BR112014009526B1 - Composição de vacina compreendendo pd-l1, kit de partes compreendendo tal composição e uso dos mesmos para tratar ou prevenir câncer - Google Patents

Abstract

imunoterapia com base em pd-l1. a presente invenção refere-se ao campo de profilaxia e terapia de condições clínicas incluindo câncer, doenças autoimunes e doenças infeciosas. em particular é proporcionado composições de vacina compreendendo pd-l1 ou fragmentos de peptídeos dos mesmo que são capazes de provocar respostas imunes úteis no tratamento do câncer, doenças autoimunes ou doenças infecciosas.

Description

[001] Todas as referências de patentes e não patentes citadas no pedido, ou no presente pedido, também estão incorporadas aqui para referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se ao campo de profilaxia e terapia de condições clínicas incluindo o câncer, doenças autoimunes e doenças infecciosas. Em particular há proporcionado composições de vacina compreendendo fragmentos de peptídeo ou PD-L1 dos mesmos que são capazes de provocar respostas imunes úteis no tratamento do câncer, doenças autoimunes ou doenças infecciosas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] O sistema imune tem a capacidade de reconhecer e destruir as células neoplásticas, contudo, apesar do fato de que a transformação neoplástica é associada com a expressão de antígenos imunogênicos, o sistema imune geralmente falha ao responder eficazmente a estes antígenos. O sistema imune se torna tolerante em relação a estes antígenos. Quando isto acontece, as células neoplásticas proliferam incontrolavelmente levando a formação de canceres malignos com um prognóstico desfavorável para os indivíduos afetados. O estado adquirido de tolerância deve ser superado para a imunoterapia de câncer ter sucesso.

[004] Várias linhas de evidência sugerem que as células T são os principais efetores na resposta imunológica contra as células de câncer. As proteínas regulatórias imunes tipo a indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), antígeno linfócito T citotóxico 4 (CTLA-4) e ligante 1 de inativação de células programadas 1 (PD-L1) desempenham um papel vital na supressão imune e na indução da tolerância de respostas imunes anticâncer. O CTLA-4 é um regulador negativo chave das respostas de células T, que pode restringir a resposta imune antitumoral.

[005]Recentemente, o anticorpo ipilimumab anti-CTLA-4 foi aprovado pela FDA assim como o EMEA para o tratamento de melanoma após mostrar efeito nos estudos de fase clínica III. Outro mecanismo central neutralizando a imunidade específica de tumor e prevenir uma imunoterapia anticâncer eficaz requer um ambiente específico no qual as células dendríticas tolerogênicas (DC) desempenham um papel essencial desviando a resposta imune para longe da imunidade eficaz.

[006] A morte programada 1 (PD1) é uma molécula de superfície regulatória distribuindo sinais de inibição importantes para manter o silêncio funcional da célula T contra seus antígenos cognatos. Seus ligantes, conhecidos como PD-L1 e PD-L2, ou B7-H2 são expressos nos APCS, células de tumor, placentária, e células não hematopoiéticas encontradas no microambiente inflamatório. A interferência com o PD-1 ou seu ligante PD-L1 aumenta a imunidade antitumoral. Parece que a regulação para cima do PD-L1 é um mecanismo que os canceres podem empregar para escapar do sistema imune hospedeiro. A expressão de PD-L1 nos tumores correlatos com resultado clínico desfavorável para uma variedade de canceres incluindo pâncreas, células renais, do ovário, cabeça e pescoço, e melanoma (Hamanishi et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104:3360-3365; Nomi et al., 2007, Clin. Cancer Res. 13:2151-2157; Hino et al., 2010, Cancer. 116:1757-1766. Desse modo, a análise de 196 espécimes de tumores de pacientes com carcinoma de células renais descobriu que uma elevada expressão de tumor de PD-L1 foi associada com uma agressividade de tumor elevada e um risco elevado em 4,5 vezes de morte (Thompson et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101:17174-17179). Os pacientes com câncer no ovário com a expressão mais elevada de PD-L1 tiveram um prognóstico significantemente mais desfavorável do que aqueles com uma expressão mais baixa de PD-L1. Uma correlação inversa foi observada entre a expressão PD-L1 e a conta linfócito T CD8+ intraepitelial, sugerindo que o PD-L1 nas células de tumor pode suprimir as células antitumorais CD8+ (Hamanishi et al., 2007, vide supra).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] O problema da imunossupressão do câncer é resolvido pela presente invenção que é com base na descoberta surpreendente pelos inventores de respostas imune citotóxicas espontâneas contra as células expressando PD-L1 em pacientes com câncer. Estas descobertas abrem o caminho para novas abordagens terapêuticas e diagnósticos que podem ser geralmente aplicáveis no controle de doenças de câncer.

[008] Interessantemente, as descobertas não são restritas ao câncer, mas também são úteis em outras condições clínicas caracterizadas pela presença de células indesejáveis que expressam PD-L1.

[009] A presente invenção alveja a doença de câncer matando as células de câncer expressando o PD-L1 diretamente e matando as células regulatórias expressando PD-L1. Isto é feito para permitir que as células T reconheçam as células expressando PD-L1. Também, quando a condição clínica é uma infecção, as células T são capacitadas para matar os APCs/DCs expressando PD-L1.

[010] Desse modo, a expressão da enzima de supressão imune PD-L1 nas células de câncer e APCs é positiva em conjunto com a aplicação do método da presente invenção, que alveja estas células expressando PD-L1. Esta abordagem, especialmente quando esta implica em matar os APCs/ Dcs, vai contra a opinião comum no campo, onde o PD-L1 geralmente é inibida por tentativa a fim de remover um meio ambiente tolerável ao redor do APCs/ DCs enquanto preserva estas células, que são consideradas requeridas a fim de lançar uma resposta imune eficaz.

[011] Além disso, a descoberta de respostas imune citotóxicas espontâneas contra as células expressando PD-L1 é particularmente surpreendente já que as células expressando PD-L1 antagonizam os efeitos desejados de outras abordagens imunoterapêuticas. Portanto, uma combinação de imunoterapias alvejando um tumor e PD-L1 é altamente sinérgica.

[012] A presença de uma resposta de célula T in vivoespecífica para PD-L1 demonstra que os pacientes com câncer são capazes de gerar respostas de células para PD-L1 in vivo em resposta a presença de peptídeos PD-L1. Desse modo, as duas condições para gerar uma resposta de célula T são encontradas: as células T estão presentes nos pacientes com câncer e elas têm a capacidade de expandir, que são mostradas no pedido como depositado. Este segue a partir do conhecimento geral no campo de imunologia que proporcionando uma proteína PD-L1 adicional ou peptídeos PD-L1 levarão a geração de respostas de células T específicas de PD-L1.

[013] Em contraste aos anticorpos ligados por membrana nas células B, que podem reconhecer os antígenos sozinhos, as células T reconhecem um ligante complexo, compreendendo uma ligação de peptídeo antigênico a uma proteína chamada de complexo de histocompatibilidade maior (MHC). No homem, esta molécula é conhecida como um antígeno de leucócito humano (HLA). Os peptídeos de amostra de moléculas HLA Classe I da degradação de proteína dentro da célula e apresenta estes na superfície da célula para as células T. Por isso, este possibilita que as células T procurem por alterações celulares. Quando uma célula T encontra um antígeno no contexto de uma molécula HLA, este se submete a uma expansão clonal e diferencia entre memória e várias células T efetoras. Por isso, a identificação de uma resposta imune espontânea é evidência de que um antígeno é uma célula T alvo. Este demonstra que as células T específicas já foram ativadas e têm se expandido in vivo.

[014] O método ELISPOT usado nos exemplos 1 e 3 do presente pedido é um ensaio muito sensível que demonstra a presença de respostas imunes in vivo e não de células tronco simples. Também, os tetrâmeros de peptídeos MHC têm sido usados com sucesso para identificar e estudar as células T específicas para os antígenos associados a tumor (TAA) que desenvolvem endogenamente ou após a vacinação em pacientes. Os tetrâmeros também têm sido usados para isolar e expandir as células T específicas TAA para uma imunoterapia celular adotiva. O presente pedido demonstra a presença de células T específicas de tetrâmeros PD-L1 (veja Exemplo 3) que também demonstra uma resposta PD-L1 contínua in vivo.

[015] A presente invenção diz respeito a uma composição de vacina compreendendo um PD-L1 da SEQ ID NO: 1 ou um homólogo funcional do mesmo pelo menos 70% idêntico ao mesmo ou um fragmento de peptídeo ativo imunogenicamente compreendendo uma sequência consecutiva de pelo menos 8 aminoácidos PD-L1 ou tal homólogo funcional do mesmo ou um ácido nucléico codificando tal PD-L1, tal homologo funcional do mesmo ou tal fragmento de peptídeo; e um adjuvante para o uso como medicamento.

[016] O efeito sinérgico de uma combinação de imunoterapias com base na vacina divulgada acima é proporcionado no aspecto da invenção que diz respeito a um kit de partes compreendendo a composição de vacina e uma outra composição imunoestimulante.

[017] O aspecto de combinar uma vacina da presente invenção com outros tratamentos para o câncer tais como agentes quimioterápicos também é proporcionado aqui.

[018] O aspecto de combinar a vacina da presente invenção com outros tratamentos contra infecções tais como imunoterapias e/ou antibióticos também é proporcionada aqui.

[019] Segue que um método para tratar uma condição clínica tal como um câncer ou infecção por qualquer um dos meios descritos acima abrangidos pelo escopo da presente invenção; os meios incluem administrar a um indivíduo sofrendo de uma condição clínica uma quantidade eficaz da composição de vacina junto com outra composição imunoestimulante e/ou um agente quimioterápico.

[020] Também é, desse modo, um objeto da presente invenção usar o PD-L1 ou um fragmento de peptídeo ativo imunologicamente do mesmo compreendendo uma sequência consecutiva de tal PD-L1 ou um homólogo funcional do mesmo ou uma composição de vacina citada acima na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença de câncer.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[021] A figura 1 mostra a presença de respostas de células T contra PDL101, PDL111 e PDL114 como medido pelo ELISPOT IFN-Y. A média de pontos específicos PDL (após a subtração dos pontos sem um peptídeo adicionado) foi calculada por 5 x 105 PBMC por cada paciente (triangulo branco). O PBMC do peito de pacientes com câncer (BC), pacientes com carcinoma de células renais (RCC), pacientes com melanoma maligno (MM) assim como indivíduos saudáveis (HD) foram analisados. As células T foram estimuladas uma vez com um peptídeo antes de ser plaquetada a 5 x 105 células por poço em duplicata tanto sem quanto com o peptídeo PDL1.

[022] A figura 2 mostra a presença de resposta de células T contra PDL101 como medido pelo ELISPOT: (a), A média de pontos específicos PDL-101 (após a subtração de pontos sem o peptídeo adicionado) foi calculada por 5 x 105 PBMC para cada paciente (triangulo branco). O PBMC do peito dos pacientes com câncer (BC), pacientes com carcinoma de célula renal (RCC), pacientes com melanoma maligno (MM) assim como os indivíduos saudáveis (HD) foram analisados. O PMBC foi isolado e plaquetado a 5 x 105 células por poço em duplicata diretamente ex vivo em duplicatas tanto sem quanto com o peptídeo PDL101. (b), A resposta de células T contra o PDL101 como medida pela ELISPOT TNF-α. A média de pontos específicos PDL (após a subtração dos pontos sem um peptídeo adicionado) foi calculada por 5 x 105 PBMC por cada paciente (triângulo branco). O PBMC do peito de pacientes com câncer (BC), pacientes com carcinoma de células renais (RCC), pacientes com melanoma maligno (MM) assim como indivíduos saudáveis (HD) foram analisados. As células T foram estimuladas uma vez com um peptídeo antes de ser plaquetada a 5 x 105células por poço em duplicata tanto sem quanto com o peptídeo PDL101.

[023] A figura 3 mostra a capacidade funcional das células T específicas de PDL101: (a), Lise por uma cultura de massa de célula T de células T2 pulsadas com peptídeo PDL101 (vermelho) ou um peptídeo irrelevante (azul) (HIV-1 pol476-484) efetores diferentes para alvejar índices como o medido pelo ensaio de liberação de 51Cr. (b), Lise da linha de células de câncer do peito MDA-MB-231 por uma cultura de massa de célula T em efetores diferentes para alvejar índices como o medido pelo ensaio de liberação de 51Cr.

[024] A figura 4 mostra as respostas naturais de célula T contra o PD-L1. (A), as respostas de célula T contra o peptídeo PD-L101(PDL115-23; LLNAFTVTV) como medido pelo ELISPOT IFN-Y. Os exemplos de respostas ELISPOT contra o PD-L101 para um paciente com carcinoma de célula renal (RCC) e dois pacientes com melanoma maligno (MM). (B), No total, o PBMC de 23 pacientes com câncer e 24 doadores saudáveis, foram estimulados uma vez com peptídeo e rastreados para respostas contra o PD-L101 usando o ELISPOT IFN-Y. A média de pontos específicos PD-L101 (após a subtração dos pontos sem adicionar peptídeo) calculado por 5 x 105 PBMC para cada paciente. Um teste Mann-Whitney elucidou um valor p = 0,06 com uma frequência maior de respostas de células T específicas de PD-L101 em pacientes com câncer comparado a doadores saudáveis (C). Os exemplos de ELISPOT IFN-y em resposta ao PD-L101 (barras pretas) ou sem peptídeo (barras cinza) em PBMC a partir de seis pacientes com melanoma (MM.03, MM.04, MM.05, MM.13, e MM.135), um paciente com câncer de mama (CM.21), e um paciente com carcinoma de célula renal (RCC.46). (D), TNF-α ELISPOT em resposta ao PD-L101 (barras pretas) ou sem peptídeo (barras cinza) em PBMC de seis pacientes com melanoma (MM.03, MM.04, MM.05, MM.13, e MM.19), um paciente com câncer de mama (CM.21), e um paciente com carcinoma de célula renal (RCC.46). Todos os experimentos foram realizados em tripletos e um teste de reamostragem livre de distribuição (DFR) confirmou respostas significantes contra o PD-L101.

[025] A figura 5 mostra as respostas de células T contra o PD-L1 ex vivo. (A), os exemplos de uma resposta de célula T contra o peptídeo PD-L101 (PDL115-23; LLNAFTVTV) como medido pelo ELISPOT IFN-Y ex vivo em um paciente com melanoma (MM.03). (B), o ELISPOT IFN-Y ex vivo em resposta ao PD-L101 (barras pretas) ou sem peptídeo (barras cinza) em PBMC a partir de dois pacientes com melanoma maligno (MM.03 e MM.04) e um paciente com carcinoma de célula renal (RCC.46). Todos os experimentos foram realizados em tripletos e um teste de reamostragem livre de distribuição (DFR) confirmou respostas significantes contra o PD-L101. (C), a análise ELISA de ligante sensível a UV (KILGFVFJV) trocado com vários peptídeos: CMV/HLA-A2 (pp65 pos495-503; NLVPMVATV), HIV/HLA-A2 (po1476-484; ILKEPVHGV) e PD- L101 (PDL115-23; LLNAFTVTV), Não-UV (não expostos a luz UV) e nenhum peptídeo (sem resgatar o peptídeo). (D), a análise de tetrâmero de células T específicas de PD-L101; dois exemplos de células T CD8 específicas de PD-L101 entre PBMC a partir de pacientes com câncer de mama (CM.21) (topo) e um paciente com melanoma maligno (MM.05) (fundo) visualizado por uma coloração de citometria de fluxo usando os tetrâmeros HLA-A2/PD-L101-PE, HLA-A2/HIV-PE assim como o anticorpo CD8-Pacfic Blue/ APC aloficocianina. Os colorantes foram realizados diretamente em ex vivo (esquerda), após uma estimulação de peptídeo in vitro (meio) e após três estimulações de peptídeo (direita).

[026] A figura 6 mostra a funcionalidade citotóxica das células T específicas PD-L1. (A), o ensaio de liberação de 51Cr representando % de lise de células T2 pulsadas com o peptídeo PD-L101 (PDL115-23) ou um peptídeo de HIV irrelevante (HIV-1 pol476-484) por cultura de célula T CM.21 após a terceira estimulação de peptídeo. (B), Lise de células T2 pulsadas com peptídeo PD-L101 (PDL115-23) ou um peptídeo de HIV irrelevante (HIV-1 po1476-484) por cultura de célula T MM.05 após três estimulações de peptídeo. (C), respostas citolíticas contra o PD-L101 como medido por GrB ELISPOT. As respostas de GrB ELISPOT são mostradas em resposta ao PD-L101 (barras pretas) ou sem peptídeo (barras cinza) em PBMC a partir de três pacientes com melanoma (MM.03, MM.53 e MM.135). Todos os experimentos foram realizados em tripleto e o teste de reamostragem livre de distribuição (DFR) mostraram respostas significantes contra o PD-L101 em dois dos pacientes.

[027] A figura 7 mostra a atividade citolítica das células de câncer PD-L1. (A), Lise da linha de células de melanoma HLA-A2+ MM.06 (esquerda) ou MM.07 (direita) com ou sem o tratamento IFN-Ypor uma cultura de célula T específica de PD-L101 (CM.21) em um efetor diferente para alvejar proporções como as ensaiadas pela liberação de 51Cr. (B), os histogramas mostrando a expressão de superfície PD-L1 em MM.07 e MM. 06 com ou sem o tratamento IFN-y. (C), Lise das linhas de células de melanoma HLA-A2+ (quadrados) ou MM.07 (círculos) pela cultura de célula T enriquecida com PD-L101.

[028] A figura 8 mostra a lise dependente de PD-L1 das células dendríticas. (A-B), a porcentagem de lise do mDC sem siRNA (círculos pretos), mDC transfectado com siRNA contra PD-L1 (0,05 nmol (quadrados pretos), 0,10 nmol (estrelas pretas) e 0,25 nmol (triângulos pretos)) e com siRNA de controle (círculos brancos) por uma cultura de células T específica de PD-L1 (topo). C), análise de citometria de fluxo mostrando o perfil da expressão de superfície de PD-L1 em mDC sem transfecção e mDC transfectado com siRNA contra o PD-L1 em três concentrações diferentes (0,05 nmol, 0,10 nmol e 0,25 nmol) e DC transfectado com siRNA de controle.

[029] A figura 9 mostra uma apresentação transversal independente de TAP por células apresentadoras de antígeno não profissional. (A), linha de célula B transfectada HLA-A2+ EBV (KIG-BCL) pulsada com peptídeo PD-L101 (PDL115-23) (quadrados pretos), PDLong1 (PD-L19-28; FMTYWHLLNAFTVTVPKDL) (estrelas pretas), PDLong2 (PDL1242-264; VILGAILLCLGVALTFIFRLRKG) (triângulos pretos), proteína PD-L1 (quadrados brancos), ou um peptídeo de HIV irrelevante (HIV-1 po1476-484) (círculos cinza) por uma cultura de célula T específica PD-L101 como medido pela liberação de 51Cr padrão (B), Lise de células T2 pulsadas com peptídeo PD- L101 (PDL115-23) (quadrados pretos), PDLong1 (PD-L19-28; FMTYWHLLNAFTVTVPKDL) (estrelas pretas), PDLong2 (PDL1242-264; VILGAILLCLGVALTFIFRLRKG) (triângulos pretos), proteína PD-L1 (quadrados brancos), ou um peptídeo de HIV irrelevante (HIV-1 po1476-484) (círculos cinza) por uma cultura de células T específica PD-L101como medido pela liberação de 51Cr padrão (C), a inativação restrita de HLA-A2 pelas células T específicas PD-L1 foi avaliada pela lise das células T2 pulsadas com anticorpo bloqueando o PDLong1 ou PDLong1+HLA-A2. (D), os histogramas mostrando a expressão de superfície PD-L1 nas linhas de células KIG-BCL e T2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[030] É um objetivo maior da presente invenção proporcionar uma composição de vacina compreendendo PD-L1 ou um fragmento de polipeptídeo ativo imunologicamente do mesmo para o uso como um medicamento na prevenção de, redução do risco de, ou tratamento de uma condição clínica, onde tal condição clínica é preferencialmente selecionada a partir de um grupo consistindo de câncer, doenças infecciosas e doenças autoimunes.

DEFINIÇÕES

[031] Adjuvante: qualquer substância cuja mistura com o PD-L1 ou um fragmento de peptídeo ativo imunologicamente do mesmo após a administração a um indivíduo aumente a resposta imune ao PD-L1 ou tal fragmento de peptídeo do mesmo. Preferencialmente tal indivíduo é um ser humano e preferencialmente tal resposta imune é uma resposta de célula T.

[032] Anticorpo: as moléculas de imunoglobulina e partes ativas das moléculas de imunoglobulina. Os anticorpos são por exemplo moléculas de imunoglobulina intactas ou fragmentos do mesmo retendo a atividade imunológica.

[033] Antígeno: qualquer substância que possa se ligar a um receptor imune distribuído por clonagem (receptor de célula B ou de célula T). Usualmente um peptídeo, um polipeptídeo ou um polipeptídeo multimérico. Os antígenos são preferencialmente capazes de provocar uma resposta imune.

