BR112019019251A2

BR112019019251A2 - cepa atenuada de salmonella

Info

Publication number: BR112019019251A2
Application number: BR112019019251A
Authority: BR
Inventors: Lubenau Heinz
Original assignee: Vaximm Ag
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2018-03-16
Publication date: 2020-04-28
Also published as: RU2019132253A; JP2020511139A; SG11201908528UA; WO2018167290A1; AU2018235153A1; IL268677A; JP2023021116A; JP7247097B2; CA3056807A1; US20220273782A1; CN110430893A; KR20190125481A; US20200085928A1; US11357842B2; EP3595704A1; MX2019011026A

Abstract

a presente invenção refere-se a uma cepa atenuada de salmonella que compreende pelo menos uma cópia de uma molécula de dna incluindo um cassete de expressão que codifica pd-l1. especificamente, a presente invenção refere-se à dita cepa atenuada de salmonella para uso no tratamento de câncer.

Description

CEPA ATENUADA DE SALMONELLA

Campo da invenção [0001] A presente invenção refere-se a uma cepa atenuada de Salmonella que compreende pelo menos pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA incluindo um cassete de expressão que codifica PD-L1. Especificamente, a presente invenção refere-se à dita cepa atenuada de Salmonella para uso no tratamento de câncer.

Antecedentes da invenção [0002] Uma característica importante do sistema imune é a sua capacidade para discriminar o próprio do não próprio. Para isso, faz uso de checkpoint (ponto de controle) - moléculas em certas células imunes que precisam ser ativadas (ou inativadas) para iniciar uma resposta imune.

[0003] Principalmente, o sistema imune tem a capacidade para reconhecer e destruir células neoplásicas. As células T parecem ser os principais efetores na imunidade contra o câncer. No entanto, muitos tumores desenvolvem mecanismos para se evadirem do sistema imune e aumentar a sua sobrevida. Proteínas reguladoras do sistema imune, como as proteínas checkpoint e seus ligantes, desempenham funções vitais na supressão imune e indução à tolerância de respostas imunes contra o câncer.

[0004] A proteína morte celular programada 1 (PD-1) é expressa na superfície de células T e transmite sinais inibitórios que mantém o silêncio funcional das células T contra antígenos cognatos. Seu ligante, PD-L1, é expresso normalmente em

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2/45 células apresentadoras de antígenos, células placentárias e células não hematopoiéticas em microambientes inflamatórios. Foi relatado que PD-L1 é expresso em células imunossupressoras conhecidas como supressoras derivadas da linhagem mieloide (MDSC). Além disso, PD-L1 é extensamente expresso na superfície de vários tipos de células cancerosas, as quais usam o eixo de sinalização PD-1/PD-L1 para escapar do sistema imunológico do hospedeiro. A expressão de PD-L1 por células cancerosas demonstrou correlacionar-se com estágio da doença e mau prognóstico para o paciente.

[0005] O potencial do direcionamento para a via de sinalização PD-L1/PD-1 foi demonstrado em estudos clínicos que avaliariam diversos anticorpos monoclonais anti-PD-1 e anti-PD-Ll, que têm como função é inibir a ligação de PD-L1 a PD-1. Esses anticorpos são criados para desencadear ou intensificar respostas imunes existentes contra o câncer. Atualmente, diferentes agentes são investigados em estudos clínicos em pacientes, como Opdivo (nivolumabe, um anticorpo anti-PD-1) em vários tumores sólidos e malignas hematológicas, pembrolizumabe (Keytruda, um anticorpo anti-PD-1) em vários tumores sólidos e neoplasias malignas hematológicas, CT-011 (anti-PD-1) em conjunto com uma vacina de células dendríticas na leucemia mieloide aguda (LMA) após remissão induzida por quimioterapia, e lirilumabe (anti-KIR) combinado com rituximabe em pacientes com leucemia linfocítica crônica (LLC) recorrente, refratária ou em não tratados com LLC de alto risco. Além disso, anticorpos monoclonais anti-PD-Ll, incluindo atezolizumabe, avelumabe ou durvalumabe, estão em

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3/45 desenvolvimento clínico avançado em várias indicações contra câncer.

[0006] Somente recentemente, foi descrita a existência de células T específicas de PD-L1.

[0007] WO 2013/056716 descreve uma vacina com peptídeo de PDL1 restrito ao HLA (antígeno leucocitário humano)-A2.

[0008] WO 2014/005683 descreve uma cepa mutante atenuada Salmonella compreendendo uma molécula de DNA recombinante codificante de uma proteína receptora de VEGF para uso em imunoterapia contra o câncer, particularmente para uso no tratamento de câncer de pâncreas.

[0009] WO 2016/202459 descreve uma abordagem terapêutica contra o câncer que compreende a administração combinada de uma cepa mutante atenuada de Salmonella incluindo uma molécula de DNA recombinante codificante de uma proteína receptora de VEGF e um anticorpo inibidor de checkpoint.

[0010] Até o conhecimento do inventor, não há relatos de qualquer vacina de DNA bacteriano direcionada contra PD-L1 que tenha como objetivo induzir células imunes citotóxicas específicas para PD-L1 que visam diretamente células tumorais PD-L1 positivas. Além do mais, nenhuma vacina oral contra o câncer direcionada para PD-L1 foi descrita.

Objetos da invenção [0011] Em vista da técnica anterior, a presente invenção tem por objeto prover um novo tratamento seguro e eficiente contra o câncer direcionado contra PD-L1. Tal nova abordagem

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4/45 terapêutica oferecería vantagens maiores para melhorar as opções de tratamento de pacientes com câncer.

Sumário da invenção [0012] A presente invenção baseia-se na descoberta surpreendente de que um veículo de entrega de DNA baseado em Salmonella, carregando uma construção de DNA recombinante codificante de PD-L1 completo ou PD-L1 truncado, compreendendo o domínio extracelular de PD-L1, exibe alta eficácia antitumoral em camundongos C57BL/6 portadores de eritroleucemia por transplante singênico disseminado de células FBL-3.

[0013] Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma cepa atenuada de Salmonella que compreende pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA incluindo um cassete de expressão que codifica PD-L1.

[0014] Em modalidades particulares, a cepa atenuada de Salmonella é da espécie Salmonella enterica. Especificamente, a cepa atenuada de Salmonella é Salmonella typhi cepa Ty21a.

[0015] Em modalidades particulares, o cassete de expressão é um cassete de expressão eucariótica. Especificamente, o cassete de expressão compreende um promotor de CMV.

[0016] Em modalidades particulares, PD-L1 é selecionado a partir do grupo que consiste em PD-L1 completo e um PD-L1 truncado compreendendo o domínio extracelular de PD-L1. Um PDL1 truncado pode compreender uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 19 a 238 de SEQ ID NO 13, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 13, a sequência de aminoácidos de SEQ

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ID NO 2 ou pode compreender uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com os aminoácidos 19 a 238 de SEQ ID NO 13, com SEQ ID NO 13 ou com SEQ ID NO 2. Em modalidades particulares, o PD-L1 é selecionado a partir do grupo que consiste em PD-L1 com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 1 e uma proteína que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com a mesma. Em outras modalidades particulares, PDL1 é selecionado a partir do grupo que consiste em PD-L1 com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 2 e uma proteína que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com a mesma. Em outras modalidades particulares, PDL1 é selecionado a partir do grupo que consiste em PD-L1 com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 13 e uma proteína que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com a mesma. Em outras modalidades particulares, PDL1 é selecionado a partir do grupo que consiste em PD-L1 com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 19 a 238 de SEQ ID NO 13 e uma proteína que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com a mesma. Particularmente, PD-L1 possui a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 ou SEQ ID NO 13, de preferência, PD-L1 compreende a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 19 a 238 de SEQ ID NO 13. Em uma modalidade, PD-L1 compreende pelo menos o domínio extracelular com ou sem o peptídeo de sinalização.

[0017] Em modalidades particulares, PD-L1 é codificado pela sequência de ácido nucleico tal como encontrada em SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 ou SEQ ID NO 14.

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6/45 [0018] Em modalidades particulares, a molécula de DNA compreende ainda o gene de resistência ao antibiótico canamicina, o sítio ori de pMBl e um promotor de CMV. Particularmente, a molécula de DNA compreende ainda a sequência de DNA tal como encontrada em SEQ ID NO 5.

[0019] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se à cepa atenuada de Salmonella de acordo com a presente invenção para uso como um medicamento.

[0020] Em Salmonella	modalidades é para uso no	particulares, tratamento de	a cepa câncer.	atenuada	de
[0021] Em Salmonella	modalidades é para uso em	particulares, a cepa atenuada imunoterapia contra o câncer.	de
[0022]	Em	modalidades	particulares,	o tratamento de câncer

compreende ainda quimioterapia, radioterapia ou terapia biológica contra câncer. Particularmente, a cepa atenuada de Salmonella é administrada antes, durante e/ou depois da quimioterapia ou do tratamento radioterápico ou da terapia biológica contra câncer. Mais em particular, a cepa atenuada de Salmonella é administrada antes e durante a quimioterapia ou o tratamento radioterápico ou a terapia biológica contra câncer.

