CN110291187A

CN110291187A - 新型的靶向vegfr-2的免疫治疗方法

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Publication number: CN110291187A
Application number: CN201880012318.8A
Authority: CN
Inventors: 海因茨·卢本奥
Original assignee: Si Meng Limited-Liability Co Of Wanke
Current assignee: Si Meng Limited-Liability Co Of Wanke; Vaximm AG
Priority date: 2017-02-17
Filing date: 2018-02-16
Publication date: 2019-09-27
Also published as: RU2019125436A; BR112019016925A2; US20200038496A1; JP2023160838A; EP3583200A1; AU2018222777B2; AU2018222777A1; AU2018222777B9; CA3050833A1; WO2018149982A1; IL268186A; KR20190117603A; JP2020507332A; US10980868B2; MX2019009724A; SG11201907391SA

Abstract

本发明涉及一种用于癌症免疫疗法的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码VEGF受体蛋白的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝，其中所述癌症被表达VEGF受体蛋白的癌细胞表征。本发明还涉及一种用于癌症免疫疗法的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码VEGF受体蛋白的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝，其中所述癌症被表达VEGF受体蛋白的癌细胞表征，并且其中所述癌症选自胶质母细胞瘤、类癌、肾癌，特别是肾细胞癌、甲状腺癌、肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃肠癌，特别是结直肠癌，更特别是结肠癌和皮肤癌，特别是黑素瘤。本发明还涉及一种用于患者的癌症免疫疗法的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码VEGF受体蛋白的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝，其中所述患者包含表达至少一种VEGF受体蛋白的癌细胞。

Description

新型的靶向VEGFR-2的免疫治疗方法

技术领域

背景技术

血管生成是促进实体肿瘤生长和转移的关键因素。血管内皮生长因子受体(VEGFR)2(也称为KDR或Flk-1)是血管内皮生长因子(VEGF)的高亲和力受体，被认为是实体瘤血管生成的主要调节子，因为它涉及所有关键的内皮功能，包括增殖、迁移和血管形成。肿瘤新生血管内衬有过表达VEGFR-2并且可通过血流容易地接近的内皮细胞。这些细胞的遗传稳定性及每个内皮细胞支撑数百个肿瘤细胞的能力使它们成为抗癌治疗的主要靶标，无论是通过抗体、酪氨酸激酶抑制剂还是疫苗(Augustin,Trends Pharmacol Sci 1998,19:216–222)。迄今为止，VEGF/VEGFR2信号传导途径已经在许多抗血管生成治疗方法中被靶向。贝伐珠单抗等化合物，例如特异性靶向肿瘤新血管系统的小分子如舒尼替尼和阿西替尼，已在一系列肿瘤适应症中显示出疗效(Powles等人，Br J Cancer2011,104(5):741-5)；Rini et al.,Lancet 2011,378:1931-1939)。

WO 2014/005683公开了一种用于癌症免疫疗法，特别是用于治疗胰腺癌的沙门氏菌减毒突变株，所述沙门氏菌减毒突变株包含编码VEGF受体蛋白的重组DNA分子。

WO 2016/202459公开了一种用于治疗癌症的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码VEGF受体蛋白的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝，其中所述治疗还包含施用至少一种另外的抗癌剂。

WO 2013/09189公开了一种用于培养缺乏半乳糖差向异构酶活性并含有重组DNA分子的伤寒沙门氏菌减毒突变菌株的方法。

长期以来一直认为VEGF受体限于恶性肿瘤的脉管系统，即受限于肿瘤基质。然而，最近的表达分析揭示了血管内皮生长因子受体，特别是VEGFR-2在肿瘤细胞自身上的表达。在各种来源的癌细胞上观察到了肿瘤特异性VEGF受体表达。这表明除了促进新血管形成之外，VEGF可能对肿瘤发生具有另外的作用。

发明目的

本发明的一个目的是提供靶向VEGF受体的新型安全有效的癌症免疫治疗方法。这种新型治疗方法将为改善癌症患者的治疗选择提供大的优势。

发明内容

最近的表达分析揭示了血管内皮生长因子受体，特别是VEGFR-2，在各种起源的癌细胞上的肿瘤特异性表达。然而，肿瘤特异性VEGF受体表达的生物学作用仍不清楚。有关VEGFR-2表达对胶质母细胞瘤影响的现有数据备受争议。虽然Kessler等人(Oncotarget，2015)报道神经胶质瘤细胞中VEGFR-2的表达驱动神经胶质瘤细胞增殖并增加神经胶质瘤细胞对各种化学治疗剂的耐药性，但Lu等人(Cancer Cell，2012)却发现VEGF通过VEGFR-2直接负调节肿瘤细胞侵袭。

本发明基于以下令人惊讶的发现：与仅在肿瘤脉管系统中表现出VEGF受体表达的肿瘤相比，靶向VEGF受体的基于沙门氏菌的DNA疫苗对于表现出肿瘤特异性VEGF受体表达(任选地除肿瘤脉管系统中的VEGF受体表达外)的肿瘤特别有效。在本发明的背景中，术语“肿瘤特异性VEGF受体表达”是指肿瘤细胞自身上而不是肿瘤脉管系统上的VEGF受体表达。

因此，在第一方面，本发明涉及一种用于癌症免疫疗法的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码VEGF受体蛋白的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝，其中所述癌症被表达VEGF受体蛋白的癌细胞表征。

在第二方面，本发明涉及一种用于癌症免疫疗法的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码VEGF受体蛋白的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝，其中所述癌症被表达VEGF受体蛋白的癌细胞表征，并且其中所述癌症选自胶质母细胞瘤、类癌、肾癌，特别是肾细胞癌、甲状腺癌、肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃肠癌，特别是结直肠癌，更特别是结肠癌和皮肤癌，特别是黑素瘤。

在第三方面，本发明涉及一种用于患者的癌症免疫疗法的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码VEGF受体蛋白的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝，其中所述患者包含表达至少一种VEGF受体蛋白的癌细胞。

在具体实施方案中，沙门氏菌减毒菌株是肠道沙门氏菌物种。特别是，所述沙门氏菌减毒株是伤寒沙门氏菌Ty21a。

在具体实施方案中，表达盒是真核表达盒。特别是，所述表达盒包含CMV启动子。

在具体实施方案中，VEGF受体蛋白是VEGFR-2，特别是人VEGFR-2。特别是，所述VEGF受体蛋白选自由如下组成的组：具有如SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的VEGFR-2，以及与其具有至少80％序列一致性的蛋白。特别是，所述VEGF受体蛋白具有如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。

在具体实施方案中，所述DNA分子包含卡那霉素抗生素抗性基因、pMB1ori和CMV启动子。在具体的这种实施方案中，所述DNA分子包含如SEQ ID NO2所示的DNA序列。

在具体实施方案中，癌症免疫疗法伴随化学疗法、放射疗法或生物癌症疗法。在具体的这些实施方案中，所述沙门氏菌减毒菌株在化学疗法或放射疗法治疗或生物癌症疗法之前、期间或之后施用，或在化学疗法或放射疗法治疗或生物癌症疗法之前和期间施用。

在具体实施方案中，生物癌症疗法包括施用编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的至少一种另外的DNA疫苗。在具体的这些实施方案中，所述编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的至少一种另外的DNA疫苗选自至少一种另外的沙门氏菌减毒株，所述另外的沙门氏菌减毒株包含含有编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的另外的表达盒的另外的DNA分子的至少一个拷贝。特别是，所述至少一种另外的沙门氏菌减毒菌株是包含另外的真核表达盒的伤寒沙门氏菌Ty21a。

在具体实施方案中，由所述至少一种另外的DNA疫苗编码的所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：人肾母细胞瘤蛋白(Wilms’Tumor Protein，WT1)、人间皮素(MSLN)、CEA和CMV pp65。特别是，由所述至少一种另外的DNA疫苗编码的所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：具有如SEQ ID NO 3中所示氨基酸序列的人肾母细胞瘤蛋白(WT1)和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 4中所示氨基酸序列的人间皮素(MSLN)和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 5中所示氨基酸序列的人CEA和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 6中所示氨基酸序列的CMVpp65和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 7中所示氨基酸序列的CMV pp65和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质和具有如SEQ ID NO 8中所示氨基酸序列的CMV pp65和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质。特别是，人肾母细胞瘤蛋白(WT1)具有如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列，人间皮素(MSLN)具有如SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列，人CEA具有如SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列，并且CMV pp65具有如SEQ IDNO 6、SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。在具体实施方案中，由所述至少一种另外的DNA疫苗编码的所述肿瘤基质抗原选自人成纤维细胞活化蛋白(FAP)。