[034] APC: células apresentadoras de antígeno. Um APC é uma célula que exibe antígenos externos complexados com MHC em sua superfície. As células T podem reconhecer este complexo usando seu receptor de célula T (TCR). Os APCs abrangem duas categorias: profissional, (na qual há três tipos: células dendríticas, macrófagos e células B) ou não profissionais (não expressam constitutivamente a maior histocompatibilidade de proteínas complexas requeridas para a interação com as células T simples; estas são expressas apenas após estimulação do APC não profissional por certas citocinas tais como IFN-Y).

[035] Impulso: impulsionar por um disparo impulsionador ou uma dose é dar uma dose adicional de um agente imunizante, tal como uma vacina, dada em um momento após a dose inicial para suportar a resposta imune provocada pela dose anterior do mesmo agente.

[036] Câncer: aqui qualquer doença pré-neoplástica ou neoplástica, benigna ou maligna, onde o “neoplástico” refere-se a uma proliferação anormal das células.

[037] Carregador: entidade ou composto ao qual os antígenos são acoplados para ajudar na indução de uma resposta imune.

[038] Proteína quimérica: uma proteína projetada geneticamente que é codificada por uma sequência de nucleotídeos feita pela união em conjunto de dois ou mais genes parciais ou completos ou uma série de ácidos nucléicos (não) aleatórios.

[039] Condição clínica: uma condição que requer atenção médica, aqui especialmente as condições associadas com a expressão de PD-L1. Os exemplos de tais condições incluem câncer, doenças infecciosas ou doenças autoimunes.

[040] CTL: linfócito T citotóxico. Um subgrupo de células T expressando CD8 junto com o receptor de célula T e, portanto, capaz de responder aos antígenos apresentados pelas moléculas de classe I.

[041] Citocinas: modulador de diferenciação ou de crescimento, usado de forma não determinada aqui, e não deve limitar a interpretação da presente invenção e das reivindicações. Além das citocinas, as moléculas de adesão ou acessórias, ou qualquer combinação das mesmas, pode ser empregada sozinha ou em combinação com outras citocinas.

[042] Veículo de distribuição: uma entidade por meio da qual uma sequência de nucleotídeo ou polipeptídio ou ambos podem ser transportados a partir de pelo menos um meio para outro.

[043] DC: Célula dendrítica. (DCs) são células imunes e formam parte de um sistema imune de mamíferos. Sua principal função é processar o material antígeno e apresentá-lo na superfície para as outras células do sistema imune, funcionando assim como células apresentadoras de antígeno (APCs).

[044] Fragmento: é usado para indicar uma parte de comprimento não completo de um ácido nucléico ou polipeptídio. Desse modo, um fragmento é ele mesmo um ácido nucléico ou um polipeptídio, respectivamente.

[045] Homólogo funcional: Um homólogo funcional pode ser qualquer polipeptídio que exiba pelo menos alguma identidade de sequência com um polipeptídio do tipo natural e tenha retido pelo menos um aspecto da funcionalidade do polipeptídio do tipo natural. Aqui o homólogo funcional de PD-L1 tem a capacidade de induzir uma resposta imune de célula T para as células expressando PD-L1.

[046] Indivíduo: geralmente qualquer espécie ou subespécie de pássaro, mamífero, peixe, anfíbio, ou réptil, preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um ser humano.

[047] Infecção: aqui o termo “infecção” refere-se a qualquer tipo de condição clínica dando origem a uma resposta imune e, portanto, inclui infecções, infecções crônicas, condições autoimunes e inflamações alérgicas.

[048] Isolado: usado aqui em conexão com os ácidos nucléicos, polipeptídios, e anticorpos divulgados aqui, “isolados” refere-se a estes tendo sido identificados e separados e/ou recuperados a partir de um componente de seu ambiente tipicamente celular, natural. Os ácidos nucléicos, os polipeptídios, e os anticorpos da invenção são preferencialmente isolados, e as vacinas e outras composições da invenção preferencialmente compreendem ácidos nucléicos isolados, polipeptídios ou anticorpos isolados.

[049] MHC: Complexo de histocompatibilidade maior, duas subclasses principais de MHC, existe a Classe I e a Classe II.

[050] Construção de ácido nucléico: um ácido nucléico projetado geneticamente. Tipicamente compreendendo vários elementos tais como genes ou fragmentos do mesmo, promotores, aumentadores, terminadores, extremidades poliA, ligantes, poliligantes, ligantes operativos, locais de clonagem múltipla (MCS), marcadores, códons, outros elementos regulatórios, locais de entrada de ribossomos internos (IRES) ou outros.

[051] Patógeno: um agente causador específico de doença, especialmente um agente biológico tal como um vírus, uma bactéria ou um parasita que pode causar uma doença ao seu hospedeiro, também referido como um agente infeccioso.

[052] PBMC: uma Célula Mononuclear de Sangue Periférico (PBMC) é uma célula de sangue tendo um núcleo redondo, tal como um linfócito ou um monócito. Estas células de sangue são um componente crítico no sistema imune para combater a infecção e se adaptar aos intrusos. A população de linfócitos consiste em células T (CD4 e CD8 positivas - 75%), células B e células NK (-25% combinadas).

[053] Carregadores farmacêuticos: também denominados excipientes, ou estabilizadores, não são tóxicos a célula ou ao indivíduo sendo exposto ao mesmo nas dosagens e concentrações empregadas. Geralmente o carregador fisiologicamente aceitável é uma solução tamponada com pH aquoso. Os exemplos de carregadores fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídios de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como a albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glucose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; álcoois de açúcar tais como manitol ou sorbitol; contra íon formando sal tais como sódio; e/ou surfactantes não iônicos tais como TWEEN.TM., polietileno glicol (PEG), e PLURONICS.TM.

[054] Pluralidade: pelo menos dois.

[055] Promotor: um local de ligação em uma cadeia de DNA na qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição do RNA mensageiro por um ou mais genes estruturais próximos.

[056] Treg: células T / linfócitos T regulatórios.

[057] Vacina: uma substância ou composição capaz de induzir uma resposta imune em um animal. As vacinas são também referidas como “composições de vacina” ou como “composições imunogênicas” no presente contexto. Tal resposta imune é de acordo com a presente invenção preferencialmente uma resposta de célula T. Uma vacina da presente invenção pode ser dada como um medicamento terapêutico e/ou profilático.

[058] Variante: Uma ‘variante’ de um dado ácido nucléico ou de um polipeptídio refere-se a um ácido nucléico ou um peptídeo que exibe um certo grau de identidade de sequência a tal ácido nucléico de referência, mas não é idêntico a tal ácido nucléico ou polipeptídio. PD-L1

[059] PD-L1 de acordo com a presente invenção é um ligante da “Morte de Célula Programada 1”. O PD-L1 humano é um PD-L1 expresso em altos níveis nas células de câncer, assim como nas células T regulatórias. Portanto, as composições de vacina de acordo com a presente invenção são úteis para a profilaxia e/ou o tratamento das condições clínicas caracterizadas pela presença de células indesejadas expressando altos níveis de PD-L1.

[060] Portanto, não apenas o câncer, mas as infecções em geral e infecções, especialmente as infecções crônicas assim como as doenças autoimunes são todas condições clínicas de relevância para a presente invenção.

[061] Uma vez que as células T expressando PD-L1 antagonizam os efeitos desejados de outras abordagens imunoterapêuticas, alvejando as células expressando o PD-L1, por exemplo, por vacinação, consequentemente são altamente sinérgicas em ação com uma imunoterapia anticâncer adicional. Na presente divulgação é demonstrado que os epítopos PD-L1 definidos de CLT são amplamente aplicáveis nas vacinações terapêuticas e são, portanto, de valor imunoterapêutico substancial.

[062] É desse modo um aspecto da presente invenção proporcionar uma composição de vacina compreendendo um PD-L1 ou um fragmento de polipeptídio ativo imunologicamente aqui para uso como um medicamento para o tratamento de uma condição clínica. Tal condição clínica pode ser um câncer, e é um outro aspecto da presente invenção prevenir, reduzir o risco de, ou tratar um câncer. Outro aspecto refere-se ao uso de uma composição de vacina da presente invenção em combinação com outros medicamentos tais como medicamentos imunoterapêuticos e/ou agentes quimioterápicos. Ainda, um aspecto refere-se ao uso de uma composição de vacina como divulgado aqui para o tratamento de doenças de origem viral e/ou microbiana e ainda para o uso de tal vacina em combinação com outros medicamentos tais como medicamentos imunoterapêuticos e/ou antibióticos e/ou agentes antivirais.

[063] As composições de vacina de acordo com a presente invenção compreendem um PD-L1 ou um fragmento de peptídeo ativo imunologicamente do mesmo para o uso no tratamento de uma condição clínica em um indivíduo em necessidade do mesmo. Preferencialmente, tal PD-L1 é PD-L1 de espécies de tal indivíduo. Desse modo, se o indivíduo em necessidade do mesmo é um tipo específico de mamífero, tal PD-L1 é preferencialmente um PD-L1 de tal tipo específico de mamífero. Em uma modalidade preferida da presente invenção as composições de vacina compreendem um PD-L1 humano da SEQ ID NO: 1 ou um fragmento de peptídeo ativo imunologicamente do mesmo. O PD-L1 humano do tipo natural, isto é, que ocorre naturalmente sem uma versão mutada do polipeptídio é identificada na SEQ ID NO: 1.

[064] Entretanto, em certas modalidades da invenção as composições de vacina da invenção compreendem um homólogo funcional de PD-L1 ou um fragmento de peptídeo ativo imunologicamente do mesmo como definido aqui abaixo.

[065] A presente invenção ainda se refere às composições de vacina compreendendo um adjuvante e: i) PD-L1 da SEQ ID NO: 1; ou ii) Um fragmento de peptídeo ativo imunologicamente de PD-L1 da SEQ ID NO: 1; ou iii) Um homólogo funcional de PD-L1 da SEQ ID NO: 1 pelo menos 70% idêntico ao mesmo; ou iv) Um fragmento de peptídeo ativo imunologicamente de um homólogo funcional de PD-L1 da SEQ ID NO: 1 pelo menos 70% idêntico ao mesmo, onde tal fragmento de peptídeo ativo imunologicamente é um fragmento de peptídeo ativo imunologicamente de PD-L1 da SEQ ID NO: 1; onde no máximo três aminoácidos tenham sido substituídos, ou v) Um ácido nucléico codificando qualquer um de i) a iv)

[066] O termo fragmento de peptídeo é usado aqui para definir qualquer comprimento não completo (quando comparado a SEQ ID NO: 1) da cadeia de resíduos de aminoácidos que sejam diretamente derivados de ou sintetizados para serem idênticos com uma cadeia consecutiva de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

[067] Um homólogo funcional pode ser definido como um comprimento completo ou um fragmento de PD-L1 que difere em sequência a partir do PD-L1 do tipo natural, tal como o PD-L1 humano do tipo natural da SEQ ID NO: 1, mas ainda capaz de induzir uma resposta imune contra as células expressando PD-L1 tais como as células de câncer e DCs. O PD-L1 expresso nestas células pode ser do tipo natural ou mutado endogenamente (tais como uma mutação congênita ou uma mutação induzida durante uma divisão celular ou outra). Um homólogo funcional pode ser uma versão mutada ou uma variante de junção alternativa do PD-L1 do tipo natural. Em outro aspecto, os homólogos funcionais de PD-L1 são definidos como descrito aqui abaixo. Um homólogo funcional pode ser, mas não está limitado a, uma versão recombinante de um PD-L1 de comprimento completo ou fragmentado com uma ou mais mutações e/ou uma ou mais deleções de sequências e/ou adições introduzidas ex vivo.

[068] Um homólogo funcional de PD-L1 pode ser qualquer proteína / polipeptídio que exiba pelo menos alguma identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 e tenha a capacidade de induzir uma resposta imune nas células expressando PD-L1.

[069] Desse modo o homólogo funcional de PD-L1 de acordo com a presente invenção compartilha preferencialmente pelo menos 70% de identidade de sequência com o PD-L1 da SEQ ID NO: 1, e portanto, o homólogo funcional preferencialmente tem pelo menos 75% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 80% de identidade de sequência, tal como pelo menos 85 % de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 90 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 91 % de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 91 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 92 % de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 93 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 94 % de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 95 % de identidade de sequência, tal como pelo menos 96 % de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 97% de identidade de sequência, tal como pelo menos 98 % de identidade de sequência, por exemplo, 99% de identidade de sequência com a sequência de PD-L1 humano da SEQ ID NO:1 e tem a capacidade de induzir uma resposta imune para as células expressando PD- L1.

[070] A sequência de identidade de acordo com a presente invenção é determinada sobre a sequência de referência inteira, e assim, a identidade de sequência para a SEQ ID NO: 1 é determinada sobre o comprimento completo da SEQ ID NO: 1. A identidade de sequência pode ser calculada usando um número de algoritmos bem conhecidos e aplicando um número de penalidades de espaço diferentes. A identidade de sequência é calculada relativa ao comprimento completo da SEQ ID NO: 1. Qualquer ferramenta de alinhamento de sequência, tal como, mas não limitado a FASTA, BLAST, ou LALIGN pode ser usada para procurar homólogos e calcular a identidade de sequência. Além disso, os alinhamentos de sequência podem ser realizados usando uma média de penalidades para as aberturas de espaço e extensões. Por exemplo, o algoritmo BLASt pode ser usado com uma penalidade de abertura de espaço na faixa de 5-12, preferencialmente 8, e uma penalidade de extensão de espaço na faixa de 1-2, preferencialmente 1.

[071] Os equivalentes funcionais podem ainda compreender modificações químicas tais como ubiquitinação, marcação (por exemplo, com radionucleotídeos, várias enzimas, etc.), pegilação (derivação com polietileno glicol), ou por inserção (ou substituição por síntese química) dos aminoácidos (aminoácidos) tais como ornitina, que não ocorre normalmente nas proteínas humanas, entretanto, é preferido que o equivalente funcional não contenha as modificações químicas.

[072] Quaisquer mudanças feitas na sequência de resíduos de aminoácidos comparada com aquela do PD-L1 da SEQ ID NO: 1 são preferencialmente substituições conservadoras. Um perito na arte saberá como fazer e avaliar as substituições ‘conservadoras’ de aminoácidos, pelo qual um aminoácido é substituído por outro com uma ou mais características físicas e/ou químicas. As substituições conservadoras de aminoácidos são menos prováveis de afetar a funcionalidade da proteína. Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as características compartilhadas. Uma substituição conservadora de aminoácido é uma substituição de um aminoácido dentro de um grupo predeterminado de aminoácidos para outro aminoácido dentro do mesmo grupo, onde os aminoácidos dentro de grupos predeterminados exibem características similares ou substancialmente similares.

[073] O fragmento de peptídeo ativo imunologicamente de PD-L1 ou de um homólogo funcional do mesmo para ser usado com a invenção pode ter qualquer comprimento desejado. Em uma modalidade específica, o fragmento de peptídeo ativo imunologicamente da invenção consiste de 50 resíduos de aminoácidos ou menos, por exemplo, de no máximo 45 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 40 resíduos de aminoácidos, por exemplo, no máximo 35 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 30 resíduos de aminoácidos, por exemplo, no máximo 25 resíduos de aminoácidos, tais como de 18 a 25 aminoácidos consecutivos de PD-L1 como definido na SEQ ID NO: 1 ou um homólogo funcional do mesmo; o homólogo funcional sendo um onde no máximo três aminoácidos tenham sido substituídos, tais como dois aminoácidos, tais como um aminoácido tenha sido substituído por outro aminoácido, preferencialmente por uma substituição conservadora.

[074] Portanto em outra modalidade específica o fragmento de peptídeo ativo imunologicamente da invenção consiste de no máximo 25 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 24 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 23 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 22 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 21 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 20 resíduos de aminoácidos, por exemplo, no máximo 19 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 18 resíduos de aminoácidos, por exemplo, no máximo 17 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 16 resíduos de aminoácidos, por exemplo, no máximo 15 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 14 resíduos de aminoácidos, por exemplo, no máximo 13 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 12 resíduos de aminoácidos, por exemplo, no máximo 11 resíduos de aminoácidos, tais como de 8 a 10 aminoácidos consecutivos de PD- L1 da SEQ ID NO: 1 ou um homólogo funcional do mesmo; o homólogo funcional sendo um onde no máximo dois aminoácidos, tais como um aminoácido tenha sido substituído, preferencialmente por uma substituição conservadora. Preferencialmente, o peptídeo compreende no máximo 10 resíduos de aminoácidos consecutivos de PD-L1 da SEQ ID NO:1, tal como 9 resíduos de aminoácidos consecutivos, tais como 8 resíduos de aminoácidos consecutivos, tais como 7 resíduos de aminoácidos consecutivos de PD- L1 como identificado na SEQ ID NO: 1 ou um homólogo funcional do mesmo; o homólogo funcional sendo um onde no máximo dois aminoácidos, tal como um aminoácido tenha sido substituído por outro aminoácido, preferencialmente por uma substituição conservadora.

[075] Portanto, em algumas modalidades os fragmentos de peptídeo ativos imunologicamente da invenção são nonapeptídeos (peptídeos compreendendo 9 resíduos de aminoácidos), e alguns decapeptídeos (compreendendo 10 resíduos).

[076] Em uma modalidade preferida da invenção o fragmento de peptídeo ativo imunologicamente compreende um peptídeo selecionado a partir de um grupo consistindo em peptídeos listados na Tabela 1, mais preferencialmente um peptídeo selecionado a partir de um grupo consistindo no grupo de SEQ ID NO: 2, 12 e 15. Preferencialmente, tal fragmento de peptídeo ativo imunologicamente consiste de no máximo 25 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 24 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 23 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 22 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 21 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 20 resíduos de aminoácidos, por exemplo, no máximo 19 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 18 resíduos de aminoácidos, por exemplo, no máximo 17 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 16 resíduos de aminoácidos, por exemplo, no máximo 15 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 14 resíduos de aminoácidos, por exemplo, no máximo 13 resíduos de aminoácidos, tais como no máximo 12 resíduos de aminoácidos, por exemplo, no máximo 11 resíduos de aminoácidos, tais como 10 aminoácidos, por exemplo 9 aminoácidos e compreende uma sequência de peptídeo selecionada a partir de um grupo de peptídeos listados na Tabela 1, mais preferencialmente um peptídeo selecionado a partir de um grupo consistindo do grupo de SEQ ID NO: 2, 12 e 15.

[077] Em uma modalidade muito preferida da invenção tal fragmento de peptídeo ativo imunologicamente é selecionado a partir de um grupo consistindo dos peptídeos listados na Tabela 1, e mais preferencialmente selecionados a partir de um grupo consistindo na SEQ ID NO: 2, 12 e 15. Tabela 1

[078] Outros fragmentos de peptídeo ativo imunologicamente da invenção compreendem (ou mais preferencialmente consiste de) entre 4 e 120, preferencialmente entre 8 e 100, mais preferencialmente entre 10 e 75, ainda mais preferencialmente entre 12 e 60, ainda mais preferencialmente entre 15 e 40, tal como entre 18 e 25 aminoácidos contíguos de PD-L1 da SEQ ID NO: 1, onde no máximo três aminoácidos comparados a sequência PD-L1 da SEQ ID NO: 1 foram substituídos, deletados ou adicionados, tais como dois aminoácidos tem sido substituídos, deletados ou adicionados, ou um aminoácido tem sido substituído, deletado ou adicionado.

[079] Desse modo, em uma modalidade da presente invenção, a composição de vacina compreende um fragmento de peptídeo ativo imunologicamente consistindo de uma sequência consecutiva de PD-L1 da SEQ ID NO: 1 na faixa de 8 a 50 aminoácidos, preferencialmente na faixa de 8 a 10 ou de 20 a 25 aminoácidos, onde no máximo três aminoácidos tenham sido substituídos, e onde a substituição seja preferencialmente conservativa. MHC

[080] Há dois tipos de moléculas MHC; as moléculas MHC da classe I e as moléculas MHC da classe II. As moléculas MHC da classe I são reconhecidas pelas células T CD8, que são as células efetoras principais da resposta imune adaptável. As moléculas MHC da classe II são principalmente expressas na superfície das células apresentadoras de antígeno (APCs), o mais importante dos quais parece ser as células dendríticas. Os APCs estimulam as células T simples, assim como as outras células no sistema imune. Eles estimulam ambas as células T CD8 e as células T CD- 4.