[0023] Em modalidades particulares, a terapia biológica contra câncer compreende a administração de pelo menos uma vacina de DNA adicional codificante de um antígeno tumoral e/ou um antígeno do estroma tumoral. Em modalidades particulares, pelo menos uma vacina de DNA adicional é selecionada a partir de pelo menos uma cepa atenuada de Salmonella compreendendo pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA incluindo um cassete de

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7/45 expressão que codifica um antígeno tumoral e/ou um antígeno do estroma tumoral. Essa inclui pelo menos uma vacina de DNA adicional compreendendo pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA incluindo um cassete de expressão que codifica um antígeno tumoral e/ou pelo menos uma vacina de DNA adicional compreendendo pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA incluindo um cassete de expressão que codifica um antígeno do estroma tumoral. Particularmente, a dita pelo menos uma cepa atenuada adicional de Salmonella é Salmonella typhi Ty21a compreendendo um cassete de expressão eucariótica.

[0024] Em uma modalidade, o dito antígeno tumoral é selecionado a partir de Proteína do Tumor de Wilms (WT1), Mesotelina (MSLN), antígeno carcinoembrionário (CEA) e pp65 de CMV. Em modalidades particulares, o dito antígeno tumoral codificado pela dita pelo menos uma vacina de DNA adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em Proteína do Tumor de Wilms (WT1) com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 6 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a mesma, Mesotelina (MSLN) com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 7 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a mesma, CEA com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ TD NO 8 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a mesma, pp65 de CMV com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 9 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a mesma, pp65 de CMV com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 10 e

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8/45 uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80%de identidade de sequência com a mesma e pp65 de CMV com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 11 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80%de identidade de sequência com a mesma. Particularmente,a

Proteína do Tumor de Wilms (WT1) possui a sequênciade aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 6, Mesotelina (MSLN) possui a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 7, CEA possui a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 8 e pp65 de CMV possui a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10 ou em SEQ ID NO 11. Em uma modalidade, o dito antígeno do estroma tumoral é VEGFR-2 ou proteína de ativação de fibroblastos (FAP), de preferência VEGFR-2. Particularmente, o dito antígeno do estroma tumoral codificado pela dita pelo menos uma vacina de DNA adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em VEGFR-2 com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 12 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a mesma e proteína de ativação de fibroblastos (FAP) humana. Particularmente, VEGFR-2 possui a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 12.

[0025] Em modalidades particulares, a cepa atenuada de Salmonella é administrada oralmente.

[0026] Em modalidades particulares, o câncer é selecionado a partir de linfoma, leucemia, mieloma, câncer de pulmão, em particular câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC), melanoma, câncer de células renais, câncer de ovário,

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9/45 glioblastoma, carcinoma de células de Merkel, câncer de bexiga, câncer da cabeça e pescoço, câncer colorretal, câncer de esôfago, câncer cervical, câncer gástrico, câncer hepatocelular, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de pâncreas e câncer de tireoide.

[0027] Em modalidades particulares, a dose única da cepa atenuada de Salmonella compreende entre aproximadamente 10⁵ e 10¹¹, particularmente entre aproximadamente 10⁶ e 10¹⁰, mais em particular entre aproximadamente 10⁶ e 10⁹, mais em particular entre aproximadamente 10⁶ e 10⁸, mais em particular entre aproximadamente 10⁶ e 10⁷ unidades formadoras de colônias (CFU).

[0028] Em modalidades particulares, a cepa atenuada de Salmonella é para uso em imunoterapia individualizada contra o câncer, compreendendo a etapa de avaliar o padrão de expressão de PD-L1 e/ou a resposta pré-imune contra PD-L1 de um paciente.

Descrição detalhada da invenção [0029] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma cepa atenuada de Salmonella que compreende pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA incluindo um cassete de expressão que codifica PD-L1.

[0030] A cepa viva atenuada de Salmonella de acordo com a presente invenção carrega estavelmente uma molécula de DNA recombinante codificante de PD-L1. Esta pode ser usada como veículo para a entrega oral dessa molécula de DNA recombinante.

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10/45 [0031] No contexto da presente invenção, o termo atenuado refere-se a uma cepa bacteriana de virulência reduzida quando comparada à cepa bacteriana original, não abrigando a mutação atenuante. As cepas bacterianas atenuadas de preferência perderam a sua virulência, mas retiveram a capacidade para induzir imunidade protetora. A atenuação pode ser conseguida pela deleção de vários genes, incluindo genes de virulência, reguladores e metabólicos. Bactérias atenuadas podem ser encontradas naturalmente ou podem ser produzidas artificialmente no laboratório, por exemplo, pela adaptação a um novo meio ou cultura celular ou podem ser produzidas pela tecnologia do DNA recombinante. A administração de aproximadamente 10¹¹ CFU da cepa atenuada de Salmonella de acordo com a presente invenção, de preferência, causa salmonelose em menos de 5%, mais preferivelmente menos de 1%, ainda mais preferivelmente menos de 1% dos indivíduos.

[0032] No contexto da presente invenção, o termo compreende ou compreendendo significa incluindo, entre outros. O termo destina-se a ser aberto, para especificar a presença de quaisquer características, elementos, números inteiros, etapas ou componentes declarados, mas não impedir a presença ou adição de uma ou mais características, elementos, números inteiros, etapas, componentes ou grupos dos mesmos. O termo compreendendo inclui, assim, os termos mais restritivos consistindo em e consistindo essencialmente em. Em uma modalidade, o termo compreendendo, conforme usado por todo o pedido de patente e, em particular, nas reivindicações, pode ser substituído pelo termo consistindo em.

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11/45 [0033] A molécula de DNA incluindo um cassete de expressão que codifica PD-L1 é adequadamente uma molécula de DNA recombinante, ou seja, uma construção preparada de DNA, de preferência composta por pedaços de DNA de origem diferente. A molécula de DNA pode ser um ácido nucleico linear ou, de preferência, um plasmídeo DNA circular gerado introduzindo uma fase de leitura aberta que codifica PD-L1 em um plasmídeo vetor de expressão. Plasmídeos vetores de expressão adequados são, por exemplo, entre outros, pVAXl™ (Invitrogen, San Diego, Califórnia) ou pcDNA™3.1 (Invitrogen, San Diego, Califórnia), ou plasmídeos vetores de expressão derivados dos mesmos. Os plasmídeos vetores de expressão podem conter uma origem para alto número de cópias, como sítio ori de pUC, ou uma origem para baixo número de cópias, como ori de pMBl.

[0034] No contexto da presente invenção, o termo cassete de expressão refere-se a uma unidade de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma fase de leitura aberta (open reading frame, ORF) sob o controle de sequências reguladoras controlando a sua expressão. Os cassetes de expressão podem preferivelmente servir como mediadores da transcrição da fase de leitura aberta incluída que codifica uma proteína recombinante, como PD-L1, em uma célula alvo. Os cassetes de expressão tipicamente compreendem um promotor, pelo menos uma fase de leitura aberta e um sinal de terminação da transcrição.

[0035] Em modalidades particulares, a cepa atenuada de Salmonella é da espécie Salmonella enterica. Derivados atenuados de Salmonella enterica são veículos atraentes para a

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12/45 entrega de antígenos heterólogos ao sistema imune de mamíferos, uma vez que as cepas de S. enteríca podem potencialmente ser entregues por vias de imunização através de mucosas, ou seja, via oral ou nasal, as quais oferecem como vantagens a simplicidade e segurança quando comparadas à administração parenteral. Além disso, as cepas de Salmonella induzem fortes respostas imunes humorais e celulares tanto em nível do compartimento sistêmico como de mucosa. Os custos para preparação de lotes sã baixos e as formulações de vacinas bacterianas vivas são altamente estáveis. A atenuação pode ser conseguida por deleção de vários genes, incluindo genes de virulência, reguladores e metabólicos.

[0036] Diversas cepas de Salmonella typhimurium, atenuadas por mutações aro, demonstraram ser veículos de entrega seguros e eficazes para antígenos heterólogos em modelos animais.

[0037] Em modalidades particulares, a cepa atenuada de Salmonella é Salmonella typhi Ty21a. A cepa Ty21a viva, atenuada de S. typhi é o componente ativo de Typhoral L®, também conhecido como Vivotif® (fabricado pela Berna Biotech Ltd., uma empresa Crucell, Suíça). É atualmente a única vacina oral viva licenciada contra febre tifoide. Essa vacina foi testada extensamente e comprovou ser segura quanto à toxicidade para pacientes, bem como em termos de transmissão para terceiros (Wahdan et al., J. Infectious Diseases 1982, 145:292-295). A vacina é licenciada em mais de 40 países e foi utilizada em milhões de pessoas, incluindo milhares de crianças para vacinação profilática contra febre tifoide. Possui um registro histórico da segurança sem paralelos. Não

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13/45 há dados disponíveis indicando que S. typhi Ty21a seja capaz de penetrar na corrente sanguínea por via sistêmica. A cepa atenuada Salmonella typhi Ty21a da vacina permite, assim, o direcionamento específico para o sistema imune no intestino, enquanto sendo segura e bem tolerada. 0 número da Autorização de Comercialização de Typhoral L® é PL 15747/0001, datada 16 de dezembro de 1996. Uma dose de vacina contém pelo menos 2xl0⁹unidades formadoras de colônias de S. typhi Ty21a viáveis e pelo menos 5xl0⁹ células não viáveis de S. typhi Ty21a.

