CN110430893A

CN110430893A - 用于癌症免疫疗法的新型的靶向pd-l1的dna疫苗

Info

Publication number: CN110430893A
Application number: CN201880018761.6A
Authority: CN
Inventors: 海因茨·卢本奥
Original assignee: Si Meng Limited-Liability Co Of Wanke
Current assignee: Si Meng Limited-Liability Co Of Wanke; Vaximm AG
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2018-03-16
Publication date: 2019-11-08
Also published as: JP7247097B2; US20200085928A1; US20220273782A1; CA3056807A1; JP2020511139A; WO2018167290A1; MX2019011026A; RU2019132253A; US11357842B2; SG11201908528UA; IL268677A; BR112019019251A2; EP3595704A1; KR20190125481A; AU2018235153A1; JP2023021116A

Abstract

本发明涉及沙门氏菌减毒株，其包含含有编码PD‑L1的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝。特别地，本发明涉及用于治疗癌症的所述沙门氏菌减毒株。

Description

用于癌症免疫疗法的新型的靶向PD-L1的DNA疫苗

技术领域

本发明涉及沙门氏菌减毒株，其包含含有编码PD-L1的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝。特别地，本发明涉及用于治疗癌症的所述沙门氏菌减毒株。

背景技术

免疫系统的一个重要特征是其区分“自我”和“外来”的能力。为此，它使用“检查点”—需要被激活(或失活)以开始免疫应答的某些免疫细胞上的分子。

原则上，免疫系统具有识别和破坏肿瘤细胞的能力。T细胞似乎是抗癌免疫的主要效应物。然而，许多肿瘤形成了逃避免疫系统以增强其存活的机制。免疫调节蛋白如检查点蛋白及其配体在免疫抑制和抗癌免疫应答的耐受诱导中起重要作用。

程序性细胞死亡1(PD-1)在T细胞表面上表达，并传递维持针对同源抗原的T细胞功能性沉默的抑制信号。其配体PD-L1通常在炎性微环境中的抗原呈递细胞、胎盘细胞和非造血细胞上表达。据报道，PD-L1在免疫抑制性骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)上表达。此外，PD-L1在各种类型的癌细胞表面广泛表达，这些癌细胞使用PD-1/PD-L1信号传导轴来逃避宿主免疫系统。据显示，癌细胞表达PD-L1与疾病阶段和不良患者预后相关。

在评估几种单克隆抗PD-1和抗PD-L1抗体(其通过抑制PD-L1与PD-1的结合起作用)的临床试验中已经证实了靶向PD-L1/PD-1信号传导途径的潜力。这些抗体旨在释放或增强预先存在的抗癌免疫应答。目前在患者中在临床试验中研究了不同的药剂，如在各种实体瘤和血液系统恶性肿瘤中研究的Opdivo(nivolumab，一种抗PD-1抗体)，在各种实体瘤和血液系统恶性肿瘤中研究的pembrolizumab(Keytruda，一种抗PD-1抗体)，在化疗诱导缓解后在AML中与树突细胞疫苗联合使用的CT-011(抗-PD-1)，和复发、难治或高风险未治疗的CLL患者中与利妥昔单抗联合使用的lirilumab(抗KIR)。此外，包括atezolizumab、avelumab或durvalumab在内的抗PD-L1单克隆抗体在各种癌症适应症中处于晚期临床开发阶段。

仅在最近，才描述了PD-L1特异性T细胞的存在。

WO 2013/056716公开了HLA(人白细胞抗原)-A2限制性PD-L1肽疫苗。

WO 2014/005683公开了一种用于癌症免疫疗法，特别是用于治疗胰腺癌的沙门氏菌减毒突变株，所述沙门氏菌减毒突变株包含编码VEGF受体蛋白的重组DNA分子。

WO 2016/202459公开了一种癌症治疗方法，其包括联合施用沙门氏菌的减毒突变株和检查点抑制剂抗体，所述沙门氏菌的减毒突变株包含编码VEGF受体蛋白的重组DNA分子。

据发明人所知，没有报道过以诱导直接靶向PD-L1阳性肿瘤细胞的PD-L1特异性细胞毒性免疫细胞为目的的靶向PD-L1的细菌DNA疫苗。此外，没有描述过靶向PD-L1的口服癌症疫苗。

发明目的

鉴于现有技术，本发明的目的是提供一种新的安全有效的靶向PD-L1的癌症治疗方法。这种新型治疗方法将为改善癌症患者的治疗选择提供大的优势。

发明内容

本发明基于以下令人惊讶的发现：基于沙门氏菌的DNA递送载体在有播散性同系FBL-3红白血病的C57BL/6小鼠中表现出高抗肿瘤效力，其中所述基于沙门氏菌的DNA递送载体携带重组DNA构建体，所述重组DNA构建体编码全长PD-L1或包含PD-L1的细胞外结构域的截短PD-L1。

因此，在第一方面，本发明涉及沙门氏菌减毒株，其包含含有编码PD-L1的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝。

在具体实施方案中，沙门氏菌减毒菌株是肠道沙门氏菌物种。特别地，所述沙门氏菌减毒株是伤寒沙门氏菌Ty21a。

在具体实施方案中，表达盒是真核表达盒。特别地，所述表达盒包含CMV启动子。

在具体的实施方案中，PD-L1选自由以下组成的组：全长PD-L1和包含PD-L1的细胞外结构域的截短的PD-L1。截短的PD-L1可包含SEQ ID NO 13的氨基酸19至238的氨基酸序列、SEQ ID NO 13的氨基酸序列、SEQ ID NO 2的氨基酸序列，或者可以包含与SEQ ID NO13的氨基酸19至238、与SEQ ID NO13或与SEQ ID NO 2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在具体的实施方案中，PD-L1选自由以下组成的组：具有如SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的PD-L1以及与其具有至少80％序列一致性的蛋白。在具体的其他实施方案中，PD-L1选自由以下组成的组：具有如SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的PD-L1以及与其具有至少80％序列一致性的蛋白。在具体的其他实施方案中，PD-L1选自由以下组成的组：具有如SEQ ID NO13所示氨基酸序列的PD-L1以及与其具有至少80％序列一致性的蛋白。在具体的其他实施方案中，PD-L1选自由以下组成的组：具有如SEQ ID NO 13的氨基酸19至238的氨基酸序列的PD-L1以及与其具有至少80％序列一致性的蛋白。特别地，PD-L1具有如SEQ ID NO 1、SEQID NO 2或SEQ ID NO 13中所示的氨基酸序列，优选地，PD-L1包含SEQ ID NO 13的氨基酸19至238的氨基酸序列。在一个实施方案中，PD-L1至少包含具有或不具有信号肽的细胞外结构域。

在具体实施方案中，PD-L1由SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 14中所示的核酸序列编码。

在具体实施方案中，所述DNA分子还包含卡那霉素抗生素抗性基因、pMB1ori和CMV启动子。特别地，所述DNA分子还包含如SEQ ID NO 5所示的DNA序列。

在第二方面，本发明涉及用作药物的根据本发明所述的沙门氏菌减毒菌株。

在具体实施方案中，沙门氏菌减毒菌株用于治疗癌症。

在具体实施方案中，沙门氏菌减毒菌株用于癌症免疫疗法。

在具体实施方案中，癌症的治疗方法还包括化学疗法、放射疗法或生物癌症疗法。特别地，所述沙门氏菌减毒株在化疗或放疗治疗或生物癌症疗法之前、期间和/或之后施用。更特别地，所述沙门氏菌减毒株在化疗或放疗治疗或生物癌症疗法之前和期间施用。

在具体实施方案中，生物癌症疗法包括施用编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的至少一种另外的DNA疫苗。在具体实施方案中，所述至少一种另外的DNA疫苗选自至少一种沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝。这包括至少一种另外的DNA疫苗，所述另外的DNA疫苗包含含有编码肿瘤抗原的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝，和/或至少一种另外的DNA疫苗，所述另外的DNA疫苗包含含有编码肿瘤基质抗原的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝。特别地，所述至少一种另外的沙门氏菌减毒菌株是包含真核表达盒的伤寒沙门氏菌Ty21a。

在一个实施方案中，所述肿瘤抗原选自肾母细胞瘤蛋白(Wilms’Tumor Protein，WT1)、间皮素(MSLN)、癌胚抗原(CEA)和CMV pp65。在具体实施方案中，由所述至少一种另外的DNA疫苗编码的所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：具有如SEQ ID NO 6中所示氨基酸序列的肾母细胞瘤蛋白(WT1)和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO7中所示氨基酸序列的间皮素(MSLN)和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 8中所示氨基酸序列的CEA和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 9中所示氨基酸序列的CMV pp65和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 10中所示氨基酸序列的CMV pp65和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质和具有如SEQ ID NO 11中所示氨基酸序列的CMV pp65和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质。特别地，肾母细胞瘤蛋白(WT1)具有如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列，间皮素(MSLN)具有如SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列，CEA具有如SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列，并且CMV pp65具有如SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述肿瘤基质抗原是VEGFR-2或成纤维细胞活化蛋白(FAP)，优选VEGFR-2。特别地，由所述至少一种另外的DNA疫苗编码的所述肿瘤基质抗原选自由如下组成的组：具有如SEQ ID NO12所示氨基酸序列的人VEGFR-2及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白，和人成纤维细胞活化蛋白(FAP)。特别地，VEGFR-2具有如SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列。