[081] Em uma modalidade, são proporcionados novos fragmentos de peptídeo restrito MHC de classe I consistindo de 8-10 aminoácidos a partir de PD-L1 da SEQ ID NO: 1 ou um homólogo funcional do mesmo, onde no máximo dois aminoácidos da SEQ ID NO: 1 foram substituídos, que são caracterizados por ter pelo menos uma de várias características, uma das quais a capacidade de se ligar a molécula HLA de classe I a qual é restrita em uma afinidade como medido pela quantidade de peptídeo que é capaz de uma recuperação da metade do valor máximo da molécula HLA de classe I (valor C50) que é no máximo 50 μM como determinado pela montagem de ensaio de ligação como descrito aqui. Este ensaio de montagem é com base na estabilização da molécula HLA após o carregamento do peptídeo à linha deficiente de transportador de peptídeo T2. Subsequentemente, as cadeias pesadas HLA estáveis dobradas corretamente são imunoprecipitadas usando anticorpos dependentes de conformação, e a ligação de peptídeo é quantificada. Os peptídeos desta modalidade compreendem (ou mais preferencialmente consistem de) no máximo 200, preferencialmente no máximo 100, mais preferencialmente no máximo 50, ainda mais preferencialmente no máximo 25, ainda mais preferencialmente no máximo 20, ainda mais preferencialmente no máximo 15, tal como no máximo 10, por exemplo na faixa de 8 a 10 aminoácidos contíguos de PD-L1 da SEQ ID NO 1 ou um homólogo funcional do mesmo onde no máximo dois aminoácidos da SEQ ID NO 1 foram substituídos.

[082] Este ensaio proporciona meios simples de triar os peptídeos candidatos pela sua capacidade de se ligar a uma dada molécula alelo HLA na afinidade acima. Em modalidades preferidas, o fragmento de peptídeo da invenção em um tendo um valor C50, que é no máximo 30 μM, tal como um valor C50, que é no máximo 20 μM, incluindo os valores C50 de no máximo 10 μM, no máximo 5 μM e no máximo 2 μM.

[083] Em outra modalidade preferida, são proporcionados novos fragmentos de peptídeo restrito MHC da classe II de PD-L1 da SEQ ID NO 1 ou um homólogo funcional do mesmo, onde no máximo dois aminoácidos da SEQ ID NO 1 foram substituídos, (também referido aqui como “peptídeos”), que são caracterizados por ter pelo menos uma de várias características descritas aqui abaixo. Os peptídeos desta modalidade compreendem (ou preferencialmente consistem de) entre 4 e 120, preferencialmente entre 8 e 100, mais preferencialmente entre 10 e 75, ainda mais preferencialmente entre 12 e 60, ainda mais preferencialmente entre 15 e 40, tal como entre 18 e 25 aminoácidos contíguos de PD-L1 da SEQ ID NO 1 da SEQ ID NO 1 ou um homólogo funcional do mesmo, onde no máximo dois aminoácidos da SEQ ID NO 1 foram substituídos.

[084] Desse modo, são proporcionados novos fragmentos de peptídeo restrito MHC de classe I de 8-10 aminoácidos ou novos fragmentos de peptídeo restrito MHC de classe II de 18-25 aminoácidos de PD-L1 da SEQ ID NO 1 ou um homólogo funcional do mesmo, onde no máximo dois aminoácidos da SEQ ID NO 1 forma substituídos, que foram caracterizados por ter pelo menos uma de várias características descritas aqui abaixo, uma da qual é a capacidade de se ligar a molécula HLA da classe I ou da classe II para a qual este é restrito.

[085] Em modalidades particulares são proporcionados fragmentos de peptídeo, que é um peptídeo restrito MHC de classe I ou um peptídeo restrito MHC de classe II tendo pelo menos uma das seguintes características: i) capaz de provocar células produzindo INF-Y em uma população PBMC de um paciente com câncer em uma frequência de pelo menos 20 por 105 PBMCs como determinado pelo ensaio ELISPOT, e/ou ii) capaz de uma detecção in situ em um tecido com tumor de CTLs que são reativos com o peptídeo epítopo. iii) capaz de induzir o crescimento das células T específicas PD-L1 in vitro.

[086] Os peptídeos mais preferidos de acordo com a presente invenção são os peptídeos capazes de aumentar uma resposta de célula T específica como determinado pelo ensaio ELISPOT, por exemplo, o ensaio ELISPOT descrito no Exemplo 1 aqui abaixo. Alguns peptídeos embora não se liguem ao MHC classe I ou classe II com uma grande afinidade, podem ainda aumentar para uma resposta de célula T como determinado pelo ELISPOT. Outros peptídeos capazes de se ligar o MHC de classe I ou classe II com grande afinidade também aumentam a resposta de célula T como determinado pelo ELISPOT. Ambos tipos de peptídeo são peptídeos preferidos de acordo com a invenção.

[087] Por isso, os peptídeos preferidos de acordo com a presente invenção são peptídeos capazes de aumentar uma resposta de célula T específica como medido pelo ensaio ELISPOT, onde mais de 20 pontos específicos de peptídeos por 108células, mais preferencialmente por 107, ainda mais preferencialmente por 106, ainda mais preferencialmente por 105células são medidos. Em particular, os peptídeos preferidos de acordo com a presente invenção são os peptídeos capazes de aumentar uma resposta de célula T específica de mais de 20 pontos específicos de peptídeo por 108 PBMC, mais preferencialmente por 107, ainda mais preferencialmente por 106, ainda mais preferencialmente por 105 PBMC, quando medido pelo ensaio ELISPOT descrito no Exemplo 1 incluindo estimulação uma vez com peptídeo in vitro.

[088] Os peptídeos mais preferidos de acordo com a presente invenção são os peptídeos que são capazes de provocar uma resposta imune celular, preferencialmente uma resposta de célula T em um indivíduo sofrendo de uma condição clínica caracterizada pela expressão de PD-L1, a condição clínica preferencialmente sendo um câncer, uma doença autoimune ou uma doença infecciosa, e mais preferencialmente um câncer.

[089] Como descrito acima, o sistema HLA representa o sistema maior de histocompatibilidade humana (MHC). Geralmente os sistemas MHC controlam uma variedade de características: antígenos de transplante, respostas imunes dependentes de timo, certos fatores de complemento e predisposição para certas doenças. Mais especificamente, os códigos MHC para três diferentes tipos de moléculas, que determinam as características mais gerais do MHC. Destas moléculas, as moléculas da classe I são então chamadas de moléculas HLA-A, HLA-B e HLA-C que estão presentes na superfície das células mais nucleadas e trombócitos.

[090] Os peptídeos da presente invenção são caracterizados por sua capacidade de se ligar a (sendo restrito por) uma molécula HLA MHC de classe I particular. Desse modo, em uma modalidade o peptídeo é um que é restrito pela molécula HLA-A MHC de classe I incluindo HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A9, HLA- A10, HLA-A11, HLA-Aw19, HLA-A23(9), HLA-A24(9), HLA-A25(10), HLA-A26(10), HLA-A28, HLA-A29(w19), HLA-A30(w19), HLA-A31(w19), HLA-A32(w19), HLA- Aw33(w19), HLA-Aw34(10), HLA-Aw36, HLA-Aw43, HLA- Aw66(10), HLA-Aw68(28), HLA-A69(28). As designações mais simples também são usadas em toda a literatura, onde apenas a designação numérica primária é usada, por exemplo. HLA-A19 ou HLA-A24 em vez de HLA-Aw19 e HLA-A24(49), respectivamente. Em modalidades específicas, o peptídeo da invenção é restrito a uma espécie HLA MHC de classe I selecionada a partir de um grupo consistindo em HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11 e HLA-A24. Em uma modalidade específica, o peptídeo da invenção é restrito a uma espécie HLA MHC de classe I HLA-A2 ou HLA-A3.

[091] Em outras modalidades úteis, o peptídeo da invenção é um peptídeo, que é restrito por uma molécula HLA-B MHC da classe I incluindo o seguinte: HLA- B5, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B12, HLA-B13, HLA-B14, HLA-B15, HLA-B16, HLA-B17, HLA-B18, HLA-B21, HLA-Bw22, HLA-B27, HLA-B35, HLA-B37, HLA-B38, HLA-B39, HLA-B40, HLA-Bw41, HLA-Bw42, HLA-B44, HLA-B45, HLA-Bw46 e HLA-Bw47. Em modalidades específicas da invenção, as espécies HLA-B MHC de classe I para as quais o peptídeo da invenção é capaz de se ligar é selecionado a partir de HLA-B7, HLA-B35, HLA-B44, HLA-B8, HLA-B15, HLA-B27 e HLA-B51.

[092] Em outras modalidades úteis, o peptídeo da invenção é um peptídeo, que é restrito por uma molécula HLA-C MHC de classe I incluindo, mas não limitado a qualquer um dos seguintes: HLA-Cw1, HLA-Cw2, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Cw6, HLA-Cw7 e HLA-Cw1.

[093] Em outras modalidades úteis, o peptídeo da invenção é um peptídeo, que é restrito por uma molécula HLA MHC de classe I incluindo, mas não limitada a qualquer um dos seguintes: HLA-DPA-1, HLA-DPB-1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA- DRA, HLA-DRB e todos os alelos nestes grupos e HLA-DM, HLA-DO.

[094] A seleção dos peptídeos potencialmente tendo a capacidade de se ligar a uma molécula particular HLA pode ser feita pelo alinhamento de sequências conhecidas que se ligam a uma dada molécula HLA para ali revelar a predominância de poucos aminoácidos relacionados em posições particulares nos peptídeos. Tais resíduos de aminoácidos predominantes também são referidos aqui como “resíduos âncora” ou “motivos de resíduo âncora”. Seguindo tal procedimentos relativamente simples com base nos dados de sequências conhecidas pode ser encontrado em bancos de dados acessíveis, os peptídeos podem ser derivados de PD-L1, que são prováveis de se ligar a uma molécula HLA específica. Os exemplos representativos de tais análises para uma média de moléculas HLA são dados na tabela abaixo: Tabela 2

* Em uma modalidade não há um resíduo âncora específico para esta posição, entretanto, em uma modalidade preferida o resíduo âncora é R ou A.

[095] Desse modo, como um exemplo, os nonapeptídeos potencialmente tendo a capacidade de se ligar ao HLA-A3 poderiam ter uma das seguintes sequências: Xaa-L-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-K, Xaa-LY-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Y; Xaa-L-Y-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-F ou Xaa-V-Y-Xaa-XaaXaa-Xaa-Xaa-K (Xaa indicando qualquer resíduo de aminoácido). Em uma maneira similar, as sequências potencialmente tendo a capacidade de se ligar a qualquer outra molécula de HLA pode ser projetada. Será apreciado que um perito na arte será capaz de identificar outros “motivos de resíduo âncora” para uma dada molécula HLA.

[096] O peptídeo da invenção pode ter uma sequência a qual é uma sequência consecutiva de uma sequência nativa do PD-L1 da SEQ ID NO: 1. Entretanto, os peptídeos tendo uma maior afinidade a qualquer dada molécula de HLA pode ser derivado de tal sequência nativa modificando a sequência por substituição, deleção ou adição de pelo menos um resíduo de aminoácido, por meio do qual os motivos de resíduo âncora em relação a uma dada molécula HLA são identificados.

[097] Desse modo, em modalidades úteis, os polipeptídios da invenção incluem peptídeos, as sequências das quais compreendem, para cada um dos alelos HLA específicos listados na tabela, qualquer um dos resíduos de aminoácidos como indicados na tabela.

[098] Desse modo, os peptídeos da invenção podem ser qualquer um dos peptídeos acima mencionados compreendendo sequência contíguas de PD-L1, onde em uma faixa de 1 a 10, preferencialmente na faixa de 1 a 5, mais preferencialmente na faixa de 1 a 3, ainda mais preferencialmente na faixa de 1 a 2, ainda mais preferencialmente 1 aminoácido tenha sido trocado por outro aminoácido, preferencialmente de uma maneira de forma que o peptídeo compreenda um ou mais, preferencialmente todos os resíduos âncora de um dado peptídeo específico HLA como indicado na tabela 2 acima.

[099] Os exemplos de espécies HLA preferíveis, para os quais os peptídeos preferidos da presente invenção são restritos incluem: uma espécie HLA MHC Classe I selecionada a partir de um grupo consistindo de HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11 e HLA-A24, mais preferencialmente o peptídeo é restrito por HLA-A3 ou HLA-A2. Alternativamente as espécies HLA preferidas incluem HLA-B MHC Classe I selecionadas a partir de um grupo consistindo em HLA-B7, HLA -B35, HLA -B44, HLA- B8, HLA-B15, HLA-B27 e HLA-B51.

[100] Uma abordagem para identificar os polipeptídios da invenção incluem as seguintes etapas: selecionar uma molécula HLA particular, por exemplo, uma ocorrendo em uma alta proporção em uma dada população, realizando uma análise de alinhamento como descrito acima para identificar os “motivos de resíduos âncora” na proteína PD-L1, isolando ou construindo peptídeos de um tamanho compatível que compreenda um ou mais dos resíduos âncora identificados e testando os peptídeos resultantes para a capacidade dos peptídeos de provocar células produzindo INF-Y em uma população PBMC de um paciente com câncer em uma frequência de pelo menos 20 por 105 PBMC como determinado pelo ensaio ELISPOT como descrito no Exemplo 1 incluindo estimulação in vitro uma vez com peptídeo.

[0101] Em um aspecto da presente invenção, os peptídeos derivados de PD- L1 maiores do que 8 a 10 resíduos de aminoácido são proporcionados. Os polipeptídios maiores do que 8 a 10 aminoácidos são processados pelo proteassoma para um comprimento menor para se ligar às moléculas HLA. Desse modo, quando administrado um polipeptídio maior do que 8 a 10 resíduos de aminoácidos maior, o polipeptídio “maior”/ proteína/ fragmento de proteína/ variante de PD-L1 é processado em uma série de peptídeos menores no citosol pelo proteassoma. Uma vantagem de usar um polipeptídio que pode ser processado pelo proteassoma em uma variedade de peptídeos menores diferentes é que mais classes der HLA podem ser almejadas com um peptídeo do que um peptídeo de 8 a 10 resíduos de aminoácido que é restrito a uma classe HLA particular.

[0102] Surpreendentemente, alguns peptídeos da presente invenção se ligam as moléculas MHC com uma afinidade suficientemente maior para render substituições desnecessárias e estão prontos para o uso como antígenos como eles são apresentados aqui. Preferencialmente, a composição de vacina da presente invenção compreende um ou mais dos seguintes: polipeptídio de comprimento completo PD-L1 (SEQ ID NO: 1), fragmentos de polipeptídio aqui a partir de, homólogos funcionais ou PD-L1 de comprimento completo da SEQ ID NO: 1 e fragmentos de peptídeo ativos imunologicamente de PD-L1 onde um ou dois aminoácidos tenham sido substituídos, adicionados ou deletados. Mais preferencialmente, a composição de vacina compreende qualquer uma das sequências listadas na listagem de sequência da presente divulgação. Mais preferencialmente, a composição de vacina compreende os peptídeos PDL101 (SEQ ID NO: 2), PDL111 (SEQ ID NO: 12), e/ou PDL114 (SEQ ID NO: 15).

[0103] Uma característica significante do peptídeo da invenção é sua capacidade de reconhecer ou provocar células T de resposta produzindo INF-Y, isto é, células T citotóxicas (CTLs) que reconhecem especificamente o peptídeo particular em uma população PBMC, em um APC ou células de tumor/ neoplásticas de um indivíduo sofrendo de um câncer e/ou uma infecção (células alvo). Esta atividade é determinada prontamente submetendo os PBMCs, APCs ou células de tumor de um indivíduo a um ensaio ELISPOT. Antes do ensaio, pode ser vantajoso estimular as células a serem ensaiadas contatando as células com o peptídeo a ser testado. Preferencialmente, o peptídeo é capaz de provocar ou reconhecer as células T produzindo INF-y em uma frequência de pelo menos 20 por 105 PBMCs como determinado pelo ensaio ELISPOT como usado aqui. Mais preferencialmente a frequência é de pelo menos 30 por 105 PBMCs.

[0104] O ensaio ELISPOT representa uma ferramenta forte para monitorar as respostas de célula T específica PD-L1. A principal implicação das descobertas aqui é que os peptídeos da invenção são expressos e complexados com as células HLA em células de câncer e/ou APCs expressando PD-L1. Isto torna estas células de câncer suscetíveis a descrição pela CTLs e enfatiza a utilidade potencial da imunização PD-L1 para combater o câncer e as infecções. A presença de respostas CTL espontâneas nos PBMCs de pacientes com carcinoma de célula renal, pacientes com melanoma e pacientes com câncer de mama aos epítopos de peptídeos derivados de PD-L1 restritos HLA mostram o potencial imunoterapêutico dos peptídeos imunogênicos PD-L1.

[0105] Em uma modalidade da presente invenção o fragmento de peptídeo ativo imunogenicamente da invenção é capaz de induzir as células T específicas PD- L1 capazes de matar as células, tais como as células de câncer expressando PD-L1. Em particular é preferido que tal fragmento de peptídeo seja capaz de induzir as células T específicas PD-L1 capazes de lisagem de pelo menos 10% das células de câncer, tais como as células MDA-MB231 após uma co-incubação in vitro como descrito aqui abaixo no Exemplo 1 e 2. ORIGEM

[0106] A proteína a partir da qual o peptídeo pode ser derivado pode ser qualquer polipeptídio PD-L1 a partir de qualquer espécie animal em que a proteína é expressa. Em modalidades preferidas, a proteína inicial é de uma espécie de mamífero incluindo espécies roedoras, coelhos e uma espécie primata tal como os humanos. Com base na sequência da proteína selecionada, o peptídeo da invenção é derivado por qualquer tratamento químico ou enzimático apropriado do material inicial de proteína que resulta em um peptídeo de um tamanho compatível como indicado acima, ou pode ser sintetizado por quaisquer procedimentos de síntese convencional com o qual um perito na arte seja familiar. Mais preferivelmente, o polipeptídio PD-L1 é um PD-L1 humano e mais preferencialmente um PD-L1 humano da SEQ ID NO: 1.

INDIVÍDUO

[0107] O indivíduo a ser tratado com a composição de vacina da presente invenção é um indivíduo que sofre de uma condição clínica. O indivíduo é preferencialmente de uma espécie mamífera e mais preferencialmente um ser humano. O indivíduo pode ser de qualquer idade, jovem ou idoso, e pode ser tanto macho quanto fêmea. A condição clínica a partir da qual o indivíduo sofre pode ser uma doença neoplástica tal como um câncer, ou uma doença infecciosa tal como uma infecção intracelular ou uma infecção viral ou uma doença autoimune.

[0108] Uma modalidade da presente invenção proporciona uma vacina para o tratamento, a redução do risco de, a estabilização de ou a prevenção de um câncer. Em outra modalidade da presente invenção proporciona uma vacina para o tratamento, a redução de risco de, a estabilização de ou a prevenção de uma doença decorrente de uma infecção, tal como uma infecção intracelular ou uma infecção viral. Ainda em outra modalidade a invenção proporciona composições de vacina para o tratamento, a redução de risco de, a estabilização de ou a prevenção de uma doença autoimune.

CÂNCER

[0109] A composição de vacina da presente invenção pode ser usada para prevenir, reduzir o risco de ou tratar uma condição clínica. Preferencialmente, a condição clínica é associada com ou caracterizada pela expressão PD-L1. O PD-L1 pode ser PD-L1 como identificado na SEQ ID NO: 1 ou um homólogo compartilhando 70% de identidade com a SEQ ID NO: 1. Entende-se aqui que o nível de expressão de PD-L1 (a expressão sendo de hnRNA, mRNA, proteína precursora, proteína processada e assim por diante) é o mesmo que ou maior do que em um indivíduo que não sofre de tal condição clínica.

[0110] Em uma modalidade preferida da invenção, a condição clínica é um câncer. O câncer (neoplasma maligno) é uma classe de doenças na qual um grupo de células exibe as peculiaridades de um crescimento descontrolado (crescimento e divisão além dos limites normais), invasão (invasão e destruição de tecidos adjacentes), e algumas vezes metástase (propagação para outros locais no corpo através de linfa ou sangue). Estas três propriedades malignas de câncer diferenciam- nas de tumores benignos, que são autolimitados, não invadem ou metastatizam. A maioria dos cânceres formam tumores, mas alguns, como a leucemia, não. O termo “câncer” como usado aqui destina-se a englobar qualquer câncer, neoplástica ou doença neoplástica.

[0111] Um grupo não limitante de canceres dados como exemplo de canceres que podem ser tratados, gerenciados e/ou prevenidos pela administração da vacina da presente invenção incluem: carcinoma de cólon, câncer de mama, câncer de pâncreas, câncer de ovário, câncer de próstata, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfagiossarcoma, linfagioendotelio sarcoma, Sinovioma, mesotelioma, sarcoma de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma da glândula de suor, carcinoma da glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistoadeocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do ducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, cancro cervical, tumor testicular, carcinoma do pulmão, carcinoma de células pequenas do pulmão, carcinoma da bexiga, carcinoma epitelial, glioblastomas, neuronomas, craniofaringiomas, schwannoma vestibular, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroama acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemias e linfomas, leucemia linfocítica aguda e mielocítica aguda policitemia vera, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, e doença de cadeia pesada, leucemias não linfocíticas agudas, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielóide crônica, doença de Hodgkin, linfomas não-Hodgkin, câncer do reto, câncer urinário, cânceres uterinos, câncer bucal, câncer de pele, câncer de estômago, tumores cerebrais, câncer de fígado, câncer de laringe, câncer de esôfago, tumores mamários, leucemia linfóide aguda na infância nulo (ALL), timo ALL, B-cell ALL, leucemia mielóide aguda, leucemia mielomonocitica, leucemia megacariocitoide aguda, linfoma de Burkitt, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, e leucemia de células T, carcinoma do pulmão de células não-pequenas grandes e pequenas, leucemia granulocítica aguda, tumores de células germinativas, câncer de endométrio, câncer gástrico, câncer de cabeça e pescoço, leucemia linfóide crônica, leucemia de células pilosas e câncer de tireóide.