[0038] Essa vacina viva oral bem tolerada contra febre tifoide foi derivada por mutagênese química do isolado bacteriano virulento de S. typhi Ty2 do tipo selvagem e abriga uma mutação do tipo perda de função no gene galE resultando em sua incapacidade para metabolizar galactose. A cepa bacteriana atenuada também não é capaz de reduzir sulfato a sulfeto, o que a diferencia da cepa Salmonella typhi Ty2 do tipo selvagem. Em relação às suas características sorológicas, a cepa Salmonella typhi Ty21a contém o antígeno 09, que é um polissacarídeo da membrana externa da bactéria, e é desprovida do antígeno 05 o qual, por sua vez, é um componente característico de Salmonella typhimurium. Essa característica sorológica respalda a justificativa para incluir o respectivo teste em um painel de testes de identidade para liberação de lotes.

[0039] Em modalidades particulares, o cassete de expressão é um cassete de expressão eucariótica. Particularmente, o cassete de expressão compreende um promotor de CMV. No contexto da presente invenção, o termo cassete de expressão

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14/45 eucariótica refere-se a um cassete de expressão que permite a expressão da fase de leitura aberta em uma célula eucariótica. Foi demonstrado que a quantidade de antígeno heterólogo necessária para induzir uma resposta imune adequada pode ser tóxica para a bactéria e pode resultar em morte celular, superatenuação ou perda de expressão do antígeno heterólogo. Com o uso de um cassete de expressão eucariótica que não é expresso no vetor bacteriano, mas somente na célula alvo, esse problema de toxicidade pode ser superado e a proteína expressa exibe tipicamente um padrão de glicosilação eucariótico.

[0040] Um cassete de expressão eucariótica compreende sequências reguladoras que são capazes de controlar a expressão de uma fase de leitura aberta em uma célula eucariótica, de preferência um promotor e um sinal de poliadenilação. Os promotores e os sinais de poliadenilação incluídos nas moléculas de DNA recombinante compreendidas pela cepa atenuada de Salmonella da presente invenção são selecionados, de preferência, para serem funcionais dentro das células do indivíduo a ser imunizado. Os exemplos de promotores adequados, especialmente para a produção de uma vacina de DNA para humanos, incluem, entre outros, promotores de citomegalovirus (CMV), como o forte promotor inicial imediato de CMV, os do vírus dos símios 40 (SV40), do vírus do tumor mamário do camundongo (MMTV), do vírus da imunodeficiência humana (HIV), como o promotor da repetição terminal longa (LTR) do HIV, do virus Moloney, do vírus Epstein Barr (EBV) do virus do sarcoma de Rous (RSV) , o promotor sintético CAG, composto pelo elemento intensificador inicial do CMV, o promotor, o primeiro exon e o primeiro

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15/45 intron do gene beta-actina de galinha e o aceitador de splice do gene beta-globina de coelho, bem como promotores de genes humanos como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculos humanos e metalotioneína humana. Em uma modalidade em particular, o cassete de expressão eucariótica contém o promotor de CMV. No contexto da presente invenção, o termo promotor de CMV refere-se ao forte promotor inicial imediato do citomegalovirus.

[0041] Os exemplos de sinais de poliadenilação adequados, especialmente para a produção de uma vacina de DNA para humanos, incluem, entre outros, o sítio de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH), sinais de poliadenilação de SV40 e sinais de poliadenilação de LTR. Em uma modalidade em particular, o cassete de expressão eucariótica incluído na molécula de DNA recombinante compreendida pela cepa atenuada de Salmonella da presente invenção compreende o sítio de poliadenilação do BGH.

[0042] Além dos elementos reguladores necessários para a expressão do gene heterólogo, como um promotor e um sinal de poliadenilação, outros elementos também podem ser incluídos na molécula de DNA recombinante. Tais elementos adicionais incluem intensificadores. O intensificador pode ser, por exemplo, o intensificador de actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculos humanos e intensificadores virais como aqueles de CMV, RSV e EBV.

[0043] As sequências reguladoras e códons são em geral dependentes da espécie, assim, a fim de maximizar a produção de proteínas, as sequências reguladoras e os códons são

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16/45 preferivelmente selecionados para serem eficazes na espécie a ser imunizada. 0 técnico no assunto pode produzir moléculas de DNA recombinante que são funcionais em uma determinada espécie de indivíduos.

[0044] Em uma modalidade, PD-L1 é selecionado a partir do grupo que consiste em PD-L1 completo e um PD-L1 truncado compreendendo o domínio extracelular de PD-L1. Um PD-L1 truncado pode compreender uma sequência de aminoácidos dos aminoácidos 19 a 238 de SEQ ID NO 13, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 13, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 2 ou pode compreender uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com os aminoácidos 19 a 238 de SEQ ID NO 13, com SEQ ID NO 13 ou com SEQ ID NO 2. Em modalidades particulares, PD-L1 é selecionado a partir do grupo que consiste em PD-L1 com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 1 e uma proteína que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com a mesma. Em outras modalidades particulares, PD-L1 é selecionado a partir do grupo que consiste em PD-L1 com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 2 e uma proteína que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com a mesma. Em ainda outras modalidades em particular, PD-L1 é selecionado a partir do grupo que consiste em PD-L1 com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 13 e uma proteína que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com a mesma. Em outras modalidades particulares, PD-L1 é selecionado a partir do grupo que consiste em PD-L1 com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 19 a 238 de SEQ ID NO 13 e uma proteína que

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17/45 compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com a mesma. Particularmente, PD-L1 possui a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 ou SEQ ID NO 13, preferivelmente PD-L1 compreende a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 19 a 238 de SEQ ID NO 13. Em uma modalidade PD-L1 compreende pelo menos o domínio extracelular com ou sem o peptídeo de sinalização.

[0045] Nesse contexto, o termo cerca de ou aproximadamente significa dentro de 80% a 120%, alternativamente dentro de 90% a 110%, incluindo dentro de 95% a 105% de um dado valor ou faixa.

[0046] No contexto da presente invenção, o termo proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com uma dada sequência de proteína, p. ex., PD-L1 com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 1, 2 ou 13 refere-se a uma proteína que pode diferir na sequência de aminoácidos e/ou na sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da dita proteína de referência, p. ex., PD-L1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 1, 2 ou 13. A proteína pode ser de origem natural, p. ex., uma versão mutante de uma proteína do tipo selvagem, p. ex., uma versão mutante de um PD-L1 do tipo selvagem ou um homólogo de uma espécie diferente, ou uma proteína modificada, p. ex., PD-L1 modificada. Sabe-se que a utilização de códons é diferente entre as espécies. Assim, na expressão de uma proteína heteróloga em uma célula alvo, pode ser necessário, ou pelo menos útil, adaptar a sequência de ácido nucleico à utilização de códons da célula alvo. Métodos para criar e para

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18/45 preparar derivados de uma dada proteína são bem conhecidos por qualquer técnico no assunto.

[0047] A proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com uma dada sequência de proteína, p. ex. , PD-L1 com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 1, 2 ou 13, pode conter uma ou mais mutações compreendendo uma adição, uma deleção e/ou uma substituição de um ou mais aminoácidos em comparação à sequência da proteína de referência, p. ex., PD-L1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 1, 2 ou 13. O mesmo aplica-se a PD-L1 com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 19 a 238 de SEQ ID NO 13. Uma ou mais mutações compreendendo uma adição, uma deleção e/ou uma substituição de um ou mais aminoácidos incluem menos de 10 mutações, menos de 9 mutações, menos de 8 mutações, menos de 7 mutações, menos de 6 mutações, menos de 5 mutações, menos de 4 mutações, menos de 3 mutações, menos de 2 mutações ou uma mutação na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 1, 2, 13 ou aminoácidos 19 a 238 de SEQ ID NO 13. De acordo com o ensinamento da presente invenção, os ditos aminoácidos excluídos, adicionados e/ou substituídos podem ser aminoácidos consecutivos ou podem ser intercalados ao longo de uma sequência de aminoácidos da proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a proteína de referência, p. ex., PD-L1 com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 1, 2, 13 ou aminoácidos 19 a 238 de SEQ ID NO 13. De acordo com o ensinamento da presente invenção, qualquer número de aminoácidos pode ser adicionado, excluído e/ou substituído, desde que a identidade de sequência de aminoácidos com a proteína de referência seja pelo menos

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19/45 cerca de 80%. De preferência, a proteína que sofreu mutação é imunogênica. De preferência, a imunogenicidade da proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com uma dada proteína de referência, p. ex., PD-L1 com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 1, 2, 13 ou aminoácidos 19 a 238 de SEQ ID NO 13, é reduzida em menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, menos de 5% ou menos de 1% quando comparada à dita proteína de referência, p. ex., PD-L1 com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 1, 2, 13 ou aminoácidos 19 a 238 de SEQ ID NO 13. A imunogenicidade, p. ex., pode ser medida por ELISA. Métodos para criar e para preparar homólogos de proteínas e para testar tais homólogos quanto ao seu potencial imunogênico são conhecidos por qualquer técnico no assunto. Em modalidades particulares, a identidade de sequência com a proteína de referência, p. ex., PD-L1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 1, 2, 13 ou aminoácidos 19 a 238 de SEQ ID NO 13 é pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90% ou mais em particular pelo menos aproximadamente 95%. Métodos e algoritmos para determinar a identidade de sequência, incluindo a comparação de uma proteína original e sua derivada contendo deleções, adições e/ou substituições em relação a uma sequência original, são bem conhecidos por qualquer praticante de competência comum na técnica. Em nível do DNA, as sequências de ácidos nucleicos que codificam a proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com uma dada proteína de referência, p. ex. , PD-L1 com a sequência de aminoácidos tal

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20/45 como encontrada em SEQ ID NO 1, 2, 13 ou aminoácidos 19 a 238 de SEQ ID NO 13, podem diferir em grande medida devido à degeneração do código genético.