在具体实施方案中，沙门氏菌减毒株通过口服施用。

在具体实施方案中，癌症选自淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肺癌特别是非小细胞肺癌(NSCLC)、黑素瘤、肾细胞癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、merkel细胞癌、膀胱癌、头颈癌、结直肠癌、食道癌、宫颈癌、胃癌、肝细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌和甲状腺癌。

在具体实施方案中，单剂量的沙门氏菌减毒株包含约10⁵至约10¹¹，特别是约10⁶至约10¹⁰，更特别是约10⁶至约10⁹，更特别是约10⁶至约10⁸，最特别是约10⁶至约10⁷个菌落形成单位(CFU)。

在具体实施方案中，所述沙门氏菌减毒株用于包括以下步骤的个体化的癌症免疫疗法：评估患者的PD-L1表达模式和/或针对PD-L1的免疫前应答。

具体实施方式

在第一方面，本发明涉及沙门氏菌减毒株，其包含含有编码PD-L1的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝。

本发明的减毒活沙门氏菌菌株稳定地携带编码PD-L1的重组DNA分子。它可以用作经口递送这种重组DNA分子的载体。

在本发明的背景中，术语“减毒”是指与不具有减毒突变的亲本细菌菌株相比毒性降低的细菌菌株。优选地，减毒细菌菌株丧失了其毒力，但保留了其诱导保护性免疫的能力。减毒可通过删除各种基因，包括毒力、调节和代谢基因实现。减毒细菌可以天然存在，或者可以在实验室中人工生产，例如通过使其适应新的培养基或细胞培养物，或者它们可以通过重组DNA技术生产。施用约10¹¹CFU的本发明的沙门氏菌减毒株在优选地小于5％，更优选小于1％，最优选小于1‰受试者中引起沙门氏菌病。

在本发明的背景中，术语“包含”(comprises)或“包含”(comprising)意指“包括但不限于”。该术语旨在是开放式的，旨在具体说明任何记载的特征、元件、整体、步骤或组分的存在，但并不排除一种或多种其他特征、元件、整体、步骤、组分或其组的存在或添加。因此，术语“包含”包括更限制性的术语“由......组成”和“基本上由......组成”。在一个实施方案中，在整个申请中，特别是在权利要求中使用的术语“包含”可以由术语“由......组成”代替。

含有编码PD-L1的表达盒的DNA分子合适地是重组DNA分子，即工程化的DNA构建体，优选由不同来源的DNA片段组成。DNA分子可以是线性核酸，或者优选地，是通过将编码PD-L1的开放阅读框引入表达载体质粒而产生的环状DNA质粒。合适的表达载体质粒例如但不限于pVAX1^TM(Invitrogen，San Diego，California)或pcDNATM3.1(Invitrogen，SanDiego，California)，或由其衍生的表达载体质粒。表达载体质粒可含有高拷贝复制起点(origin)，例如pUC ori，或低拷贝复制起点，例如pMB1 ori。

在本发明的背景中，术语“表达盒”是指包含至少一个开放阅读框(ORF)的核酸单位，所述开放阅读框在控制其表达的调节序列的控制下。优选地，表达盒可以介导靶细胞中所包括的编码重组蛋白(如PD-L1)的开放阅读框的转录。表达盒通常包含启动子、至少一个开放阅读框和转录终止信号

在具体实施方案中，沙门氏菌减毒菌株是肠道沙门氏菌物种。肠道沙门氏菌的减毒衍生物是将外源抗原递送至哺乳动物免疫系统的有吸引力的载体，因为肠道沙门氏菌菌株可能通过免疫的粘膜途径(即经口或经鼻)递送，其与肠胃外施用相比提供了简单和安全的优点。此外，沙门氏菌菌株在全身和粘膜隔室的水平均引发强烈的体液和细胞免疫应答。批量制备的成本低，并且活菌疫苗制剂非常稳定。减毒可通过删除各种基因，包括毒力、调节和代谢基因来实现。

已显示，几种通过aro突变而减毒的鼠伤寒沙门氏菌菌株是动物模型中安全有效的外源抗原递送载体。

在具体实施方案中，沙门氏菌减毒株是伤寒沙门氏菌Ty21a。减毒活伤寒沙门氏菌Ty21a菌株是Typhoral的活性成分，Typhoral也称为(由Crucell在瑞士的公司Berna Biotech有限责任公司制造)。它是目前唯一获得许可的抗伤寒热口服活疫苗。这种疫苗已经被广泛测试，并已被证明在患者毒性以及向第三方传播方面是安全的(Wahdan等人，Wahdan等人,J.Infectious Diseases 1982,145:292-295)。该疫苗已在40多个国家获得许可，并已用于数百万人的抗伤寒热预防性疫苗接种中，包括数千名儿童。它拥有空前的安全记录。没有可获得的数据表明伤寒沙门氏菌Ty21a能够系统性地进入血液。因此，减毒活伤寒沙门氏菌Ty21a疫苗菌株能够在肠道中特异性靶向免疫系统，同时安全且耐受性良好。Typhoral的销售许可证编号为PL 15747/0001，日期为1996年12月16日。一个剂量的疫苗含有至少2×10⁹个活伤寒沙门氏菌Ty21a菌落形成单位和至少5×10⁹个失活的伤寒沙门氏菌Ty21a细胞。

这种耐受性良好的、活体口服抗伤寒热疫苗是通过对野生型毒性细菌分离株伤寒沙门氏菌Ty2的化学诱变衍生的，并且含有galE基因功能缺失性突变，导致其不能代谢半乳糖。减毒细菌菌株也不能将硫酸盐还原成硫化物，从而将其与野生型伤寒沙门氏菌Ty2菌株区分开来。关于其血清学特征，伤寒沙门氏菌Ty21a菌株含有O9-抗原(其是细菌外膜的多糖)并且缺乏O5-抗原(其是鼠伤寒沙门氏菌的特征性成分)。该血清学特征支持将相应的测试包括在一组对批量释放的识别测试中的基本原理。

在具体实施方案中，表达盒是真核表达盒。特别是，所述表达盒包含CMV启动子。在本发明的背景中，术语“真核表达盒”是指允许真核细胞中开放阅读框表达的表达盒。已显示，诱导足够的免疫应答所需的外源抗原的量对细菌可能是有毒性的，并可能导致细胞死亡、过度减毒或外源抗原表达缺失。使用在细菌载体中不表达而仅在靶细胞中表达的真核表达盒可以克服这一毒性问题，并且所表达的蛋白通常呈现出真核糖基化模式。

真核表达盒包含能够控制开放阅读框在真核细胞中表达的调控序列，优选为启动子和聚腺苷酸化信号。本发明沙门氏菌减毒株所包含的重组DNA分子所包括的启动子和聚腺苷酸化信号优选选择为在待免疫的受试者的细胞内起作用。合适的启动子，特别是用于生产人类DNA疫苗的实例包括但不限于来自巨细胞病毒(CMV)的启动子，如强CMV立即早期启动子；猿猴病毒40(SV40)；小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)；人类免疫缺陷病毒(HIV)，如HIV长末端重复(LTR)启动子；莫洛尼病毒；爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)；以及来自劳氏肉瘤病毒(RSV)；由CMV早期增强子元件、鸡β-肌动蛋白基因的启动子、第一外显子和第一内含子，以及兔β珠蛋白基因的剪接受体组成的合成CAG启动子；以及来自人类基因如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人类金属硫蛋白的启动子。在一个具体实施方案中，所述真核表达盒含有CMV启动子。在本发明的背景中，术语“CMV启动子”是指强立即早期巨细胞病毒启动子。

合适的聚腺苷酸化信号，特别是用于生产人类DNA疫苗的聚腺苷酸化信号的实例包括但不限于牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化位点、SV40聚腺苷酸化信号和LTR聚腺苷酸化信号。在一个具体实施方案中，本发明沙门氏菌减毒株所包含的重组DNA分子所包括的真核表达盒包含BGH聚腺苷酸化位点。

除了异源基因表达所需的调控元件，如启动子和聚腺苷酸化信号之外，重组DNA分子中还可包含其他元件。这种其他元件包括增强子。增强子可以是例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸的增强子和病毒增强子如来自CMV、RSV和EBV的增强子。

调控序列和密码子通常是物种依赖的，因此为了使蛋白生产最大化，调控序列和密码子优选选择为在待免疫的物种中有效。本领域技术人员可以生产在给定受试者物种中有功能的重组DNA分子。