在具体实施方案中，减毒的沙门氏菌菌株通过口服施用。

在具体实施方案中，单剂量的沙门氏菌减毒株包含约10⁵至约10¹¹，特别是约10⁶至约10¹⁰，更特别是约10⁶至约10⁹，更特别是约10⁶至约10⁸，最特别是约10⁶至约10⁷个菌落形成单位(CFU)。

在具体实施方案中，所述沙门氏菌减毒菌株用于个体化的癌症免疫疗法，其包括评估患者针对至少一种VEGF受体蛋白(特别是VEGFR-2)的表达模式和/或免疫前应答的步骤。

具体实施方式

在第一方面，本发明涉及一种用于癌症免疫疗法的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码VEGF受体蛋白(特别是VEGFR-2)的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝，其中所述癌症被表达VEGF受体蛋白(特别是VEGFR-2)的癌细胞表征。

在本发明的背景中，术语“被表达VEGF受体蛋白的癌细胞的癌症表征”是指被存在在mRNA和/或蛋白质水平上表达至少一种VEGF受体蛋白，特别是VEGFR-2，的癌细胞所表征的癌症指征。在具体实施方案中，与相同组织类型的非癌细胞相比，mRNA和/或蛋白质水平上的至少一种VEGF受体蛋白，特别是VEGFR-2，的表达增加。例如，与同一患者的相同组织类型的非癌细胞相比，至少一种VEGF受体蛋白，特别是VEGFR-2，的表达可能增加。在其他实施方案中，与代表性健康受试者群体中相同组织的非癌细胞中的平均表达相比，至少一种VEGF受体蛋白，特别是VEGFR-2，的表达可能增加。被VEGF受体蛋白表达表征的癌症适应症尤其包括胶质母细胞瘤、类癌、肾癌，特别是肾细胞癌、胰腺癌、甲状腺癌、肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃肠癌，特别是结直肠癌，更特别是结肠癌和皮肤癌，特别是黑素瘤。

因此，在第二方面，本发明涉及一种用于癌症免疫疗法的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码VEGF受体蛋白(特别是VEGFR-2)的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝，其中所述癌症被表达VEGF受体蛋白的癌细胞表征，特别是被表达VEGFR-2的癌细胞表征，其中所述癌症选自胶质母细胞瘤、类癌、肾癌，特别是肾细胞癌、甲状腺癌、肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃肠癌，特别是结直肠癌，更特别是结肠癌和皮肤癌，特别是黑素瘤。

靶向VEGFR-2的免疫疗法的一个特别有前景的适应症是胶质母细胞瘤。胶质母细胞瘤显示极高的肿瘤血管形成。此外，VEGFR-2可以靶向肿瘤脉管系统和肿瘤细胞。约20％至50％的胶质母细胞瘤患者显示出肿瘤特异性VEGFR-2表达，这尤其显示在侵袭前沿。此外，在神经胶质瘤样干细胞中观察到了VEGFR-2表达。到目前为止，胶质母细胞瘤的治疗方案仍然不能令人满意。例如，靶向VEGF的单克隆抗体阿瓦斯汀(avastin)仅在无进展生存期中显示出益处，但在总体生存期中不显示。

在第三方面，本发明涉及一种用于患者的癌症免疫疗法的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码VEGF受体蛋白(特别是VEGFR-2)的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝，其中所述患者包含表达至少一种VEGF受体蛋白的癌细胞，特别是表达至少一种VEGFR-2的癌细胞。

在本发明的具体实施方案中，已经确定患者患有被表达VEGF受体蛋白的癌细胞表征的癌症，或者具有表达至少一种VEGF受体蛋白的癌细胞。在第一步中，在mRNA或蛋白质水平上评估患者的肿瘤特异性VEGF受体蛋白表达，例如，VEGFR-2的肿瘤特异性表达，优选在体外评估。为此目的，可以例如通过免疫组织化学染色对肿瘤组织样品(例如，活组织检查)进行染色或者可以使其进行原位杂交。用于评估肿瘤特异性抗原表达的方法是本领域熟知的。

根据本发明，所述减毒沙门氏菌菌株作为含有编码VEGF受体蛋白的表达盒的重组DNA分子的细菌载体起作用，用于将所述重组DNA分子递送到靶细胞中。含有编码异源抗原，如VEGF受体蛋白的DNA分子的递送载体被称为DNA疫苗。因此，术语“编码……的DNA疫苗”和“包含含有编码……的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝的沙门氏菌减毒株”在本文中可互换使用。

在本发明的背景中，术语“疫苗”是指在施用后能够在受试者中诱导免疫应答的药剂。优选地，疫苗可以预防、改善或治疗疾病。

本发明的减毒活沙门氏菌菌株稳定地携带编码VEGF受体蛋白的重组DNA分子。它可以用作口服递送这种重组DNA分子的载体。

基因免疫可能优于常规疫苗接种。靶DNA可以在相当长的一段时间内被检测到，从而充当抗原的储库。一些质粒中的序列基序，如GpC岛，是免疫刺激性的，并且可以作为由LPS和其他细菌组分引起的免疫刺激所促进的佐剂。

减毒活沙门氏菌载体在原位产生它们自己的免疫调节因子如脂多糖(LPS)，这可能与其他形式的施用(例如微胶囊化)相比构成优势。此外，根据本发明所述的粘膜疫苗具有淋巴内作用模式，这被证明是有益的。摄入本发明的减毒疫苗后，肠道派伊尔结中的巨噬细胞和其他细胞被修饰的细菌侵入。细菌被这些吞噬细胞摄取。由于它们的减毒突变，伤寒沙门氏菌Ty21菌株细菌不能保持在这些吞噬细胞中，而是在这个时间点死亡。重组DNA分子被释放，并随后通过特定的运输系统或通过内体泄露(endosomal leakage)转移到免疫吞噬细胞的胞质溶胶中。最后，重组DNA分子进入细胞核，在细胞核内转录，导致VEGF受体蛋白在吞噬细胞的胞质溶胶中大量表达。被感染的细胞经历细胞凋亡，装载VEGF受体蛋白抗原，并被肠道免疫系统摄取和加工。细菌感染的危险信号在此过程中充当强力佐剂，导致在全身和粘膜隔室水平上产生强烈的靶抗原特异性CD8+T细胞和抗体应答。免疫应答在接种后十天左右达到峰值。抗载体应答的缺乏使得可多次使用相同疫苗来强化。

在本发明的背景中，术语“减毒”是指与不具有减毒突变的亲本细菌菌株相比毒性降低的细菌菌株。优选地，减毒细菌菌株丧失了其毒力，但保留了其诱导保护性免疫的能力。通过删除各种基因，包括毒力、调节和代谢基因，可以实现减毒。减毒细菌可以天然存在，或者可以在实验室中人工生产，例如通过使其适应新的培养基或细胞培养物，或者它们可以通过重组DNA技术生产。施用约10¹¹CFU的本发明的沙门氏菌减毒株在优选地小于5％，更优选小于1％，最优选小于1‰受试者中引起沙门氏菌病。

在本发明的背景中，术语“包含”(comprises)或“包含”(comprising)意指“包括但不限于”。该术语旨在是开放式的，旨在具体说明任意陈述的特征、元件、整体、步骤或组分的存在，但并不排除一种或多种其他特征、元件、整体、步骤、组分或其组的存在或添加。因此，术语“包含”包括更限制性的术语“由......组成”和“基本上由......组成”。在一个实施方案中，在整个申请中，特别是在权利要求中使用的术语“包含”可以由术语“由......组成”代替。

含有编码VEGF受体蛋白的表达盒的DNA分子合适地是重组DNA分子，即工程化的DNA构建体，优选由不同来源的DNA片段组成。DNA分子可以是线性核酸，或者优选地，是通过将编码VEGF受体蛋白的开放阅读框引入表达载体质粒而产生的环状DNA质粒。

在本发明的背景中，术语“表达盒”是指包含至少一个开放阅读框(ORF)的核酸单位，所述开放阅读框在控制其表达的调节序列的控制下。优选地，表达盒可以介导靶细胞中所包括的编码抗原(如VEGF受体蛋白)的开放阅读框的转录。表达盒通常包含启动子、至少一个开放阅读框和转录终止信号。

在具体实施方案中，沙门氏菌减毒菌株是肠道沙门氏菌物种。肠道沙门氏菌的减毒衍生物是将外源抗原递送至哺乳动物免疫系统的有吸引力的载体，因为肠道沙门氏菌菌株可能通过免疫的粘膜途径(即经口或经鼻)递送，与肠胃外施用相比，提供了简单和安全的优点。此外，沙门氏菌菌株在全身和粘膜隔室的水平均引发强烈的体液和细胞免疫应答。批量制备的成本低，并且活菌疫苗制剂非常稳定。减毒可通过删除各种基因，包括毒力、调节和代谢基因实现。

