTL Analyzers). La definición de una respuesta ELISPOT se basó en las directrices y recomendaciones proporcionadas por el CIP mediante un enfoque empírico o estadístico; el primero implica establecer un umbral para representar una respuesta biológica. Esto está respaldado por las directrices del CIP que sugieren que se debe definir un umbral como >6 puntos específicos por 100 000 CMSP. La prueba de remuestreo sin distribución (RSD) no paramétrica ofrece una manera de comparar oficialmente los pocillos estimulados con antígeno con los pocillos de control negativo. Como mínimo, el ensayo ELISPOT debe realizarse al menos por triplicado. Por otra parte, se utilizó la prueba de Mann-Whitney no paramétrica de datos independientes para comparar los respondedores específicos de PD-L101 entre pacientes con cáncer y donantes sanos.

Establecimiento de cultivos de células T específicas de antígeno

Se establecieron dos cultivos de células T específicas de PD-L101. Se estimularon CMSP de un paciente con cáncer de mama (CM.21) y de un paciente con melanoma (MM.05) con CD autólogas, irradiadas, cargadas con PD-L101. Al día siguiente se añadieron IL-7 e IL-12 (PeproTech, Londres, RU). La estimulación de los cultivos se llevó a cabo cada 8 días con CD autólogas, irradiadas, cargadas con PD-L101 (2x), seguido de CMSP autólogas, irradiadas, cargadas con PD-101. El día después de la estimulación con péptido, se añadió IL-2 (PeproTech, Londres, RU).

Generación de DC

Se generaron DC a partir de CMSP mediante adherencia en placas de cultivo a 37 °C durante 1-2 horas en RPMI-1640. Durante 6 días, se cultivaron monocitos adherentes en RPMI-1640 complementado con suero de ternera fetal al 10 % en presencia de IL-4 (250 U/ml) y GM-CSF (1000 U/ml). Las CD se maduraron mediante la adición de IL-p (1000 U/ml), IL-6 (1000 U/ml) TNF-a (1000 U/ml) y PGE²(1 ug/ml).

Ensayo de citotoxicidad

Los ensayos de liberación de 51C convencionales para determinar la citotoxicidad mediada por CTL se llevaron a cabo como se describe en Andersen et al., J Immunol 1999. Las células diana eran células T2, la línea de células B transformadas con VEB HLA-A2+ (KIG-BCL), CD maduras (CDm) autólogas, líneas celulares de melanoma HLA-A2+ (MM1312.07 y MM.909.06) con o sin adición de IFN-y (100 /ml) durante 2 días. Las células T2 y KIG-BCL se pulsaron con proteína recombinante PD-L1 (Sino Biological Inc.) durante 3 horas a 37 °C previa adición de cromo. La lisis de las células T2 se bloqueó utilizando anticuerpo anti-HLA-A2 conjugado con FITC (2 ug/100 ul, BD Biosciences). Tecnología de intercambio de péptidos HLA y ELISA

Para evaluar la afinidad del complejo HLA-péptido se utilizó un método de intercambio UV junto con un ELISA de tipo sándwich como se describió anteriormente (19). Como controles positivos se utilizaron dos péptidos aglutinantes fuertes (HLA-A2/CMV pp65 pos495-503 (NLVPMVATV) y HLA-A2/VIH-1 pol476-484 (ILKEPVHGV)) y una muestra no expuesta a luz UV, mientras que como control negativo se utilizó una muestra sin péptido de rescate. Se prepararon controles positivos por cuadruplicado y péptido PD-L101 por triplicado.