在一个实施方案中，PD-L1选自由以下组成的组：全长PD-L1和包含PD-L1的细胞外结构域的截短的PD-PD-L1。截短的PD-L1可包含SEQ ID NO 13的氨基酸19至238的氨基酸序列、SEQ ID NO 13的氨基酸序列、SEQ ID NO 2的氨基酸序列，或者可以包含与SEQ ID NO13的氨基酸19至238、与SEQ ID NO 13或与SEQ ID NO 2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在具体实施方案中，PD-L1选自由以下组成的组：具有如SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的PD-L1以及与其具有至少80％序列一致性的蛋白。在具体的其他实施方案中，PD-L1选自由以下组成的组：具有如SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的PD-L1以及与其具有至少80％序列一致性的蛋白。在其他具体实施方案中，PD-L1选自由以下组成的组：具有如SEQ ID NO 13所示氨基酸序列的PD-L1以及与其具有至少80％序列一致性的蛋白。在具体的其他实施方案中，PD-L1选自由以下组成的组：具有如SEQ ID NO 13的氨基酸19至238的氨基酸序列的PD-L1以及与其具有至少80％序列一致性的蛋白。特别地，PD-L1具有如SEQ ID NO 1、SEQID NO2或SEQ ID NO 13中所示的氨基酸序列，优选地，PD-L1包含SEQ ID NO 13的氨基酸19至238的氨基酸序列。在一个实施方案中，PD-L1至少包含具有或不具有信号肽的细胞外结构域。

在这一背景下，术语“约”或“近”是在给定值或范围的80％至120％以内，或者90％至110％以内，包括95％至105％以内。

在本发明的背景中，术语“与给定蛋白质序列(例如，具有如SEQ ID NO 1、2或13中所示氨基酸序列的PD-L1)具有至少约80％序列一致性的蛋白质”指的是与所述参照蛋白(例如，具有如SEQ ID NO 1、2或13中所示氨基酸序列的PD-L1)的氨基酸序列和/或编码该氨基酸序列的核酸序列可能不同的蛋白质。所述蛋白可以是天然来源的，例如野生型蛋白的突变形式，例如野生型PD-L1的突变形式，或不同物种的同源物，或工程化的蛋白，例如工程化的PD-L1。已知密码子的使用在物种之间是不同的。因此，当在靶细胞中表达外源蛋白时，使核酸序列适应靶细胞的密码子使用可能是必要的或至少是有帮助的。

用于设计和构建给定蛋白的衍生物的方法是本领域任一普通技术人员所熟知的。与参照蛋白序列(例如，具有SEQ ID NO 1、2或13的氨基酸序列的PD-L1)相比，与给定蛋白质序列(例如，具有SEQ ID NO 1、2或13的氨基酸序列的PD-L1)具有至少约80％序列一致性的蛋白质可以含有包含一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的一个或多个突变。相同情况适用于具有SEQ ID NO 13的氨基酸19至238的氨基酸序列的PD-L1。所述包含一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的一个或多个突变包扩在SEQ ID NO 1、2、13或SEQ ID NO13的氨基酸19至238的的氨基酸序列中的少于10个突变、少于9个突变、少于8个突变、少于7个突变、少于6个突变、少于5个突变、少于4个突变、少于3个突变、少于2个突变或一个突变。根据本发明的教导，所述缺失、添加和/或取代的氨基酸可以是连续的氨基酸，或者可以散布在与参照蛋白(例如，具有SEQ ID NO 1、2、13或SEQ ID NO 13的氨基酸19至238的氨基酸序列的PD-L1)具有至少约80％序列一致性的蛋白的氨基酸序列的长度上。根据本发明的教导，只要与参照蛋白的氨基酸序列一致性至少约80％，则可以添加、缺失和/或取代任意数目的氨基酸。优选地，突变的蛋白质是免疫原性的。优选地，与参照蛋白(例如，具有SEQ IDNO 1、2、13或SEQ ID NO 13的氨基酸19至238的氨基酸序列的PD-L1)相比，与给定的参照蛋白(例如，具有SEQ ID NO 1、2、13或SEQ ID NO 13的氨基酸19至238的氨基酸序列的PD-L1)具有至少约80％序列一致性的蛋白的免疫原性减少了小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％。免疫原性可以例如通过ELISA测量。用于设计和构建蛋白同源物和用于测试这些同源物的免疫原性潜力的方法是本领域普通任一技术人员所熟知的。在具体的实施方案中，与参照蛋白(例如，具有SEQ ID NO 1、2、13或SEQ ID NO 13的氨基酸19至238的氨基酸序列的人PD-L1)的序列一致性为至少约80％，至少约85％，至少约90％或最特别是至少约95％。用于测定序列一致性包括比较亲本蛋白与其相对于亲本序列具有缺失、添加和/或取代的衍生物的方法和算法，是本领域普通技术人员公知的。在DNA水平上，由于遗传密码的简并性，编码与给定参照蛋白(例如，具有SEQ ID NO 1、2、13或SEQID NO 13的氨基酸19至238的氨基酸序列的PD-L1)具有至少约80％序列一致性的蛋白的核酸序列可能在很大程度上不同。

在具体实施方案中，所述DNA分子包含卡那霉素抗生素抗性基因、pMB1 ori和CMV启动子。在具体实施方案中，重组DNA分子来源于市售的pVAX1TM表达质粒(Invitrogen，SanDiego，California)。通过用pBR322的低拷贝pMB1复制起点取代高拷贝pUC复制起点来改造该表达载体。进行低拷贝修饰是为了降低代谢负担并使构建体更稳定。将产生的表达载体骨架命名为pVAX10。

在具体实施方案中，所述DNA分子还包含如SEQ ID NO 5所示的DNA序列(载体骨架pVAX10)。

通过NheI/XhoI将编码人PD-L1(具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列)的ORF插入到表达载体骨架中，得到表达质粒pVAX10.PD-L1h。包含携带有表达质粒pVAX10.PD-L1h的减毒沙门氏菌菌株Ty21a的DNA疫苗被命名为VXM10h。通过NheI/XhoI将编码人PD-L1(具有SEQID NO 2的氨基酸序列)的ORF插入到表达载体骨架中，得到表达质粒pVAX10.PD-L1ha。包含携带有表达质粒pVAX10.PD L1ha的减毒沙门氏菌菌株Ty21a的DNA疫苗被命名为VXM10ha。通过NheI/XhoI将编码人PD-L1(具有SEQ ID NO 13的氨基酸序列)的ORF插入到表达载体骨架中，得到表达质粒pVAX10.PD-L1hb。包含携带有表达质粒pVAX10.PD-L1hb的减毒沙门氏菌菌株Ty21a的DNA疫苗被命名为VXM10hb。

编码PD-L1的沙门氏菌减毒株可以在药物组合物中提供。药物组合物可以是溶液、悬浮液、肠溶包衣胶囊、冻干粉末或适用于预期用途的任意其他形式。

药物组合物还可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。

在本发明的背景中，术语“赋形剂”是指与药物的活性成分一起制剂的天然或合成物质。合适的赋形剂包括抗粘剂、粘合剂、包衣、崩解剂、调味剂、着色剂、润滑剂、助流剂、吸收剂、防腐剂和甜味剂。

在本发明的背景中，术语“药学上可接受的”是指，当施用于哺乳动物(例如人)时生理上可耐受的并且通常不产生不利反应的药物组合物的分子物质和其他成分。术语“药学上可接受的”还可以表示由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于哺乳动物，更特别是用于人的。

在具体实施方案中，药物组合物作为饮用溶液提供。该实施例的患者依从性有所改善，并且使得可以进行快速、可行且实惠的大规模疫苗接种。

特别是，合适的饮用溶液包含将胃酸至少中和至某一程度，即，使胃液的pH接近pH7的手段。在一个具体实施方案中，饮用溶液是缓冲悬浮液，所述缓冲悬浮液通过使本发明的沙门氏菌减毒株悬浮在合适的缓冲液中而获得，优选地，悬浮在将胃酸至少中和至某一程度的缓冲液中而获得，优选地，悬浮在含有2.6g碳酸氢钠、1.7g L-抗坏血酸酸、0.2g乳糖一水合物和100ml饮用水的缓冲液中而获得。

在第二方面，本发明涉及根据本发明的沙门氏菌减毒菌株用作药物。

在具体实施方案中，沙门氏菌减毒菌株用于癌症的治疗。

在具体实施方案中，沙门氏菌减毒菌株用作疫苗。

在具体实施方案中，沙门氏菌减毒菌株用于癌症免疫疗法。

不希望受理论束缚的，据信与通过阻止PD-L1配体与PD-1结合来介导检查点抑制的单克隆抗PD-1和抗PD-L1抗体相反，根据本发明的沙门氏菌减毒株引发PD-L1特异性T细胞应答，导致PD-L1阳性肿瘤细胞的破坏。另外，特别是在仅使用人PD-L1(SEQ ID NO 13)的细胞外结构域的情况下，如在质粒pVAX10.PD-L1hb的使用中，所表达的基于PD-L1的蛋白质产物可以被分泌，并且可以产生抗PD-L1抗体应答，这可以进一步支持本发明方法的治疗效果。不受理论束缚的，使用缺乏信号肽的截短的人PD-L1，例如，包含SEQ ID NO 2(如在质粒pVAX10.PD-L1ha的使用中)和SEQ ID NO 13的氨基酸19至238(相当于PD-L1的细胞外结构域)的氨基酸序列的截短的人PD-L1，所表达的基于PD-L1的蛋白质产物可以在细胞质中积累，并且可以产生针对PD-L1的增强的细胞毒性T细胞应答，这可以进一步支持本发明方法的治疗效果。因此，在一个实施方案中，PD-L1至少包含具有或不具有信号肽的PD-L1的细胞外结构域。