已显示，几种通过aro突变而减毒的鼠伤寒沙门氏菌菌株是动物模型中安全有效的外源抗原递送载体。

在具体实施方案中，所述沙门氏菌减毒株和所述至少一种另外的沙门氏菌减毒株是伤寒沙门氏菌Ty21a。减毒活伤寒沙门氏菌Ty21a菌株是Typhoral 的活性成分，Typhoral 也称为(由Crucell在瑞士的公司Berna Biotech Ltd.制造)。它是目前唯一获得许可的抗伤寒热口服活疫苗。这种疫苗已经被广泛测试，并已被证明在患者毒性以及向第三方传播方面是安全的(Wahdan等人，Wahdan等人,J.Infectious Diseases1982,145:292-295)。该疫苗已在40多个国家获得许可，并已用于数百万人的抗伤寒热预防性疫苗接种中，包括数千名儿童。它拥有空前的安全记录。没有可用的数据表明伤寒沙门氏菌Ty21a能够系统性地进入血液。因此，减毒活伤寒沙门氏菌Ty21a疫苗菌株能够在肠道中特异性靶向免疫系统，同时安全且耐受性良好。Typhoral 的销售许可证编号为PL15747/0001，日期为1996年12月16日。一个剂量的疫苗含有至少2×10⁹个活伤寒沙门氏菌Ty21a菌落形成单位和至少5×10⁹个失活的伤寒沙门氏菌Ty21a细胞。

这种耐受性良好的、活体口服抗伤寒热疫苗是通过对野生型毒性细菌分离株伤寒沙门氏菌Ty2的化学诱变衍生的，并且含有galE基因功能缺失性突变，导致其不能代谢半乳糖。减毒细菌菌株也不能将硫酸盐还原成硫化物，从而将其与野生型伤寒沙门氏菌Ty2菌株区分开来。关于其血清学特征，伤寒沙门氏菌Ty21a菌株含有O9-抗原(其是细菌外膜的多糖)并且缺乏O5-抗原，而O5-抗原又是鼠伤寒沙门氏菌的特征性成分。该血清学特征支持将相应的测试包括在一组对批量释放的识别测试中的基本原理。

在具体实施方案中，表达盒是真核表达盒。特别是，所述表达盒包含CMV启动子。在本发明的背景中，术语“真核表达盒”是指允许真核细胞中开放阅读框表达的表达盒。已显示，诱导适当的免疫应答所需的外源抗原的量对细菌可能是有毒性的，并可能导致细胞死亡、过度减毒或外源抗原表达缺失。使用在细菌载体中不表达而仅在靶细胞中表达的真核表达盒可以克服这一毒性问题，并且所表达的蛋白通常呈现出真核糖基化模式。

真核表达盒包含能够控制开放阅读框在真核细胞中表达的调控序列，优选为启动子和聚腺苷酸化信号。本发明沙门氏菌减毒株所包含的重组DNA分子所包括的启动子和聚腺苷酸化信号优选被选择为在待免疫的受试者的细胞内起作用。合适的启动子，特别是用于生产人类DNA疫苗的实例包括但不限于来自巨细胞病毒(CMV)的启动子，如强CMV立即早期启动子；猿猴病毒40(SV40)；小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)；人类免疫缺陷病毒(HIV)，如HIV长末端重复(LTR)启动子；莫洛尼病毒；爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)；以及来自劳氏肉瘤病毒(RSV)；由CMV早期增强子元件、鸡β-肌动蛋白基因的启动子、第一外显子和第一内含子，以及兔β珠蛋白基因的剪接受体组成的合成CAG启动子；以及来自人类基因如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人类金属硫蛋白的启动子。在一个具体实施方案中，所述真核表达盒含有CMV启动子。在本发明的背景中，术语“CMV启动子”是指强立即早期巨细胞病毒启动子。

合适的聚腺苷酸化信号，特别是用于生产人类DNA疫苗的聚腺苷酸化信号的实例包括但不限于牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化位点、SV40聚腺苷酸化信号和LTR聚腺苷酸化信号。在一个具体实施方案中，本发明沙门氏菌减毒株所包含的重组DNA分子所包括的真核表达盒包含BGH聚腺苷酸化位点。

除了表达VEGF受体蛋白所需的调控元件，如启动子和聚腺苷酸化信号之外，重组DNA分子中还可包含其他元件。这种其他元件包括增强子。增强子可以是例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸的增强子和病毒增强子如来自CMV、RSV和EBV的增强子。

调控序列和密码子通常是物种依赖的，因此为了使蛋白生产最大化，调控序列和密码子优选被选择为在待免疫的物种中有效。本领域技术人员可以生产在给定受试者物种中有功能的重组DNA分子。

在这一背景下，术语“约”或“近”是在给定值或范围的80％至120％以内，或者90％至110％以内，包括95％至105％以内。

在本发明的背景中，术语“与给定蛋白质(例如，具有如SEQ ID NO 1中所示氨基酸序列的VEGFR-2)具有至少约80％序列一致性的蛋白质”是指的氨基酸序列可能不能同于编码参照蛋白(例如，具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的VEGFR-2)氨基酸序列的蛋白质。所述蛋白可以是天然来源的，例如野生型蛋白的突变形式，例如野生型VEGFR-2的突变形式，或不同物种的同源物，或工程化的蛋白，例如工程化的VEGFR-2。已知密码子的使用在物种之间是不同的。因此，当在靶细胞中表达外源蛋白时，使核酸序列适应靶细胞的密码子使用可能是必要的或至少是有帮助的。

用于设计和构建给定蛋白的衍生物的方法是本领域任一普通技术人员所熟知的。与参照蛋白(例如，具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的VEGFR-2)相比，与给定蛋白质(例如，具有如SEQ ID NO 1中所示氨基酸序列的VEGFR-2)具有至少约80％序列一致性的蛋白质可以含有一个或多个突变，包含一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代。根据本发明的教导，所述缺失、添加和/或取代的氨基酸可以是连续的氨基酸，或者可以散布在与参照蛋白(例如具有如SEQ ID NO 1中所示氨基酸序列的VEGFR-2)具有至少约80％序列一致性的蛋白的氨基酸序列的长度上。根据本发明的教导，只要与参照蛋白的氨基酸序列一致性至少约80％并且突变的蛋白是免疫原性的，则可以添加、缺失和/或取代任意数目的氨基酸。优选地，通过ELISA测量，与参照蛋白(例如，具有如SEQ ID NO1中所示氨基酸序列的VEGFR-2)相比，与给定的参照蛋白(例如，具有如SEQ ID NO 1中所示氨基酸序列的VEGFR-2)具有至少约80％序列一致性的蛋白的免疫原性减少了小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％。用于设计和构建蛋白同源物和用于测试这些同源物的免疫原性潜力的方法是本领域普通任一技术人员所熟知的。在具体实施方案中，与参照蛋白(例如，具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的VEGFR-2)的氨基酸序列一致性为至少约80％，至少约85％，至少约90％或最特别是至少约95％。用于测定序列一致性的方法和算法，包括亲本蛋白与其衍生物(所述衍生物相对于亲本序列具有缺失、添加和/或取代)的比较，是本领域普通技术人员公知的。在DNA水平上，由于遗传密码的简并性，编码与给定参照蛋白(例如具有如SEQ ID NO 1中所示氨基酸序列的VEGFR-2)具有至少约80％序列一致性的蛋白的核酸序列可能在很大程度上不同。

在具体实施方案中，所述DNA分子包含卡那霉素抗生素抗性基因、pMB1ori和CMV启动子。在具体实施方案中，重组DNA分子来源于市售的pVAX1TM表达质粒(Invitrogen，SanDiego，California)。通过用pBR322的低拷贝pMB1复制起点取代高拷贝pUC复制起点来改造该表达载体。进行低拷贝修饰是为了降低代谢负担并使构建体更稳定。将产生的表达载体骨架命名为pVAX10。

在具体实施方案中，所述DNA分子包含如SEQ ID NO 2所示的DNA序列(载体骨架pVAX10)。

通过NheI/XhoI将编码人VEGFR-2(其具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列)的ORF插入到表达载体骨架中，得到表达质粒pVAX10.VR2-1(WO2013/091898)。表达质粒pVAX10.VR2-1示意图如图9。包含携带有表达质粒pVAX10.VR2-1的减毒沙门氏菌菌株Ty21a的DNA疫苗被命名为VXM01(WO2013/091898)。