[0112] Em uma modalidade preferida a composição de vacina de acordo com a invenção de composição de vacina é capaz de provocar uma resposta clínica em um sujeito, onde a resposta clínica pode ser caracterizada por uma estabilização da doença, em uma modalidade preferida a resposta clínica pode ser caracterizada por uma resposta parcial ou preferencialmente a resposta clínica pode ser caracterizada por uma remissão completa de um câncer. Preferencialmente, o câncer é selecionado a partir de um grupo de: melanoma, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer do pâncreas, canceres hematológicos (tais como leucemias), canceres de células do cólon e renais, mais preferencialmente a partir de um grupo consistindo de melanoma, câncer de células renais e câncer de mama.

[0113] Em um aspecto da invenção a composição de vacina é capaz de provocar uma resposta clínica em um indivíduo. Em uma modalidade a resposta clínica pode ser caracterizada por uma doença estável (sem agravamento ou progressão), em uma modalidade preferida a resposta clínica pode ser caracterizada por uma resposta parcial ou preferencialmente a resposta clínica pode ser caracterizada por uma remissão completa de um câncer ou infecções. A resposta clínica pode ser determinada como descrito aqui abaixo.

[0114] Em outro aspecto da invenção a composição de vacina é capaz de provocar uma resposta clínica em um sujeito, onde a resposta clínica é caracterizada pela diminuição na soma do diâmetro maior da lesão de alvo maior. A diminuição pode ser determinada como descrito aqui abaixo.

[0115] Todas as lesões mensuráveis de até um máximo de cinco lesões por órgão e 10 lesões no total, representativas de todos os órgãos envolvidos devem ser identificados como lesões alvo e gravadas e medidas na linha de base. - As lesões alvo devem ser selecionadas com base em seu tamanho (lesões com o diâmetro maior) e suas compatibilidades para medições repetidas precisas (tanto por técnicas de imagem quanto clinicamente). - Uma soma do diâmetro maior (LD) para todas as lesões alvo será calculada e reportada como uma soma de linha de base LD. A soma de linha de base LD será usada como referência pela qual para caracterizar o tumor objetivo. - Todas as lesões (ou locais de doença) devem ser identificadas como lesões não almejadas e também devem ser gravadas na linha de base. As medidas destas lesões não são requeridas, mas a presença ou ausência de cada uma deve ser notada durante todo o acompanhamento.

[0116] Avaliação das lesões alvo - Resposta Completa (CR): Desaparecimento de todas as lesões alvo - Resposta Parcial (PR): Pelo menos uma diminuição em 30% na soma do LD das lesões alvo, tendo como referência a soma da linha de base LD - Doença Progressiva (PD): Pelo menos um aumento de 20% na soma do LD das lesões alvo, tendo como referência a menor soma de LD gravada desde que o tratamento iniciou ou o aparecimento de uma ou mais lesões novas - Doença Estável (SD): Nem o encolhimento suficiente para qualificar para PR ou um aumento suficiente para qualificar para PD, tendo como referência a menor soma de LD desde que o tratamento começou

[0117] Avaliação de lesões não almejadas - Resposta Completa (CR): Desaparecimento de todas as lesões não almejadas e a normalização do nível marcador de tumor - Resposta Incompleta / Doença Estável (SD): Persistência de uma ou mais lesões alvo ou/e a manutenção do nível marcador de tumor acima dos limites normais - Doença Progressiva (PD): Aparecimento de uma ou mais lesões novas e/ou uma progressão inequívoca das lesões não almejadas existentes

[0118] Em uma modalidade da presente invenção a composição de vacina compreendendo qualquer uma das proteínas aqui mencionadas e/ou os polipeptídios é capaz de provocar uma resposta clínica no sujeito, onde a resposta clínica é caracterizada por uma diminuição na soma do diâmetro maior da lesão alvo maior.

[0119] É contemplado que a composição de vacina da invenção é capaz de provocar uma resposta imune contra um câncer expressando PD-L1 da SEQ ID NO: 1 ou um homólogo funcional do mesmo tendo pelo menos 70% de identidade com a SEQ PD-L1. A composição de vacina da invenção é capaz de provocar a produção em um indivíduo vacinado de células T efetoras tendo um efeito citotóxico contra as células de câncer, PD-L1 expressando APCs e/ou induzindo a infiltração de células T específicas de antígeno no tumor estroma em um sujeito.

[0120] Além de sua capacidade de produzir respostas imunes nas populações PBMC, também é contemplado que os peptídeos da invenção são capazes de produzir uma resposta citolítica in situ, isto é, em tecidos de tumor sólido. Isto pode, por exemplo, ser demonstrado proporcionando complexos de peptídeo HLA, por exemplo, sendo multimerizado e sendo proporcionado com uma marca detectável, e usando tais complexos para uma coloração imunohistoquímica para detectar CTLs em um tecido de tumor que sejam reativos com os fragmentos de peptídeo ativos imunologicamente da invenção. Portanto, uma outra característica significante do peptídeo da invenção é que este é capaz de uma detecção in situ em um tecido de tumor de CTLs que sejam reativos com o peptídeo epítopo.

[0121] Também é contemplado que os peptídeos da invenção, além de sua capacidade de se ligar as moléculas HLA resultando na apresentação de complexos de HLA e peptídeos nas superfícies das células, cujos complexos em parte agem como epítopos ou alvos para as células T citolíticas, podem provocar outros tipos de respostas imunes, tais como as respostas de célula B resultando na produção de anticorpos contra os complexos e/ou uma reação de Hipersensibilidade do Tipo Retardada (DTH). O último tipo de resposta imune é definido como um endurecimento palpável e vermelhidão no local da injeção de peptídeo da invenção.

[0122] É um objeto da presente invenção proporcionar uma composição de vacina compreendendo um PD-L1 da SEQW ID NO: 1 ou um homólogo funcional do mesmo tendo pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou um fragmento de peptídeo ativo imunologicamente compreendendo uma sequência consecutiva de tal PD-L1 ou tal homólogo funcional do mesmo ou um ácido nucléico codificando tal PD-L1 ou tal fragmento de peptídeo; e um adjuvante, para a prevenção de, redução do risco de ou o tratamento de câncer.

TRATAMENTO DE COMBINAÇÃO DE CÂNCER

[0123] Nas modalidades da invenção, onde a invenção refere-se às composições de vacina compreendendo PD-L1 ou um fragmento de peptídeo ativo imunologicamente do mesmo para o tratamento de câncer, pode em alguns casos ser apropriado combinar um tratamento com uma composição de vacina de acordo com a invenção com um outro tratamento de câncer convencional tal como quimioterapia, radioterapia, tratamento com substâncias imunoestimulantes, terapia de gene, tratamento com anticorpos usando células dendríticas.

[0124] Já que a expressão elevada de PD-L1 em células de tumor leva a inibição do sistema imune, a combinação de uma imunoterapia com base em PD-L1 como divulgado pela presente invenção com uma quimioterapia citotóxica e ou outro tratamento imunoterapêutico anticâncer é uma abordagem eficaz para tratar o câncer. Estes remédios também são referidos aqui como “ingredientes ativos em segundo”.

[0125] Os exemplos de agentes quimioterápicos que são de relevância em relação a administração (sequencialmente e simultaneamente) com a composição de vacina da presente invenção incluem, mas não estão limitados a: todos os ácidos trans retinóicos, Actimida, Azacitidina, Azatioprina, bleomicina, carboplatina, capecitabina, Cisplatina, clorambucil, ciclofosfamida, citarabina, daunorrubicina, Docetaxel, doxifluridina, doxorrubicina, epirrubicina, Etoposida, fludarabina, Fluorouracil, gemcitabina, hidroxiuréia, idarrubicina, irinotecano, lenalidomida, Leucovorina, Mecloretamina, melfalano, mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, oxaliplatina, Paclitaxel, Pemetrexed, Revlimid, temozolomida, teniposido, Tioguanina, valrubicina, vinblastina, vincristina, Vindesina e Vinorelbina. Em uma modalidade, um agente quimioterápico para uso na combinação do presente agente pode, ele mesmo, ser uma combinação de diferentes agentes quimioterápicos. As combinações compatíveis incluem um FOLFOX e IFL. FOLFOX é uma combinação que inclui 5-fluorouracil (5- FU), leucovorina, e oxaliplatina. O tratamento IFL inclui irinotecano, 5-FU, e leucovorina.

[0126] Outro segundo ingrediente ativo pode ser um inibidor de quinase, para separar, um uso combinado ou simultâneo no tratamento de tumores. Os inibidores de quinase compatíveis incluem aqueles que tem mostrado possuir uma atividade antitumoral (tal como gefitinib (Iressa) e erlotinib (Tarceva) e estes podem ser usados em combinação com os peptídeos. O receptor de inibidores de tirosina quinase, tais como maleato de Sunitinib e Sorafenib que tem mostrado ser eficaz no tratamento de carcinoma de célula renal também são compatíveis para serem usados como segundo ingredientes ativos.

[0127] Outros exemplos de ingredientes ativos em segundo são as substâncias imunoestimulantes, por exemplo, citocinas e anticorpos. Tais citocinas podem ser selecionadas a partir de um grupo consistindo de, mas não limitado a,GM- CSF, IFN tipo I, interleucina 21, interleucina 2, interleucina 12 e interleucina 15. O anticorpo é preferencialmente um anticorpo imunoestimulante tal como anticorpos anti-CD40 ou anti-CTLA-4. A substância imunoestimulatória também pode ser uma substância capaz de depleção das células inibitórias imunes (por exemplo, células T regulatórias) ou fatores, tal substância pode, por exemplo, ser E3 ubiquitina ligases. E3 ubiquitina ligases (as proteínas HECT, RING e U-box) surgiram como reguladores moleculares chave da função de célula imune, e cada um pode estar envolvido na regulação das respostas imunes durante a infecção visando moléculas inibitórias específicas para a destruição proteolítica. Várias proteínas HECT e RING E3 também foram agora ligadas a uma indução e a manutenção da auto-tolerância imune: c-Cbl, Cbl-b, GRAIL, Itch e Nedd4 cada um regula negativamente a proliferação e a produção do fator de crescimento de célula T.

[0128] Em uma modalidade, a composição de vacina da presente invenção, compreendendo um PD-L1, qualquer um dos homólogos funcionais do mesmo descritos aqui acima ou qualquer um dos fragmentos de peptídeo ativo imunologicamente do mesmo descritos aqui acima, é administrado em combinação com um segundo ingrediente ativo, tal como uma substância imunoestimulatória. A substância imunoestimulatória é preferencialmente uma interleucina tal como IL-21 ou IL-2 ou um agente quimioterápico.

DOENÇAS INFECCIOSAS E DOENÇAS AUTOIMUNES

[0129] A presente invenção também se refere às composições de vacina compreendendo PD-L1 ou qualquer um dos fragmentos de peptídeo ativo imunologicamente do mesmo descritos aqui acima para o tratamento de uma condição clínica, onde a condição clínica pode ser uma infecção ou a condição clínica pode ser uma doença autoimune.

[0130] A palavra infecção como usada aqui refere-se a qualquer tipo de condição clínica dando origem a uma resposta imune, tal como uma inflamação, e, portanto, inclui doenças infecciosas, infecções crônicas, condições autoimunes e inflamações alérgicas. Desse modo, as infecções, tais como doenças infecciosas, infecções crônicas, condições autoimunes e inflamações alérgicas são todas condições clínicas de relevância para a presente invenção, e são tratadas por sua vez abaixo.

[0131] Em particular a infecção ou a doença autoimune pode ser uma doença associada com a inflamação. A inflamação é a resposta biológica complexa de tecidos vasculares para um estímulo nocivo, tal como patógenos, células danificadas, ou irritações. É uma tentativa protetora pelo organismo para remover o estímulo nocivo assim como iniciar o processo de cicatrização para o tecido. A inflamação pode ser classificada tanto como aguda quanto crônica. A inflamação aguda é a resposta inicial do corpo a um estímulo nocivo e é alcançada pelo movimento aumentado de plasma e leucócitos do sangue nos tecidos feridos. Uma cascata de eventos bioquímicos propagam e maturam a resposta inflamatória, envolvendo o sistema vascular local, o sistema imune, e várias células dentro do tecido prejudicado. A inflamação prolongada, conhecida como inflamação crônica, leva a uma mudança progressiva nos tipos de células que estão presentes no local da inflamação e é caracterizado pela destruição simultânea e a cicatrização do tecido a partir do processo inflamatório. Em ambos os casos, o PD-L1 é expresso pelas células do sistema imune tais como os APCs e, portanto, as infecções e as inflamações são condições clínicas que podem ser tratadas, prevenidas, ou para o qual o risco pode ser reduzido pela administração da composição de vacina da presente invenção. A composição de vacina preferencialmente compreende PD-L1 ou qualquer um dos fragmentos de peptídeo ativo imunologicamente do mesmo descritos aqui acima.

[0132] Os exemplos de distúrbios associados com a inflamação que são de relevância para a presente invenção incluem, mas não estão limitados a: inflamações alérgicas, asma, doenças autoimunes, inflamações crônicas, prostatite crônica, glomerulonefrite, hipersensibilidades, doenças infecciosa, doenças do intestino inflamatórias, doença inflamatória pélvica, lesão de reperfusão, artrite reumatoide, rejeição de transplante, e vasculite.

INFECÇÕES CRÔNICAS E INFLAMAÇÕES

[0133] Em uma modalidade da presente invenção a condição clínica é uma inflamação crônica. Em particular, a doença autoimune a ser tratada com as composições de vacina da invenção podem ser uma inflamação crônica. Uma inflamação crônica é uma condição patológica caracterizada pela inflamação ativa concorrente, destruição de tecido, e tentativas de reparo. Um tecido inflamado cronicamente é caracterizado pela infiltração de células imune mononucleares (monócitos, macrófagos, linfócitos, e células de plasma), destruição de tecido, e tentativas de cicatrização, que incluem angiogênese e fibrose.

[0134] Em uma inflamação aguda, a remoção de estímulo para o recrutamento de monócitos (que se tornam macrófagos sob uma ativação apropriada) no tecido inflamado, e os macrófagos existentes saem do tecido através dos linfáticos. Entretanto, no tecido inflamado cronicamente o estímulo é persistente, e, portanto, o recrutamento de monócitos é mantido, os macrófagos existentes são presos no local, e a proliferação dos macrófagos é estimulada (especialmente nas placas de ateroma).

[0135] É um objeto da presente invenção proporcionar uma composição de vacina compreendendo PD-L1 da SEQ ID NO: 1 ou um homólogo funcional do mesmo tendo pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou um fragmento de peptídeo ativo imunologicamente compreendendo uma sequência consecutiva de tal PD-L1 ou tal homólogo funcional do mesmo, por exemplo, qualquer um dos fragmentos de peptídeo ativo imunologicamente descritos aqui acima ou um ácido nucléico codificando tal PD-L1 ou tal fragmento de peptídeo; e um adjuvante, para a prevenção de, a redução de risco de ou o tratamento de uma doença autoimune, por exemplo, o tratamento de uma inflamação crônica.

DOENÇAS INFECCIOSAS

[0136] A composição de vacina da presente invenção pode ser usada para prevenir, reduzir o risco de ou tratar uma condição clínica. Em uma modalidade preferida da invenção, a condição clínica é uma doença infecciosa. A doença infecciosa pode ser promovida por qualquer agente infecciosos tal como uma bactéria, um vírus, parasitas e ou fungos que são capazes de induzir um aumento na expressão de PD-L1 no indivíduo sofrendo de doença infecciosa, preferencialmente, a doença de infecção é ou está em risco de se tornar uma doença crônica. Portanto, é um aspecto da presente invenção proporcionar uma composição de vacina compreendendo PD-L1 ou qualquer um dos fragmentos de peptídeo ativo imunologicamente do mesmo descrito aqui acima para o tratamento, melhora de (diminuição da severidade) estabilização e/ou prevenção de uma doença causada por um agente infeccioso.

[0137] Uma doença infecciosa pode ser causada por um vírus, e doenças virais contra as quais a composição de vacina da presente invenção pode ser administrada no tratamento de, inclui, mas não estão limitadas as seguintes doenças virais: HIV, AIDS, Complexo Relacionado a AIDS, catapora (varicela), gripe comum, infecção por citomegalovírus, colorado febre da carraça, dengue, febre hemorrágica Ebola, febre aftosa, Hepatite, Herpes simplex, Herpes zoster, HPV (papilomavírus humano), influenza (gripe), febre de Lassa, sarampo, febre hemorrágica Marburg, mononucleose infecciosa, Caxumba, norovírus, Poliomielite, leucoencefalopatia multifocal progressiva, Raiva, Rubéola, SARS, varíola (varíola), encefalite viral, gastroenterite viral, meningite viral, pneumonia viral, doença do Nilo Ocidental, e febre amarela. Preferencialmente a composição de vacina é administrada a indivíduos sofrendo de HIV/AIDS ou infecções virais que podem causar câncer. Os principais vírus associados com os canceres humanos são o papilomavírus humano, vírus da hepatite B e hepatite C, vírus Epstein-Barr, e vírus linfotrópico T humano; desse modo, é um objeto da pr4esente invenção ser administrado como um tratamento ou como parte do tratamento destas infecções virais. Mais preferencialmente, a doença infeciosa pode ser infecção com um vírus selecionado a partir de um grupo consistindo em HIV e vírus da hepatite.

[0138] Os exemplos de infecções bacterianas de relevância para a presente invenção incluem, mas não estão limitados a: Antrax, meningite bacteriana, botulismo, brucelose, campilobacteriose, risco de doença de gato, cólera, difteria, tifo epidêmico, gonorréia, Impetigo, legionário, lepra (doença de Hansen), leptospirose, listeriose, doença de Lyme, Melioidose, febre reumática, infecção por MRSA, Nocardiose, Pertussis (VVhooping tosse), Praga, pneumonia pneumocócica , psitacose, febre Q, febre maculosa (RMSF), salmonelose, febre escarlatina, Shigelose, sífilis, tétano, Tracoma, Tuberculose, Tularemia, febre tifóide, tifo, e infecções do trato urinário. É um objeto da presente invenção proporcionar uma vacina para o tratamento e / ou prevenção e / ou redução do risco de uma infecção bacteriana.

[0139] É um outro aspecto da presente invenção proporcionar uma composição de vacina para o tratamento e/ou prevenção e/ou a redução de risco de: doenças infecciosas parasitárias tais como, mas não limitadas a: tripanossoma africano, amebíase, Ascaridíase, Babesiose, Doença de Chagas, Clonorchiasis, criptosporidiose, cisticercose, Difilobotriose, Dracunculíase, equinococose, Enterobíase, Fasciolíase, Fasciolopsiasis, Filariose, infecção amebiana de vida livre, giardíase, gnatostomíase, Himenolepíase, Isosporíase, calazar, leishmaniose, malária, Metagonimiasis, miíase, oncocercose, Pediculose, infecção de Pinworm, sarna, Esquistossomose, teníase, toxocaríase, toxoplasmose, triquinose, triquinose, tricuríase, Tricomoníase e tripanossomíase; Doenças infecciosas fúngicas, tais como, mas não limitados a: Aspergilose, blastomicose, candidíase, coccidioidomicose, criptococose, histoplasmose, Tinea pedis; Doenças infecciosas causadas por príons tais como, mas não limitados a: encefalopatia espongiforme transmissível, encefalopatia espongiforme bovina, doença de Creutzfeldt-Jakob, Insônia familiar fatal Kuru, e Síndrome de Alpers; desse modo, é um objeto da presente invenção a ser administrado como tratamento de ou como parte de um tratamento destas infecções causadas por parasitas, fungos ou priões.

[0140] Em uma modalidade preferida as composições de vacina da invenção são para o tratamento de uma doença infecciosa, que é uma infecção intracelular, preferencialmente em uma infecção intracelular com um patogênico selecionado a partir de um grupo consistindo em L. monocitógenose plasmódio.

TRATAMENTO COMBINADO DE DOENÇA INFECCIOSA

[0141] É proporcionado para isso um tratamento de qualquer doença infeciosa pela administração da composição de vacina de acordo com a presente invenção pode ser dada em conjunto com um outro (segundo) ingrediente ativo tanto sequencialmente em qualquer ordem quanto simultaneamente ou em combinação com um outro tratamento tal como um tratamento com antibiótico, quimioterapia, tratamento com substâncias imunoestimulantes, tratamento usando células dendríticas, agentes antivirais, agentes antiparasitários e assim por diante.