Silenciamiento de PD-L1 mediado por ARNip

El dúplex Stealth de ARNip para el silenciamiento dirigido de PD-L1 y el dúplex de control negativo Stealth de ARNip recomendado para el contenido medio de GC, se obtuvieron en Invitrogen (Invitrogen, Paisley, RU). El dúplex Stealth de ARNip de PD-L1 consistía en la secuencia de sentido 5'-CCUACUGGCAUUUGCUGAACGCAUU3' y la secuencia de antisentido 5'-AAUGCGUUCAGCAAAUGCCAGUAGG-3'. Para experimentos de silenciamiento de PD-L1, CDm se transfectaron con ARNip de PGL1, utilizando parámetros de electroporación.

Análisis de citometría de flujo

El análisis de citometría de flujo se realizó en un citómetro FACSCANTO II (BD Biosciences, San José CA, EE. UU.) para determinar la expresión de PD-L1 en la superficie de CDm antes y después del silenciamiento dirigido por ARNip, células T2, líneas celulares KIG-BCL y de melanoma HLA-A2+ (MM1312.07 y MM.909.06) con o sin tratamiento con IFN-^y. Las células se lavaron en PBS/BSA al 1 % y posteriormente se tiñeron con anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 conjugado con FITC o PE-Cy5 durante 30 min en hielo en PBS/BSA al 1 %. Como control se utilizó un anticuerpo del mismo isotipo no reactivo (BD Biosciences). Los análisis de fluorescencia se realizaron utilizando el programa informático FACSDiva (BD Biosciences) y el programa informático FlowJo (Tree Star, Ashland OR, EE.UU).

Tinción de multímeros de HLA

Para la tinción de multímeros/tetrámeros, se prepararon tetrámeros acoplados con PE y APC utilizando tecnología de intercambio de péptidos de MHC. La tinción se realizó con CD3-AmCyan, CD8-Pacific Blue, CD4-FITC (BD Bioscience) y los complejos de HLA-tetrámero HLA-A2/PD-L101 (POL^115-23; LLNAFTVTV) o HIV-1 (pol476-484; ILKEPVHGV) conjugados con APC/PE. Antes de realizar el análisis FACs (Fluorescent Activated Cell Sorter, clasificación de células activadas por fluorescencia), se añadió el marcador de muerte celular 7-AAD-PerCP (BD Bioscience). Para el enriquecimiento, los cultivos de células T se tiñeron con tetrámero HLA-A2/PD-L101 conjugado con PE y posteriormente se aislaron con microesferas anti PE (MACS Miltenyi Biotec).

En algunos experimentos, las células se estimularon con péptido PD-L101 (0,2 mM) o con un péptido del VIH irrelevante y se tiñeron con anticuerpo CD107a-PE (BD Biosciences) durante 4 h a 37 °C. Después, las células se tiñeron con tetrámero y marcadores de superficie y se analizaron en un citómetro FACSCANTO II (BD Biosciences, San José, EE.UU).