[0048] Em modalidades particulares, PD-L1 é codificado pela sequência de ácido nucleico tal como encontrada em SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 ou SEQ ID NO 14.

[0049] Em modalidades particulares, a molécula de DNA compreende o gene de resistência ao antibiótico canamicina, o sitio ori de pMBl e um promotor de CMV. Em modalidades particulares, a molécula de DNA recombinante é derivada do plasmideo de expressão pVAXl™ disponível comercialmente (Invitrogen, San Diego, Califórnia). Esse vetor de expressão foi modificado substituindo a origem de replicação pUC para alto número de cópias pela origem de replicação pMBl para baixo número de cópias de pBR322. A modificação para baixo número de cópias foi feita com o objetivo de reduzir a carga metabólica e para tornar a construção mais instável. O esqueleto gerado do vetor de expressão foi designado pVAXIO.

[0050] Em modalidades particulares, a molécula de DNA compreende ainda a sequência de DNA tal como encontrada em SEQ ID NO 5 (esqueleto do vetor pVAXIO).

[0051] A inserção da ORE que codifica PD-L1 humano com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 1 no esqueleto do vetor de expressão via Nhel/Xhol produziu o plasmideo de expressão pVAXl0.PD-Llh. A vacina de DNA compreendendo a cepa atenuada Ty21a de Salmonella abrigando o plasmideo de expressão pVAXl0.PD-Llh é designada VXMIOh. A inserção da ORE que codifica PD-L1 humano com a sequência de aminoácidos de SEQ ID

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NO 2 no esqueleto do vetor de expressão via Nhel/Xhol produziu o plasmídeo de expressão pVAXl0.PD-Llha. A vacina de DNA compreendendo a cepa atenuada Ty21a de Salmonella abrigando o plasmídeo de expressão pVAXl0.PD-Llha é designada VXMlOha. A inserção da ORF que codifica PD-L1 humano com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 13 no esqueleto do vetor de expressão via Nhel/Xhol produziu o plasmídeo de expressão pVAXlO.PDLlhb. A vacina de DNA compreendendo a cepa atenuada Ty21a de Salmonella abrigando o plasmídeo de expressão pVAXl0.PD-Llhb é designada VXMIOhb.

[0052] A cepa atenuada de Salmonella que codifica PD-L1 pode ser provida em uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica pode estar na forma de solução, suspensão, cápsula com revestimento entérico, pó liofilizado ou qualquer outra forma adequada para o uso pretendido.

[0053] A composição farmacêutica pode compreender ainda um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[0054] No contexto da presente invenção, o termo excipiente refere-se a uma substância natural ou sintética formulada junto com o ingrediente ativo de um medicamento. Os excipientes adequados incluem antiaderentes, aglutinantes, revestimentos, desintegrantes, aromatizantes, corantes, lubrificantes, deslizantes, adsorventes, conservantes e adoçantes.

[0055] No contexto da presente invenção, o termo farmaceuticamente aceitável refere-se a entidades moleculares e outros ingredientes de composições farmacêuticas que são fisiologicamente toleráveis e que tipicamente não

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22/45 produzem reações não desejadas quando administrados a um mamífero (p. ex., humano) . 0 termo farmaceuticamente aceitável pode também significar aprovado por uma agência reguladora de um governo Federal ou Estadual ou listado na Farmacopeia Norte-Americana ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em mamíferos e, mais em particular, em humanos.

[0056] Em modalidades particulares, a composição farmacêutica é fornecida como uma solução para beber. Essa modalidade oferece a vantagem de adesão melhorada do paciente e permite programas rápidos, viáveis e econômicos de vacinação em massa.

[0057] Em particular, as soluções adequadas para beber compreendem meios para neutralizar os ácidos gástricos até pelo menos certo grau, ou seja, para levar o pH do suco gástrico a um pH mais próximo de 7 . Em uma modalidade em particular, a solução para beber é uma suspensão tamponada obtida suspendendo a cepa atenuada de Salmonella de acordo com a presente invenção em um tampão adequado, de preferência em um tampão que neutralize os ácidos gástricos até pelo menos certo grau, preferivelmente em um tampão contendo 2,6 g de hidrogenocarbonato de sódio, 1,7 g de ácido L-ascórbico, 0,2 g de lactose monoidratada e 100 mL de água potável.

[0058] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se à cepa atenuada de Salmonella de acordo com a presente invenção para uso como um medicamento.

[0059] Em modalidades particulares, a cepa atenuada de Salmonella é para uso no tratamento de câncer.

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[0060] Em Salmonella	modalidades particulares, a é para uso como uma vacina.	cepa	atenuada	de
[0061] Em Salmonella	modalidades é para uso em	particulares, a imunoterapia contra	cepa atenuada o câncer.	de

[0062] Sem a intenção de ficar preso à teoria, acredita-se que, ao contrário dos anticorpos monoclonais anti-PD-1 e antiPD-L1, que atuam como mediadores na inibição de checkpoints ao impedirem a ligação do ligante PD-L1 a PD-1, a cepa atenuada de Salmonella de acordo com a presente invenção provoca uma resposta de células T específica para PD-L1 que leva à destruição de células tumorais PD-Ll-positivas. Além disso, especialmente no caso de se usar apenas somente o domínio extracelular de PD-L1 humano (SEQ ID NO 13), como no uso do plasmídeo pVAXl0.PD-Llhb, o produto proteico à base de PD-L1 que é expresso pode ser secretado e resultar em uma resposta de anticorpo anti-PD-Ll, o que pode servir de apoio adicional ao efeito terapêutico da abordagem de acordo com a presente invenção. Sem a intenção de ficar preso à teoria, com o uso de PD-L1 humano truncado desprovido do peptídeo sinal, p. ex., PD-L1 humano truncado compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 2, como no uso do plasmídeo pVAXl0.PD-Llha, e dos aminoácidos 19 a 238 de SEQ ID NO 13 (correspondente ao domínio extracelular de PD-L1), o produto proteico à base de PD-L1 que é expresso pode acumular no citoplasma e resultar em uma resposta intensificada de células T citotóxicas, o que pode servir de apoio adicional ao efeito terapêutico da abordagem de acordo com a presente invenção. Assim, em uma

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24/45 modalidade, o PD-L1 compreende pelo menos o domínio extracelular de PD-L1 com ou sem peptídeo de sinalização.

[0063] De acordo com a invenção, a cepa atenuada de Salmonella funciona como o transportador bacteriano da molécula de DNA recombinante incluindo um cassete de expressão que codifica PD-L1 para a entrega da dita molécula de DNA recombinante a uma célula alvo. Tal vetor de entrega compreendendo uma molécula de DNA que codifica um antígeno heterólogo, como PDLl, é denominado vacina de DNA.

[0064] No contexto da presente invenção, o termo vacina refere-se a um agente que é capaz de induzir uma resposta imune em um indivíduo quando da administração. Uma vacina pode preferivelmente prevenir, melhorar ou tratar uma doença.

[0065] A imunização genética podería ser mais vantajosa do que a vacinação convencional. O DNA alvo pode ser detectado por um período considerável de tempo, agindo, assim, como um depósito do antígeno. Os motivos da sequência em alguns plasmídeos, como ilhas GpC, são imunoestimuladores e podem funcionar como adjuvantes promovidos pela imunoestimulação que se deve a LPS e outros componentes bacterianos.

[0066] Os vetores atenuados de Salmonella produzem os seus próprios fatores imunomoduladores, como lipopolissacarídeos (LPS) in situ, o que pode constituir uma vantagem sobre outras formas de administração como microencapsulação. Além do mais, a vacina de mucosa de acordo com a presente invenção possui um modo de ação intralinfático, que demonstra ser de benefício. Após a ingestão da vacina atenuada de acordo com a presente invenção, macrófagos e outras células em placas de Peyer do

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25/45 intestino são invadidos pelas bactérias modificadas. As bactérias são absorvidas por essas células fagocitárias. Devido às suas mutações atenuantes, as bactérias da cepa S. typhí Ty21 não são capazes de persistir nessas células fagocitárias, mas, morrem nesse momento. As moléculas de DNA recombinante são liberadas e, subsequentemente, transferidas para o citosol das células imunes fagocitárias, quer por um sistema de transporte específico quer por escape endossomal. Finalmente, as moléculas de DNA recombinante entram no núcleo, onde são transcritas, levando à expressão maciça de PD-L1 no citosol das células fagocitárias e, potencialmente, no caso em particular de ser usado apenas o domínio extracelular de PD-L1 humano (p. ex. , SEQ ID NO 13), como no uso do plasmídeo pVAXl0.PD-Llhb, na secreção do produto proteico à base de PDL1. As células infectadas sofrem apoptose, carregadas com o antígeno de PD-L1 e são absorvidas e processadas pelo sistema imune do intestino. Os sinais de perigo da infecção bacteriana servem como um forte adjuvante nesse processo, levando a uma resposta forte de anticorpo e células T CD8+ específicas para o antígeno alvo em nível do compartimento sistêmico e de mucosa. A resposta imune atinge o pico em torno de dez dias após a vacinação. A falta de resposta contra o transportador permite o reforço com a mesma vacina repetidas vezes. Adicionalmente, a secreção do produto proteico à base de PD-L1 pode resultar em uma resposta de anticorpo anti-PD-Ll, o que pode servir de apoio adicional ao efeito terapêutico da abordagem de acordo com a presente invenção.