根据本发明，所述沙门氏菌减毒株作为含有编码PD-L1的表达盒的重组DNA分子的细菌载体起作用，用于将所述重组DNA分子递送到靶细胞中。含有编码异源抗原(如PD-L1)的DNA分子的递送载体被称为DNA疫苗。

在本发明的背景中，术语“疫苗”是指在施用后能够在受试者中诱导免疫应答的药剂。优选地，疫苗可以预防、改善或治疗疾病。

基因免疫可能优于常规疫苗接种。靶DNA可以在相当长的一段时间内被检测到，从而充当抗原的储库。一些质粒中的序列基序，如GpC岛，是免疫刺激性的，并且可以作为由LPS和其他细菌组分引起的免疫刺激所促进的佐剂。

活减毒沙门氏菌载体在原位产生它们自己的免疫调节因子如脂多糖(LPS)，这可能与其他形式的施用(例如微胶囊化)相比构成优势。此外，根据本发明所述的粘膜疫苗具有淋巴内作用模式，这被证明是有益的。摄入本发明的减毒疫苗后，肠道派伊尔结中的巨噬细胞和其他细胞被修饰的细菌侵入。细菌被这些吞噬细胞摄取。由于它们的减毒突变，伤寒沙门氏菌Ty21菌株细菌不能保持在这些吞噬细胞中，而是在这个时间点死亡。重组DNA分子被释放，并随后通过特定的转运系统或通过内体泄露(endosomal leakage)转移到免疫吞噬细胞的胞质溶胶中。最后，重组DNA分子进入细胞核，在那里它们被转录，导致在吞噬细胞的细胞质中大量表达PD-L1，并且可能，特别是在仅使用人PD-L1(SEQ ID NO 13)的细胞外结构域的情况下，如在质粒pVAX10.PD-L1hb的使用中，在基于PD-L1的蛋白质产物的分泌中。被感染的细胞经历细胞凋亡，装载PD-L1抗原，并被肠道免疫系统摄取和加工。细菌感染的危险信号在此过程中充当强力佐剂，导致在全身和粘膜隔室水平上产生强烈的靶抗原特异性CD8+T细胞和抗体应答。免疫应答在接种后十天左右达到峰值。抗载体应答的缺乏使得可多次使用相同疫苗来强化。此外，基于PD-L1的蛋白质产物的分泌可以产生抗PD-L1抗体应答，这可以进一步支持本发明方法的治疗效果。

在具体实施方案中，癌症的治疗方法还包括化学疗法、放射疗法或生物癌症疗法。特别地，所述沙门氏菌减毒株在化疗或放疗治疗或生物癌症疗法之前、期间和/或之后施用。更特别地，所述沙门氏菌减毒株在化疗或放疗治疗或生物癌症疗法之前和期间施用。为了治愈癌症，彻底根除癌症干细胞可能是必要的。为获得最大效力，联合不同的治疗方法可能是有益的。

在本发明的背景中，术语“生物癌症疗法”是指这样的癌症疗法，所述癌症疗法涉及使用活生物体(包括细菌和病毒)、源自活生物体的物质或这些物质的实验室生产形式。一些癌症的生物疗法旨在刺激身体的免疫系统以对抗癌细胞(所谓的生物癌症免疫疗法)。生物癌症治疗方法包括递送肿瘤抗原和肿瘤基质抗原(例如通过基于沙门氏菌的DNA疫苗，特别是基于伤寒沙门氏菌Ty21a的DNA疫苗)、递送作为药物的治疗性抗体、施用免疫刺激性细胞因子和施用免疫细胞(包括工程化T细胞)。治疗性抗体包括靶向肿瘤抗原或肿瘤基质抗原的抗体。

在具体实施方案中，生物癌症疗法包括施用编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的至少一种另外的DNA疫苗。在具体实施方案中，所述至少一种另外的DNA疫苗选自至少一种另外的沙门氏菌减毒株，所述另外的沙门氏菌减毒株包含含有编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝。特别是，所述至少一种另外的沙门氏菌减毒菌株是包含真核表达盒的伤寒沙门氏菌Ty21a。

在一个实施方案中，所述肿瘤抗原选自肾母细胞瘤蛋白(Wilms’Tumor Protein，WT1)、间皮素(MSLN)、CEA和CMV pp65。在具体实施方案中，由所述至少一种另外的DNA疫苗编码的所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：具有如SEQ ID NO 6中所示氨基酸序列的肾母细胞瘤蛋白(WT1)和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 7中所示氨基酸序列的间皮素(MSLN)和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ IDNO 8中所示氨基酸序列的CEA和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ IDNO 9中所示氨基酸序列的CMV pp65和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 10中所示氨基酸序列的CMV pp65和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质和具有如SEQ ID NO 11中所示氨基酸序列的CMV pp65和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质。特别地，肾母细胞瘤蛋白(WT1)具有如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列，间皮素(MSLN)具有如SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列，CEA具有如SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列，并且CMV pp65具有如SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述肿瘤基质抗原是VEGFR-2或FAP，优选VEGFR-2。特别地，由所述至少一种另外的DNA疫苗编码的所述肿瘤基质抗原选自由如下组成的组：具有如SEQ ID NO 12所示氨基酸序列的人VEGFR-2及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白，和人成纤维细胞活化蛋白(FAP)。特别是，VEGFR-2具有如SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列。

在具体实施方案中，编码PD-L1的沙门氏菌减毒株在编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的至少一种另外的DNA疫苗之前、同时和/或之后施用。

在本发明的背景中，术语“与……同时”意指在同一天，更特别是在12小时内，更特别是在2小时内施用所述编码PD-L1的沙门氏菌减毒株和所述编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的至少一种另外的DNA疫苗。

在具体实施方案中，施用所述编码PD-L1的减毒沙门氏菌菌株和所述编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的至少另外的DNA疫苗在连续的十二周内发生，更特别地在连续的八周内发生，更特别是在连续的三周至六周内发生。编码PD-L1的减毒沙门氏菌菌株和编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的至少一种另外的DNA疫苗可以通过相同途径或通过不同途径施用。例如，特别是如果所述至少一种另外的DNA疫苗是另外的沙门氏菌减毒株，则可以经口施用。

单次剂量的另外的沙门氏菌减毒株可包含约10⁵至约10¹¹，特别是约10⁶至约10¹⁰，更特别是约10⁶至约10⁹，更特别是约10⁶至约10⁸，最特别是约10⁶至约10⁷个菌落形成单位(CFU)。

可以与本发明的沙门氏菌减毒突变株联合使用的化学治疗剂可以是例如：吉西他滨、氨磷汀(乙醇)、卡巴他赛、卡铂、奥沙利铂、顺铂、卡培他滨、达卡巴嗪(DTIC)、放线菌素D、多烯紫杉醇、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、链脲霉素、环磷酰胺、尼莫司汀(ACNU)、carrnustine(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、多柔比星脂质体(doxil)、亚叶酸、吉西他滨(健择(gemzar))、道诺霉素、道诺霉素脂质体(daunoxome)、表柔比星、丙卡巴肼、酮康唑、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、长春碱、长春新碱、博来霉素、紫杉醇、多西他赛(泰索帝)、permetrexed、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、CPT-11、10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、美司钠、干扰素α、干扰素β、伊立替康、米托蒽醌、拓扑替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、奥沙利铂、普卡霉素、米托坦、培门冬酶(pegaspargase)、喷司他汀、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素、链脲霉素、他莫西芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、噻替派、乌拉莫司汀(uracil mustard)、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、替莫唑胺及其组合。

本发明最优选的化疗剂是卡巴他赛、卡铂、奥沙利铂、顺铂、环磷酰胺、多西他赛、依托泊苷、吉西他滨、多柔比星、洛莫司汀、紫杉醇、伊立替康、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、亚叶酸、5-氟尿嘧啶、博来霉素和替莫唑胺，尤其是吉西他滨。

在具体实施方案中，沙门氏菌减毒株经口施用。经口施用比肠胃外施用更简单、更安全、更舒适。然而，必须要注意的是，编码PD-L1的沙门氏菌减毒株也可以通过任意其他合适的途径施用。优选地，向受试者施用治疗有效剂量，并且该剂量取决于具体应用，恶性肿瘤类型，受试者的体重、年龄、性别和健康状况，施用方式和制剂等。根据需要，施用可以是单次或多次。