[0142] Os exemplos de um segundo ingrediente ativo que pode ser usado no tratamento de uma doença infecciosa em combinação com a vacina da presente invenção inclui, e não estão limitados aos antibióticos. O termo antibióticos aqui refere- se à substâncias com uma atividade antibacteriana, antifúngica, antiviral e/ou antiparasitária; os exemplos de relevância para a presente invenção incluem, mas não estão limitados a: Amicacina, gentamicina, canamicina, Neomicina, Netilmicina, Paromomicina, estreptomicina, tobramicina, Ertapenem, Imipenem, Meropenem, cloranfenicol, fluoroquinolonas, ciprofloxacina, Gatifloxacina, Gemifloxacina, grepafloxacina, levofloxacina, Lomefloxacina, moxifloxacina, Norfloxacina, ofloxacina, Esparfloxacina, Trovafloxacina, Glicopeptídeos, Vancomicina, Lincosamidas, clindamicina, macrolídeos/ quetólidos, azitromicina, claritromicina, Diritromicina, eritromicina, Cefadroxil, Cefazolina, Cefalexina, Cefalotina, Cefapirina, cefradina, Cefaclor, Cefamandola, cefonicida, cefotetano, cefoxitina, Cefprozil, cefuroxima, Loracarbef, Cefdinir, Cefditoren, cefixima, Cefoperazona, Cefotaxima, Cefpodoxima, Ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftriaxona, Cefepima, Monobactamas, Aztreonam, Nitroimidazóis, Metronidazol, Oxazolidinonas, Linezolida, penicilinas, amoxicilina, amoxicilina/ clavulanato, ampicilina, Sulbactam, bacampicilina, Carbenicilina, Cloxacilina, Dicloxacilina, meticilina, mezlocilina, Nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V, Piperacilina, Piperacilina / Tazobactam, Ticarcilina, Ticarcilina / Clavulanato , Estreptograminas, Quinupristina, Dalfopristina, Sulfonamida/ sulfametoxazol, trimetoprim, tetraciclinas, Demeclociclina, doxiciclina, minociclina, tetraciclina, antifúngicos Azola Clotrimazola fluconazol, itraconazol, cetoconazol, miconazol, voriconazol, anfotericina B, nistatina, Equinocandina, caspofungina, micafungina, Ciclopirox, flucitosina, griseofulvina e terbinafina. Igualmente importante são os antivirais, como Vidarabina, aciclovir, ganciclovir e Valcyte (valganciclovir ), inibidores nucleosídeos da transcriptase reversa - analógicos (NRTI): AZT (zidovudina), ddl (didanosina), DDC (zalcitabina), d4T (estavudina ), 3TC (lamivudina), inibidores não- nucleosídeos da transcriptase reversa ( NNRTI ): nevirapina, delavirdina, os inibidores de protease: saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, Ribavirina, Amantadina/ rimantadina, Relenza e Tamiflu, Pleconaril, interferons.

[0143] Em uma modalidade, a presente invenção diz respeito a uma composição de vacina compreendendo PD-L1 da SEQ ID NO: 1, qualquer um dos homólogos funcionais do mesmo descritos aqui acima ou qualquer um dos fragmentos de peptídeo ativos imunologicamente do mesmo descritos aqui acima para o tratamento de uma doença infecciosa em combinação com pelo menos um antibiótico. Preferencialmente, a composição de vacina da presente invenção é usada para o tratamento de infecções crônicas, por exemplo, HIV e, portanto, é usada em combinação com qualquer um dos antibióticos listados acima tais como agentes antivirais.

DOENÇAS AUTOIMUNES

[0144] As doenças autoimunes aparecem quando um organismo falha ao reconhecer suas próprias partes constituintes (abaixo dos níveis sub moleculares) como próprio, que resulta em uma resposta imune contra suas próprias células e tecidos. Qualquer doença que resulte de tal resposta imune aberrante é denominada uma doença autoimune e é de relevância para a presente invenção.

[0145] É um objeto da presente invenção proporcionar uma composição de vacina compreendendo o PD-L1 da SEQ ID NO: 1 ou um homólogo funcional do mesmo tendo pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou quaisquer fragmentos de peptídeo ativos imunologicamente de PD-L1 descritos aqui acima ou um ácido nucléico codificando tal PD-L1 ou tal fragmento de peptídeo; e um adjuvante, para a prevenção, a redução de risco de ou o tratamento de doenças autoimunes. Tais doenças autoimunes podem preferencialmente ser selecionadas a partir de um grupo consistindo de doença celíaca, diabetes mellitus tipo 1 (IDDM), lúpus eritematoso sistémico (SLE), síndroma de Sjogren, esclerose múltipla (MS), tireoidite de Hashimoto, doença de Graves, púrpura trombocitopenia idiopática, e artrite reumatoide (AR). De preferência, a doença autoimune é selecionada a partir de um grupo que consiste em diabetes, lúpus SLE e esclerose.

TRATAMENTO COMBINADO DE DOENÇA AUTOIMUNE

[0146] Os tratamentos atuais para a doença autoimune são usualmente imunossupressivos, anti-inflamatórios, ou paliativos. As terapias não imunes, tais como reposição de hormônio no tratamento da tireoidite de Hashimoto ou diabetes mellitus do tipo 1 resulta na resposta auto agressiva. A manipulação dietética limita a severidade da doença celíaca. O tratamento com esteroide ou NSAID limita os sintomas inflamatórios de muitas doenças. As preparações intravenosas da globulina imune (IVIG) são usadas para a Polineuropatia Desmielinizante Inflamatória Crônica (PDIC) e síndrome de Guillain-Barré (SGB). As terapias imunomodulatórias mais específicas, tais como o TNFα antagonista Etanercept, tem mostrado ser útil no tratamento de RA. Estas imunoterapia podem ser associadas com um risco elevado de efeitos colaterais, tais como suscetibilidade a infecção.

[0147] A terapia helmíntica desenvolveu-se com base nestas observações e envolve inoculação do indivíduo com um nematoide parasítico intestinal específico (helmintos). Há atualmente dois tratamentos estreitamente relacionados disponíveis, a inoculação tanto com Necator americanos, comumente conhecido como ancilostomídeos, ou ovos de Trichuris Suis, comumente conhecido como porco tricuídeos ovos. Uma pesquisa está disponível demonstrando que esta abordagem é altamente eficaz no tratamento de uma variedade de doenças autoimunes, incluindo doença de Crohn, colite ulcerativa, asma, alergias, esclerose múltipla, e doenças inflamatórias crônicas.

[0148] Em uma modalidade, a vacina aqui divulgada é usada em combinação com um segundo ingrediente ativo tal como qualquer um dos tratamentos e medicamentos acima mencionados contra as doenças autoimunes.

INFLAMAÇÃO ALÉRGICA

[0149] A alergia é um distúrbio do sistema imune geralmente também referido como atopia. As reações alérgicas ocorrem à substâncias do meio ambiente conhecidas como alergênicos; estas reações são adquiridas, previsíveis e rápidas. Estritamente, a alergia é uma das quatro formas de hipersensibilidade e é chamada de hipersensibilidade do tipo I (ou imediata). É caracterizada pela ativação excessiva de certas células brancas do sangue chamadas mastócitos e basófilos por um tipo de anticorpo, conhecido como IgE, resultando em uma resposta inflamatória extrema. As reações alérgicas comuns incluem eczema, urticária, febre do feno, asma, alergias alimentares, e as reações ao veneno de picadas de insetos, como abelhas e vespas.

[0150] A inflamação alérgica é uma característica patofisiológica importante de várias deficiências ou condições médicas incluindo asma alérgica, dermatite atópica, rinite alérgica e várias doenças alérgicas oculares.

[0151] É um objeto da presente invenção proporcionar uma composição de vacina compreendendo um PD-L1 da SEQ ID NO: 1 ou um homólogo funcional do mesmo tendo pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou qualquer fragmento de peptídeo ativo imunologicamente de PD-L1 descrito aqui acima ou um ácido nucléico codificando tal PD-L1 ou tal fragmento de peptídeo; e um adjuvante, para a prevenção, a redução de risco de ou o tratamento de inflamação alérgica.

TRATAMENTO EM COMBINAÇÃO PARA INFLAMAÇÃO ALÉRGICA

[0152] Dois tipos de tratamentos estão disponíveis para o tratamento de inflamações alérgicas: farmacoterapia e imunoterapia.

[0153] A farmacoterapia é o uso de medicamentos antagonistas para bloquear a ação dos mediadores alérgicos, ou para prevenir a ativação de células e processos de degranulação. Estes incluem anti-histaminas, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, epinefrina (adrenalina), teofilina, cromolina de sódio e anti- leucotrienos, tais como o montelucaste (Singulair) ou zafirlucaste (Accolate); anticolinérgicos, descongestionantes, estabilizadores de mastócitos, e outros compostos que se pensa afetar eosinófilos quimiotaxia, são também comumente usados.

[0154] A imunoterapia é o tratamento de dessensibilização e hiposensibilização no qual o indivíduo é vacinado gradualmente com doses maiores progressivamente do alergênico em questão. Uma segunda forma de imunoterapia envolve a injeção intravenosa de anticorpos anti-IgE monoclonais. Um terceiro tipo, imunoterapia sublingual, é uma terapia administrada oralmente que tem a vantagem de uma tolerância imune oral a antígenos não patogênicos tais como alimentos e bactéria residente.

[0155] Em uma modalidade, a vacina aqui divulgada é usada em combinação com um segundo ingrediente ativo tal como qualquer uma das drogas e tratamentos acima mencionados contra as inflamações alergênicas.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[0156] A presente invenção diz respeito às composições farmacêuticas capazes de tratar, reduzir o risco de e/ou prevenir uma doença clínica associada a expressão PD-L1 em um indivíduo; em outras palavras os termos vacina e composição farmacêutica são usados aqui intercambiavelmente. A vacina/ composições farmacêuticas da presente invenção podem ser composições de vacina “tradicionais” compreendendo antígenos tais como polipeptídios de proteínas e/ou moléculas de ácido nucléico. Elas também podem estar na forma de composições compreendendo células, tais como células modificadas originárias de um indivíduo e processada por último, ou a composições compreendendo moléculas complexas tais como anticorpos ou TCRs.

[0157] Geralmente, uma vacina é uma substância ou composição capaz de induzir uma resposta imune em um indivíduo. A composição pode compreender um ou mais dos seguintes: um “componente ativo” tal como um antígeno (por exemplo, proteína, polipeptídio, peptídeos, ácidos nucléicos e similares), as construções de ácidos nucléicos compreendendo um ou mais antígenos entre outros elementos, células (por exemplo, APC carregado, células T para uso de transferência adotiva), moléculas complexas (anticorpos, TCRs e complexos MHC e mais), carregadores, adjuvantes e carregadores farmacêuticos. No seguinte, os vários componentes de uma composição de vacina de acordo com a presente invenção são divulgados aqui em maiores detalhes.

[0158] A composição de vacina da invenção é capaz de provocar uma resposta imune contra um câncer, DC ou APC expressando PD-L1 da SEQ ID NO: 1 ou um homólogo funcional do mesmo tendo pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 1, quando administrado a um indivíduo sofrendo de um câncer e/ou infecção (levando a expressão PD-L1) em uma modalidade preferida a condição clínica é um câncer. A composição de vacina da invenção é capaz de provocar a produção em um indivíduo vacinado com células T efetoras tendo um efeito citotóxico contra as células de câncer, APCs e DCs expressando PD-L1 e/ou induzindo a infiltração das células T específicas de antígeno em um tumor estroma em um sujeito.

ANTÍGENOS E OUTROS COMPONENTES ATIVOS Proteína / composições de vacina com base em polipeptídio/proteína

[0159] Os peptídeos da presente invenção preferencialmente se ligam com uma grande afinidade ao MHC e estão prontos para o uso como antígenos como estão apresentados aqui. Preferencialmente, a composição de vacina da presente invenção compreende um ou mais dos seguintes: PD-L1 (SEQ ID NO: 1), fragmentos de peptídeo ativo imunologicamente daqui, homólogos funcionais de PD-L1 de comprimento completo e comprimento parcial, em particular qualquer um dos fragmentos descritos aqui acima. Mais preferencialmente, a composição de vacina compreende qualquer uma das sequências listadas na listagem de sequências da presente divulgação. Mais ainda preferencialmente, a composição de vacina compreende os peptídeos PDL101 (SEQ ID NO: 2), PDL111 (SEQ ID NO: 12), e/ou PDL114 (SEQ ID NO: 15).

[0160] A escolha do antígeno na composição de vacina da invenção dependerá dos parâmetros determináveis por um perito na arte. Como já foi mencionado, cada um dos diferentes peptídeos da invenção é apresentado nas superfícies das células por uma molécula HLA particular. Como tal, se um sujeito a ser tratado é tipificado em relação ao fenótipo HLA, um peptídeo/ peptídeos são selecionados, que seja/sejam conhecidos por se ligar a aquela molécula HLA particular. Alternativamente, o antígeno de interesse é selecionado com base na predominância de vários fenótipos HLA em uma dada população. Como um exemplo, o HLA-A2 é o fenótipo mais predominante na população caucasiana, e, portanto, uma composição contendo um peptídeo ligando-se ao HLA-A2 será ativa em uma maior proporção daquela população. Além disso, os antígenos/peptídeos da presente invenção podem ser modificados de acordo com os motivos de resíduo âncora apresentados na tabela 2, para aumentar a ligação as moléculas de HLA particulares.

[0161] A composição da invenção também pode conter uma combinação de dois ou mais peptídeos derivados de PD-L1, cada um interagindo especificamente com uma população diferente de moléculas HLA de forma que cubra uma proporção maior da população alvo. Desse modo, como exemplos, a composição farmacêutica pode conter uma combinação de um peptídeo restrito pela molécula HLA-A e um peptídeo pela molécula HLA-B, por exemplo, incluindo aquelas moléculas HLA-A e HLA-B que correspondem a predominância dos fenótipos HLA na população alvo, tais como, por exemplo, HLA-A2 e HLA-B35. Adicionalmente, a composição pode compreender um peptídeo restrito pela molécula HLA-C.

[0162] No caso de vacinas com base em peptídeos, os epítopos podem ser administrados de uma forma ‘MHC pronta’, que possibilita a apresentação através de carga de exógenos independentemente da captação de antígeno e o processamento por ambas as células apresentadoras de antígeno. Os peptídeos da presente invenção compreendem ambos peptídeos de uma forma ‘MHC pronta’ curta e em uma forma longa requerendo processamento por um proteassoma proporcionando assim uma composição de vacina mais complexa que pode almejar antígenos de tumor múltiplos. Os grupos HLA mais diferentes são almejados pela vacina, a maior probabilidade da vacina funcionar em diversas populações.

[0163] A presente invenção diz respeito em uma modalidade preferida a uma composição de vacina compreendendo PD-L1 da SEQ ID NO: 1 ou um homólogo funcional do mesmo tendo pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou um fragmento de peptídeo ativo imunologicamente compreendendo uma sequência consecutiva de tal PD-L1 ou um homólogo funcional do mesmo ou um ácido nucléico codificando tal PD-L1 ou um fragmento de peptídeo; em combinação com um adjuvante para o uso como um medicamento. A composição de vacina pode ser administrada para tratar, ou reduzir o risco associado a uma condição clínica em um indivíduo.

COMPOSIÇÃO DE VACINA DE EPÍTOPO MULTIPLO

[0164] A invenção também se refere às vacinas de epítopo múltiplo altamente imunogênicas. Preferencialmente, tais vacinas devem ser projetadas de forma que facilite uma distribuição simultânea dos peptídeos derivados de PD-L1 mais adequados opcionalmente em combinação com outros peptídeos compatíveis e/ou adjuvantes como descrito doravante. A presente invenção abrange tais vacinas de epítopo múltiplo compreendendo os peptídeos derivados de PD-L1 opcionalmente em combinação com outras proteínas ou fragmentos de peptídeos não pertencentes a ou derivados de PD-L1 e/ou adjuvantes como descrito doravante. Um fator importante conduzindo o desenvolvimento das vacinas tendo mais de uma composição complexa é o desejo de atingir antígenos de tumor múltiplos, por exemplo, projetando vacinas compreendendo ou codificando uma coleção de epítopos de células Th e CTL selecionadas cuidadosamente. A invenção, desse modo, em um aspecto refere-se às composições de vacina compreendendo ambos os epítopos PD-L1 restritos de Classe I e Classe II.

[0165] Os peptídeos da presente invenção compreendem assim ambos peptídeos de uma forma ‘MHC pronta’ curta (classe I restrita), e de uma forma mais longa requerendo um processamento pela proteassoma (classe II restrita). Desse modo, a composição de acordo com a presente invenção pode ser proporcionada como uma vacina de epítopo múltiplo compreendendo epítopo restrito de classe I e/ou epítopos restritos de classe II como definido doravante.

COMPOSIÇÃO DE VACINA COM BASE EM ÁCIDO NUCLÉICO

[0166] A composição de vacina de acordo coma presente invenção pode compreender um ácido nucléico codificando um PD-L1 ou um fragmento de peptídeo ativo imunologicamente do mesmo, em particular quaisquer fragmentos descrito aqui acima. Tal ácido nucléico pode assim codificar qualquer um dos fragmentos de peptídeos e das proteínas acima mencionadas. O ácido nucléico pode, por exemplo, ser um DNA, RNA, LNA, HNA, PNA, preferencialmente o ácido nucléico é um DNA ou um RNA.

[0167] Os ácidos nucléicos da invenção podem ser compreendidos dentro de qualquer vetor compatível, tal como um vetor de expressão. Vários vetores estão disponíveis e o perito na arte será capaz de selecionar um vetor útil para o propósito específico. O vetor pode, por exemplo, ser na forma de um plasmídeo, cosmídeo, uma partícula viral ou um cromossomo artificial. A sequência de ácido nucléico apropriada pode ser inserida no vetor por uma variedade de procedimentos, por exemplo, o DNA pode ser inserido em um local de endonuclease de restrição apropriada usando técnicas bem conhecidas na arte. Além da sequência de ácido nucléico de acordo com a invenção, o vetor pode, além disso, compreender uma ou mais das sequências de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento aumentador, um promotor, e uma sequência de terminação de transcrição. O vetor também pode compreender sequências adicionais, tais como aumentadores, extremidades poli-A, ligantes, poliligantes, ligantes operativos, locais de clonagem múltipla (MCS, códons STOP, locais de entrada de ribossomos internos (I RES) e sequências de homólogos hospedeiros para a integração ou outros elementos definidos. Os métodos para projetar as construções de ácido nucléico são bem conhecidas na arte (veja, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory, 2a Edição, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). O vetor é preferencialmente um vetor de expressão, compreendendo o ácido nucléico ligado operativamente a a uma sequência de ácido nucléico regulatória direcionando a expressão do mesmo em uma célula compatível. Dentro do escopo da presente invenção tal sequência de ácido nucléico regulatório deve em geral ser capaz de direcionar a expressão em uma célula de mamífero, preferencialmente uma célula humana, mais preferencialmente em uma células apresentadoras de antígeno.

[0168] Em uma modalidade preferida o vetor é um vetor viral. O vetor também pode ser um vetor bacteriano, tal como um vetor bacteriano atenuado. Os vetores bacterianos atenuados podem ser usados a fim de induzir respostas imunes de mucosas permanentes nos locais de infecção e persistência. A bactéria recombinante diferente pode ser usada como vetores, por exemplo, o vetor bacteriano pode ser selecionado a partir de um grupo consistindo em Salmonella, Lactococcus e Listeria. Em geral, a indução de imunidade para o antígeno heterólogo HPV16 L1 ou E7 pode ser mostrado, com uma indução CTL forte e uma regressão do tumor em camundongos. O vetor pode, além disso, compreender um ácido nucléico codificando um polipeptídio estimulatório de célula T.

APCs CARREGADOS

[0169] Em modalidades úteis uma resposta imunogênica direcionada contra um câncer é provocada administrando o peptídeo da invenção tanto carregando as moléculas MHC de classe I quanto as de classe II em células apresentadoras de antígeno (APCs) do indivíduo, isolando PBMCs do indivíduo e incubando as células com o peptídeo antes de injetar as células de volta no indivíduo ou isolando o APCs precursor do indivíduo e diferenciando as células em APCs profissionais usando citocinas e antígenos antes de injetar as células de volta no indivíduo.

[0170] É desse modo, um aspecto da invenção proporcionar composições de vacina compreendendo células apresentadoras de antígeno compreendendo PD-L1 ou qualquer fragmento de peptídeo ativo imunologicamente do mesmo descrito aqui acima ou um ácido nucléico codificando tal PD-L1 ou tal fragmento de peptídeo ativo imunologicamente. A célula apresentadora de antígeno pode ser qualquer célula capaz de apresentar um antígeno para uma célula T. As células apresentadoras de antígeno preferidas são as células dendríticas. As células dendríticas (DC) podem ser preparadas e usadas nos procedimentos terapêuticos de acordo com qualquer protocolo compatível, por exemplo, como descrito aqui abaixo. Será apreciado por um perito na arte que o protocolo pode ser adotado para usar com indivíduos com diferentes tipos de HLA e doenças diferentes.