[0067] Em modalidades particulares, o tratamento de câncer compreende ainda quimioterapia, radioterapia ou terapia

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26/45 biológica contra câncer. Particularmente, a cepa atenuada de Salmonella é administrada antes, durante e/ou depois da quimioterapia ou do tratamento radioterápico ou da terapia biológica contra câncer. Mais em particular, a cepa atenuada de Salmonella é administrada antes e durante a quimioterapia ou o tratamento radioterápico ou a terapia biológica contra câncer. Para a cura do câncer, a erradicação completa de células-tronco cancerígenas pode ser essencial. Para eficácia máxima, pode ser benéfica uma combinação de diferentes abordagens terapêuticas.

[0068] No contexto da presente invenção, o termo terapia biológica contra câncer refere-se à terapia contra o câncer envolvendo o uso de organismos vivos, incluindo bactérias e vírus, substâncias derivadas de organismos vivos ou versões produzidas em laboratório de tais substâncias. Algumas terapias biológicas para câncer visam estimular o sistema imune do corpo para que atue contra as células tumorais (a conhecida imunoterapia biológica contra o câncer). As abordagens envolvendo terapia biológica contra câncer incluem a entrega de antígenos tumorais e antígenos do estroma tumoral, p. ex., por vacinas de DNA baseada em Salmonella, especialmente vacinas de DNA baseadas em S. typhi Ty21a, a liberação de anticorpos terapêuticos como fármacos, a administração de citocinas imunoestimulatórias e a administração de células imunes, incluindo células T modificadas. Anticorpos terapêuticos incluem anticorpos direcionados contra antígenos tumorais ou antígenos do estroma tumoral.

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27/45 [0069] Em modalidades particulares, a terapia biológica contra câncer compreende a administração de pelo menos uma vacina de DNA adicional codificante de um antígeno tumoral e/ou um antígeno do estroma tumoral. Em modalidades particulares, pelo menos uma vacina de DNA adicional é selecionada a partir de pelo menos uma cepa atenuada adicional de Salmonella compreendendo pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA incluindo um cassete de expressão que codifica um antígeno tumoral e/ou um antígeno do estroma tumoral. Particularmente, a dita pelo menos uma cepa atenuada adicional de Salmonella é Salmonella typhi Ty21a compreendendo um cassete de expressão eucariótica.

[0070] Em uma modalidade, o dito antígeno tumoral é selecionado a partir de Proteína do Tumor de Wilms (WT1), Mesotelina (MSLN) , CEA e pp65 de CMV. Em modalidades particulares, o dito antígeno tumoral codificado pela dita pelo menos uma vacina de DNA adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em Proteína do Tumor de Wilms (WT1) com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 6 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a mesma, Mesotelina (MSLN) com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 7 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a mesma, CEA com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 8 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a mesma, pp65 de CMV com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 9 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de

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28/45 sequência com a mesma, pp65 de CMV com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 10 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a mesma e pp65 de CMV com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 11 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a mesma. Particularmente, a Proteína do Tumor de Wilms (WT1) possui a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 6, Mesotelina (MSLN) possui a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 7, CEA possui a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 8 e pp65 de CMV possui a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10 ou SEQ ID NO 11. Em uma modalidade, o dito antígeno do estroma tumoral é VEGFR-2 ou FAP, de preferência VEGFR-2. Particularmente, o dito antígeno do estroma tumoral codificado pela dita pelo menos uma vacina de DNA adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em VEGFR-2 com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 12 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a mesma e a proteína de ativação de fibroblastos (FAP) humana. Particularmente, VEGFR-2 possui a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 12.

[0071] Em modalidades particulares, a cepa atenuada de Salmonella que codifica PD-L1 é administrada antes de, simultaneamente com e/ou depois de pelo menos uma vacina de DNA adicional codificante de um antígeno tumoral e/ou um antígeno do estroma tumoral.

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29/45 [0072] No contexto da presente invenção, o termo simultaneamente com significa a administração da cepa atenuada de Salmonella que codifica PD-L1 e de pelo menos uma vacina de DNA adicional codificante de um antigeno tumoral e/ou um antigeno do estroma tumoral no mesmo dia, mais em particular dentro de 12 horas, ainda mais em particular dentro de 2 horas.

[0073] Em modalidades particulares, a administração da cepa atenuada de Salmonella que codifica PD-L1 e de pelo menos um vacina de DNA adicional codificante de um antigeno tumoral e/ou um antigeno do estroma tumoral ocorre dentro de doze semanas consecutivas, mais em particular dentro de oito semanas consecutivas, ainda mais em particular dentro de três a seis semanas consecutivas. A cepa atenuada de Salmonella que codifica PD-L1 e pelo menos uma vacina de DNA adicional codificante de um antigeno tumoral e/ou um antigeno do estroma tumoral podem ser administradas pela mesma via ou por vias diferentes. Por exemplo, especialmente se pelo menos uma vacina de DNA adicional for uma cepa atenuada adicional de Salmonella, esta pode ser administrada oralmente.

[0074] A dose única da cepa atenuada adicional de Salmonella pode compreender entre aproximadamente 10⁵ e 10¹¹, em particular entre aproximadamente 10⁶ e 10¹⁰, mais em particular entre aproximadamente 10⁶ e 10⁹, mais em particular entre aproximadamente 10⁶ e 10⁸, ainda mais em particular entre aproximadamente 10⁶ e 10⁷ unidades formadoras de colônias (CFU).

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30/45 [0075] Os agentes quimioterápicos que podem ser utilizados em combinação com a cepa mutante atenuada de Salmonella da presente invenção podem ser, por exemplo, gencitabina, amifostina (ethyol), cabazitaxel, carboplatina, oxaliplatina, cisplatina, capecitabina, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, docetaxel, mecloretamina, estreptozocina, ciclofosfamida, nimustina (ACNU), carnustina (BCNU), lomustina (CCNU), doxorrubicina (adriamicina) , doxorrubicina lipo (doxil), ácido folinico, gencitabina (gemzar), daunorrubicina, daunorrubicina lipo (daunoxome), epirrubicina, procarbazina, cetoconazol, mitomicina, citarabina, etoposideo, metotrexato, 5fluorouracila (5-FU), vimblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotero), pemetrexede, aldesleucina, asparaginase, bussulfano, carboplatina, cladribina, camptotecina, CPT-11, 10-hidroxi-7-etilcamptotecina (SN38), dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiureia, ifosfamida, idarrubicina, mesna, interferon alfa, interferon beta, irinotecano, mitoxantrona, topotecano, leuprolida, megestrol, melfalano, mercaptopurina, oxaliplatina, plicamicina, mitotano, pegaspargase, pentostatina, pipobroman, plicamicina, estreptozocina, tamoxifeno, teniposideo, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostarda de uracila, vinorelbina, clorambucil, temozolomida e combinações dos mesmos.

[0076] Os agentes quimioterápicos mais preferidos de acordo com a invenção são cabazitaxel, carboplatina, oxaliplatina, cisplatina, ciclofosfamida, docetaxel, etoposideo, gencitabina, doxorrubicina, lomustina, paclitaxel (taxol), irinotecano, vincristina, vimblastina, vinorelbina, ácido

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31/45 folínico, 5-fluorouracila, bleomicina e temozolomida, especialmente gencitabina.

[0077] Em modalidades particulares, a cepa atenuada de Salmonella é administrada oralmente. A administração oral é mais simples, mais segura e mais confortável do que a administração parenteral. No entanto, deve-se ressaltar que a cepa atenuada de Salmonella que codifica PD-L1 pode também ser administrada por qualquer outra via adequada. De preferência, uma dose terapeuticamente eficaz é administrada ao indivíduo, e essa dose depende da aplicação em particular, do tipo de neoplasia maligna, do peso, idade, sexo e estado de saúde do indivíduo, do modo de administração e da formulação, etc. A administração pode ser única ou múltipla, conforme necessário.

[0078] Em modalidades particulares, o câncer é selecionado a partir de linfoma, leucemia, mieloma, câncer de pulmão, em particular câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC), melanoma, câncer de células renais, câncer de ovário, glioblastoma, carcinoma de células de Merkel, câncer de bexiga, câncer da cabeça e pescoço, câncer colorretal, câncer de esôfago, câncer cervical, câncer gástrico, câncer hepatocelular, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de pâncreas e câncer de tireoide.

[0079] A cepa atenuada de Salmonella que codifica PD-L1 é surpreendentemente eficaz em doses relativamente baixas. A administração de doses baixas de vacinas bacterianas vivas minimiza o risco de excreção e, assim, de transmissão para terceiros.