在具体实施方案中，癌症免疫疗法伴随化学疗法、放射疗法或生物癌症疗法。在具体的这种实施方案中，所述沙门氏菌减毒菌株在化学疗法或放射疗法治疗或生物癌症疗法之前、期间或之后施用，或在化学疗法或放射疗法治疗或生物癌症疗法之前和期间施用。为了治愈癌症，彻底根除癌症干细胞可能是必要的。为获得最大效力，联合不同的治疗方法可能是有益的。

在本发明的背景中，术语“生物癌症疗法”是指这样的癌症疗法，所述癌症疗法涉及使用活生物体(包括病毒)、源自活生物体的物质或这些物质的实验室生产形式。一些癌症的生物疗法旨在刺激身体的免疫系统以对抗癌细胞(所谓的生物癌症免疫疗法)。生物癌症治疗方法包括递送肿瘤抗原和肿瘤基质抗原(例如通过基于沙门氏菌的DNA疫苗，特别是基于伤寒沙门氏菌Ty21a的DNA疫苗)、递送作为药物的治疗性抗体、施用免疫刺激性细胞因子和施用免疫细胞(包括工程化T细胞)。治疗性抗体包括靶向肿瘤抗原或肿瘤基质抗原的抗体。

在具体实施方案中，生物癌症疗法包括施用编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的至少一种另外的DNA疫苗(至少一种另外的沙门氏菌减毒株，其包含含有表达盒的DNA分子的至少一个拷贝)。在具体的这种实施方案中，所述编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的至少一种另外的DNA疫苗选自至少一种另外的沙门氏菌减毒株，所述另外的沙门氏菌减毒株包含含有编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的另外的表达盒的另外的DNA分子的至少一个拷贝。特别是，所述至少一种另外的沙门氏菌减毒菌株是包含另外的真核表达盒的伤寒沙门氏菌Ty21a。

在具体实施方案中，由所述至少一种另外的DNA疫苗编码的所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：人肾母细胞瘤蛋白(Wilms’Tumor Protein，WT1)、人间皮素(MSLN)、人CEA和CMV pp65。特别是，由所述至少一种另外的DNA疫苗编码的所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：具有如SEQ ID NO 3中所示氨基酸序列的人肾母细胞瘤蛋白(WT1)和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 4中所示氨基酸序列的人间皮素(MSLN)和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 5中所示氨基酸序列的人CEA和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 6中所示氨基酸序列的CMVpp65和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 7中所示氨基酸序列的CMV pp65和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质和具有如SEQ ID NO 8中所示氨基酸序列的CMV pp65和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质。特别地，人肾母细胞瘤蛋白(WT1)具有如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列，人间皮素(MSLN)具有如SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列，人CEA具有如SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列，并且CMV pp65具有如SEQ IDNO 6、SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。在具体实施方案中，由所述至少一种另外的DNA疫苗编码的所述肿瘤基质抗原选自人成纤维细胞活化蛋白(FAP)。

在具体实施方案中，编码VEGF受体蛋白的沙门氏菌减毒株在编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的至少一种另外的DNA疫苗之前或同时施用。

在本发明的背景中，术语“与……同时”意指在同一天，更特别是在12小时内，更特别是在2小时内施用所述编码VEGF受体蛋白的沙门氏菌减毒株和所述编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的至少一种另外的DNA疫苗。

在具体实施方案中，施用所述编码VEGF受体蛋白的减毒沙门氏菌菌株和所述编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的至少另外的DNA疫苗在连续的八周内发生，更特别是在连续的三周至六周内发生。编码VEGF受体蛋白的减毒沙门氏菌菌株和编码肿瘤抗原或肿瘤基质抗原的至少一种另外的DNA疫苗可以通过相同途径或通过不同途径施用。例如，特别是如果所述至少一种另外的DNA疫苗是另外的沙门氏菌减毒株，则可以口服施用。

单剂量的另外的沙门氏菌减毒株可包含约10⁵至约10¹¹，特别是约10⁶至约10¹⁰，更特别是约10⁶至约10⁹，更特别是约10⁶至约10⁸，最特别是约10⁶至约10⁷个菌落形成单位(CFU)。

可以与本发明的沙门氏菌减毒突变株联合使用的化学治疗剂可以是例如：吉西他滨、氨磷汀(乙醇)、卡巴他赛、卡铂、奥沙利铂、顺铂、卡培他滨、达卡巴嗪(DTIC)、放线菌素D、多烯紫杉醇、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、链脲霉素、环磷酰胺、尼莫司汀(ACNU)、carrnustine(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、多柔比星脂质体(doxil)、亚叶酸、吉西他滨(健择(gemzar))、道诺霉素、道诺霉素脂质体(daunoxome)、表柔比星、丙卡巴肼、酮康唑、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、长春碱、长春新碱、博来霉素、紫杉醇、多西他赛(泰索帝)、permetrexed、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、CPT-11、10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、美司钠、干扰素α、干扰素β、伊立替康、米托蒽醌、拓扑替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、奥沙利铂、普卡霉素、米托坦、培门冬酶(pegaspargase)、喷司他汀、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素、链脲霉素、他莫西芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、噻替派、乌拉莫司汀(uracil mustard)、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、替莫唑胺及其组合。

本发明最优选的化疗剂是卡巴他赛、卡铂、奥沙利铂、顺铂、环磷酰胺、多西他赛、依托泊苷、吉西他滨、多柔比星、洛莫司汀、紫杉醇、伊立替康、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、亚叶酸、5-氟尿嘧啶、博来霉素和替莫唑胺，尤其是吉西他滨。

在具体实施方案中，癌症免疫疗法伴随化学疗法和放射疗法的组合。在具体的这种实施方案中，化学疗法包括施用替莫唑胺。

在具体实施方案中，减毒的沙门氏菌菌株通过口服施用。口服施用比肠胃外施用更简单、更安全、更舒适。然而，必须要注意的是，编码VEGF受体蛋白的沙门氏菌减毒株也可以通过任意其他合适的途径施用。优选地，向受试者施用治疗有效剂量，并且该剂量取决于具体应用，恶性肿瘤类型，受试者的体重、年龄、性别和健康状况，施用方式和制剂等。根据需要，施用可以是单次或多次。

编码VEGF受体蛋白的沙门氏菌减毒株可以以溶液、悬浮液、冻干物、肠溶包衣胶囊或任意其他合适的形式提供。所述沙门氏菌减毒株通常被配制成饮用溶液。该实施例的患者依从性有所改善。优选地，所述饮用溶液包含将胃酸至少中和至某一程度，即，使胃液的pH接近pH 7的手段。优选地，所述饮用溶液是包含编码VEGF受体蛋白的沙门氏菌减毒株的缓冲悬浮液。在一个具体实施方案中，所述缓冲悬浮液通过使沙门氏菌减毒株悬浮在合适的缓冲液中而获得，优选地，所述合适的缓冲液含有2.6g碳酸氢钠、1.7g L-抗坏血酸、0.2g乳糖一水合物和100ml的饮用水。

编码VEGF受体蛋白的沙门氏菌减毒株在相对低的剂量下令人惊讶地有效。编码VEGF受体蛋白的沙门氏菌减毒株的功效在具有癌症特异性VEGF受体蛋白表达的癌症中特别高。施用低剂量的活细菌疫苗使排泄的风险降至最低，并由此使传播给第三方的风险降至最低。

在具体实施方案中，编码VEGF受体蛋白的沙门氏菌减毒株，特别是编码人VEGFR-2伤寒沙门氏菌Ty21a减毒株的单一剂量包含约10⁵至约10¹¹菌落形成单位(CFU)，具体地，约10⁶至约10¹⁰菌落形成单位(CFU)，更具体地，约10⁶至约10⁹菌落形成单位(CFU)，更具体地，约10⁶至约10⁸菌落形成单位(CFU)，最具体地，约10⁶至约10⁷菌落形成单位(CFU)。