[0171] As células dendríticas (DC) podem ser pulsadas com 50 μg/ml de peptídeo restrito HLA (sintetizado em qualidade GMP) por 1 hora a 37 °C e 5 x 106 células são administradas subcutaneamente no dia 1 e 14, subsequentemente a cada 4 semanas, uma leucaferese adicional após 5 vacinações. A geração de DC para o uso clínico e controle de qualidade pode ser realizada essencialmente como descrito em Nicolette et al., (2007).

[0172] Desse modo, em uma modalidade da presente invenção, um método para tratar um indivíduo sofrendo de uma condição clínica caracterizado pela expressão de PD-L1, preferencialmente onde a condição clínica é um câncer ou um a infecção, é um onde o peptídeo é administrado apresentando o peptídeo as células apresentadoras de antígeno do indivíduo (APCs) ex vivo, seguidas pela injeção de APCs tratados de volta no indivíduo. Estes são pelo menos dois caminhos alternativos de realizar isto. Uma alternativa é isolar o APCs do indivíduo e incubar (carregar) as moléculas de MHC da classe I com o peptídeo. Carregar as moléculas de MHC da classe I significa incubar o APCs com o peptídeo de forma que o APCs com as moléculas MHC de classe I específicas para o peptídeo ligarão o peptídeo e, portanto, sejam capazes de apresenta-la as células T. Subsequentemente, os APCs são reinjetados no indivíduo. Outra forma alternativa baseia-se das descobertas recentes feitas no campo da biologia de células dendríticas. Neste caso, os monócitos (sendo precursores de células dendríticas) são isolados de um indivíduo e diferenciados in vitro em APC profissional (ou células dendríticas) pelo uso de citocinas e antígenos. Subsequentemente, os DCs gerados in vitrosão pulsados com o peptídeo e injetados no indivíduo.

TRANSFERÊNCIA ADOTIVA / IMUNOTERAPIA ADOTIVA

[0173] Um aspecto importante da invenção refere-se a cultivar células T específicas de PD-L1 in vitro e a transferência adotiva destes para os indivíduos. A transferência adotiva significa que o médico transfere diretamente os componentes atuais do sistema imune que já são capazes de produzir uma resposta imune específica, em um indivíduo.

[0174] É um objetivo da presente invenção proporcionar células T específicas de PD-L1, que podem ser úteis, por exemplo, para a transferência adotiva. As células T isoladas compreendendo os receptores de célula T capazes de se ligar especificamente aos complexos de peptídeo PD-L1/ MHC de classe I ou peptídeo PD- L1/ MHC de classe II podem ser adotivamente transferidos para os indivíduos, tais células T preferencialmente sendo células T que tenham sido expandidas in vitro, onde o peptídeo PD-L1 pode ser qualquer um dos peptídeos PD-L1 mencionados aqui acima. Os métodos de expansão de células T in vitrosão bem conhecidos pelo perito. A invenção também se refere aos métodos de tratamento compreendendo administrar as células T compreendendo receptores de células T capazes de se ligar especificamente ao complexo de peptídeo PD-L1 restrito MHC a um indivíduo, tal como um ser humano sofrendo de câncer, onde o peptídeo derivado de PD-L1 pode ser qualquer um dos peptídeos PD-L1 mencionados aqui acima. A invenção, além disso, refere-se ao uso de células T compreendendo os receptores de célula T capazes de se ligar especificamente ao PD-L1 ou aos fragmentos de peptídeo dos mesmos para a preparação de um medicamento para o tratamento de um câncer ou uma infecção. A transferência de célula T autóloga pode ser realizada essencialmente como descrito em Walter et al., (1995).

TRANSFERÊNCIA TCR

[0175] Ainda em outra modalidade, tais células T poderiam ser irradiadas antes da transferência adotiva para controle de proliferação no indivíduo. Isto é possível para projetar geneticamente a especificidade das células T pela transferência de gene TCR (Engles et al., 2007). Isto permite que a transferência das células T influenciando a especificidade do peptídeo PD-L1 nos indivíduos. Em geral, o uso das células T para a imunoterapia adotiva é atrativo porque este permite a expansão das células T em um ambiente livre de vírus ou tumor, e a análise de função de célula T antes da infusão. A aplicação de células T modificadas por gene TCR (tais como as células T transformadas com a construção de expressão direcionando a expressão de um TCR heterólogo) na transferência adotiva tem várias vantagens em comparação com a transferência das linhas de célula T: (i) a geração de células T redirecionadas é geralmente aplicável. (ii) uma alta afinidade ou uma afinidade muito alta de TCRs pode ser selecionada ou criada e usada para projetar as células T. (iii) uma avidez alta de células T pode ser gerada usando códon TCRs otimizado ou murinizado permitindo uma melhor expressão de superfície dos TCRs estabilizados. A projeção genética de uma especificidade de célula T pelo receptor de transferência de gene (TCR) pode ser realizado essencialmente como descrito em Morgan et al., 2006.

TRANSFECÇÃO TCR

[0176] O TCR com uma reatividade antitumoral conhecida pode ser geneticamente introduzido nos linfócitos T humanos primários. Os genes codificando as cadeias alfa e beta TCR de um clone CTL específico de tumor pode ser transfectado nas células T primárias e desta forma reprogramam as células T com especificidade contra o antígeno de tumor. O TCR RNA é transfectado nos PBMC por eletroporação (Schaft et al., 2006). Alternativamente, as células T podem ser proporcionadas em novas especificidades pela transferência de gene TCR usando vetores retrovirais (Morgan et al., 2006). Entretanto, o provírus de um vetor retroviral pode ser integrado aleatoriamente no genoma das células transfectadas e subsequentemente incomodar o crescimento de células. A eletroporação das células T com o RNA codificando TCR supera esta desvantagem, uma vez que o RNA é apenas transitoriamente presente nas células transfectadas e não podem ser integradas no genoma (Schaft et al., 2006). Além disso, a transfecção das células é rotineiramente usada no laboratório.

ADJUVANTES E CARREGADORES

[0177] A composição da vacina de acordo com a invenção preferencialmente compreende um adjuvante e/ou um carregador. Os exemplos de adjuvantes e carregadores úteis são dados aqui abaixo. Desse modo, o PD-L1 da SEQ ID NO: 1, o homólogo funcional ou o fragmento de peptídeo ativo imunologicamente do mesmo pode em uma composição da presente invenção estar associado com um adjuvante e/ou um carregador.

[0178] Os adjuvantes são qualquer substância cuja mistura na composição de vacina aumente ou de outra maneira modifique a resposta imune ao PD-L1 ou um fragmento de peptídeo do mesmo, veja ainda abaixo. Os carregadores são estruturas de suporte, por exemplo, um polipeptídio ou um polissacarídeo, ao qual o PD-L1 ou um fragmento de peptídeo do mesmo é capaz de ser associado e que ajuda na apresentação especialmente dos peptídeos da presente invenção.

[0179] Muitos dos peptídeos da invenção são relativamente moléculas pequenas e podem, portanto, ser requeridas nas composições como descrito aqui para combinar os peptídeos com vários materiais tais como adjuvantes e/ou carregadores, para produzir vacinas, composições imunogênicas, etc. Os adjuvantes, amplamente definidos, são substâncias que promovem respostas imunes. Uma discussão geral de adjuvantes é proporcionada em Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (2a edição, 1986) nas páginas 61-63. Goding nota, que quando o antígeno de interesse é de um peso molecular baixo, ou é um imunogênico fraco, recomenda-se acoplar a um carregador imunogênico. Os exemplos de tais moléculas carregadoras incluem hemocianina da lapa, albumina do soro de bovino, ovalbumina e imunoglobulina de galinha. Vários extratos de saponina também têm sugerido como sendo úteis como adjuvantes nas composições imunogênicas. Foi proposto usar um fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF), uma citocina bem conhecida, como um adjuvante (WO 97/28816).

[0180] Um carregador pode estar presente independentemente de um adjuvante. A função de um carregador pode, por exemplo, ser para aumentar o peso molecular de um fragmento de peptídeo particular a fim de aumentar sua atividade ou imunogenicidade, para conferir estabilidade, para aumentar a atividade biológica, ou aumentar o soro de meia-vida. Além disso, um carregador pode ajudar na apresentação do polipeptídio PD-L1 ou tal fragmento do mesmo as células T. O carregador pode ser qualquer carregador compatível conhecido por um perito na arte, por exemplo, uma célula apresentadora de uma proteína ou um antígeno. Um carregador de proteína pode ser, mas não está limitado a, hemocianina da lapa, proteínas de soro tais como transferrina, albumina do soro de bovino, albumina de soro humano, tiroglobulina ou ovalbumina, imunoglobulinas, ou hormônios, tais como insulina ou ácido palmítico. Para a imunização de humanos, o carregador deve ser um carregador aceitável fisiologicamente aceitável para humanos e seguro. Entretanto, toxóide de tétano e/ou toxóide de difteria são carregadores compatíveis em uma modalidade da invenção. Alternativamente, o carregador pode ser dextranos, por exemplo, sefarose.

[0181] Desse modo, é um aspecto da presente invenção que as composições de vacina compreendem PD-L1 da SEQ ID NO: 1, um homólogo funcional do mesmo compartilhando pelo menos 70% de identidade de sequência ou qualquer um dos fragmentos de peptídeo ativo imunologicamente descrito aqui acima é associado com um carregador tal como, por exemplo, uma proteína das acima ou uma células apresentadoras de antígeno tal como, por exemplo, uma célula dendrítica (DC).

[0182] As composições de vacina da invenção em geral compreendem um adjuvante. Os adjuvantes podem, por exemplo, ser selecionados a partir de um grupo consistindo de: AIK(SO4)2, AINa(SO4)2, AINH4 (SO4), sílica, alúmen, Al(OH)3, Ca3 (PO4)2, caulino, carbono, hidróxido de alumínio, dipeptideos de muramilo , N - acetil- muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-DMP), N-acetil nornuramil-L-alanil-D- isoglutamina (CGP 11687, também referido como nor-MDP) , N-acetilmuramiul-L- alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxfosforiloxi)- etilamina (CGP 19835A, também referido como MTP-PE ), RIBI (MPL + TDM + CWS) em um esqualeno/Tween-80.RTM 2%. emulsão, lipopolissacarídeos e os seus vários derivados, incluindo o lípido A, adjuvante completo de Freund (FCA), os adjuvantes de Freund incompleto, Merck Adjuvante 65, polinucleotídeos (por exemplo, ácidos poli IC e poli AU), cera D de Micobactéria, tuberculose, substâncias encontradas em Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis, e membros do gênero Brucella, Titermax, ISCOMS, Quil A, ALUN (veja EUA 58767 e 5554372 ), derivados de lipídios A, derivados de coleratoxina, derivados de HSP, derivados de LPS, matrizes de peptídeos sintéticos ou GMDP, interleucina 1, interleucina 2, Montanide ISA- 51 e QS- 21. Os adjuvantes preferidos a serem utilizados com a invenção incluem adjuvantes com base em óleo / surfactante, tais como adjuvantes Montanide (disponível pela Seppic, Bélgica), preferencialmente, Montanide ISA - 51. Outros adjuvantes preferidos são adjuvantes com base em DNA bacteriano, tais como adjuvantes incluindo sequências de oligonucleotídeos CpG. Ainda outros adjuvantes preferidos são adjuvantes com base em dsRNA viral, tais como poli I:C. As imidazoquinilinas são ainda outros exemplos de adjuvantes preferidos. Os adjuvantes mais preferidos são os adjuvantes compatíveis para uso humano.

[0183] Os adjuvantes Montanide (todos disponíveis pela Seppic, Bélgica), devem ser selecionados a partir de um grupo consistindo de Montanide ISA-51, Montanide ISA-50, Montanide ISA-70, Montanide ISA-206, Montanide ISA-25, Montanide ISA-720, Montanide ISA-708, Montanide ISA-763A, Montanide ISA-207, Montanide ISA-264, Montanide ISA-27, Montanide ISA-35, Montanide ISA 51F, Montanide ISA 016D and Montanide IMS, preferencialmente a partir de um grupo consistindo de Montanide ISA-51, Montanide IMS e Montanide ISA-720, mais preferencialmente a partir de um grupo consistindo de Montanide ISA-51. Montanide ISA-51 (Seppic, Inc.) é um adjuvante com base em óleo/surfactante no qual diferentes surfactantes são combinados com um óleo mineral não metabolizável, um óleo metabolizável, ou uma mistura dos dois. Eles são preparados para uso como uma emulsão com uma solução aquosa compreendendo PD-L1 da SEQ ID NO: 1, qualquer um d os homólogos funcionais do mesmo descritos aqui acima ou qualquer um dos fragmentos de peptídeo ativos imunologicamente do mesmo descritos aqui acima. O surfactante é um oleato de mannide. QS-21 (Antigenics; Aquila Biopharmaceuticals, Framingham, MA) é uma saponina solúvel em água altamente purificada que se manuseia como uma solução aquosa. Os adjuvantes QS-21 e ISA-51 podem ser proporcionados em frascos estéreis de uso único.

[0184] A citocina GM-CSF bem conhecida é outro adjuvante preferido da presente invenção. O GM-CDF tem sido usado como um adjuvante por uma década e pode ser preferivelmente um GM-SF como descrito no WO 97/28816.

[0185] Também é contemplado dentro da invenção que as composições de vacina podem compreender mais do que um adjuvante diferente e, desse modo, as composições de vacina da invenção podem compreender uma mistura de adjuvantes mencionados aqui acima. Além disso, é contemplado dentro da presente invenção que ambas a composição de vacina assim como pelo menos um outro adjuvante pode ser administrado a um indivíduo em necessidade do mesmo simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem.

[0186] As funcionalidades desejadas de adjuvantes capazes de serem usados de acordo com a presente invenção são listados na tabela abaixo. Tabela 3: Modos de ação de adjuvante

Fonte: Cox, J.C., e Coulter, A.R. (1997). Vaccine 15, 248-56.

[0187] Uma composição de vacina de acordo com a presente invenção pode compreender mais do que um adjuvante. Além disso, a invenção abrange uma composição terapêutica ainda compreendendo qualquer substância adjuvante e/ou carregador incluindo qualquer um dos acima ou combinações dos mesmos. Também é contemplado que a proteína PD-L1, um homólogo funcional do mesmo ou quaisquer fragmentos de peptídeo ativos imunologicamente do mesmo, e o adjuvante podem ser administrados separadamente ou em qualquer sequência apropriada.

[0188] Preferencialmente, as composições de vacina da presente invenção compreendem um adjuvante Montanide tal como Montanide ISA 51 ou Montanide ISA 720 ou o adjuvante GM-CSF ou uma mistura dos mesmos.

[0189] Portanto, a invenção abrange uma composição terapêutica compreendendo ainda uma substância adjuvante incluindo qualquer um dos acima ou combinações dos mesmos. Também é contemplado que o antígeno, isto é, o peptídeo da invenção e o adjuvante podem ser administrados simultaneamente ou separadamente em qualquer sequência apropriada.

ADMINISTRAÇÃO E DOSAGEM

[0190] A quantidade de PD-L1 ou do fragmento de peptídeo ativo imunologicamente do mesmo na composição de vacina pode variar, dependendo da aplicação particular. Entretanto, uma dose única do PD-L1 ou do fragmento de peptídeo do mesmo é preferencialmente em qualquer lugar a partir de cerca de 10 μg a cerca de 5000 μg, mais preferencialmente de cerca de 50 μg a cerca de 2500 μg, tal como cerca de 100 μg a cerca de 1000 μg. os modos de administração incluem administração intradermal, subcutânea e intravenosa, implantação na forma de uma formulação de liberação de tempo, etc. Qualquer e todas as formas de administração conhecidas na arte são abrangidas aqui. Também quaisquer formas de dosagem convencionais que sejam conhecidas na arte para serem apropriadas para formular uma composição de peptídeo imunogênico injetável são abrangidas, tal como as formas liofilizadas e as soluções, suspensões ou formas de emulsão contendo, se requerido, os carregadores aceitáveis farmaceuticamente, diluentes, preservativos, adjuvantes, componentes de tampão, etc.

[0191] As composições farmacêuticas podem ser preparadas e administradas usando qualquer protocolo convencional conhecido por um perito na arte. No exemplo 2, um exemplo não limitante de preparação de uma composição de vacina, de acordo com a invenção é dada assim como um exemplo não limitante de administração de tal como uma vacina. Será apreciado por um perito na arte que o protocolo pode ser facilmente adaptado a qualquer uma das composições de vacina descritas aqui. Em uma outra modalidade da invenção, a composição farmacêutica da invenção é útil para o tratamento de um indivíduo sofrendo de uma condição clínica caracterizada pela expressão de PD-L1, tal como um câncer e infecções.

[0192] O efeito imunoprotetor da composição da invenção pode ser determinado usando várias abordagens conhecidas pelos peritos na arte. Uma resposta imune de sucesso também pode ser determinada pela ocorrência de reações DTH após a imunização e/ou a detecção de anticorpos especificamente reconhecendo os peptídeos da composição de vacina.

[0193] As composições de vacina de acordo com a invenção podem ser administradas a um indivíduo em quantidades eficazes terapeuticamente.

[0194] As composições farmacêuticas podem ser proporcionadas a um indivíduo por uma variedade de rotas tais como subcutânea, tópica, oral ou intramuscular. A administração das composições farmacêuticas é realizada oralmente ou por via parenteral. Os métodos da distribuição parental incluem administração tópica, intra-arterial (diretamente no tecido), intramuscular, subcutânea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, ou intranasal. A presente invenção também tem o objetivo de proporcionar formulações farmacêuticas parenterais e sistêmicas, oral, tópica compatíveis para o uso nos métodos de profilaxia e tratamento com a composição de vacina.

[0195] Por exemplo, as composições de vacina podem ser administradas em formas de dosagem oral tais como tabletes, cápsulas (cada uma incluindo formulações de liberação de tempo e liberação sustentável), pílulas, pós, grânulos, elixires, extratos, soluções, suspensões, xaropes e emulsões, ou por injeção. Também, elas podem ser administradas em forma intravenosa (ambos bolus e infusão), intraperitoneal, subcutânea, tópica com ou sem oclusão, ou intramuscular, todas usando formas bem conhecidas pelos peritos nas artes farmacêuticas. Uma quantidade eficaz, mas não tóxica da vacina, compreendendo qualquer um dos compostos descritos aqui, pode ser empregada como um agente terapêutico ou profilático. Também qualquer e todas as formas de dosagem convencionais que são conhecidas na arte para serem apropriadas para formular composições de peptídeo imunogênicas injetáveis são abrangidas, tais como as formas liofilizadas e soluções, suspensões ou formas de emulsão contendo, se requerido, os carregadores aceitáveis farmaceuticamente convencionais, diluentes, preservativos, adjuvantes, componentes de tampão, etc.

[0196] Os modos preferidos de administração da composição de vacina de acordo com a invenção inclui, mas não está limitado a administração sistêmica, tal como administração intravenosa ou subcutânea, administração intradermal, administração intramuscular, administração intranasal, administração oral, administração retal, administração vaginal, administração pulmonar e geralmente qualquer forma de administração mucosal. Além disso, está dentro do escopo da presente invenção que os meios para qualquer uma das formas de administração mencionadas aqui estão inclusas na presente invenção.

[0197] Uma vacina de acordo com a presente invenção pode ser administrada uma vez, ou qualquer número de vezes tais como duas, três, quatro ou cinco vezes. Em uma modalidade a administração da composição de vacina da presente invenção pode ser administrada em qualquer número de vezes tal como 1 vez por mês, nos primeiros dois anos, a seguir administrada uma vez a cada três meses por pelo menos dois anos, tal como três anos, quatro anos ou cinco anos. Administrar a vacina mais do que uma vez tem o efeito de impulsionar a resposta imune resultante. A vacina pode ainda ser impulsionada administrando a vacina em uma forma ou em uma parte do corpo diferente da administração anterior. O disparo impulsionador é tanto um disparo impulsionador homólogo quanto heterólogo. Um disparo impulsionador homólogo é onde a primeira e as vacinações subsequentes compreendem as mesmas estruturas e mais especificamente o mesmo veículo de distribuição especialmente o mesmo vetor viral. Um disparo impulsionador heterólogo é quando construções idênticas são compreendidas dentro de diferentes vetores virais.

SEGUNDO INGREDIENTE ATIVO

[0198] É um aspecto da presente invenção que a composição de vacina aqui proporcionada é usada em combinação com um segundo ingrediente ativo. A administração da composição de vacina e o segundo ingrediente ativo pode ser sequencial ou combinada. Os exemplos de segundo ingrediente ativo são dados acima para ambos o câncer e as infecções. É um outro aspecto que a composição de vacina pode ser usada em combinação com outra terapia de relevância para uma dada condição clínica a ser tratada. Tal terapia pode incluir cirurgia, quimioterapia ou terapia de gene, substâncias imunoestimulantes ou anticorpos; um perito na arte é capaz de determinar o tratamento de combinação apropriado para um dado cenário.