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32/45 [0080] Em modalidades particulares, a dose única da cepa atenuada de Salmonella compreende entre aproximadamente 10⁵ e 10¹¹, em particular entre aproximadamente 10⁶ e 10¹⁰, mais em particular entre aproximadamente 10⁶ e 10⁹, mais em particular entre aproximadamente 10⁶ e 10⁸, ainda mais em particular entre aproximadamente 10⁶ e 10⁷ unidades formadoras de colônias (CFU).

[0081] Nesse contexto, o termo cerca de ou aproximadamente significa dentro de um fator de 3, alternativamente dentro de um fator de 2, inclusive dentro de um fator de 1,5 de um dado valor ou faixa.

[0082] Em modalidades particulares, a cepa atenuada de Salmonella é para uso em imunoterapia individualizada contra o câncer, compreendendo a etapa de avaliar o padrão de expressão de PD-L1 e/ou a resposta pré-imune contra PD-L1 de um paciente. A expressão de PD-L1 do paciente e/ou as respostas pré-imunes do paciente contra PD-L1 podem ser avaliadas em uma primeira etapa, por exemplo, por diagnósticos complementares. Métodos para avaliar a expressão de um gene alvo, como PD-L1, seja em nível de mRNA ou de proteína são bem conhecidos por qualquer técnico no assunto. Por exemplo, coloração imunohistoquímica, métodos de citometria de fluxo ou de sequenciamento de RNA, ou métodos alternativos utilizando marcação podem ser utilizados para identificar o nível de expressão alvo no tumor. Do mesmo modo, métodos para avaliar uma resposta pré-imune do paciente contra uma dada proteína, como PD-L1, são bem conhecidos por qualquer técnico no assunto. Um pool de células T pré-existentes, específicas para

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PD-L1, do paciente pode ser detectado, p. ex., por ELISpot ou análise multimer FACS. Alta expressão específica de PD-L1 no tumor e/ou a ocorrência de respostas pré-imunes contra PD-L1 são indicadores prognósticos para a predisposição de um paciente responder de modo especialmente favorável ao tratamento com a cepa atenuada de Salmonella que codifica PDL1.

[0083] A cepa atenuada de Salmonella que codifica PD-L1 pode ser fornecida na forma de solução, suspensão, liofilizado, cápsula com revestimento entérico, ou qualquer outra forma adequada. Tipicamente, a cepa atenuada de Salmonella é formulada como solução para beber. Essa modalidade oferece a vantagem de adesão melhorada do paciente. De preferência, a solução para beber compreende meios para neutralizar os ácidos gástricos até certo grau, ou seja, levar o pH do suco gástrico para um pH mais próximo de 7. De preferência, a solução para beber é uma suspensão tamponada compreendendo a cepa atenuada de Salmonella que codifica PD-L1. Em uma modalidade em particular, a suspensão tamponada é obtida suspendendo a cepa atenuada de Salmonella em um tampão adequado, preferivelmente contendo 2,6 g de hidrocarbonato de sódio, 1,7 g de ácido Lascórbico, 0,2 g de lactose monoidratada e 100 mL de água potável.

[0084] Pode ser favorável, dependendo da ocorrência de possíveis efeitos colaterais, incluir o tratamento com antibióticos ou agentes anti-inflamatórios.

[0085] Caso ocorram eventos adversos que se pareçam com reações de hipersensibilidade mediadas por histamina,

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34/45 leucotrienos ou citocinas, opções de tratamento para febre, anafilaxia, instabilidade da pressão arterial, broncoespasmo e dispnéia estão disponíveis. As opções de tratamento, em caso de autoagressão indesejada provocada por células T, são derivadas de esquemas de tratamento padrão na doença aguda ou crônica do hospedeiro versus enxerto e aplicadas depois do transplante de células-tronco. Ciclosporina e glicocorticoides são propostos como opções de tratamento.

[0086] No caso improvável de infecção tipo sistêmica por Salmonella typhi Ty21a, recomenda-se a terapia com antibióticos adequados, por exemplo, com fluoroquinolonas incluindo ciprofloxacino ou ofloxacino. Infecções bacterianas do trato gastrointestinal deverão ser tratadas com respectivos agentes, como rifaximina.

[0087] Em modalidades particulares, a imunoterapia contra o câncer compreende uma administração única ou administrações múltiplas da cepa atenuada de Salmonella PD-L1 ou de uma composição farmacêutica compreendendo a mesma. A dose única das administrações pode ser igual ou diferente. Em particular, a imunoterapia contra o câncer compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 administrações da cepa atenuada de Salmonella que codifica PDLl, de preferência em que as administrações múltiplas ocorram dentro de três a seis meses consecutivos.

Breve descrição das figuras

Figura 1: Sequência de aminoácidos de PD-L1 humano completo (SEQ ID NO 1), o qual é codificado pelo cDNA de PD-L1 contido no plasmídeo pVAXl0.PD-Llh.

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Figura 2: Sequência de aminoácidos de uma forma truncada de PD-L1 humano (SEQ ID NO 2) desprovido do peptídeo de sinalização (MRIFAVFIFMTYWHLLNA) , que é codificada pelo cDNA de PD-L1 contido no plasmideo pVAXl0.PD-Llha.

Figura 3: Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO 3) contido no plasmideo pVAXl0.PD-Llh e codificante de PD-L1 humano completo de SEQ ID NO 1 .

Figura 4: Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO 4) contido no plasmideo pVAXl0.PD-Llha e codificante de PD-L1 humano truncado de SEQ ID NO 2.

Figura 5: Sequência de ácido nucleico compreendida no vetor de expressão pVAXIO vazio (sequência do vetor de expressão pVAXIO sem a porção do sítio de clonagem múltipla que está localizado entre os sítios de restrição Nhel e Xhol) (SEQ ID NO 5) .

Figura 6: Sequência de aminoácidos de WT1 humana codificado pelo cDNA de WT1 contido no plasmideo pVAXIO.hWTl (SEQ ID NO

6).

Figura 7: Sequência de aminoácidos de MSLN humana codificada pelo cDNA de MSLN contido no plasmideo pVAXIO.hMSLN (SEQ ID NO

7).

Figura 8: Sequência de aminoácidos de CEA humano codificado pelo cDNA de CEA contido no plasmideo pVAXlO.hCEA (SEQ ID NO

8).

Figura 9: Sequência de aminoácidos de pp65 de CMV codificado pelo cDNA de pp65 de CMV contido no plasmideo pVAXl0.CMVpp65_l (SEQ ID NO 9).

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Figura 10: Sequência de aminoácidos de pp65 de CMV codificado pelo cDNA de pp65 de CMV contido no plasmídeo pVAX10.CMVpp65_2 (SEQ ID NO 10).

Figura 11: Sequência de aminoácidos de pp65 de CMV codificado pelo cDNA de pp65 de CMV contido no plasmídeo pVAXl0.CMVpp65_3 (SEQ ID NO 11).

Figura 12: Sequência de aminoácidos de VEGFR-2 codificado pelo cDNA de VEGFR-2 contido no plasmídeo pVAX10.VR2-l (SEQ ID NO 12) .

Figura 13: Sequência de aminoácidos de PD-L1 humano truncado (SEQ ID NO 13) compreendendo o domínio extracelular (aminoácidos 19-238) e o peptídeo de sinalização (aminoácidos 1-18).

Figura 14: Sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO 14) que codifica o PD-L1 humano truncado de SEQ ID NO 13.

Figura 15: Efeitos da administração profilática de VXMIOm e VXMIOma sobre a sobrevida de camundongos C57BL/6 portadores de eritroleucemia por transplante singênico disseminado de células FBL-3. Os camundongos foram vacinados com (A) vetor vazio (1,6 x 10⁸ CFU) ; (B) VXMIOm (1,8 x 10⁸ CFU) ; (C) VXMIOm (1,0 x 10¹⁰ CFU); (D) VXMIOma (3,6 x 10⁸ CFU); ou (E) VXMIOma (1,0 x 10¹⁰ CFU). A seta vertical indica inoculação do tumor.

Figura 16: Efeitos da administração profilática de VXMIOm e VXMIOma sobre a sobrevida em longo prazo de camundongos C57BL/6 após a reintrodução (re-challenge) de células FBL-3. Os camundongos foram vacinados e tratados como segue (A) vetor vazio (1,6 x 10⁸ CFU); (B) não tratado (reintrodução controle);

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37/45 (C) VXMlOm (1,8 x 10⁸ CFU); (D) VXMlOm (1,0 x 10¹⁰ CFU); (E) VXMlOma (3,6 x 10⁸ CFU); ou (F) VXMlOma (1,0 x 10¹⁰ CFU). As setas verticais indicam inoculação do tumor.

Figura 17: Efeitos da administração terapêutica de VXMlOm e VXMlOma sobre a sobrevida de camundongos C57BL/6 portadores de eritroleucemia por transplante singênico disseminado de células FBL-3. A) Esquema para vacinação terapêutica com

VXMlOm e VXMlOma no modelo FBL-3. B) Os camundongos foram vacinados com (A) vetor vazio (1,0 x 10⁹ CFU); (B) VXMlOm (1,0 x 10⁹ CFU); ou (C) VXMlOma (1,0 x 10⁹ CFU). A seta vertical indica inoculação do tumor.