Resultados

Respuestas naturales de células T contra PD-L 1

La secuencia de aminoácidos de la proteína PD-L1 se exploró para determinar los epítopos peptídicos nonadecaméricos y decaméricos de HLA-A2 más probables utilizando la "Base de datos SYFPEITHIP" disponible en Internet. El péptido PD-L^115-23(LLNAFTVTV) denominado "PD-L101" resultó ser el principal candidato con una puntuación predictiva de 30 y este péptido se sintetizó posteriormente. Utilizando el ensayo de secreción ELISPOT de IFN-^y, se efectuó un recuento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de individuos sanos y de pacientes con cáncer, para detectar la presencia de respuestas específicas de células T contra este péptido derivado de PD-L1. El ensayo ELISPOT se ha utilizado anteriormente para la identificación de nuevos antígenos tumorales basándose en inmunidad espontánea en pacientes con cáncer. Por tanto, las CMSP HLA-A2+ de pacientes con cáncer de mama, carcinoma de células renales o melanoma, se estimularon una vez con PD-L101 in vitro antes del análisis con ELISPOT. Se detectaron respuestas fuertes y frecuentes contra PD-L101 en varios pacientes. En la figura 4A se ilustran las respuestas de células T específicas de PD-L101 en un paciente con carcinoma de células renales (RCC.46) y en dos pacientes con melanoma (MM.04 y MM.13). En general, ELISPOT de IFN-y reveló la presencia de células T reactivas a PD-L1 en la sangre de pacientes con cáncer HLA-A2+ (Figura 4B). Además, se examinó la reactividad contra PD-L1 en CMSP de individuos sanos (Figura 4B). Aunque se podían encontrar células T específicas de PD-L1 entre las CMSP de individuos sanos, parecía ser menos frecuente que en los pacientes con cáncer, aunque una prueba de Mann-Whitney ilustró que esta diferencia no llegó a ser significativa (P = 0,06). Para explicar los datos, ocho pacientes que respondieron se representan en un gráfico de barras en la Figura 4C en el que las respuestas se comparan con el fondo de cada paciente. El ELISPOT de IFN-y se realizó solo por duplicado para ahorrar material y, por consiguiente, las respuestas solo se consideran mediante el enfoque empírico, tal y como sugieren las directrices del programa de inmunoguiado (CIP, inmunoguidingprogram) de la CIMT (cáncerimmunotheraphy, inmunoterapia del cáncer). También se examinaron CMSP de pacientes que respondían al IFN-^yde PD-L1 para ver si las células específicas de PD-L101 liberaban además la citocina TNF-a. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Puede observarse en la figura 4D que las células naturales específicas de PD-L101 liberaron también TNF-a después de la estimulación con el epítopo derivado de PD-L1. En los ocho pacientes, la respuesta a TNF-a llegó a ser significativa utilizando una prueba de remuestreo sin distribución (RSD) no paramétrica.

A continuación, se examinaron a los tres pacientes que respondieron para determinar la presencia de células específicas de PD-L101 directamente ex-vivo sin estimulación con péptido in vitro. En la figura 5A se ilustra un ELISPOT directo. Mientras que la frecuencia de las células T reactivas a PD-L1 aumenta notablemente mediante estimulación in vitro, las células T reactivas a PD-L1 fueron fácilmente detectables ex vivo en pacientes seleccionados (Figura 5B).

La capacidad de PD-L101 para unirse a HLA-A2 se examinó a través de la comparación con dos epítopos de alta afinidad, restringidos por HLA-A2, es decir, VIH-1 pol476-484 (ILKEP^vH^gV) y CMV pp65 pos495-503 (NLVPMVATV)(NLVPMVATV), utilizando tecnología de intercambio de péptidos seguido de ELISA. P^d-L101 se unió a HLA-A2 de forma comparable al epítopo de control de alta afinidad (Figura 5C). La alta afinidad de unión de PD-L101 a HLA-A2 permitió crear tetrámeros de HLA-A2/PD-L101 estables, que se utilizaron para detectar CTL reactivos con PDL1 mediante citometría de flujo. En primer lugar, se tiñeron las CMSP de dos pacientes que respondieron a PD-L101 con el tetrámero específico de HLA-A2/PD-L101 directamente ex vivo. Esto reveló que las células T reactivas a PD-L1 eran detectables ex vivo en los dos pacientes (Figura 5D). En ambos pacientes, la estimulación in vitro con un péptido aumentó notablemente la frecuencia de células T específicas de p D-L1. A continuación, se utilizaron las CMSP de estos pacientes con cáncer (CM.21 y MM.05) para generar cultivos en bruto de células T contra este péptido in vitro. Posteriormente, se estimularon in vitro las CMSP de los pacientes con CD autólogas pulsadas con PD-L101. Después de tres reestimulaciones in vitro se detectaron células T claramente positivas a HLA-A2/PD-L101. El 13,52 % de células positivas al tetrámero PD-L1 se obtienen utilizando células T de un paciente con cáncer de mama y el 0,17 % de células positivas al tetrámero PD-L1 se obtienen utilizando células T de un paciente con melanoma maligno (Figura 5D).