[0199] Em alguns casos será apropriado combinar o método de tratamento da invenção com um outro tratamento médico tal como uma quimioterapia, radioterapia, tratamento com substâncias imunoestimulantes, terapia de gene, tratamento com anticorpos e/ou antibióticos e tratamento usando células dendríticas.

FERRAMENTAS DE DIAGNÓSTICO E PROGNÓSTICO

[0200] Os peptídeos da presente invenção proporcionam a base para desenvolver amplamente os procedimentos de diagnóstico e prognóstico em relação ao câncer e as infecções. Desse modo, em outras modalidades úteis a composição da invenção é uma composição para ex vivo ou um diagnóstico in situ da presença de células expressando PD-L1 em um indivíduo. O procedimento de diagnóstico é com base nas células T reativas a PD-L1 entre PBMCs ou em tecido de tumor.

[0201] Portanto, há proporcionado um kit de diagnóstico para ex vivo ou diagnóstico in situ da presença em um indivíduo de células T reativas a PD-L1 ou em tecido de tumor compreendendo um ou mais peptídeos da invenção, e um método compreendendo contatar um tecido de tumor ou uma amostra de sangue com um complexo de um peptídeo da invenção e uma molécula HLA de classe I ou classe II ou um fragmento de tal molécula e detectar uma ligação do complexo ao tecido ou às células de sangue. Em um aspecto, a invenção proporciona um complexo de um peptídeo e uma molécula HLA de classe I ou classe II ou um fragmento de tal molécula, que é útil como um reagente de diagnóstico tal como é descrito aqui. Tal complexo pode ser4 monomérico ou multimérico.

[0202] Outra abordagem de prognóstico ou diagnóstico útil é com base na geração de anticorpos em espécies animais heterólogas, por exemplo, os anticorpos murinos direcionados contra o PD-L1 humano, que pode então ser usado, por exemplo, para diagnosticar a presença de células de câncer apresentando o peptídeo. Para tal propósito de imunização, a quantidade de peptídeo pode ser menor do que a usada em curso da terapia in vivo, tal como aquela mencionada acima. Em geral, uma dose preferida pode variar de cerca de 1 μg a cerca de 750 μg de peptídeo. Também é possível produzir anticorpos monoclonais com base em imunização com um peptídeo da invenção. Portanto, a presente invenção também se refere a uma molécula, em particular um anticorpo monoclonal ou policlonal incluindo um fragmento do mesmo, que é capaz de se ligar especificamente a um peptídeo da invenção e a uma molécula que é capaz de bloquear tal ligação, por exemplo, um anticorpo elevado contra o anticorpo monoclonal ou policlonal direcionado contra um peptídeo da invenção. A invenção ainda se refere aos receptores de célula T isolados capazes de se ligar especialmente a um peptídeo ou uma proteína da invenção assim como a ácidos nucléicos isolados codificando o mesmo. Tais receptores de célula T podem, por exemplo, ser clonados a partir de proteína ou de células T específicas de peptídeo usando técnicas padrão bem conhecidas por um perito.

[0203] Em um aspecto a invenção também se refere a células T isoladas compreendendo receptores de célula T capazes de se ligar especificamente ao PD- L1 e/ou qualquer um dos fragmentos de peptídeo ativos imunologicamente do mesmo descritos aqui. As células T isoladas podem ser células T CD8 ou células T CD4. As células T isoladas são preferencialmente células T que tenham sido expandidas in vitro. Os métodos para expandir as células T in vitrosão bem conhecidos pelos peritos. Tais células T podem em particular ser úteis no tratamento de câncer por transferência adaptativa ou transferência de células autólogas. Desse modo, a invenção também se refere a composições farmacêuticas compreendendo células T assim como métodos para tratamento compreendendo administrar células T compreendendo receptores de células T capazes de se ligar especificamente ao PD-L1 ou fragmentos de peptídeo do mesmo a um indivíduo, em necessidade do mesmo tal como um indivíduo sofrendo de câncer e/ou infecções. A transferência de células autólogas pode ser realizada essencialmente como descrito em Walter et al., (1995).

[0204] A presente invenção proporciona os meios para tratar, prevenir, aliviar ou curar uma condição clínica caracterizada pela expressão de PD-L1 tal como câncer e infecções preferencialmente um câncer, compreendendo administrar a um indivíduo sofrendo da doença uma quantidade eficaz de uma composição como definido aqui, uma molécula que é capaz de se ligar especificamente a um fragmento de peptídeo, que pode, por exemplo, ser um anticorpo ou um receptor de célula T ou o kit de partes descrito aqui. Portanto, é um outro aspecto da invenção proporcionar um método para tratar uma condição clínica associada com a expressão de PD-L1 da SEQ ID NO: 1.

MONITORAMENTO DA IMUNIZAÇÃO

[0205] Em modalidades preferidas, a composição farmacêutica da invenção é uma composição de vacina. É, portanto, de interesse e um aspecto da presente invenção monitorar a imunização de um indivíduo ao qual a composição de vacina da presente invenção é administrada. A composição de vacina pode, assim, ser capaz de provocar uma resposta imune a um câncer e/ou infecção. Como usado aqui, a expressão “composição de vacina” refere-se a uma composição provocando pelo menos um tipo de resposta imune direcionada contra as células expressando PD-L1 tal como as células de câncer, APCs ou DCs. Desse modo, tal resposta imune pode ser qualquer uma das seguintes: uma resposta CTL onde os CTLs são gerados, e que são capazes de reconhecer o complexo de peptídeo/HLA apresentado nas superfícies das células resultando em lise de célula, isto é, a vacina provoca a produção, no sujeito vacinado, de células T efetoras tendo um efeito citotóxico contra as células de câncer; uma resposta de célula B dando aumento a produção de anticorpos anticâncer; e/ou um tipo DTH de resposta imune. É um objetivo da presente invenção monitorar a imunização de um indivíduo monitorando qualquer uma das reações acima subsequentes para administrar a composição da presente invenção a tal indivíduo.

[0206] Em um aspecto a invenção refere-se aos métodos para monitorar a imunização, tal método compreendendo as etapas de i) proporcionar uma amostra de sangue de um indivíduo ii) proporcionar um PD-L1 da SEQ ID NO: qualquer um dos homólogos funcionais do mesmo descritos aqui acima ou qualquer um dos fragmentos de peptídeo ativo imunologicamente descritos aqui acima; iii) determinar se tal amostra de sangue compreende anticorpos ou células T compreendendo receptores de célula T especificamente se ligando a proteína ou peptídeo iv) determinar assim se a resposta imune a tal proteína ou peptídeo foi elevada em tal indivíduo.

[0207] O indivíduo é preferencialmente um ser humano, por exemplo um ser humano que tenha sido imunizado com PD-L1 ou um fragmento de peptídeo daqui ou um ácido nucléico codificando tal proteína ou peptídeo.

KIT DE PARTES

[0208] A invenção também se refere a um kit de partes compreendendo - qualquer uma das composições de vacina descritas aqui e/ou - um PD-L1 da SEQ ID NO: 1 ou qualquer um dos homólogos funcionais daqui descritos aqui acima e/ou - qualquer um dos fragmentos de peptídeo ativo imunologicamente de PD-L1 descrito aqui acima, e/ou - qualquer um dos ácidos nucléicos codificando as proteínas dos dois pontos principais acima e as instruções de como usar o kit de partes.

[0209] A invenção também se refere a um kit de partes compreendendo - qualquer uma das composições de vacina descritas aqui e/ou - um PD-L1 da SEQ ID NO: 1 ou qualquer um dos homólogos funcionais do mesmo descritos aqui acima e/ou - qualquer um dos fragmentos de peptídeo ativo imunologicamente de PD-L1 descritos aqui acima e/ou - qualquer um dos ácidos nucléicos codificando as proteínas do dois pontos principais acima e um segundo ingrediente ativo.

[0210] Preferencialmente, o segundo ingrediente ativo é escolhido em correspondência com a condição clínica a ser tratada de forma que no caso onde um câncer é para ser tratado o segundo ingrediente ativo é escolhido entre, por exemplo, agentes quimioterápicos como listado acima. Também, se tratando uma infecção viral/microbiana, o segundo ingrediente ativo é preferencialmente um antibiótico e/ou um agente antiviral.

[0211] Os componentes do kit de partes são preferencialmente compreendidos em composições individuais, está, portanto, dentro do escopo da presente invenção que todos os componentes do kit de partes estão compreendidos dentro da mesma composição. Os componentes do kit de partes podem assim ser administrado simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 PACIENTES

[0212] As Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMC) foram coletadas a partir de pacientes com câncer (carcinoma de célula renal, melanoma, e câncer de mama) e controles saudáveis. As amostras de sangue foram traçadas em um mínimo de quatro semanas após o término de qualquer tipo de terapia anticâncer. O PBMC foi isolado usando uma separação Linfoprep, do tipo HLA (Departamento de Imunologia Clínica, Hospital Universitário, Copenhague, Dinamarca) e congelado em FCS com 10% de DMSO. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Éticas Científicas para a Região da Capital da Dinamarca e conduzido de acordo com as provisões da Declaração de Helsinki. Um informativo escrito dos pacientes foi obtido antes de entrar o estudo.

ENSAIO ELISPOT

[0213] O ensaio ELISPOT foi usado para quantificar o IFN-Yespecífico de peptídeo liberando as células efetoras como descrito anteriormente (Andersen et al., 2001, Cancer Res. 61:869-872). Em alguns experimentos o PBMC foi estimulado uma vez in vitro com o peptídeo antes de analisar como descrito (McCutcheon et al., 1997, J Immunol Methods 210:149-166) para estender a sensibilidade do ensaio. Em suma, as placas com 96 poços com fundo de nitrocelulose (MultiScreen MAI P N45; Millipore) foram revestidas durante a noite com mAb de captura de IFN-y (Mabtech). Os poços foram lavados, bloqueados por um meio X-vivo e células efetoras (PBMC coletados e quando indicado estimulado como descrito acima) foram adicionados em duplicata em diferentes concentrações de células, com ou sem 10 μM de peptídeo. As placas foram incubadas durante a noite. No dia seguinte, o meio foi descartado e os poços foram lavados antes da adição do Ab secundário biotinilado relevante (Mabtech). As placas forma incubadas em temperatura ambiente (RT) por 2 horas, lavadas, e a enzima avidina conjugada (AP-Avidin; Calbiochem/Invitrogen Life Technologies) foi adicionada para cada poço. As placas foram incubadas a RT por 1 hora e o substrato de enzima NBT/BCIP (Invitrogen Life Technologies) foi adicionado a cada poço e incubado em RT por 5-10 min. Após o surgimento de manchas roxas escuras, a reação foi terminada lavando com água corrente. As manchas foram contadas usando um analisador ImmunoSpot Series 2.0 (CTL Analyzers).

ESTABELECIMENTO DE CLONES E CULTURAS DE CÉLULA T ESPECÍFICAS DE ANTÍGENO

[0214] O PBMC de um paciente com melanoma foi estimulado com um DC carregado de peptídeo PD-L1 autólogo (20 Gy) irradiado (PBMC:DC proporção = 3x106: 3x105). No dia seguinte IL-7 (5ng/m1) e IL-12 (10ng/m1) (PeproTech, London, UK) foram adicionados. A estimulação das culturas foi realizada a cada 10 dias com DC autólogo irradiado carregado com PDL101 (2x) seguido por PBMC autólogo irradiado carregado com lkB10 (3x). Cento e vinte U/ml IL-2 (PeproTech, London, UK) foi adicionado após cada estimulação. Após um mês de crescimento das culturas foram testados para especificidade em um ensaio de liberação de 51Cr padrão.

ENSAIO DE CITOTOXIDADE

[0215] Os ensaios de liberação de 51Cr convencionais para a citotoxidade mediada por CTL foram realizados como descrito em outro lugar (Andersen et al., 1999). As células alvo foram as T2 com ou sem PDL101 (figura 3a) e a linha de células de câncer de mama HLA-A2+ a linha de célula de câncer de mama MDA- MB-231 (figura 3b) (disponível pela American Type Culture Collection (ATCC)).

RESULTADOS PD-L1 CONTRA RESPOSTAS IMUNES RESTRITAS POR HLA-A2

[0216] A sequência de aminoácido da proteína PD-L1 foi triada para os epítopos de peptídeo deca-mer e nona HLA-A2 mais prováveis a partir dos resíduos âncora específicos de HLA-A2 (veja tabela 2). 17 peptídeos derivados de PD-L1 foram selecionados e subsequentemente sintetizados. Usando um ensaio de secreção ELISPOT IFN-Y,foram examinados PBMC de pacientes com câncer e indivíduos saudáveis para a presença de respostas de célula T específicas contra estes peptídeos derivados de PDl1. PBMC de HLA-A2+, pacientes com câncer em último estágio (câncer de mama, melanoma e carcinoma de célula renal) foram estimulados uma vez com diferentes peptídeos in vitro antes da examinação por ELISPOT. As respostas ELISPOT foram detectadas contra PDL101, (LLNAFTVTV; PD-L115-23, SEQ ID NO:2)), PDL111 (CLGVALTFI; PDL1250-258, SEQ ID NO:12) e PDL114 (VILGAILLCL; PDL1242-251, SEQ ID NO: 15). Além disso, foram examinados PBMC de indivíduos saudáveis para a reatividade contra estes três peptídeos derivados de PDL1. Os resultados são mostrados na figura 1, que mostra as manchas específicas PDL1 por 5x105 PBMC como determinado após a estimulação uma vez in vitro com peptídeo como descrito aqui acima.

[0217] Além de determinar a presença de células T específicas usando IFNy como um marcador, TNTα também foi usado como um marcador. Desse modo, um ensaio ELISPOT foi realizado essencialmente como descrito acima com o peptídeo PDL101 incluindo uma estimulação uma vez in vitro com tal peptídeo, exceto que os anticorpos TNFα foram usados no lugar dos anticorpos IFNy. A figura 2B mostra os resultados.

DETECÇÃO DE CÉLULAS T RESTRITAS HLA-A2 REATIVAS DE PD-L1 EM PACIENTES COM CÂNCER

[0218] Enquanto a frequência de células T reativas a PD-L1 são aumentadas marcadamente por uma estimulação in vitro, as células T reativas de PD-L1 também foram rapidamente detectáveis ex vivo em pacientes selecionados: Em seis pacientes com repostas fortes após a estimulação in vitro, uma reatividade respectiva também foi detectada ex vivo. Os resultados são mostrados na figura 2A, que mostra as manchas PDL1 por 5x105 PBMC como determinado no PBMC diretamente após a coleta, isto é, sem uma estimulação in vitro.

CAPACIDADE FUNCIONAL DAS CÉLULAS T ESPECÍFICAS PD-L1

[0219] Tendo identificado os pacientes hospedando respostas contra o peptídeo PDl101, usamos PBMC a partir de tais pacientes para gerar as culturas de célula T específicas contra este peptídeo in vitro. PBMC foi estimulado por células dendríticas pulsadas por PD-L1 autólogas (DC) como descrito acima. Após quatro rodadas de estimulação, a especificidade do peptídeo foi testada em ensaios de liberação de 51Cr padrão. Para este fim, tanto as células T2 descarregadas quanto as células T2 carregadas com peptídeo lkB10 serviram como alvos. Este ensaio revelou que apenas as células T2 pulsadas comPD-L101 foram mortas (figura 3). Em seguida, as culturas de célula T específicas de PD-L1 foram ainda usadas para testar a capacidade de matar as linhas de célula de câncer positivas de HLA-A2.

[0220] Em seguida, os clones foram estabelecidos a partir das culturas de células T limitando a diluição. Após uma curta etapa de expansão, a especificidade dos clones em crescimento foi analisada em ensaios de liberação de 51Cr padrão. O clone 9 eficazmente quebrou células T2 pulsadas com PD-L1. Também o clone 9 gerado a partir de culturas de massa específica foi capaz de matar as células de câncer de mama MDA-MB-231.

EXEMPLO 2 COMPOSIÇÃO DE VACINA

[0221] 500 μg de peptídeo PD-L1 (PDL101, PDL111 ou PDL115) em 500 μL de tampão e fosfato é misturado com 500 μL de adjuvantes Montanide (Seppic, France) e administrados ao paciente. Em adição 75 μg de Leucina (Sargramostim; GM-CSF — disponível pela Genzyme, Estados Unidos) para estimulação do sistema imune. Ambas a composição de vacina e o GM-CSF são administrados por injeção subcutânea. A área de vacinação é em adição tratada topicamente com Aldara (Imiquimod — disponível pela MEDA AB, Suécia) para aumentar a resposta imune local.

EXEMPLO 3 PACIENTES

[0222] As células mononucleares de Sangue Periférico (PBMC) foram coletadas de indivíduos saudáveis e pacientes com câncer (melanoma, carcinoma de célula renal e câncer de mama). As amostras de sangue foram tiradas um mínimo de quatro semanas após o término de qualquer tipo de terapia anticâncer. PBMC foram isolados usando uma separação Lymphoprep, o tipo HLA e congelado em FCS com 10% DMSO. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética Científica para a região capital da Dinamarca e conduzida de acordo com as provisões da Declaração de Helsinki. Um consentimento informado por escrito por pacientes foi obtido antes de entrar no estudo.

[0223] Para identificar os epítopos CTL restritos de HLA-A2 para PD-L1, a sequência de aminoácidos de PD- L1 foi analisada usando o "Database SYFPEITHIP" (15) disponível pela internet. O 9mer (aqui denominado "PD-L101") PDL115-23; (LLNAFTVTV) marcou 30 pelo algoritmo SYFPEITHI e resultou como o melhor epítopo candidato. O peptídeo PD-L101 e os dois polipeptídios longos de PD-L1 foram produzidos; PDLong1: PDL19-28, FMTYWHLLNAFTVTVPKDL e PDLong2: PDL1242- 264, VILGAILLCLGVALTFIFRLRKG. Apenas o primeiro (PDLong1) incluía a sequência de PD-L101. A alta afinidade de HLA-A2 ligando o epítopo HIV-1 pol476-484 (ILKEPVHGV) e CMV pp65 pos495-503 (NLVPMVATV) foi usada como controles irrelevantes.

ENSAIO ELISPOT

[0224] No presente estudo o ELISPOT foi realizado de acordo com as regras proporcionadas pela CIP(http://cimt.eu/cimt/files/dl/cipguidelines.pdf). Em alguns experimentos PBMC foi estimulado uma vez in vitro com peptídeo antes da análise como descrito para estender a sensibilidade do ensaio. Em suma, as placas de 96 poços de fundo com nitrocelulose (MultiScreen MAIP N45; Millipore) foram revestidas durante a noite com anticorpos relevantes. Os poços foram lavados, bloqueadas por um meio X-vivo e as células efetoras foram adicionadas se possível em triplicata senão em duplicata em diferentes concentrações de célula, com ou sem peptídeo. As placas foram incubadas durante a noite. No dia seguinte, o meio foi descartado e os poços foram lavados antes da adição do Ab secundário biotinilado relevante (Mabtech), seguido pela enzima avidina conjugada (AP-Avidin; Calbiochem/Invitrogen Life Technologies) e finalmente o substrato de enzima NBT/BCIP (Invitrogen Life Technologies). As manchas foram contadas usando um analisador ImmunoSpot Series 2.0 (CTL Analyzers). A definição de uma resposta ELISPOT foi com base nas regras e nas recomendações proporcionadas pela CIP por uma abordagem empírica ou estatística; a primeira implica em configurar um limiar para representar uma resposta biológica. Este é suportado pelas regras CIP sugerindo que um limiar deve ser definido como >6 manchas específicas por 100.000 PBMC. O teste de reamostragem livre de distribuição não paramétrico (DFR) dá uma maneira de comparar formalmente os poços estimulados por antígenos com os poços de controle negativo. Como um mínimo o ensaio ELISPOT deve ser realizado pelo menos em tripleto. Além disso, o teste Mann-Whitney não pareado não paramétrico foi usado para comparar os respondedores específicos PD-L101 entre os pacientes com câncer e os doadores saudáveis.

ESTABELECIMENTO DE CULTURAS DE CÉLULAS T ESPECÍFICAS DE ANTÍGENO

[0225] Duas culturas de célula T específicas de PD-L1 foram estabelecidas. O PBMC de paciente com câncer de mama (CM.21) e de paciente com melanoma (MM.05) forma estimulados com DC autólogo carregado com PD-L1 irradiado. No dia seguinte IL-7 e IL-12 (PeproTech, Londres, UK) foram adicionados. A estimulação das culturas foi realizada a cada 8 dias com DC autólogo irradiado carregado com PD- L101 (2x) seguido por PBMC autólogo irradiado carregado com PD-101. O dia após a estimulação o peptídeo IL-2 (PeproTech, Londres, UK) foi adicionado.

GERAÇÃO DE DC

[0226] DC foi gerado a partir de PBMC por aderência nos pratos de cultura a 37°C por 1-2 horas em RPMI-1640. Os monócitos aderentes foram cultivados em RPMI-1640 suplementados com 10% de soro de bezerro fetal na presença de IL-4 (250 U/ml) e GM-CSF (1000 U/ml) por 6 dias. DC foi maturado pela adição de IL-β (1000U/ml), IL-6 (1000U/ml) TNF-α (1000U/ml) e PGE2 (1 ug/ml).