Figura 18: (A) Desenho experimental e (B) resposta anti-PD-Ll no soro de camundongos C57BL/6 portadores de eritroleucemia por transplante singênico disseminado de células FBL-3, coletado 79 dias depois da vacinação final (esquema de vacinação: dl, d3, d5, d7, dl4, d21; desafio de FBL-3 d20) com VXM10: 10⁸ CFU (quadrado), VXM10: 10¹⁰ CFU (círculo), VXMlOa: 10⁸ CFU (triângulo, ponta para baixo), VXMlOa: 10¹⁰ CFU (triângulo, ponta para cima), controle negativo (retângulo) . A

linha t	:race j ada	representa o valor de	corte	: derivado	dos
valores	do grupo	controle negativo (95%	de confiança). PD-L1
solúvel	murino	recombinante foi usado	para	imunização	com
CFA/IFA	no grupo	controle positivo (cruz).
Figura	19: (A)	Desenho experimental e	(B)	nível de	ΙΕΝγ
(símbolos claros	) e TNFa (símbolos escuros)	secretados	por

esplenócitos isolados de camundongos imunizados com o vetor vazio (círculos), VXM10 (quadrados) ou VXMlOa (triângulos), e estimulados com um pool de 5 peptídeos derivados de PD-L1,

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38/45 conforme medido no sobrenadante da cultura por ELISA depois de 6 dias de estimulação (média de n=5).

EXEMPLOS

Exemplo 1: Avaliação da atividade antitumoral de VXMIOm em camundongos C57BL/6 portadores de eritroleucemia por transplante singênico disseminado de células FBL-3 [0088] O objetivo desse estudo foi investigar a eficácia antitumoral de duas vacinas de DNA de PD-L1 baseadas em Salmonella em camundongos C57 BL/6 portadores de eritroleucemia por transplante singênico disseminado de células FBL-3. VXMIOm é a cepa SL7207 de Salmonella typhimurium aroA transformada com o plasmídeo de expressão pVAXIO que codifica PD-L1 murino nativo completo (com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO 17). VXMIOma é a cepa SL7207 de Salmonella typhimurium aroA transformada com o plasmídeo de expressão pVAXIO que codifica uma forma truncada de PD-L1 murino (com a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO 18), mais especificamente a terminação N truncada por 17 resíduos de 17 aminoácidos.

[0089] O tratamento iniciou no dia da randomização e foi considerado o Dia 1 (Dl) . Trinta camundongos C57BL/6 machos sadios, 4-6 semanas de idade, foram randomizados de acordo com seu peso corporal em 5 grupos de 6 animais cada. A alocação dos animais para os grupos de tratamento está resumida na Tabela 1. Um teste estatístico (teste t de Student) foi realizado para examinar a homogeneidade entre os grupos (dados não mostrados).

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Tabela 1:

Grupo n°	N° de animais	Vacina	Dose	Via	Esquema de tratamento
1	6	Vetor vazio (VXM0m_empty)	1,6 χ 10⁸ CFU/adm	VO	dl, d7,	d3, d5, dl4, d21
2	6	VXMIOm (PD-L1 completo)	1,8 χ 10⁸ CFU/adm	VO	dl, d7,	d3, d5, dl4, d21
3	6	VXM10m-HD (dose alta)	1, 0 x 10¹⁰ CFU/adm	vo	dl, d7,	d3, d5, dl4, d21
4	6	VXMIOma (PD-L1 truncado)	3,6 χ 10⁸ CFU/adm	vo	dl, d7,	d3, d5, dl4, d21
5	6	VXM10ma-HD (dose alta)	1, 0 x 10¹⁰ CFU/adm	vo	dl, d7,	d3, d5, d!4, d21

[0090] O Grupo 1 foi tratado com o vetor vazio controle (VXM0m_empty; vetor bacteriano controle S. typhimurium sem abrigar plasmídeo de expressão exógena). Os Grupos 2 a 5 foram tratados com VXMIOm ou VXMIOma, em duas doses únicas diferentes.

[0091] VXMOm-empty, VXMIOm e VXMIOma foram administrados por gavagem oral (per os, VO) em 100 pL de volumes finais por aplicação. Independentemente dos grupos de animais, cada animal recebeu uma aplicação de tampão antes da dose, VO, para neutralizar o ácido no estômago antes da administração (100 pL/animal/aplicação) . Esse tampão foi produzido pela dissolução de 2,6 g de hidrogenocarbonato de sódio, 1,7 g de

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40/45 ácido L-Ascórbico, 0,2 g de lactose monoidratada em 100 mL de água potável e foi aplicado dentro de 30 minutos antes da aplicação de VXMOm-empty, VXMIOm e VXMIOma.

[0092] A vacinação primária, iniciada no Dia 1, consistiu em 4 administrações a cada dois dias (dl, 3, 5, 7) . A vacinação primária foi seguida por vacinas de reforço nos Dias 14 e 21.

[0093] Tumores foram induzidos em todos os animais por injeção I.P. de 5,0 x 10⁶ células FBL-3 em 500 pL de RPMI 1640 no Dia 20. FBL-3 é uma linhagem celular de eritroleucemia induzida pelo vírus da leucemia de Friend, que tem origem em camundongos C57BL/6. Essa linhagem de células expressa antígenos tumorais únicos de transplante específicos que podem ser reconhecidos pelo sistema imune. A preparação de camundongos singênicos com células tumorais FBL-3 leva à rejeição subsequente de desafios futuros com tumor vivo. Embora FBL-3 seja imunogênico, a injeção de células tumorais FBL-3 vivas em camundongos singênicos virgens resulta em crescimento tumoral, sugerindo que as células tumorais FBL-3 tumor possuem mecanismos de escape do reconhecimento e destruição pelo sistema imune. Deve-se ressaltar que PD-L1 demonstrou ser altamente expresso na linhagem de células FBL3 .

[0094] O peso corporal do animal, a viabilidade e o comportamento dos animais foram monitorados por todo o estudo.

[0095] A sobrevida dos animais em teste é mostrada em um gráfico de Kaplan-Meier na Figura 15.

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Exemplo 2: Efeitos da administração de VXMIOm e VXMIOma sobre a sobrevida em longo prazo de camundongos C57BL/6 após a reintrodução (re-challenge) de células FBL-3 [0096] 0 objetivo desse estudo foi investigar o efeito em longo prazo de eficácia antitumoral de duas vacinas de DNA de PD-L1 baseadas em Salmonella em camundongos C57 BL/6 portadores de eritroleucemia por transplante singênico disseminado de células FBL-3 após a reintrodução.

[0097] O Estudo do Exemplo 1 foi continuado, e os camundongos receberam uma segunda dose de indução de tumor no Dia 100. Foram incluídos mais animais não vacinados controle (n=10) que estavam presentes no estudo desde o início do experimento, mas que não receberam a primeira indução do tumor, como controle para a reintrodução do tumor. A reintrodução foi realizada por indução do tumor em todos os animais dos Grupos 2-5 (vide Tabela 1) e os animais não vacinados controle por injeção I.P. de 5,0 x 10⁶ células FBL-3 em 500 pL de RPMI 1640 no Dia 100.

[0098] O peso corporal do animal, a viabilidade e o comportamento dos animais foram monitorados continuamente. Ao longo da fase de tratamento, em comparação ao grupo controle, a administração de VXMIOm e VXMIOma gerou uma resposta potente de células T de memória contra a leucemia, com 100% dos camundongos sobrevivendo por longo prazo também depois da reintrodução do desafio com células FBL-3. Não foi observada toxicidade relacionada à vacinação nem perda do peso corporal por todo o estudo. A sobrevida dos animais teste é exibida em um gráfico de Kaplan-Meier na Figura 16.

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Exemplo 3: Avaliação	da atividade	terapêutica	antitumoral de
VXMIOm e VXMIOma	em camundongos C57BL/6	portadores de
eritroleucemia por células FBL-3	transplante	singênico	disseminado de
[0099] 0 objetivo desse estudo	foi investi	gar a eficácia
antitumoral de	VXMIOm e	VXMIOma,	administrados
terapeuticamente a	camundongos	C57BL/6	portadores de
eritroleucemia por	transplante	singênico	disseminado de

células FBL-3.

[00100] Tumores foram induzidos em todos os animais por injeção intraperitoneal (i.p.) de 5,0 x 10⁶ células FBL-3 em 500 pL de RPMI 1640 no Dia 0.

[00101] O tratamento iniciou no dia da randomização, que foi considerado o Dia 1 (Dl, após injeção do tumor) . Para os grupos de tratamento, dezesseis camundongos C57BL/6 machos sadios, 4-6 semanas de idade, foram randomizados de acordo com seu peso corporal em 2 grupos de 8 animais cada. Um teste estatístico (Teste t de Student) foi realizado para examinar a homogeneidade entre os grupos (dados não mostrados).

[00102] VXMOm-empty, VXMIOm e VXMIOma foram administrados por gavagem oral (per os, VO) a 1,0 χ 10⁹ CFU em 100 pL como descrito no Exemplo 1.

[00103] Um grupo de 8 camundongos foi tratado com o vetor vazio controle (VXM0m_empty; vetor bacteriano S. typhímuríum controle não abrigando plasmídeo de expressão exógena). O outro grupo de 8 camundongos foi tratado com VXMIOm ou VXMIOma, com um tratamento primário 4 vezes nos Dias 1, 3, 5, 7 e 2 reforços semanais nos Dias 14 e 21 (Figura 17A).