Las células T específicas de PD-L1 son CTL

La función citolítica de los cultivos específicos de PD-L1 se probó en ensayos de liberación de 51Cr estándar utilizando, como células diana, células T2 deficientes en TAP cargadas con PD-L101 o con un péptido de control irrelevante procedente del VIH. En la figura 6A se ilustra que los cultivos de células T de dos pacientes diferentes causaron la lisis de células T2 pulsadas con PD-L101 de manera eficiente, mientras que no se observó citotoxicidad contra células T2 pulsadas con el péptido irrelevante. Por otra parte, se añadieron PD-L101 o el péptido del VIH irrelevante directamente al cultivo en bruto de células T y el cultivo se analizó mediante FACS. Esto reveló distintas poblaciones de células HLA-A2/PD-L101-tetrámero+, Cd107a+ en cultivos con PD-L101 añadido (Figura 6B)

A continuación, se examinó si las células T específicas de PD-L101 presentes entre las CMSP mostraban directamente una función citotóxica. Por tanto, las CMSP de los tres pacientes con melanoma (MM.03, MM.53 y MM.135) que portaban células T específicas de PD-L1 y liberadoras de IFN-y, se analizaron para comprobar la reactividad adicional contra PD-L101 utilizando ELISPOT de Granzima B (GrB). Se pudieron detectar respuestas contra PD-L101 en los tres pacientes (aunque solo dos llegaron a ser significativas) con una frecuencia de aproximadamente 100-300 células específicas de PD-L101 y liberadoras de GrB por 5*105 CMSP (Figura 6C).

Actividad citolítica contra células de melanoma PD-L1+

A continuación, se examinó la capacidad de los CTL específicos de PD-L101 para destruir las células de melanoma PD-L1+ MM1312.07 y MM.909.06. Un cultivo CTL específico de PD-L101 eliminó ambas líneas celulares, aunque MM1312.07 solo se eliminó de manera eficaz a una proporción de efector a diana de 30: 1 (Figura 7A). El cultivo de CTL fue sumamente específico para PDL101. La expresión de PD-L1 por las dos líneas celulares de melanoma MM1312.07 y MM.909.06 se examinó mediante FACS. Ambas líneas celulares expresaron PD-L1, aunque MM1312.07 solo mostró una expresión muy baja. El tratamiento con IFN-y aumentó la expresión de PD-L1 en ambas líneas celulares (Figura 7B). De acuerdo con esto, el tratamiento con IFN-y aumentó la destrucción de ambas líneas celulares de melanoma (Figura 7A). Para aumentar la destrucción del reconocimiento de las células de melanoma, se enriqueció el CTL específico de PD-L101 utilizando perlas magnéticas acopladas al tetrámero HLA-A2/PD-L101. El cultivo de CTL resultante consistió en aproximadamente un 78 % de células positivas a tetrámero y eliminó las líneas celulares de melanoma MM1312.07 y MM.909.06 con una eficacia muy alta (Figura 7C).