ENSAIO DE CITOTOXIDADE

[0227] Os ensaios convencionais de liberação de 51Cr para citotoxidade mediada por CTL foram realizados como descrito em Andersen et al., J Immunol 1999. As células alvo foram as células T2, linhas de células B transformadas EVB HLA-A2+ (KIG-BCL), DC maturado autólogo (mDC), linhas de células de melanoma HLA-A2+ (MM1312.07 e MM.909.06) com ou sem IFN-y (100U/ml) adição por 2 dias. As células T2 e KIG-BCL foram pulsados com a proteína recombinante PD-L1 (Sino Biological Inc.) por 3 horas a 37°C antes da adição de crômio. A lise das células T2 foi bloqueada usando um anticorpo conjugado FITC anti HLA-A2 (2ug/100ul, BD Biosciences).

TECNOLOGIA DE TROCA DE PEPTÍDEO HLA E ELISA

[0228] Para avaliar a afinidade do complexo de peptídeo HLA um método de troca UV foi usado em combinação com um sanduíche ELISA como descrito anteriormente (19). Dois peptídeos ligantes fortes (HLA-A2/CMV pp65 pos495-503 (NLVPMVATV) e HLA-A2/1-11V-1 POL476-484 (I LKEPVHGV)) e uma amostra não exposta a luz UV foram usadas como controles positivos, enquanto uma amostra sem resgate de peptídeo foi usada como um controle negativo. Os controles positivos forma feitos em quadruplicata e os peptídeos PD-L101 em triplicata.

SILENCIAMENTO DE PD-L1 MEDIADO POR siRNA

[0228] A discrição dupla siRNA para almejar o silenciamento de PD-L1 e o duplo controle negative siRNA de discrição recomendada para o meio de conteúdo GC forma obtidos a partir de Invitrogen (Invitrogen, Paisley, UK). A discrição dupla siRNA PD-L1 consistia na sequência de sentido 5'- CCUACUGGCAUUUGCUGAACGCAUU3' e a sequência antisentido 5'- AAUGCGUUCAGCAAAUGCCAGUAGG-3'. Para os experimentos de silenciamento de PD-L1, mDC foram transfectados com siRNA PD-L1 usando parâmetros de eletroporação.

ANÁLISE DE CITOMETRIA DE FLUXO

[0229] A análise de citometria de fluxo foi realizada em um FACSCANTO ll (BD Biosciences, San Jose CA, USA) para determinar uma expressão de superfície de PD-L1 em mDC antes e depois do silenciamento almejado de siRNA, as células T2, KIG-BCL e as linhas de célula de melanoma HLA-A2+ (MM1312.07 e MM.909.06) com ou sem o tratamento IFN-Y. As células foram lavadas em PBS/1% BSA e subsequentemente coloridas tanto com FITC- quanto com anticorpo monoclonal anti PD-L1 conjugado com PE-Cy5 por 30 min em gelo em PBS/1% BSA. O anticorpo combinado com isotipo não reativo (BD Biosciences) foi usado como controle. As análises de fluorescência foram realizadas usando um software FACSDiva (BD Biosciences) e um software FlowJo (Tree Star, Ashland OR, USA).

COLORAÇÃO DE MULTÍMERO HLA

[0230] Para uma coloração de multímero/tetrâmero, os tetrâmeros acoplados com PE e APC foram preparados usando uma tecnologia de troca de peptídeo MHC. A coloração foi realizada com CD3-AmCyan, CD8-Pacfic Blue, CD4-FITC (BD Bioscience) e os complexos tetrâmeros de HLA HLA-A2/PD-L101 (PDL115-23; LLNAFTVTV) ou HIV-1 (pol476-484; ILKEPVHGV) conjugados com APC/PE. Os marcadores de células mortas 7-AAD-PerCP (BD Bioscience) adicionados antes da análise FACS. Para um enriquecimento das culturas de célula T foram coloridos com tetrâmero HLA-A2/PD-L101 conjugado com PE para e subsequentemente isolado com micro esferas anti PE (MACS Miltenyi Biotec).

[0231] Em alguns experimentos as células foram estimuladas com peptídeo PD-L101 (0,2mM) ou um peptídeo HIV irrelevante e colorido com anticorpo CD107a- PE (BD Biosciences) por 4 horas a 37°C. Subsequentemente, as células foram coloridas com um tetrâmero e os marcadores de superfície e analisados com FACSCANTO II (BD Biosciences, San Jose CA, USA).

RESULTADOS RESPOSTAS DE CÉLULA T NATURAIS CONTRA PD-L1

[0232] A sequência de aminoácido da proteína PD-L1 foi triada para os epítopos de peptídeo deca-mer e nona HLA-A2 mais prováveis usando o "Database SYFPEITHIP"disponível pela internet. O peptídeo PD-L115-23 (LLNAFTVTV) intitulado "PD-L101" saiu como o melhor candidato com uma pontuação predicativa de 30 e este peptídeo foi subsequentemente sintetizado. Examinados as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) a partir de indivíduos saudáveis assim como de pacientes com câncer para a presença de respostas de célula T específicas contra este peptídeo derivado de PD-L1 usando o ensaio de secreção IFN-Y ELISPOT. O ensaio ELISPOT foi utilizado anteriormente para a identificação de novos antígenos de tumor com base em uma imunidade espontânea em pacientes com câncer. Desse modo, o HLA-A2+PBMC de pacientes com câncer de mama, carcinoma de célula renal ou melanoma foram estimulados uma vez com PD-L101 in vitro antes da examinação por ELISPOT. As respostas frequentes e fortes foram detectadas contra PD-L101 em vários pacientes. A figura 4A exemplifica as respostas de célula T específicas de PD- L101 em um paciente com carcinoma de célula renal (RCC.46) e dois pacientes com melanoma (MM.04 e MM.13). Em geral, a presença de células T reativas de PD-L1 no sangue de pacientes com câncer HLA-A2+ foram reveladas por IFN-y ELISPOT (Figura 4B). Além disso, a reatividade contra PD-L1 foi examinada em PBMC a partir de indivíduos saudáveis (Figura 4B). Embora as células T específicas de PD-L1 podem ser encontradas entre os indivíduos saudáveis PBMC parece ser menos frequente do que nos pacientes com câncer, embora um teste Mann-Whitney ilustrou que esta diferença não alcançou uma completa significância (P = 0.06). A fim de explicar os dados, oito pacientes respondendo são retratados em uma barra na figura 4C que que as respostas são comparadas aos antecedentes para cada paciente. O ELISPOT IFN-Yfoi realizado apenas em duplicata para guardar material e as respostas foram, consequentemente, apenas consideradas por uma abordagem empírica como sugerido pelas regras CIMT Immuno Guiding Program (CIP). Ainda examinados PBMC de pacientes respondendo a IFN-y de PD-L1 se as células específicas PD-L101 ainda liberaram a citocina TNF-α. Estes experimentos foram realizados em triplicata. Este pode ser visto a partir da figura 4D que as células específicas PD-L101 naturais em adição liberam TNF-α após a estimulação com o epítopo derivado de PD-L1. Em todos os oito pacientes a resposta TNF-α alcançou significância usando um teste de reamostragem livre de distribuição não paramétrico (DFR).

[0233] Em seguida, examinamos os três pacientes respondendo para a presença de células específicas de PD-L101 diretamente ex vivo sem uma estimulação de peptídeo in vitro. Um ELISPOT direto é exemplificado na Figura 5A. Enquanto a frequência de células T reativas PD-L1 são marcadamente aumentadas por uma estimulação in vitro, as células T reativas PD-L1 foram prontamente detectáveis ex vivo em pacientes selecionados (Figura 5B).

[0234] O PD-L101 foi examinado para sua capacidade de se ligar ao HLA-A2 pela comparação com dois epítopos de alta afinidade restritos HLA-A2, isto é, HIV-1 pol476484 (ILKEPVHGV) e CMV pp65 pos495-503 (NLVPMVATV) usando uma tecnologia de troca de peptídeo seguido por ELISA.

[0235] PD-L101 ligado ao HLA-A2 comparável ao epítopo de controle de alta afinidade (Figura 5C).

[0236] A alta afinidade de ligação de PD-L101 para HLA-A2 nos possibilita fazer tetrâmeros HLA-A2/PDL101 estáveis, que foram usados para detectar o CTL reativo a PDL1 por uma citometria de fluxo. Primeiro, colorimos o PBMC a partir de dois pacientes respondendo a PD-L101 com o tetrâmero específico HLA-A2/PD-L101 diretamente ex vivo. Estas células T reativas PD-L1 reveladas foram detectáveis ex vivo em ambos os pacientes (Figura 5D). Em ambos os pacientes uma estimulação de peptídeo in vitro aumentou marcadamente a frequência de células T específicas de PD-L1. Em seguida, usamos PBMC destes pacientes com câncer (CM.21 e MM.05) para gerar culturas de massa de célula T contra este peptídeo in vitro. Subsequentemente, o PBMC estimulado in vitro a partir de pacientes com DC autólogo pulsado de PDL101. Após três re-estimulações in vitro claras as células T positivas HLA-A2/PD-L101 foram detectáveis. 13,52% de células positivas de tetrâmero PD-L1 são obtidas usando células T de um paciente com câncer de mama e 0,17% de células T positivas de tetrâmero PD-L1 são obtidas usando células T de paciente com melanoma maligno (Figura 5D).

CÉLULAS T ESPECÍFICAS PD-L1 SÃO CTL

[0237] A função citolítica das culturas específicas PD-L1 foram testadas em ensaios de liberação 51Cr padrão usando células T2 deficientes TAP como células alvo tanto carregadas com PD-L101 quanto com um peptídeo de controle irrelevante de HIV. A figura 6A ilustra que as culturas de célula T de duas células T2 lisadas de pacientes diferentes pulsadas com PD-L101 eficazmente, enquanto nenhum citotóxico foi observado contra as células T2 pulsadas com o peptídeo irrelevante. Além disso, adicionado tanto o PD-L101 quanto o peptídeo HIV irrelevante diretamente a cultura de massa de célula T e analisado por um FACS. Isto revelou populações distintas de tetrâmeros+HLA-A2/PD-L101, células CD107a+ em culturas com PD-L101 adicionado (Figura 6B)

[0238] Em seguida, examinamos se as células T específicas PD-L101 presentes entre PBMC exibiram diretamente a função citotóxica. Desse modo, o PBMC de três pacientes com melanoma (MM.03, MM.53 e MM.135) todos hospedando células T liberando IFN-y, específico PD-L101 foram analisadas para outra reatividade contra PD-L101 usando a Granzyme B (GrB) ELISPOT. As respostas contra PD-L101 puderam ser detectadas em três pacientes (embora apenas dois alcançaram significância) com uma frequência em cerca de 100-300 células de liberação de GrB específico de PD-L101 por 5x105 PBMC (Figura 6C).

ATIVIDADE CITOLÓGICA CONTRA AS CÉLULAS DE MELANONA PD-L1+

[0239] Em seguida, examinamos a capacidade do CTL específico de PD- L101-para matar as células de melanoma PD-L1+ MM1312.07 e MM.909.06. Uma cultura CTL específica de PD-L101matou ambas as linhas de células, embora MM1312.07 só foi eficazmente morta em um efetor para almejar a proporção de 30:1 (Figura 7A). A cultura CTL foi altamente específica de PDL101. A expressão PD-L1 pelas duas linhas de célula de melanoma MM1312.07 e MM.909.06 foram examinadas por FACS. Ambas as linhas de células expressaram PD-L1, embora apenas a MM1312.07 exibiu uma expressão muito baixa. O tratamento IFN-Y aumentou a expressão PD-L1 em ambas as linhas de células (Figura 7B). Em concordância com este, o tratamento IFN-y aumentou a inativação de ambas as linhas de célula de melanoma (Figura 7A). Para aumentar a inativação do reconhecimento das células de melanoma, enriquecemos o CTL específico PD-L101 usando esferas magnéticas de tetrâmero HLA-A2/PD-L101 acopladas. A cultura CTL resultante consistia em cerca de 78% de células positivas de tetrâmeros e matou as linhas de célula de melanoma MM1312.07 e MM.909.06 com uma eficácia muito alta (Figura 7C).

LISE DEPENDENTE PD-L1 DE CÉLULAS DENDRÍTICAS

[0240] O PD-L1 pode ser induzido em células imunes. Desse modo, como a próxima e muito mais importante etapa, dirigimos a questão se DC maduro expressando PD-L1 também poderia ser suscetível para matar pela CTL reativa de PD-L1. Para testar esta noção, geramos um DC autólogo a partir dos mesmos doadores dos quais as culturas CTL tinham sido geradas; o DC foi maturado pela adição de um coquetel de maturação padrão consistindo em IL-1b, IL-6, TNF-α, e PGE2. Examinamos duas culturas CTL específicas PD-L101 diferentes geradas a partir de dois pacientes com câncer (Figura 8A e 8B). Ambas culturas CTL mataram eficazmente o DC maturado expressando PD-L1 (mDC) (Figura 8A e 8B). Adicionalmente, usando diferentes concentrações de siRNA PD-L1 regulamos para baixo a expressão de proteína PD-L1 no DC autólogo e resgatamos ali o DC de ser morto pelas culturas CTL específicas PD-L1 (Figura 8A e 8B). Como controle mDC foi transfectado com um meio siRNA de controle negativo GC. Estes DC foram mortos por ambas culturas de célula T específica PD-L101 (Figura 8A e 8B). A porcentagem de células positivas de tetrâmero PD-L101 entre as culturas de célula T matando mDC foram avaliados por uma coloração de tetrâmero. Os complexos de tetrâmeros HLA- A2/PD-L101-PE/APC e HLA-A2/HIVPE/APC foram usados. 46.92% e 71.69% de células positivas de tetrâmero PD-L101 entre as culturas de células T matando mDC foram identificadas (Figura 8A e 8B respectivamente). Para validar o inesperado de PD-L1 no nível de proteína, analisamos a expressão de superfície PD-L1 em mDC 24horas após a transfecção de siRNA (Figura 8C). Estas colorações confirmaram que o uso de siRNA PD-L1 reduziu o nível da expressão de proteína PD-L1 nas células (Figura 8C) em uma maneira dependente de concentração. Notavelmente, a eficácia da inativação correlatada com a quantidade de PD-L1 expresso pelo DC.

APRESENTAÇÃO CRUZADA INDEPENDENTE TAP DE PD-L1 POR CÉLULAS APRESENTADORAS DE ANTÍGENO NÃO PROFISSIONAL

[0241] Analisamos dois polipeptídeos longos de PD-L1; PDL19-28 (FMTYWHLLNAFTVTVPKDL) intitulado "PDLong1" e PDL1242-264 (VILGAILLCLGVALTFIFRLRKG) intitulado "PDLong2". Apenas o primeiro (PDLong1) incluía a sequência de PD-L101 (PDL115-23; LLNAFTVTV). O CTL específico PD-L101 foi testado contra a linha de células B transformadas EBV HLA-A2+ KIG-BCL pulsada com PD-L101, PDLong1, PDLong2 ou um peptídeo HIV irrelevante. As células B pulsadas não apenas com o peptídeo PD-L101 mínimo, mas em adição com o peptídeo PDLong1 foram reconhecidos pelo CTL específico de PD-L101, enquanto que as células B puladas tanto com os peptídeos de controle de HIV quanto com PDLong2 não foram mortos (Figura 9A). As células KIG-BCL não expressaram PD-L1 (Figura 9D). Similarmente, examinamos a capacidade das células do peptídeo PD-L1 longo. Desse modo, o CTL específico PD-L101 foi testado contra as células T2 pulsadas com PD-L101, PDLong1, PDLong2 ou o peptídeo HIV. Apesar da ausência dos transportadores TAP nas células T2, o peptídeo PDL01 foi eficazmente apresentado pelas células T2, uma vez que foram mortas pelo CTL específico PD- L101 (Figura 9B). A inativação foi restrita a HLA-A2, já que poderia ser bloqueado pela adição de anticorpos anti HLA-A2 (Figura 9C). As células T2 não expressaram PD-L1 (Figura 9D). Finalmente, avaliamos se o CTL específico PD-L101 reconheceu as células T2 ou KIG-BCL pulsadas com uma proteína de comprimento completo por pelo menos 3 horas. KIG-BCL não foi aparentemente capaz de aparecer em cruz da proteína de comprimento completo, uma vez que estas células não foram reconhecidas (Figura 9). Surpreendentemente, entretanto, as células T pulsadas com a proteína de comprimento completo foram reconhecidas e mortas pelo CTL específico de PD-L101 (Figura 9B). Desse modo, as células T2 foram capazes não apenas de assumir, processar e apresentar PDLong1, mas além disso a proteína PD- L1 recombinante de comprimento completo.

EXEMPLO 4

[0242] Para investigar se a co-estimulação com peptídeo PD-L1 impulsionaria a reatividade de célula T contra os antígenos associados a tumor e virais qualquer um dos seguintes experimentos foram realizados.

CO-CULTURA COM CÉLULAS T ESPECÍFICAS PD-L1 AUTÓLOGAS

[0243] PBMC foram estimulados in vitro com 50 μg/ml de peptídeo viral (CMV pp65495-503 NLVPMVATV), CMV IE1 316-324 (VLEETSVML) ou Flu matrix p58-66 (GILGFVFTL)). 40 U/ml IL-2 foram adicionados no dia 2 e 6. O PBMC foi tanto cultivado sozinho quanto adicionado a células T específicas PD-L1 autólogas (em um PBMC para uma proporção de célula T específica de PD-L1 de 2000:1) no dia 6. No dia 9, as culturas foram estimuladas com 120 U/ml IL-2. Após 12 dias em cultura, o número de células T específicas de vírus nas culturas, tanto cultivadas sozinhas quanto adicionadas a células T específicas de PD-L1, foram comparadas por uma coloração de tetrâmero MHC. O número de Tregs, IL-17A produzindo células T e a proporção de célula CD4/CD8 nas culturas também foram comparadas. Como um controle, o PBMC foi co-culturado com células T CD8+autólogas de especificidade irrelevante.

CO-ESTIMULAÇÃO COM PEPTÍDEO PD-L1

[0244] PBMC foram estimulados in vitro com 25 μg/ml de antígeno associado a tumor ou vírus (CMV pp65465-563 (NI-VPMVATV), CMV IE1316-324 (VLEETSVML), ou MART-126-35 (EAAGIGILTV)), tanto na co-cultura com 25 μg/mI de peptídeo PD- L1 ou um peptídeo irrelevante (HIV-1 pol476-484 (ILKEPVHGV)). 40 U/ml IL-2 foi adicionado a cada três dias. A cada sete dias, as culturas foram estimuladas com uma mistura de peptídeo CMV- ou MART-1 mais um peptídeo PD-L1, ou uma mistura de peptídeo CMV ou MART-1 mais o peptídeo HIV-1 pol476-484, respectivamente. As células foram estimuladas com peptídeos diluídos em 10-, 100-, e 1000 vezes para a segunda, Terceira e quarta estimulação de peptídeo, respectivamente. Após três ou quarto estimulações, o número de células T específicas CMV- ou MART-1 nas culturas, tanto co-culturadas com peptídeo PD-L1 ou peptídeo de HIV-1 pol476-484, foi comparada pela coloração de tetrâmero HC. O número de Tregs, IL-17A produzindo células T e a proporção de células CD4/CD8 nas culturas também foram comparados.

Claims (7)

1. Composição de vacina CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: a) um fragmento de peptídeo imunologicamente ativo compreendendo uma sequência consecutiva de pelo menos 8 aminoácidos do PD-L1 da SEQ ID NO: 1 e que compreende a sequência de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 12 ou 15, ou a sequência de VILGAILLCLGVALTFIFRLRKG; e b) um adjuvante.

2. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o fragmento de peptídeo imunologicamente ativo consiste em no máximo 50 resíduos de aminoácidos, por exemplo, no máximo 45 resíduos de aminoácidos, tal como no máximo 40 resíduos de aminoácidos, por exem-plo, no máximo 35 resíduos de aminoácidos, tal como no máximo 30 resíduos de ami- noácidos, por exemplo, no máximo 25 resíduos de aminoácidos, tal como de 20 a 25 resíduos de aminoácidos.

3. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito fragmento de peptídeo imunologicamente ativo compreende a sequência FMTYWHLLNAFTVTVPKDL.

4. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o adjuvante é selecionado a partir do grupo consistindo em adjuvantes com base em DNA bacteriano, adjuvantes com base em óleo/surfactante, adjuvantes com base em dsRNA viral e imidazoquinilinas.

5. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição de vacina compreende células apresentadoras de antígeno compreendendo o fragmento de peptídeo imunologica- mente ativo ou um ácido nucléico codificando o dito fragmento de peptídeo imunolo- gicamente ativo.

6. Kit de partes CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) a composição de vacina, como definida em qualquer uma das reivindica-ções 1 a 5; e b) uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo imunoestimu- lante.

7. Uso da composição de vacina, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou do kit de partes, conforme definido na reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de câncer, o qual expressa PD-L1.

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