在这一背景下，术语“约”或“近”意指给定值或范围的3倍以内，或者2倍以内，包括1.5倍以内。

在具体实施方案中，所述沙门氏菌减毒株用于个体化的癌症免疫疗法，其包括评估患者针对至少一种VEGF受体蛋白(特别是VEGFR-2)的表达模式和/或免疫前应答的步骤。或者，所述沙门氏菌减毒株用于患者的癌症免疫疗法，其中所述患者已被确定患有被表达VEGF受体蛋白(例如，VEGFR-2)的癌细胞表征的癌症，或者被确定为具有表达至少一种VEGF受体蛋白(例如，VEGFR-2)的癌细胞，特别是通过评估针对至少一种VEGF受体蛋白(特别是VEGFR-2)的表达模式和/或免疫前应答。可以在第一步中例如通过伴随诊断来评估患者的VEGF受体蛋白表达和/或患者针对VEGF受体蛋白的免疫前应答。用于在mRNA或蛋白质水平上评估靶基因(例如VEGFR-2)的表达的方法是本领域普通技术人员所熟知的。例如，免疫组织化学染色、流式细胞术方法或RNA测序，或使用标记的替代方法可用于鉴定肿瘤中靶标表达的水平。类似地，用于评估患者针对给定蛋白质(例如VEGFR-2)的免疫前应答的方法是本领域普通技术人员所熟知的。患者的预先存在的VEGFR-2特异性T细胞池可以通过例如ELISpot或多聚体FACS分析进行检测。高肿瘤特异性VEGFR-2表达和/或针对VEGFR-2的免疫前应答的发生是患者对用编码VEGFR-2的沙门氏菌减毒株治疗具有特别有利地响应的预后指标。

取决于可能发生的副作用，包括使用抗生素或抗炎剂的治疗可能是有利的。

如果发生类似由组胺、白三烯或细胞因子介导的过敏反应的不良事件，则可使用针对发热、过敏反应、血压不稳定、支气管痉挛和呼吸困难的治疗选择。在不期望的T细胞衍生的自我攻击的情况下，治疗选择来源于干细胞移植后应用的急性和慢性移植物抗宿主病的标准处理方案。提出环孢菌素和糖皮质激素作为治疗选择。

在不太可能的全身性伤寒沙门氏菌Ty21a型感染的情况下，推荐适当的抗生素治疗，例如使用氟喹诺酮类(fluoroquinolones)，包括环丙沙星(ciprofloxacin)或氧氟沙星(ofloxacin)。胃肠道的细菌感染使用相应的药剂例如利福昔明(rifaximin)来进行治疗。

编码VEGF受体蛋白的沙门氏菌减毒株可以在药物组合物中提供。药物组合物可以是溶液、悬浮液、肠溶包衣胶囊、冻干粉末或适用于预期用途的任意其他形式。

药物组合物还可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。

在本发明的背景中，术语“赋形剂”是指与药物的活性成分一起配制的天然或合成物质。合适的赋形剂包括抗粘剂、粘合剂、包衣、崩解剂、调味剂、着色剂、润滑剂、助流剂、吸收剂、防腐剂和甜味剂。

在本发明的背景中，术语“药学上可接受的”是指，当施用于哺乳动物(例如人)时生理上可耐受的并且通常不产生不利反应的药物组合物的分子物质和其他成分。术语“药学上可接受的”还可以表示由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于哺乳动物，更特别是用于人的。

在具体实施方案中，药物组合物作为饮用溶液提供。该实施例的患者依从性有所改善，并且使得可以进行快速、可行且实惠的大规模疫苗接种。

特别是，合适的饮用溶液包含将胃酸至少中和至某一程度，即，使胃液的pH接近pH7的手段。在一个具体实施方案中，饮用溶液是缓冲悬浮液，所述缓冲悬浮液通过使本发明的沙门氏菌减毒株悬浮在合适的缓冲液中而获得，优选地，在将胃酸至少中和至某一程度的缓冲液中，优选地，在含有2.6g碳酸氢钠、1.7g L-抗坏血酸酸、0.2g乳糖一水合物和100ml饮用水的缓冲液中。

在具体实施方案中，癌症免疫疗法包括单次或多次施用编码VEGF受体蛋白的沙门氏菌减毒株或包含其的药物组合物。施用的单一剂量可以相同或不同。特别是，癌症免疫疗法包括1、2、3、4、5或6次施用编码VEGF受体蛋白的沙门氏菌减毒株，优选地，其中多次施用发生在连续的3至6个月中。

附图说明

图1：人VEGFR-2的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)，其由质粒pVAX10.VR2-1中包含的VEGFR-2cDNA编码；

图2：空表达载体pVAX10中所包含的核酸序列(不含限制性位点NheI和XhoI之间的多克隆位点部分的表达载体pVAX10的序列)(SEQ ID NO 2)；

图3：质粒pVAX10.hWT1中所包含的WT-1cDNA所编码的截短的(锌指结构域被删除)人WT-1的氨基酸序列(SEQ ID NO 3)；

图4：质粒pVAX10.hMSLN中所包含的MSLN cDNA所编码的人MSLN的氨基酸序列(SEQID NO 4)；

图5：质粒pVAX10.hCEA中所包含的CEA cDNA所编码的人CEA的氨基酸序列(SEQ IDNO 5)；

图6：质粒pVAX10.CMVpp65_1中所包含的CMV pp65cDNA所编码的人CMV pp65的氨基酸序列(SEQ ID NO 6)；

图7：质粒pVAX10.CMVpp65_2中所包含的CMV pp65cDNA所编码的人CMV pp65的氨基酸序列(SEQ ID NO 7)；

图8：质粒pVAX10.CMVpp65_3中所包含的CMV pp65cDNA所编码的人CMV pp65的氨基酸序列(SEQ ID NO 8)；

图9：pVAX10.VR2-1的质粒图谱；

图10：患者2605的脑MRI图像

实施例

实施例1VXM01治疗具有可手术的胶质母细胞瘤复发的患者

本研究的目的是检测编码VEGFR-2的DNA疫苗VXM01的安全性、耐受性、免疫和生物标志物反应。

该研究在患有可进行手术的胶质母细胞瘤复发的患者中进行，至少一种标准治疗对该患者失败，所述标准治疗必须包括使用替莫唑胺的放化疗。所有患者均接受DNA疫苗VXM01作为其标准疗法的附加物。

该研究由以下组成：筛选期、治疗和观察期(直至第3个月)、肿瘤随访(从第3个月到第12个月)以及加强治疗期(在肿瘤随访期间的第8周至第48周之间)。研究结束后，患者随访长达2年。

治疗和观察期包括在介入后第1、3、5和7天各口服施用一次VXM01，并在第5±1周再次手术。在加强治疗期间，在第8、12、16、20、24、28、32、36、40、44和48周以每4周口服一次的单次加强剂量施用VXM01。

以10⁶和10⁷菌落形成单位(CFU)/ml的单剂量口服施用VXM01。

九个胶质母细胞瘤患者中有五个显示出有利的病程。

患者2605：

患者2605是一名55岁的女性患者，患有复发性胶质母细胞瘤WHO IV级。先前的癌症治疗包括胶质母细胞瘤的第一次手术和用Gy 60随后用75mg/m²替莫唑胺进行的一线放化疗。

患者用剂量为10⁶CFU的VXM01治疗。VXM01治疗开始于研究第1、3、5和7天的4次初始给药，并在第35天的常规手术后继续进行，从第8周开始每4周进行加强给药。在第10周，除VXM01之外，开始洛莫司汀/依托泊苷化疗。

筛选就诊时的肿瘤参照靶病变为25×10mm。肿瘤大小发展总结在表1中：

表1：

靶病变	肿瘤直径1[mm]	肿瘤直径2[mm]
			基线	25	10
第10天	28	13
			第21天	27	13
第35天	25	12
			第12周	0	0
第20周	0	0
			第36周	0	0
第52周	0	0
			第60周	0	0
第76周	0	0

图10中描绘了基线和第35天、第12周、第20周和第76周的相应MRI图像。

在研究第10天和第35天的常规手术之间，肿瘤大小趋向于从28×13mm减小至25×12mm。根据RANO标准，这被评估为稳定疾病(SD)。在第35天进行常规再次手术后第12周、第7周，由于新的非靶病变的发生，根据RANO标准的评估是进行性疾病(PD)。手术后，第12周在MRI报告没有可见的“靶病变”。除VXM01之外，开始洛莫司汀/依托泊苷化疗。在第20周(即再次手术后15周)，根据RANO标准将肿瘤评估为稳定疾病(SD)。在第36周，停止洛莫司汀/依托泊苷化疗，并且每4周用VXM01继续治疗患者，并且在提交本申请之前没有停止治疗。

Karnofsky指数在筛选时为100％，在第12周时为90％。

在研究前收集的原发性肿瘤样品的免疫组织化学染色显示该患者的肿瘤细胞表达VEGFR-2。在第35天的复发肿瘤样品中，在用VXM01治疗后，显示肿瘤细胞不表达VEGFR-2。

在肿瘤组织免疫组织化学中，VXM01治疗后复发肿瘤中CD8+T细胞与原发肿瘤相比增加了2.3倍。

序列表

<110> 万科斯蒙股份有限公司

<120> 新型的靶向VEGFR-2的免疫治疗方法

<130> 113255P855PC

<150> EP17156718.3

<151> 2017-02-17

<160> 8

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 1356

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Gln Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu

1 5 10 15

Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro

20 25 30

Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr

35 40 45

Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro

50 55 60

Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser

65 70 75 80

Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn

85 90 95

Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser

100 105 110

Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser

115 120 125

Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys

130 135 140

Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser

145 150 155 160

Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg

165 170 175

Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile

180 185 190

Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser

195 200 205

Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr

210 215 220

Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu

225 230 235 240

Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile

245 250 255

Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu

260 265 270

Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe

275 280 285

Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu

290 295 300

Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr

305 310 315 320

Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met

325 330 335

Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala

340 345 350

Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly

355 360 365

Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr

370 375 380

Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu

385 390 395 400

Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val

405 410 415

Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val

420 425 430

Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr

435 440 445

Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu

450 455 460

Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr

465 470 475 480

Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys

485 490 495

Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys

500 505 510

Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr

515 520 525

Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser

530 535 540

Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln

545 550 555 560

Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser

565 570 575

Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro

580 585 590

Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr

595 600 605

Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile

610 615 620

Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr

625 630 635 640

Val Cys Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val

645 650 655

Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn

660 665 670

Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys

675 680 685

Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn

690 695 700

Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg

705 710 715 720

Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr

725 730 735

Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe

740 745 750

Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Ile Ile Ile Leu

755 760 765

Val Gly Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile

770 775 780

Ile Leu Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Gly Gly Glu Leu Lys Thr Gly

785 790 795 800

Tyr Leu Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His

805 810 815

Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp

820 825 830

Arg Leu Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val

835 840 845

Ile Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr

850 855 860

Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg

865 870 875 880

Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu

885 890 895

Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu

900 905 910

Met Val Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu

915 920 925

Arg Ser Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg

930 935 940

Phe Arg Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys

945 950 955 960

Arg Arg Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly

965 970 975

Phe Val Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro

980 985 990

Glu Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr

995 1000 1005

Ser Phe Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys

1010 1015 1020

Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn

1025 1030 1035 1040

Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp

1045 1050 1055

Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met

1060 1065 1070

Ala Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr Ile Gln Ser Asp Val

1075 1080 1085

Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser

1090 1095 1100

Pro Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys

1105 1110 1115 1120

Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr

1125 1130 1135

Gln Thr Met Leu Asp Cys Trp His Gly Glu Pro Ser Gln Arg Pro Thr

1140 1145 1150

Phe Ser Glu Leu Val Glu His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala

1155 1160 1165

Gln Gln Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Val Leu Pro Ile Ser Glu Thr Leu

1170 1175 1180

Ser Met Glu Glu Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Val Ser

1185 1190 1195 1200

Cys Met Glu Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn

1205 1210 1215

Thr Ala Gly Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg

1220 1225 1230

Pro Val Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu

1235 1240 1245

Val Lys Val Ile Pro Asp Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val Leu

1250 1255 1260

Ala Ser Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Thr Lys Leu Ser Pro

1265 1270 1275 1280

Ser Phe Gly Gly Met Val Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser Val Ala Ser

1285 1290 1295

Glu Gly Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly Tyr His Ser Asp

1300 1305 1310

Asp Thr Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Glu Glu Ala Glu Leu Leu Lys

1315 1320 1325

Leu Ile Glu Ile Gly Val Gln Thr Gly Ser Thr Ala Gln Ile Leu Gln

1330 1335 1340

Pro Asp Ser Gly Thr Thr Leu Ser Ser Pro Pro Val

1345 1350 1355

<210> 2

<211> 3500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表达质粒

<400> 2

tgggcttttg ctggcctttt gctcacatgt tcttgactct tcgcgatgta cgggccagat 60

atacgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 120

ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 180

gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 240

caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggactattt acggtaaact gcccacttgg 300

cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 360

ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 420

tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 480

gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 540

gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 600

tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctctggc 660

taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga 720

cccaagctgg ctagcctcga gtctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact 780

gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg 840

gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg 900

agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg 960

gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctac tgggcggttt 1020

tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc 1080

cctgcaaagt aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa 1140

gctctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg 1200

caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa 1260

tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg 1320

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ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa 1440

gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc 1500

ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg 1560

ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg 1620

aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg 1680

aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg 1740

gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact 1800

gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg 1860

ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc 1920

ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attattaacg 1980

cttacaattt cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 2040

tacaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 2100

acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatagca 2160

cgtgctaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 2220

catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc cccatcagtg 2280

accaaacagg aaaaaaccgc ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg 2340

cttctggaga aactcaacga gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt 2400

cacgaccacg ctgatgagct ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 2460

aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 2520

agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg 2580

acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 2640

ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat 2700

accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 2760

tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 2820

ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 2880

ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 2940

gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 3000

gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 3060

ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 3120

tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 3180

gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 3240

tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 3300

tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 3360

tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 3420

ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 3480

ctcaagaaga tcctttgatc 3500

<210> 3

<211> 371

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro

1 5 10 15

Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala

20 25 30

Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr

35 40 45

Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro

50 55 60

Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly

65 70 75 80

Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe

85 90 95

Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe

100 105 110

Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe

115 120 125

Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile

130 135 140

Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr

145 150 155 160

Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe

165 170 175

Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln

180 185 190

Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser

195 200 205

Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp

210 215 220

Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln

225 230 235 240

Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser

245 250 255

Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu

260 265 270

Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile

275 280 285

His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro

290 295 300

Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys

305 310 315 320

Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys

325 330 335

Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro

340 345 350

Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp

355 360 365

Gln Leu Lys

370

<210> 4

<211> 630

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

Met Ala Leu Pro Thr Ala Arg Pro Leu Leu Gly Ser Cys Gly Thr Pro

1 5 10 15

Ala Leu Gly Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu Gly Trp Val Gln

20 25 30

Pro Ser Arg Thr Leu Ala Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu

35 40 45

Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Ile Ser Ser Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Gln Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu Ser Thr Glu

65 70 75 80

Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys Asn Val Lys Leu

85 90 95

Ser Thr Glu Gln Leu Arg Cys Leu Ala His Arg Leu Ser Glu Pro Pro

100 105 110

Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Leu Phe Leu Asn Pro

115 120 125

Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gln Ala Cys Thr Arg Phe Phe Ser Arg Ile

130 135 140

Thr Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg Gln

145 150 155 160

Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser Leu

165 170 175

Leu Ser Glu Ala Asp Val Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp Leu

180 185 190

Pro Gly Arg Phe Val Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg Leu

195 200 205

Val Ser Cys Pro Gly Pro Leu Asp Gln Asp Gln Gln Glu Ala Ala Arg

210 215 220

Ala Ala Leu Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Trp

225 230 235 240

Ser Val Ser Thr Met Asp Ala Leu Arg Gly Leu Leu Pro Val Leu Gly

245 250 255

Gln Pro Ile Ile Arg Ser Ile Pro Gln Gly Ile Val Ala Ala Trp Arg

260 265 270

Gln Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gln Pro Glu Arg Thr Ile

275 280 285

Leu Arg Pro Arg Phe Arg Arg Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser

290 295 300

Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile Asp Glu Ser Leu Ile Phe Tyr Lys Lys

305 310 315 320

Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val Asp Ala Ala Leu Leu Ala Thr Gln Met

325 330 335

Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val Leu

340 345 350

Lys His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser Val

355 360 365

Ile Gln His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile

370 375 380

Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu

385 390 395 400

Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser Pro Gln Ala Pro Arg Arg Pro Leu

405 410 415

Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile Asp Arg Phe Val Lys Gly Arg Gly Gln

420 425 430

Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr

435 440 445

Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser

450 455 460

Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln

465 470 475 480

Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn

485 490 495

Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys Ile Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro

500 505 510

Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu

515 520 525

Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val

530 535 540

Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala

545 550 555 560

Glu Glu Arg His Arg Pro Val Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln

565 570 575

Asp Asp Leu Asp Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn

580 585 590

Gly Tyr Leu Val Leu Asp Leu Ser Met Gln Glu Ala Leu Ser Gly Thr

595 600 605

Pro Cys Leu Leu Gly Pro Gly Pro Val Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu

610 615 620

Leu Ala Ser Thr Leu Ala

625 630

<210> 5

<211> 702

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 5

Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln

1 5 10 15

Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr

20 25 30

Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly

35 40 45

Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly

50 55 60

Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile

65 70 75 80

Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser

85 90 95

Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile

100 105 110

Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp

115 120 125

Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu

130 135 140

Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys

145 150 155 160

Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr

165 170 175

Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln

180 185 190

Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn

195 200 205

Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg

210 215 220

Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro

225 230 235 240

Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn

245 250 255

Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe

260 265 270

Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn

275 280 285

Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser

290 295 300

Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu

325 330 335

Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr

340 345 350

Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg

355 360 365

Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr

370 375 380

Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Lys Leu Ser

385 390 395 400

Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp

405 410 415

Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser

435 440 445

Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile

450 455 460

Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn

465 470 475 480

Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val

485 490 495

Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro

500 505 510

Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln

515 520 525

Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser

530 535 540

Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn

545 550 555 560

Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser

565 570 575

Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly

580 585 590

Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly

595 600 605

Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln

610 615 620

Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu

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Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe

645 650 655

Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile

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Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr

675 680 685

Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile

690 695 700

<210> 6

<211> 561

<212> PRT

<213> 巨细胞病毒（Cytomegalovirus）

<400> 6

Met Glu Ser Arg Gly Arg Arg Cys Pro Glu Met Ile Ser Val Leu Gly

1 5 10 15

Pro Ile Ser Gly His Val Leu Lys Ala Val Phe Ser Arg Gly Asp Thr

20 25 30

Pro Val Leu Pro His Glu Thr Arg Leu Leu Gln Thr Gly Ile His Val

35 40 45

Arg Val Ser Gln Pro Ser Leu Ile Leu Val Ser Gln Tyr Thr Pro Asp

50 55 60

Ser Thr Pro Cys His Arg Gly Asp Asn Gln Leu Gln Val Gln His Thr

65 70 75 80

Tyr Phe Thr Gly Ser Glu Val Glu Asn Val Ser Val Asn Val His Asn

85 90 95

Pro Thr Gly Arg Ser Ile Cys Pro Ser Gln Glu Pro Met Ser Ile Tyr

100 105 110

Val Tyr Ala Leu Pro Leu Lys Met Leu Asn Ile Pro Ser Ile Asn Val

115 120 125

His His Tyr Pro Ser Ala Ala Glu Arg Lys His Arg His Leu Pro Val

130 135 140

Ala Asp Ala Val Ile His Ala Ser Gly Lys Gln Met Trp Gln Ala Arg

145 150 155 160

Leu Thr Val Ser Gly Leu Ala Trp Thr Arg Gln Gln Asn Gln Trp Lys

165 170 175

Glu Pro Asp Val Tyr Tyr Thr Ser Ala Phe Val Phe Pro Thr Lys Asp

180 185 190

Val Ala Leu Arg His Val Val Cys Ala His Glu Leu Val Cys Ser Met

195 200 205

Glu Asn Thr Arg Ala Thr Lys Met Gln Val Ile Gly Asp Gln Tyr Val

210 215 220

Lys Val Tyr Leu Glu Ser Phe Cys Glu Asp Val Pro Ser Gly Lys Leu

225 230 235 240

Phe Met His Val Thr Leu Gly Ser Asp Val Glu Glu Asp Leu Thr Met

245 250 255

Thr Arg Asn Pro Gln Pro Phe Met Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe

260 265 270

Thr Val Leu Cys Pro Lys Asn Met Ile Ile Lys Pro Gly Lys Ile Ser

275 280 285

His Ile Met Leu Asp Val Ala Phe Thr Ser His Glu His Phe Gly Leu

290 295 300

Leu Cys Pro Lys Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ile Ser Gly Asn Leu Leu

305 310 315 320

Met Asn Gly Gln Gln Ile Phe Leu Glu Val Gln Ala Ile Arg Glu Thr

325 330 335

Val Glu Leu Arg Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe Phe Phe Asp

340 345 350

Ile Asp Leu Leu Leu Gln Arg Gly Pro Gln Tyr Ser Glu His Pro Thr

355 360 365

Phe Thr Ser Gln Tyr Arg Ile Gln Gly Lys Leu Glu Tyr Arg His Thr

370 375 380

Trp Asp Arg His Asp Glu Gly Ala Ala Gln Gly Asp Asp Asp Val Trp

385 390 395 400

Thr Ser Gly Ser Asp Ser Asp Glu Glu Leu Val Thr Thr Glu Arg Lys

405 410 415

Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met Ala Gly Ala Ser Thr Ser

420 425 430

Ala Gly Arg Lys Arg Lys Ser Ala Ser Ser Ala Thr Ala Cys Thr Ala

435 440 445

Gly Val Met Thr Arg Gly Arg Leu Lys Ala Glu Ser Thr Val Ala Pro

450 455 460

Glu Glu Asp Thr Asp Glu Asp Ser Asp Asn Glu Ile His Asn Pro Ala

465 470 475 480

Val Phe Thr Trp Pro Pro Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn Leu

485 490 495

Val Pro Met Val Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Glu

500 505 510

Phe Phe Trp Asp Ala Asn Asp Ile Tyr Arg Ile Phe Ala Glu Leu Glu

515 520 525

Gly Val Trp Gln Pro Ala Ala Gln Pro Lys Arg Arg Arg His Arg Gln

530 535 540

Asp Ala Leu Pro Gly Pro Cys Ile Ala Ser Thr Pro Lys Lys His Arg

545 550 555 560

Gly

<210> 7

<211> 561

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的CMV pp65

<400> 7

Met Glu Ser Arg Gly Arg Arg Cys Pro Glu Met Ile Ser Val Leu Gly

1 5 10 15

Pro Ile Ser Gly His Val Leu Lys Ala Val Phe Ser Arg Gly Asp Thr

20 25 30

Pro Val Leu Pro His Glu Thr Arg Leu Leu Gln Thr Gly Ile His Val

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Arg Val Ser Gln Pro Ser Leu Ile Leu Val Ser Gln Tyr Thr Pro Asp

50 55 60

Ser Thr Pro Cys His Arg Gly Asp Asn Gln Leu Gln Val Gln His Thr

65 70 75 80

Tyr Phe Thr Gly Ser Glu Val Glu Asn Val Ser Val Asn Val His Asn

85 90 95

Pro Thr Gly Arg Ser Ile Cys Pro Ser Gln Glu Pro Met Ser Ile Tyr

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Val Tyr Ala Leu Pro Leu Lys Met Leu Asn Ile Pro Ser Ile Asn Val

115 120 125

His His Tyr Pro Ser Ala Ala Glu Arg Lys His Arg His Leu Pro Val

130 135 140

Ala Asp Ala Val Ile His Ala Ser Gly Lys Gln Met Trp Gln Ala Arg

145 150 155 160

Leu Thr Val Ser Gly Leu Ala Trp Thr Arg Gln Gln Asn Gln Trp Lys

165 170 175

Glu Pro Asp Val Tyr Tyr Thr Ser Ala Phe Val Phe Pro Thr Lys Asp

180 185 190

Val Ala Leu Arg His Val Val Cys Ala His Glu Leu Val Cys Ser Met

195 200 205

Glu Asn Thr Arg Ala Thr Lys Met Gln Val Ile Gly Asp Gln Tyr Val

210 215 220

Lys Val Tyr Leu Glu Ser Phe Cys Glu Asp Val Pro Ser Gly Lys Leu

225 230 235 240

Phe Met His Val Thr Leu Gly Ser Asp Val Glu Glu Asp Leu Thr Met

245 250 255

Thr Arg Asn Pro Gln Pro Phe Met Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe

260 265 270

Thr Val Leu Cys Pro Lys Asn Met Ile Ile Lys Pro Gly Lys Ile Ser

275 280 285

His Ile Met Leu Asp Val Ala Phe Thr Ser His Glu His Phe Gly Leu

290 295 300

Leu Cys Pro Lys Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ile Ser Gly Asn Leu Leu

305 310 315 320

Met Asn Gly Gln Gln Ile Phe Leu Glu Val Gln Ala Ile Arg Glu Thr

325 330 335

Val Glu Leu Arg Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe Phe Phe Asp

340 345 350

Ile Asp Leu Leu Leu Gln Arg Gly Pro Gln Tyr Ser Glu His Pro Thr

355 360 365

Phe Thr Ser Gln Tyr Arg Ile Gln Gly Lys Leu Glu Tyr Arg His Thr

370 375 380

Trp Asp Arg His Asp Glu Gly Ala Ala Gln Gly Asp Asp Asp Val Trp

385 390 395 400

Thr Ser Gly Ser Asp Ser Asp Glu Glu Leu Val Thr Thr Glu Arg Lys

405 410 415

Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met Ala Gly Ala Ser Thr Ser

420 425 430

Ala Gly Arg Asn Arg Lys Ser Ala Ser Ser Ala Thr Ala Cys Thr Ala

435 440 445

Gly Val Met Thr Arg Gly Arg Leu Lys Ala Glu Ser Thr Val Ala Pro

450 455 460

Glu Glu Asp Thr Asp Glu Asp Ser Asp Asn Glu Ile His Asn Pro Ala

465 470 475 480

Val Phe Thr Trp Pro Pro Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn Leu