编码PD-L1的沙门氏菌减毒株在相对低的剂量下令人惊讶地有效。施用低剂量的活细菌疫苗使排泄的风险降至最低，并由此使传播给第三方的风险降至最低。

在这一背景下，术语“约”或“近”意指给定值或范围的3倍以内，或者2倍以内，包括1.5倍以内。

在具体实施方案中，所述沙门氏菌减毒株用于个体化的癌症免疫疗法，其包括以下步骤：评估患者的PD-L1表达模式和/或针对PD-L1的免疫前应答。可以在第一步中(例如通过伴随诊断)评估患者的PD-L1表达和/或患者针对PD-L1的免疫前应答。用于在mRNA或蛋白质水平上评估靶基因(例如PD-L1)的表达的方法是本领域普通技术人员所熟知的。例如，免疫组织化学染色、流式细胞术方法或RNA测序，或使用标记的替代方法可用于鉴定肿瘤中靶标表达的水平。类似地，用于评估患者针对给定蛋白质(例如PD-L1)的免疫前应答的方法是本领域普通技术人员所熟知的。患者的预先存在的PD-L1特异性T细胞池可以通过例如ELISpot或多聚体FACS分析进行检测。高肿瘤特异性PD-L1表达和/或针对PD-L1的免疫前应答的发生是患者对用编码PD-L1的沙门氏菌减毒株治疗特别有利地响应的预后指标。

编码PD-L1的沙门氏菌减毒株可以以溶液、悬浮液、冻干物、肠溶包衣胶囊或任意其他合适的形式提供。所述沙门氏菌减毒株通常被配制成饮用溶液。该实施例的患者依从性有所改善。优选地，所述饮用溶液包含将胃酸至少中和至某一程度，即，使胃液的pH接近pH 7的手段。优选地，所述饮用溶液是包含编码PD-L1的沙门氏菌减毒株的缓冲悬浮液。在一个具体实施方案中，所述缓冲悬浮液通过使沙门氏菌减毒株悬浮在合适的缓冲液中而获得，所述合适的缓冲液优选含有2.6g碳酸氢钠、1.7g L-抗坏血酸、0.2g乳糖一水合物和100ml的饮用水。

取决于可能发生的副作用，包括使用抗生素或抗炎剂的治疗可能是有利的。

如果发生类似由组胺、白三烯或细胞因子介导的过敏反应的不良事件，则可使用针对发热、过敏反应、血压不稳定、支气管痉挛和呼吸困难的治疗选项。在发生不期望的源自T细胞的自我攻击的情况下，治疗选项来源于干细胞移植后应用的急性和慢性移植物抗宿主病的标准处理方案。提出环孢菌素和糖皮质激素作为治疗选项。

在不太可能的全身性伤寒沙门氏菌Ty21a型感染的情况下，推荐适当的抗生素治疗，例如使用氟喹诺酮类(fluoroquinolones)，包括环丙沙星(ciprofloxacin)或氧氟沙星(ofloxacin)。胃肠道的细菌感染使用相应的药剂例如利福昔明(rifaximin)来进行治疗。

在具体实施方案中，癌症免疫疗法包括单次或多次施用PD-L1沙门氏菌减毒株或包含其的药物组合物。施用的单一剂量可以相同或不同。特别是，癌症免疫疗法包括1、2、3、4、5或6次施用编码PD-L1的沙门氏菌减毒株，优选地，其中多次施用发生在连续的3至6个月中。

附图说明

图1：人全长PD-L1的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)，其由质粒pVAX10.PD-L1h中包含的PD-L1 cDNA编码。

图2：截短形式的PD-L1的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)，其缺少信号肽(MRIFAVFIFMTYWHLLNA)，其由质粒pVAX10.PD-L1ha中包含的PD-L1cDNA编码。

图3：质粒pVAX10.PD-L1h中所包含的，并且编码SEQ ID NO 1所示的人全长PD-L1的核酸序列(SEQ ID NO 3)。

图4：质粒pVAX10.PD-L1ha中所包含的，并且编码SEQ ID NO 2所示的截短的人PD-L1的核酸序列(SEQ ID NO 4)。

图5：空表达载体pVAX10中所包含的核酸序列(不含限制性位点NheI和XhoI之间的多克隆位点部分的表达载体pVAX10的序列)(SEQ ID NO 5)。

图6：质粒pVAX10.hWT1中所包含的WT1 cDNA所编码的人WT1的氨基酸序列(SEQ IDNO 6)。

图7：质粒pVAX10.hMSLN中所包含的MSLN cDNA所编码的人MSLN的氨基酸序列(SEQID NO 7)。

图8：质粒pVAX10.hCEA中所包含的CEA cDNA所编码的人CEA的氨基酸序列(SEQ IDNO 8)。

图9：质粒pVAX10.CMVpp65_1中所包含的CMV pp65 cDNA所编码的人CMV pp65的氨基酸序列(SEQ ID NO 9)。

图10：质粒pVAX10.CMVpp65_2中所包含的CMV pp65 cDNA所编码的人CMV pp65的氨基酸序列(SEQ ID NO 10)。

图11：质粒pVAX10.CMVpp65_3中所包含的CMV pp65 cDNA所编码的人CMV pp65的氨基酸序列(SEQ ID NO 11)。

图12：质粒pVAX10.VR2-1中所包含的VEGFR-2cDNA所编码的VEGFR-2的氨基酸序列(SEQ ID NO 12)。

图13：截短的人PD-L1(SEQ ID NO 13)的氨基酸序列，其包含细胞外结构域(氨基酸19-238)和信号肽(氨基酸1-18)。

图14：编码SEQ ID NO 13所示的截短的人PD-L1的核酸序列(SEQ ID NO14)。

图15：预防性施用VXM10m和VXM10ma对携带播散性同系FBL-3红白血病的C57BL/6小鼠的存活的影响。用(A)空载体(1.6x 10⁸CFU)；(B)VXM10m(1.8x 10⁸CFU)；(C)VXM10m(1.0x 10¹⁰CFU)；(D)VXM10ma(3.6x 10⁸CFU)；或(E)VXM10ma(1.0x 10¹⁰CFU)接种小鼠。垂直箭头表示肿瘤接种。

图16：预防性施用VXM10m和VXM10ma对用FBL-3细胞再激发后C57BL/6小鼠的长期存活的影响。如下对小鼠进行疫苗接种和处理：(A)空载体(1.6x 10⁸CFU)；(B)未处理(对照再激发)；(C)VXM10m(1.8x 10⁸CFU)；(D)VXM10m(1.0x 10¹⁰CFU)；(E)VXM10ma(3.6x10⁸CFU)；或(F)VXM10ma(1.0x 10¹⁰CFU)接种小鼠。垂直箭头表示肿瘤接种。

图17：治疗性施用VXM10m和VXM10ma对携带播散性同系FBL-3红白血病的C57BL/6小鼠的存活的影响。A)在FBL-3模型中用VXM10m和VXM10ma进行治疗性疫苗接种的时间表。用(A)空载体(1.0x 10⁹CFU)；(B)VXM10m(1.0x 10⁹CFU)；或(C)VXM10ma(1.0x 10⁹CFU)接种小鼠。垂直箭头表示肿瘤接种。

图18：(A)实验设计，和(B)用VXM1010⁸CFU(方形)、VXM1010¹⁰CFU(圆形)、VXM10a10⁸CFU(三角形，尖端向下)、VXM10a 10¹⁰CFU(三角形，尖端向上)、阴性对照(矩形)最后一次免疫接种(免疫接种时间表：d1、d3、d5、d7、d14、d21；d20进行FBL-3激发)后79天收集的携带播散性同系FBL-3红白血病的C57BL/6小鼠血清中的抗PD-L1应答。虚线表示从阴性对照组的值得到的截止值(95％置信度)。在阳性对照组中使用可溶性重组鼠PD-L1与CFA/IFA一起进行免疫(交叉)。

图19：(A)实验设计，和(B)从用空载体(圆圈)、VXM10(正方形)或VXM10a(三角形)免疫，并用衍生自PD-L1的5种肽的库刺激的小鼠中分离的脾细胞所分泌的IFNγ(空心符号)和TNFα(闭合符号)的水平，如在刺激6天后通过ELISA在培养物上清液中所测量的(n＝5的平均值)。

实施例

实施例1：VXM10m在携带播散性同系FBL-3红白血病的C57BL/6小鼠中的抗肿瘤活性的评估

本研究的目的是研究两种基于沙门氏菌的PD-L1 DNA疫苗在携带播散性同系FBL-3红白血病的C57BL/6小鼠中的抗肿瘤效力。VXM10m是用编码鼠全长天然PD-L1(具有SEQ IDNO 17的核酸序列)的表达质粒pVAX10转化的鼠伤寒沙门氏菌aroA菌株SL7207。VXM10ma是用编码截短形式的鼠PD-L1(具有SEQ ID NO 18的核酸序列)(更具体地，N-末端截短了17个氨基酸残基)的表达质粒pVAX10转化的鼠伤寒沙门氏菌aroA菌株SL7207。