Lisis de células dendríticas dependiente de PD-L1

El PD-L1 puede inducirse en células inmunitarias. Por tanto, como siguiente etapa y mucho más importante, se abordó la cuestión de si las CD maduras que expresan PD-L1 también serían susceptibles de ser destruidas por CTL reactivos a PD-L1. Para probar esta idea, se generaron CD autólogas de los mismos donantes de los que se habían generado los cultivos de CTL; las CD se maduraron mediante la adición de un cóctel de maduración estándar que consistió en IL-1b, IL-6, TNF-a y PGE². Se examinaron dos cultivos diferentes de CTL específicos de PD-L101 generados a partir de dos pacientes con cáncer (Figura 8A y 8B). Ambos cultivos de CTL destruyeron de manera eficaz CD maduras (CDm) que expresaban PD-L1 (Figuras 8A y 8B). Adicionalmente, utilizando diferentes concentraciones de ARNip de PD-L1, se reguló a la baja la expresión de la proteína PD-L1 en las CD autólogas y, por lo tanto, se rescató a las CD de ser eliminadas por los cultivos de CTL específicos de PD-L1 (Figuras 8A y 8B). Como control, las CDm se transfectaron con ARNip de control medio negativo para GC. Estas CD fueron destruidas por cultivos de células T específicas de PD-L101 (Figuras 8A y 8B). El porcentaje de células positivas para tetrámero PD-L101 entre los cultivos de células T que destruyen mDC se evaluó mediante tinción con tetrámero. Se utilizaron los complejos de tetrámeros HLA-A2/PD-L101-PE/APC y HLA-A2/HIVPE/APC. Se identificó un 46,92 % y un 71,69 % de células positivas a tetrámero de PD-L101 entre los cultivos de células T que destruyen CDm (Figura 8A y 8B respectivamente). Para validar la atenuación de PD-L1 a nivel de proteína, se analizó la expresión de PD-L1 en la superficie en CDm 24 h después de la transfección de ARNip (Figura 8C). Estas tinciones confirmaron que el uso de ARNip de PD-L1 redujo el nivel de expresión de la proteína PD-L1 en las células (Figura 8C) en una cuestión dependiente de la concentración. Extraordinariamente, la eficacia de destrucción se correlacionó con la cantidad de PD-L1 expresada por la CD.

Presentación cruzada independiente de TAP de PD-L1 por células presentadoras de antígeno no profesionales

Se analizaron dos polipéptidos largos de PD-L1; PDL19-28 (FMTYWHLLNAFTVTVPKDL) denominado "PDLong1" y PDL1^242-254(VILGAILLCLGVALTFIFRLRKG) denominado "PDLong2". Solo el primero (PDLong1) incluía la secuencia de PD-L101 (PDL^115-23; LLNAFTVTV). Los CTL específicos de PD-L101 se probaron frente a la línea de células B transformada con VEB HLA-A2+, K iG-BCL, pulsada con PD-L101, PDLong1, PDLong2 o con un péptido del VIH irrelevante. Las células B pulsadas no solo con el péptido PD-L101 mínimo sino también con el péptido PDLong1 fueron reconocidas por el CTL específico de PD-L101, mientras que las células B pulsadas con PDLong2 o con péptidos de control del VIH no se destruyeron (Figura 9A). Las células KIG-BCL no expresaron PD-L1 (Figura 9D). De manera similar, se examinó la capacidad de las células T2 para presentar de forma cruzada el péptido PD-L1 largo. Por tanto, los CTL específicos de PD-L101 se probaron frente a las células T2 pulsadas con PD-L101, PDLong1, PDLong2 o con el péptido del VIH. A pesar de la ausencia de transportadores TAP en las células T2, el péptido PDL01 fue presentado de manera eficaz por las células T2, ya que fueron destruidas por el CTL específico de PD-L101 (Figura 9B). La destrucción fue de HLA-A2 restringido, ya que podría bloquearse mediante la adición de anticuerpos anti-HLA-A2 (Figura 9C). Las células T2 no expresaron PD-L1 (Figura 9D). Por último, se evaluó si los CTL específicos de PD-L101 reconocían las células KIG-BCL o T2 pulsadas con la proteína de longitud completa durante al menos 3 horas. Aparentemente, KIG-BCL no pudo presentar de forma cruzada la proteína de longitud completa, ya que estas células no fueron reconocidas (Figura 9). Sin embargo, sorprendentemente, las células T2 pulsadas con la proteína de longitud completa fueron reconocidas y eliminadas por CTL específico de PD-L101 (Figura 9B). Por tanto, las células T2 eran capaces no solo de absorber, procesar y presentar PDLong1 sino además la proteína PD-L1 recombinante de longitud completa.

Ejemplo 4

Para investigar si la coestimulación con el péptido PD-L1 reforzará la reactividad de las células T frente a antígenos víricos y asociados a tumores, se realizó cualquiera de los siguientes experimentos.