485 490 495

Val Pro Met Val Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Glu

500 505 510

Phe Phe Trp Asp Ala Asn Asp Ile Tyr Arg Ile Phe Ala Glu Leu Glu

515 520 525

Gly Val Trp Gln Pro Ala Ala Gln Pro Lys Arg Arg Arg His Arg Gln

530 535 540

Asp Ala Leu Pro Gly Pro Cys Ile Ala Ser Thr Pro Lys Lys His Arg

545 550 555 560

Gly

<210> 8

<211> 536

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的CMV pp65

<400> 8

Met Glu Ser Arg Gly Arg Arg Cys Pro Glu Met Ile Ser Val Leu Gly

1 5 10 15

Pro Ile Ser Gly His Val Leu Lys Ala Val Phe Ser Arg Gly Asp Thr

20 25 30

Pro Val Leu Pro His Glu Thr Arg Leu Leu Gln Thr Gly Ile His Val

35 40 45

Arg Val Ser Gln Pro Ser Leu Ile Leu Val Ser Gln Tyr Thr Pro Asp

50 55 60

Ser Thr Pro Cys His Arg Gly Asp Asn Gln Leu Gln Val Gln His Thr

65 70 75 80

Tyr Phe Thr Gly Ser Glu Val Glu Asn Val Ser Val Asn Val His Asn

85 90 95

Pro Thr Gly Arg Ser Ile Cys Pro Ser Gln Glu Pro Met Ser Ile Tyr

100 105 110

Val Tyr Ala Leu Pro Leu Lys Met Leu Asn Ile Pro Ser Ile Asn Val

115 120 125

His His Tyr Pro Ser Ala Ala Glu Arg Lys His Arg His Leu Pro Val

130 135 140

Ala Asp Ala Val Ile His Ala Ser Gly Lys Gln Met Trp Gln Ala Arg

145 150 155 160

Leu Thr Val Ser Gly Leu Ala Trp Thr Arg Gln Gln Asn Gln Trp Lys

165 170 175

Glu Pro Asp Val Tyr Tyr Thr Ser Ala Phe Val Phe Pro Thr Lys Asp

180 185 190

Val Ala Leu Arg His Val Val Cys Ala His Glu Leu Val Cys Ser Met

195 200 205

Glu Asn Thr Arg Ala Thr Lys Met Gln Val Ile Gly Asp Gln Tyr Val

210 215 220

Lys Val Tyr Leu Glu Ser Phe Cys Glu Asp Val Pro Ser Gly Lys Leu

225 230 235 240

Phe Met His Val Thr Leu Gly Ser Asp Val Glu Glu Asp Leu Thr Met

245 250 255

Thr Arg Asn Pro Gln Pro Phe Met Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe

260 265 270

Thr Val Leu Cys Pro Lys Asn Met Ile Ile Lys Pro Gly Lys Ile Ser

275 280 285

His Ile Met Leu Asp Val Ala Phe Thr Ser His Glu His Phe Gly Leu

290 295 300

Leu Cys Pro Lys Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ile Ser Gly Asn Leu Leu

305 310 315 320

Met Asn Gly Gln Gln Ile Phe Leu Glu Val Gln Ala Ile Arg Glu Thr

325 330 335

Val Glu Leu Arg Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe Phe Phe Asp

340 345 350

Ile Asp Leu Leu Leu Gln Arg Gly Pro Gln Tyr Ser Glu His Pro Thr

355 360 365

Phe Thr Ser Gln Tyr Arg Ile Gln Gly Lys Leu Glu Tyr Arg His Thr

370 375 380

Trp Asp Arg His Asp Glu Gly Ala Ala Gln Gly Asp Asp Asp Val Trp

385 390 395 400

Thr Ser Gly Ser Asp Ser Asp Glu Glu Leu Val Thr Thr Glu Arg Lys

405 410 415

Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met Ala Gly Ala Ser Thr Ser

420 425 430

Ala Gly Arg Asn Arg Lys Ser Ala Ser Ser Ala Thr Ala Cys Thr Ala

435 440 445

Gly Val Met Thr Arg Gly Arg Leu Lys Ala Glu Ser Thr Val Ala Pro

450 455 460

Glu Glu Asp Thr Asp Glu Asp Ser Asp Asn Glu Ile His Asn Pro Ala

465 470 475 480

Val Phe Thr Trp Pro Pro Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn Leu

485 490 495

Val Pro Met Val Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Glu

500 505 510

Phe Phe Trp Asp Ala Asn Asp Ile Tyr Arg Ile Phe Ala Glu Leu Glu

515 520 525

Gly Val Trp Gln Pro Ala Ala Gln

530 535

Claims

1.一种用于癌症免疫疗法的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码VEGF受体蛋白的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝，其中所述癌症被表达VEGF受体蛋白的癌细胞表征。

2.根据权利要求1所使用的沙门氏菌减毒株，其中所述癌症选自胶质母细胞瘤、类癌、肾癌，特别是肾细胞癌、甲状腺癌、肺癌，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃肠癌，特别是结直肠癌，更特别是结肠癌和皮肤癌，特别是黑素瘤。

3.一种用于患者的癌症免疫疗法的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码VEGF受体蛋白的表达盒的DNA分子的至少一个拷贝，其中所述患者包含表达至少一种VEGF受体蛋白的癌细胞。

4.根据权利要求1至3中任一项所使用的沙门氏菌减毒株，其中，所述沙门氏菌减毒株是肠道沙门氏菌菌种，特别是其中所述沙门氏菌减毒株是伤寒沙门氏菌Ty21a。

5.根据权利要求1至4中任一项所使用的沙门氏菌减毒株，其中所述表达盒是真核表达盒，特别是其中所述表达盒包含CMV启动子。

6.根据权利要求1至5中任一项所使用的沙门氏菌减毒株，其中所述VEGF受体蛋白是VEGFR-2，特别是其中所述VEGF受体蛋白选自由以下组成的组：具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的VEGFR-2以及与其具有至少80％序列一致性的蛋白，特别是其中所述VEGF受体蛋白具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求1至6中任一项所使用的沙门氏菌减毒株，其中所述DNA分子包含卡那霉素抗生素抗性基因、pMB1 ori和CMV启动子，特别是其中所述DNA分子包含如SEQ ID NO2所示的DNA序列。

8.根据权利要求1至7中任一项所使用的沙门氏菌减毒株，其中所述癌症免疫疗法伴随化学疗法、放射疗法或生物癌症疗法，特别是其中所述沙门氏菌减毒株在化疗或放疗治疗或生物癌症疗法之前、期间或之后施用，或在化疗或放疗治疗或生物癌症疗法之前和期间施用。

9.根据权利要求8所使用的沙门氏菌减毒株，其中所述生物癌症疗法包括施用编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的至少一种另外的DNA疫苗，特别是选自至少一种另外的沙门氏菌减毒株，所述另外的沙门氏菌减毒株包含含有编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的另外的表达盒的另外的DNA分子的至少一个拷贝，特别是，其中所述至少一种另外的沙门氏菌减毒菌株是包含另外的真核表达盒的伤寒沙门氏菌Ty21a。

10.根据权利要求9所使用的沙门氏菌减毒株，其中由所述至少一种另外的DNA疫苗编码的所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：人肾母细胞瘤蛋白、人间皮素(MSLN)、人CEA和CMVpp65。

11.根据权利要求10所使用的沙门氏菌减毒株，其中所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：具有如SEQ ID NO3中所示氨基酸序列的人肾母细胞瘤蛋白蛋白(WT1)和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO4中所示氨基酸序列的人间皮素(MSLN)和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO5中所示氨基酸序列的人CEA和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO6中所示氨基酸序列的CMVpp65和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质、具有如SEQ ID NO7中所示氨基酸序列的CMV pp65和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质和具有如SEQ ID NO8中所示氨基酸序列的CMV pp65和与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质。

12.根据权利要求9所使用的沙门氏菌减毒株，其中由所述至少一种另外的DNA疫苗编码的所述肿瘤基质抗原是人成纤维细胞活化蛋白(FAP)。

13.根据权利要求1至12中任一项所使用的沙门氏菌减毒株，其中，所述沙门氏菌减毒株通过口服施用。

14.根据权利要求1至13中任一项所使用的沙门氏菌减毒株，其中，所述沙门氏菌减毒株的单剂量包含约10⁵至约10¹¹，特别是约10⁶至约10¹⁰，更特别是约10⁶至约10⁹，更特别是约10⁶至约10⁸，最特别是约10⁶至约10⁷个菌落形成单位(CFU)。

15.根据权利要求1至14中任一项所使用的沙门氏菌减毒株，其中其用于个体化的癌症免疫疗法，包括评估患者针对至少一种VEGF受体蛋白，特别是VEGFR-2，的表达模式和/或免疫前应答的步骤。