治疗开始于随机化当天，其被当作第1天(D1)。根据其体重，将30只4-6周龄健康雄性C57BL/6小鼠随机分为5组，每组6只动物。表1总结了治疗组的动物分配。进行统计学测试(Student t检验)以测试组之间的同质性(数据未显示)。

表1：

用空载体对照(VXM0m_空；不含外源表达质粒的鼠伤寒沙门氏菌细菌载体对照)处理第1组。用VXM10m或VXM10ma以两种不同的单剂量处理第2组至第5组。

VXM0m-空、VXM10m和VXM10ma通过口服管饲法(per os，po)施用，每次施用最终体积100μl。无论哪一动物组，在给药前，每只动物均口服(po)接受给药前应用缓冲液以中和胃中的酸(100μl/动物/应用)。该缓冲液通过将2.6g碳酸氢钠、1.7g L-抗坏血酸、0.2g乳糖一水合物溶解于100ml饮用水中来制备，并在应用XM0m-空、VXM10m和VXM10ma前30分钟内应用。

初次接种在第1天开始，包括4次施用，每隔2天一次(第1、3、5、7天)。初次疫苗接种后，在第14天和第21天进行两次加强疫苗接种。

在第20天，通过腹膜内注射500μl RPMI 1640中的5.0×10⁶个FBL-3细胞在所有动物中诱导肿瘤。FBL-3是源自C57BL/6小鼠的弗氏白血病病毒(Friend leukemia virus)诱导的红白血病细胞系。该细胞系表达可被免疫系统识别的独特的肿瘤特异性移植抗原。用FBL-3肿瘤细胞致敏同系小鼠导致后续对未来活肿瘤激发的排斥。虽然FBL-3具有免疫原性，但将活FBL-3肿瘤细胞注射到幼稚同系小鼠中会导致肿瘤生长，这表明FBL-3肿瘤细胞具有逃避免疫识别和破坏的机制。值得注意的是，PD-L1显示在FBL-3细胞系上高度表达。

在整个研究中监测动物体重、活力和动物行为。

试验动物的存活情况示于图15的卡普兰-梅尔(Kaplan-Meier)图中。

实施例2：施用VXM10m和VXM10ma对用FBL-3细胞再激发后C57BL/6小鼠的长期存活的影响

本研究的目的是研究两种基于沙门氏菌的PD-L1 DNA疫苗在再激发后在携带播散性同系FBL-3红白血病的C57BL/6小鼠中的抗肿瘤效力的长期效果。

继续实施例1的研究，小鼠在第100天接受第二次肿瘤诱导剂量。包括另外的未接种的对照动物(n＝10)作为肿瘤再激发的对照，其从实验开始就存在于本研究中，但未接受第一次肿瘤诱导。通过在第100天腹膜内注射500μl RPMI1640中的5.0x 10⁶个FBL-3细胞在第2-5组的所有动物(参见表1)和未接种的对照动物中肿瘤诱导进行再激发。

继续监测动物体重、活力和动物行为。在治疗阶段，当与对照组相比时，施用VXM10m和VXM10ma产生针对白血病的有效的记忆T细胞应答，在用FBL-3细胞再激发之后小鼠仍100％长期存活。在整个研究中未观察到与疫苗接种相关的毒性或体重减轻。试验动物的存活情况示于图16的卡普兰-梅尔(Kaplan-Meier)图中。

实施例3：VXM10m和VXM10ma在携带播散性同系FBL-3红白血病的C57BL/6小鼠中的治疗性抗肿瘤活性的评估

本研究的目的是研究治疗性施用的VXM10m和VXM10ma在携带播散性同系FBL-3红白血病的C57BL/6小鼠中的抗肿瘤效力。

在第0天通过腹膜内(i.p.)注射500μl RPMI 1640中的5.0x 10⁶个FBL-3细胞在所有动物中诱导肿瘤。

治疗开始于随机化当天，其被当作第1天(D1，肿瘤注射后)。对于治疗组，根据其体重，将16只4-6周龄健康雄性C57BL/6小鼠随机分为2组，每组8只动物。进行统计学测试(Student t检验)以测试组之间的同质性(数据未显示)。

如实施例1中所述，通过口服管饲法(per os，po)以100μl中1.0×10⁹CFU的量施用VXM0m-空、VXM10m和VXM10ma。

用空载体对照(VXM0m_空；不含外源表达质粒的鼠伤寒沙门氏菌细菌载体对照)处理1组(8只小鼠)。另一组(8只小鼠)用VXM10m或VXM10ma处理，在第1、3、5、7天进行4次初次免疫处理，在第14和21天进行2次每周一次的加强免疫(图17A)。

在初次免疫-加强免疫期和峰值免疫应答期间，即从研究第0天至第28天，每周监测动物体重、活力和动物行为3次，然后每周两次，直至研究结束。

在治疗阶段，当与对照组相比时，口服VXM10m和VXM10ma在FBL-3白血病模型中产生强烈的抗肿瘤作用，在白血病激发后80天动物存活100％(图17B)。在整个研究中未观察到与疫苗接种相关的毒性或体重减轻。空载体的施用未显示任何抗癌作用。

实施例4：接种VXM10m和VXM10ma后携带播散性同系FBL-3红白血病的C57BL/6小鼠中抗PD-L1抗体应答的评估

本研究的目的是研究携带播散性同系FBL-3红白血病的C57 BL/6小鼠中VXM10或VXM10a的抗PD-L1应答，所述VXM10或VXM10a在第1、3、5和7天以10⁸CFU和10¹⁰CFU的量施用，并在第14天和第21天进行加强免疫。在第20天通过腹膜内注射5.0×10⁶个FBL-3细胞在所有动物中诱导肿瘤。基本上如实施例1中所述进行疫苗接种和肿瘤诱导。在阳性对照组中使用可溶性重组鼠PD-L1与CFA/IFA一起进行免疫。

在第21天最后一次接种后79天，通过ELISA评估接种VXM10或VXM10a的动物的血清中的全身性抗体应答(图18A)。在接种VXM10和VXM10a的少数动物中检测到抗PD-L1抗体，并且在最高剂量处理组中应答更明显，50％的动物(6只动物中的3只)显示出信号背景比高于截止值(图18B)。

实施例5：在C57BL/6小鼠中接种VXM10m和VXM10ma后对PD-L1的T细胞应答的评估

本研究的目的是研究健康C57 BL/6小鼠(每组n＝5)对PD-L1表位诱导的T细胞应答，其中所述健康C57 BL/6小鼠每隔一天(第1、3、5和第7天)通过口服途径用10¹⁰CFU的VXM10、VXM10a或空载体对照免疫4次(图19A)。

使用衍生自鼠PD-L1的5种免疫原性肽的库，在最后一次免疫后10天(第17天)进行脾细胞(spenocyte)的离体再刺激。在体外刺激6天后，通过ELISA检测培养上清液中是否存在IFNγ和TNFα。

在来自接种VXM10a并用PD-L1肽刺激的动物的脾细胞上清液中TNFα和IFNγ(程度较低)的水平显著增加(图19B)。这些数据证实，用VXM10a免疫诱导了对PD-L1特异的T细胞库。

实施例6：VXM10mb在携带播散性同系FBL-3红白血病的C57BL/6小鼠中的抗肿瘤活性的评估

本研究的目的是研究第三种基于沙门氏菌的PD-L1 DNA疫苗在携带播散性同系FBL-3红白血病的C57BL/6小鼠中的抗肿瘤效力的长期效果。VXM10mb是用编码截短形式的鼠PD-L1(更具体地，是包括N-末端信号肽的细胞外结构域)(氨基酸序列SEQ ID NO 15；核酸序列SEQ ID NO 16)的表达质粒pVAX10转化的鼠伤寒沙门氏菌aroA菌株SL7207。实验基本上如实施例1和2中所述进行。