Cocultivo con células T autólogas específicas de PD-L 1

Se estimularon CMSP in vitro con 50 pg/ml de péptido vírico (CMV pp65495-503 (NLVPMVATV), CMV IE^1316-324(VLEETSVML) o matriz de gripe p58-66(GILGFVFTL)). Los días 2 y 6, se añadieron 40 U/ml de IL-2. El día 6, las CMSP se cultivaron solas o se añadieron células T autólogas específicas de PD-L1 (en una proporción de CMSP a células T específicas de PD-L1 de 2000:1). El día 9, los cultivos se estimularon con 120 U/ml de IL-2. Después de 12 días en cultivo, se comparó la cantidad de células T específicas de virus en los cultivos, ya sea células T específicas de PD-L1 cultivadas solas o añadidas, mediante tinción con tetrámero de MHC. También se comparó la cantidad de Tregs (células T reguladoras), de células T productoras de IL-17A y la proporción de células CD4/CD8 en los cultivos. Como control, las CMSP se cocultivaron con células T CD8+ autólogas de especificidad irrelevante.

Coestimulación con péptido PD-L1

Se estimularon CMSP in vitro con 25 pg/ml de antígenos víricos o asociados a tumores (CMV pp65495-503 (NLVPMVATV), CMV IE^1316-324(VLEETSVML) o MART^-126-35(EAAGIGILTV)), ya sea en cocultivo con 25 pg/ml de péptido PD-L1 o con un péptido irrelevante (VIH-1 pol476-484 (ILKEPVHGV)). Cada tres días, se añadieron 40 U/ml de

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición de vacuna que comprende

a) un fragmento peptídico inmunogénicamente activo, que consiste en una secuencia consecutiva de, a lo sumo, 50 aminoácidos de PD-L1 de SEQ ID NO: 1, y que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 o la secuencia VILGAILLCLGVALTFIFRLRKG; y opcionalmente

b) un adyuvante

para su uso como medicamento.

2. La composición de vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho fragmento peptídico inmunogénicamente activo, consiste en una secuencia consecutiva de, a lo sumo, 40 aminoácidos de PD-L1 de SEQ ID NO: 1.

3. La composición de vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho fragmento peptídico inmunogénicamente activo comprende la secuencia FMTYWHLLNAFTVTVPKDL.

4. La composición de vacuna para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en adyuvantes basados en ADN bacteriano, adyuvantes basados en aceite/tensioactivo, adyuvantes basados en ARNbc vírico e imidazoquinolinas.

5. La composición de vacuna para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha composición de vacuna comprende células presentadoras de antígeno que comprenden el fragmento peptídico inmunogénicamente activo o un ácido nucleico que codifica dicho fragmento peptídico inmunogénicamente activo.

6. La composición de vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica.

7. La composición de vacuna para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho uso es en un método para el tratamiento o la prevención del cáncer, una infección o una enfermedad autoinmunitaria.

8. La composición de vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho método comprende la administración secuencial o combinada con un segundo principio activo.

9. La composición de vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho segundo principio activo comprende quimioterapia, radioterapia, sustancias inmunoestimuladoras, genoterapia, anticuerpos, antibióticos o células dendríticas.

10. Un fragmento peptídico inmunogénicamente activo, que consiste en una secuencia consecutiva de, a lo sumo, 50 aminoácidos de PD-L1 de SEQ ID NO: 1 y que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 o la secuencia VILGAILLCLGVALTFIFRLRKG.

11. El fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la reivindicación 10, que consiste en una secuencia consecutiva de, a lo sumo, 40 aminoácidos de PD-L1 de SEQ ID NO: 1.

12. El fragmento de péptido inmunogénicamente activo de la reivindicación 10 u 11, para uso en un método para el tratamiento o la prevención del cáncer.