实施例7：VXM10mb在携带播散性同系FBL-3红白血病的C57BL/6小鼠中的治疗性抗肿瘤活性的评估

本研究的目的是研究治疗性施用的VXM10mb在携带播散性同系FBL-3红白血病的C57BL/6小鼠中的抗肿瘤效力。实验基本上如实施例3中所述进行。

序列表

<110> 万科斯蒙股份有限公司

<120> 用于癌症免疫疗法的新型的靶向PD-L1的DNA疫苗

<130> 113344P855PC

<150> EP17188941

<151> 2017-09-01

<150> EP17161666

<151> 2017-03-17

<160> 18

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 290

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu

1 5 10 15

Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

20 25 30

Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu

35 40 45

Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

50 55 60

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

85 90 95

Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

100 105 110

Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val

115 120 125

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val

130 135 140

Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr

145 150 155 160

Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser

165 170 175

Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn

180 185 190

Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr

195 200 205

Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu

210 215 220

Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His

225 230 235 240

Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr

245 250 255

Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys

260 265 270

Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu

275 280 285

Glu Thr

290

<210> 2

<211> 273

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly

1 5 10 15

Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp

20 25 30

Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile

35 40 45

Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr

50 55 60

Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala

65 70 75 80

Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg

85 90 95

Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys

100 105 110

Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp

115 120 125

Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro

130 135 140

Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly

145 150 155 160

Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val

165 170 175

Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys

180 185 190

Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val

195 200 205

Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His Leu

210 215 220

Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr Phe

225 230 235 240

Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys Gly

245 250 255

Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu Glu

260 265 270

Thr

<210> 3

<211> 873

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

atgaggatat ttgctgtctt tatattcatg acctactggc atttgctgaa cgcatttact 60

gtcacggttc ccaaggacct atatgtggta gagtatggta gcaatatgac aattgaatgc 120

aaattcccag tagaaaaaca attagacctg gctgcactaa ttgtctattg ggaaatggag 180

gataagaaca ttattcaatt tgtgcatgga gaggaagacc tgaaggttca gcatagtagc 240

tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag 300

atcacagatg tgaaattgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggtggt 360

gccgactaca agcgaattac tgtgaaagtc aatgccccat acaacaaaat caaccaaaga 420

attttggttg tggatccagt cacctctgaa catgaactga catgtcaggc tgagggctac 480

cccaaggccg aagtcatctg gacaagcagt gaccatcaag tcctgagtgg taagaccacc 540

accaccaatt ccaagagaga ggagaagctt ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac 600

acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagat tagatcctga ggaaaaccat 660

acagctgaat tggtcatccc agaactacct ctggcacatc ctccaaatga aaggactcac 720

ttggtaattc tgggagccat cttattatgc cttggtgtag cactgacatt catcttccgt 780

ttaagaaaag ggagaatgat ggatgtgaaa aaatgtggca tccaagatac aaactcaaag 840

aagcaaagtg atacacattt ggaggagacg taa 873

<210> 4

<211> 822

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

atgtttactg tcacggttcc caaggaccta tatgtggtag agtatggtag caatatgaca 60

attgaatgca aattcccagt agaaaaacaa ttagacctgg ctgcactaat tgtctattgg 120

gaaatggagg ataagaacat tattcaattt gtgcatggag aggaagacct gaaggttcag 180

catagtagct acagacagag ggcccggctg ttgaaggacc agctctccct gggaaatgct 240

gcacttcaga tcacagatgt gaaattgcag gatgcagggg tgtaccgctg catgatcagc 300

tatggtggtg ccgactacaa gcgaattact gtgaaagtca atgccccata caacaaaatc 360

aaccaaagaa ttttggttgt ggatccagtc acctctgaac atgaactgac atgtcaggct 420

gagggctacc ccaaggccga agtcatctgg acaagcagtg accatcaagt cctgagtggt 480

aagaccacca ccaccaattc caagagagag gagaagcttt tcaatgtgac cagcacactg 540

agaatcaaca caacaactaa tgagattttc tactgcactt ttaggagatt agatcctgag 600

gaaaaccata cagctgaatt ggtcatccca gaactacctc tggcacatcc tccaaatgaa 660

aggactcact tggtaattct gggagccatc ttattatgcc ttggtgtagc actgacattc 720

atcttccgtt taagaaaagg gagaatgatg gatgtgaaaa aatgtggcat ccaagataca 780

aactcaaaga agcaaagtga tacacatttg gaggagacgt aa 822

<210> 5

<211> 3500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表达载体pVAX10

<400> 5

tgggcttttg ctggcctttt gctcacatgt tcttgactct tcgcgatgta cgggccagat 60

atacgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 120

ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 180

gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 240

caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggactattt acggtaaact gcccacttgg 300

cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 360

ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 420

tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 480

gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 540

gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 600

tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctctggc 660

taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga 720

cccaagctgg ctagcctcga gtctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact 780

gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg 840

gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg 900

agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg 960

gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctac tgggcggttt 1020

tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc 1080

cctgcaaagt aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa 1140

gctctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg 1200

caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa 1260

tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg 1320

tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt 1380

ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa 1440

gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc 1500

ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg 1560

ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg 1620

aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg 1680

aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg 1740

gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact 1800

gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg 1860

ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc 1920

ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attattaacg 1980

cttacaattt cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 2040

tacaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 2100

acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatagca 2160

cgtgctaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 2220

catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc cccatcagtg 2280

accaaacagg aaaaaaccgc ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg 2340

cttctggaga aactcaacga gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt 2400

cacgaccacg ctgatgagct ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 2460

aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 2520

agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg 2580

acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 2640

ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat 2700

accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 2760

tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 2820

ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 2880

ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 2940

gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 3000

gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 3060

ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 3120

tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 3180

gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 3240

tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 3300

tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 3360

tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 3420

ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 3480

ctcaagaaga tcctttgatc 3500

<210> 6

<211> 371

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 6

Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro

1 5 10 15

Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala

20 25 30

Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr

35 40 45

Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro

50 55 60

Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly

65 70 75 80

Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe

85 90 95

Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe

100 105 110

Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe

115 120 125

Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile

130 135 140

Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr

145 150 155 160

Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe

165 170 175

Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln

180 185 190

Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser

195 200 205

Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp

210 215 220

Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln

225 230 235 240

Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser

245 250 255

Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu

260 265 270

Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile

275 280 285

His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro

290 295 300

Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys

305 310 315 320

Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys

325 330 335

Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro

340 345 350

Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp

355 360 365

Gln Leu Lys

370

<210> 7

<211> 630

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 7

Met Ala Leu Pro Thr Ala Arg Pro Leu Leu Gly Ser Cys Gly Thr Pro

1 5 10 15

Ala Leu Gly Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu Gly Trp Val Gln

20 25 30

Pro Ser Arg Thr Leu Ala Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu

35 40 45

Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Ile Ser Ser Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Gln Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu Ser Thr Glu

65 70 75 80

Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys Asn Val Lys Leu

85 90 95

Ser Thr Glu Gln Leu Arg Cys Leu Ala His Arg Leu Ser Glu Pro Pro

100 105 110

Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Leu Phe Leu Asn Pro

115 120 125

Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gln Ala Cys Thr Arg Phe Phe Ser Arg Ile

130 135 140

Thr Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg Gln

145 150 155 160

Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser Leu

165 170 175

Leu Ser Glu Ala Asp Val Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp Leu

180 185 190

Pro Gly Arg Phe Val Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg Leu

195 200 205

Val Ser Cys Pro Gly Pro Leu Asp Gln Asp Gln Gln Glu Ala Ala Arg

210 215 220

Ala Ala Leu Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Trp

225 230 235 240

Ser Val Ser Thr Met Asp Ala Leu Arg Gly Leu Leu Pro Val Leu Gly

245 250 255

Gln Pro Ile Ile Arg Ser Ile Pro Gln Gly Ile Val Ala Ala Trp Arg

260 265 270

Gln Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gln Pro Glu Arg Thr Ile

275 280 285

Leu Arg Pro Arg Phe Arg Arg Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser

290 295 300

Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile Asp Glu Ser Leu Ile Phe Tyr Lys Lys

305 310 315 320

Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val Asp Ala Ala Leu Leu Ala Thr Gln Met

325 330 335

Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val Leu

340 345 350

Lys His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser Val

355 360 365

Ile Gln His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile

370 375 380

Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu

385 390 395 400

Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser Pro Gln Ala Pro Arg Arg Pro Leu

405 410 415

Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile Asp Arg Phe Val Lys Gly Arg Gly Gln

420 425 430

Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr

435 440 445

Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser

450 455 460

Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln

465 470 475 480

Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn

485 490 495

Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys Ile Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro

500 505 510

Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu

515 520 525

Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val

530 535 540

Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala

545 550 555 560

Glu Glu Arg His Arg Pro Val Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln

565 570 575

Asp Asp Leu Asp Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn

580 585 590

Gly Tyr Leu Val Leu Asp Leu Ser Met Gln Glu Ala Leu Ser Gly Thr

595 600 605

Pro Cys Leu Leu Gly Pro Gly Pro Val Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu

610 615 620

Leu Ala Ser Thr Leu Ala

625 630

<210> 8

<211> 702

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 8

Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln

1 5 10 15

Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr

20 25 30

Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly

35 40 45

Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly

50 55 60

Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile

65 70 75 80

Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser

85 90 95

Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile

100 105 110

Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp

115 120 125

Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu

130 135 140

Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys

145 150 155 160

Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr

165 170 175

Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln

180 185 190

Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn

195 200 205

Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg

210 215 220

Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro

225 230 235 240

Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn

245 250 255

Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe

260 265 270

Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn

275 280 285

Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser

290 295 300

Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu

325 330 335

Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr

340 345 350

Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg

355 360 365

Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr

370 375 380

Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Lys Leu Ser

385 390 395 400

Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp

405 410 415

Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser

435 440 445

Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile

450 455 460

Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn

465 470 475 480

Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val

485 490 495

Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro

500 505 510

Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln

515 520 525

Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser

530 535 540

Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn

545 550 555 560

Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser

565 570 575

Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly

580 585 590

Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly

595 600 605

Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln

610 615 620

Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu

625 630 635 640

Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe

645 650 655

Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile

660 665 670

Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr

675 680 685

Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile

690 695 700

<210> 9

<211> 561

<212> PRT

<213> 巨细胞病毒（Cytomegalovirus）

<400> 9

Met Glu Ser Arg Gly Arg Arg Cys Pro Glu Met Ile Ser Val Leu Gly

1 5 10 15

Pro Ile Ser Gly His Val Leu Lys Ala Val Phe Ser Arg Gly Asp Thr

20 25 30

Pro Val Leu Pro His Glu Thr Arg Leu Leu Gln Thr Gly Ile His Val

35 40 45

Arg Val Ser Gln Pro Ser Leu Ile Leu Val Ser Gln Tyr Thr Pro Asp

50 55 60

Ser Thr Pro Cys His Arg Gly Asp Asn Gln Leu Gln Val Gln His Thr

65 70 75 80

Tyr Phe Thr Gly Ser Glu Val Glu Asn Val Ser Val Asn Val His Asn

85 90 95

Pro Thr Gly Arg Ser Ile Cys Pro Ser Gln Glu Pro Met Ser Ile Tyr

100 105 110

Val Tyr Ala Leu Pro Leu Lys Met Leu Asn Ile Pro Ser Ile Asn Val

115 120 125

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<212> PRT

<213> 巨细胞病毒（Cytomegalovirus）

<400> 11

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<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 13

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<212> DNA

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<210> 15

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<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

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gatgagcaag tgattcagtt tgtggcagga gaggaggacc ttaagcctca gcacagcaac 240

ttcaggggga gagcctcgct gccaaaggac cagcttttga agggaaatgc tgcccttcag 300

atcacagacg tcaagctgca ggacgcaggc gtttactgct gcataatcag ctacggtggt 360

gcggactaca agcgaatcac gctgaaagtc aatgccccat accgcaaaat caaccagaga 420

atttccgtgg atccagccac ttctgagcat gaactaatat gtcaggccga gggttatcca 480

gaagctgagg taatctggac aaacagtgac caccaacccg tgagtgggaa gagaagtgtc 540

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<210> 17

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<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 17

atgaggatat ttgctggcat tatattcaca gcctgctgtc acttgctacg ggcgtttact 60

atcacggctc caaaggactt gtacgtggtg gagtatggca gcaacgtcac gatggagtgc 120

agattccctg tagaacggga gctggacctg cttgcgttag tggtgtactg ggaaaaggaa 180

gatgagcaag tgattcagtt tgtggcagga gaggaggacc ttaagcctca gcacagcaac 240

ttcaggggga gagcctcgct gccaaaggac cagcttttga agggaaatgc tgcccttcag 300

atcacagacg tcaagctgca ggacgcaggc gtttactgct gcataatcag ctacggtggt 360

gcggactaca agcgaatcac gctgaaagtc aatgccccat accgcaaaat caaccagaga 420

atttccgtgg atccagccac ttctgagcat gaactaatat gtcaggccga gggttatcca 480

gaagctgagg taatctggac aaacagtgac caccaacccg tgagtgggaa gagaagtgtc 540

accacttccc ggacagaggg gatgcttctc aatgtgacca gcagtctgag ggtcaacgcc 600

acagcgaatg atgttttcta ctgtacgttt tggagatcac agccagggca aaaccacaca 660

gcggagctga tcatcccaga actgcctgca acacatcctc cacagaacag gactcactgg 720

gtgcttctgg gatccatcct gttgttcctc attgtagtgt ccacggtcct cctcttcttg 780

agaaaacaag tgagaatgct agatgtggag aaatgtggcg ttgaagatac aagctcaaaa 840

aaccgaaatg atacacaatt cgaggagacg taa 873

<210> 18

<211> 822

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 18

atgtttacta tcacggctcc aaaggacttg tacgtggtgg agtatggcag caacgtcacg 60

atggagtgca gattccctgt agaacgggag ctggacctgc ttgcgttagt ggtgtactgg 120

gaaaaggaag atgagcaagt gattcagttt gtggcaggag aggaggacct taagcctcag 180

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ctcttcttga gaaaacaagt gagaatgcta gatgtggaga aatgtggcgt tgaagataca 780

agctcaaaaa accgaaatga tacacaattc gaggagacgt aa 822

Claims

1.一种沙门氏菌减毒株，其包含含有编码PD-L1的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝。

2.根据权利要求1所述的沙门氏菌减毒株，其中

(a)所述沙门氏菌减毒菌株是肠道沙门氏菌物种；

(b)所述沙门氏菌减毒株是伤寒沙门氏菌Ty21a；

(c)所述表达盒是真核表达盒，和/或

(d)所述表达盒包含CMV启动子。

3.根据权利要求1或2所述的沙门氏菌减毒株，其中PD-L1选自由以下组成的组：具有如SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的PD-L1以及与其具有至少80％序列一致性的蛋白，和具有如SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的PD-L1以及与其具有至少80％序列一致性的蛋白，和具有如SEQ ID NO 13所示氨基酸序列的PD-L1以及与其具有至少80％序列一致性的蛋白，特别地，其中PD-L1具有如SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 13中所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的沙门氏菌减毒株，其中PD-L1由SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 14中所示的核酸序列编码。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的沙门氏菌减毒株，其中所述DNA分子还包含卡那霉素抗生素抗性基因、pMB1 ori和CMV启动子，特别地，其中所述DNA分子包含如SEQ ID NO5所示的DNA序列。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的沙门氏菌减毒株，其用作药物。

7.根据权利要求6使用的沙门氏菌减毒株，其中其用于治疗癌症。

8.根据权利要求7使用的沙门氏菌减毒株，其中其用于癌症免疫疗法。

9.根据权利要求7或8使用的沙门氏菌减毒株，其中所述癌症的治疗还包括化学疗法、放射疗法或生物癌症疗法，特别是其中所述沙门氏菌减毒株在化疗或放疗治疗或生物癌症疗法之前、期间和/或之后施用，更特别地，所述沙门氏菌减毒株在化疗或放疗治疗或生物癌症疗法之前和期间施用。

10.根据权利要求9使用的沙门氏菌减毒株，其中所述生物癌症疗法包括施用编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的至少一种另外的DNA疫苗，特别地，所述至少一种另外的DNA疫苗选自至少一种另外的沙门氏菌减毒株，所述另外的沙门氏菌减毒株包含含有编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的另外的表达盒的另外的DNA分子的至少一个拷贝，特别地，其中所述至少一种另外的沙门氏菌减毒菌株是包含另外的真核表达盒的伤寒沙门氏菌Ty21a。

11.根据权利要求10使用的沙门氏菌减毒株，其中由所述至少一种另外的DNA疫苗编码的所述肿瘤抗原选自肾母细胞瘤蛋白(WT1)、间皮素(MSLN)、CEA、CMV pp65和/或其中由所述至少一种另外的DNA疫苗编码的所述肿瘤基质抗原是VEGFR-2或人成纤维细胞活化蛋白(FAP)。

12.根据权利要求11使用的沙门氏菌减毒株，其中由所述至少一种另外的DNA疫苗编码的所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：具有如SEQ ID NO 6中所示氨基酸序列的肾母细胞瘤蛋白(WT1)和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 7中所示氨基酸序列的间皮素(MSLN)和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 8中所示氨基酸序列的CEA和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 9中所示氨基酸序列的CMV pp65和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ IDNO 10中所示氨基酸序列的CMV pp65和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质和具有如SEQ ID NO 11中所示氨基酸序列的CMV pp65和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质，并且其中，由所述至少一种另外的DNA疫苗编码的所述肿瘤基质抗原选自由如下组成的组：具有如SEQ ID NO 12所示氨基酸序列的人VEGFR-2及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白，和人成纤维细胞活化蛋白(FAP)。

13.根据权利要求6至12中任一项使用的沙门氏菌减毒株，其中所述沙门氏菌减毒株通过口服施用。

14.根据权利要求7至13中任一项使用的沙门氏菌减毒株，其中所述癌症选自淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肺癌特别是非小细胞肺癌(NSCLC)、黑素瘤、肾细胞癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、merkel细胞癌、膀胱癌、头颈癌、结直肠癌、食道癌、宫颈癌、胃癌、肝细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌和甲状腺癌。

15.根据权利要求6至14中任一项使用的沙门氏菌减毒株，其中，单剂量的沙门氏菌减毒株包含约10⁵至约10¹¹，特别是约10⁶至约10¹⁰，更特别是约10⁶至约10⁹，更特别是约10⁶至约10⁸，最特别是约10⁶至约10⁷个菌落形成单位(CFU)。

16.根据权利要求8至15中任一项使用的沙门氏菌减毒株，其中其用于包括以下步骤的个体化的癌症免疫疗法：评估患者的PD-L1表达模式和/或针对PD-L1的免疫前应答。