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43/45 [00104] 0 peso corporal do animal, a viabilidade e o comportamento dos animais foram monitorados 3 vezes semanalmente durante o período primário-reforço e quando do pico de resposta imune, ou seja, do Dia 0 ao 28 do estudo e, então, duas vezes por semana até o final do estudo.

[00105] Ao longo da fase de tratamento, em comparação ao grupo controle, a administração oral de VXMIOm e VXMIOma resultou em um forte efeito antitumoral no modelo de leucemia FBL-3, com 100% dos animais sobrevivendo 80 dias depois do desafio da leucemia (Figura 17B) . Não foi observada toxicidade relacionada à vacinação nem perda do peso corporal por todo o estudo. A administração do vetor vazio não mostrou qualquer efeito contra o câncer.

Exemplo 4: Avaliação da resposta de anticorpos anti-PD-Ll após vacinação com VXMIOm e VXMIOma em camundongos C57BL/6 portadores de eritroleucemia por transplante singênico disseminado de células FBL-3 [00106] O objetivo desse estudo foi investigar a resposta antiPD-Ll frente a VXM10 ou VXMlOa, administrados a 10⁸ CFU e 10¹⁰CFU nos Dias 1, 3, 5 e 7 com um reforço nos Dias 14 e 21 a camundongos C57 BL/6 portadores de eritroleucemia por transplante singênico disseminado de células FBL-3. Tumores foram induzidos em todos os animais por injeção I.P. de 5,0 x 10⁶ células FBL-3 no Dia 20. A vacinação e indução do tumor foram realizadas basicamente como descritas no Exemplo 1. PDL1 solúvel murino recombinante foi usado para imunização com CFA/IFA no grupo controle positivo.

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44/45 [00107] A resposta sistêmica de anticorpos foi avaliada por ELISA no soro de animais vacinados com VXM10 ou com VXMlOa, 79 dias depois da vacinação final no Dia 21 (Figura 18A). Anticorpos anti-PD-Ll foram detectados em uns poucos animais vacinados com VXM10 e VXMlOa, e a resposta foi mais acentuada nos grupos de tratamento de dose mais alta, com 50% dos animais (3 em 6) mostrando uma razão sinal/fundo acima do valor de corte (Figura 18B)

Exemplo 5: Avaliação da resposta de células T contra PD-L1 após vacinação com VXMIOm e VXMIOma em camundongos C57BL/6 [00108] O objetivo desse estudo foi investigar a resposta de células T, induzida contra epítopos de PD-L1 em camundongos C57 BL/6 sadios (n = 5 por grupo) imunizados quatro vezes, a cada dois dias (Dias 1, 3, 5 e 7) por via oral, com 10¹⁰ CFU de VXM10, VXMlOa ou o vetor vazio controle (Figura 19A).

[00109] A reestimulação ex vivo dos esplenócitos foi realizada 10 dias depois da última imunização (Dia 17), utilizando um pool de 5 peptídeos imunogênicos derivados de PD-L1 murino. O conteúdo do sobrenadante da cultura foi testado quanto à presença de ΙΕΝγ e TNFa por ELISA após 6 dias da estimulação in vitro.

[00110] O nível de TNFa e, menor medida, de ΙΕΝγ foi aumentado significativamente no sobrenadante de esplenócitos derivados de animais vacinados com VXMlOa e estimulados com peptídeos de PD-L1 (Figura 19B). Esses dados confirmam que a imunização com VXMlOa induziu um pool de células T específicas para PD-L1.

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Exemplo 6: Avaliação da atividade antitumoral de VXMIOmb em camundongos C57BL/6 portadores de eritroleucemia por transplante singênico disseminado de células FBL-3 [00111] 0 objetivo desse estudo é investigar o efeito em longo prazo da eficácia antitumoral de uma terceira vacina de DNA de PD-L1 baseada em Salmonella em camundongos C57 BL/6 portadores de eritroleucemia por transplante singênico disseminado de células FBL-3. VXMIOmb é a cepa SL7207 de Salmonella typhimurium arok transformada com o plasmideo de expressão pVAXIO que codifica uma forma truncada de PD-L1 murino, mais especificamente o domínio extracelular incluindo o peptídeo de sinalização N-terminal (sequência de aminoácidos, SEQ ID NO 15; sequência de ácido nucleico, SEQ ID NO 16) . O Experimento é realizado essencialmente como descrito nos Exemplos 1 e 2.

Exemplo 7: Avaliação da atividade terapêutica antitumoral de VXMIOmb em camundongos C57BL/6 portadores de eritroleucemia por transplante singênico disseminado de células FBL-3 [00112] O objetivo desse estudo é investigar a eficácia antitumoral de VXMIOmb administrado terapeuticamente a camundongos C57BL/6 portadores de eritroleucemia por transplante singênico disseminado de células FBL-3. O Experimento é realizado essencialmente como descrito no Exemplo 3.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Cepa atenuada de Salmonella, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA incluindo um cassete de expressão que codifica PD-L1.
2. Cepa atenuada de Salmonella de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que:

(a) a cepa atenuada de Salmonella é da espécie Salmonella enterica;

(b) a cepa atenuada de Salmonella é Salmonella typhi Ty21a;

(c) o cassete de expressão é um cassete de expressão eucariótico e/ou (d) o cassete de expressão compreende um promotor de CMV.
3. Cepa atenuada de Salmonella de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que PD-L1 é selecionado a partir do grupo que consiste em PD-L1 com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 1 e uma proteína que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com a mesma e PD-L1 com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 2 e uma proteína que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com a mesma e PD-L1 com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 13 e uma proteína que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com a mesma, particularmente em que PD-L1 possui a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 ou SEQ ID NO 13.

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4. Cepa atenuada de Salmonella de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que PD-L1 é codificado pela sequência de ácido nucleico tal como encontrada em SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4 ou SEQ ID NO 14.
5. Cepa atenuada de Salmonella de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a molécula de DNA compreende ainda o gene de resistência ao antibiótico canamicina, o sitio ori de pMBl e um promotor de CMV, particularmente em que a molécula de DNA compreende a sequência de DNA tal como encontrada em SEQ ID NO 5.
6. Cepa atenuada de Salmonella de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que é para uso como um medicamento.
7. Cepa atenuada de Salmonella for use de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer.
8. Cepa atenuada de Salmonella para uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que é para uso em imunoterapia contra o câncer.
9. Cepa atenuada de Salmonella para uso de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que o tratamento de câncer compreende ainda quimioterapia, radioterapia ou terapia biológica contra câncer, particularmente em que a cepa atenuada de Salmonella é administrada antes, durante e/ou depois da quimioterapia ou do tratamento radioterápico ou da terapia biológica contra câncer, mais em particular antes e durante a quimioterapia ou o tratamento radioterápico ou a terapia biológica contra câncer.

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10. Cepa atenuada de Salmonella para uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a terapia biológica contra câncer compreende a administração de pelo menos uma vacina de DNA adicional codificante de um antigeno tumoral e/ou um antigeno do estroma tumoral, particularmente selecionado a partir de pelo menos uma cepa atenuada adicional de Salmonella compreendendo pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA adicional incluindo ainda um cassete de expressão que codifica um antigeno tumoral e/ou um antigeno do estroma tumoral, particularmente em que a dita pelo menos uma cepa atenuada adicional de Salmonella é Salmonella typhi Ty21a incluindo um cassete de expressão eucariótica adicional.
11. Cepa atenuada de Salmonella para uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o dito antigeno tumoral codificado pela dita pelo menos uma vacina de DNA adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em Proteína do Tumor de Wilms (WT1), Mesotelina (MSLN), CEA, pp65 de CMV e/ou em que o dito antigeno do estroma tumoral codificado pela dita pelo menos uma vacina de DNA adicional é VEGFR-2 ou proteína de ativação de fibroblastos (FAP) humana.
12. Cepa atenuada de Salmonella para uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o dito antigeno tumoral codificado pela dita pelo menos uma vacina de DNA adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em Proteína do Tumor de Wilms (WT1) com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 6 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a mesma, Mesotelina (MSLN) com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 7 e uma proteína que compartilha pelo

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4/5 menos cerca de 80% de identidade de sequência com a mesma, CEA com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 8 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a mesma, pp65 de CMV com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 9 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a mesma, pp65 de CMV com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 10 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a mesma, e pp65 de CMV com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 11 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a mesma, e em que o dito antígeno do estroma tumoral codificado pela dita pelo menos uma vacina de DNA adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em VEGFR-2 com a sequência de aminoácidos tal como encontrada em SEQ ID NO 12 e uma proteína que compartilha pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a mesma e proteína de ativação de fibroblastos (FAR) humana.
13. Cepa atenuada de Salmonella para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, caracterizada pelo fato de que a cepa atenuada de Salmonella é administrada oralmente.
14. Cepa atenuada de Salmonella para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13, caracterizada pelo fato de que o câncer é selecionado a partir de linfoma, leucemia, mieloma, câncer de pulmão, em particular câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC), melanoma, câncer de células renais, câncer de ovário, glioblastoma, carcinoma de células de Merkel, câncer de bexiga, câncer da cabeça e pescoço, câncer colorretal, câncer de esôfago, câncer cervical, câncer gástrico, câncer

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5/5 hepatocelular, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de pâncreas e câncer de tireoide.
15. Cepa atenuada de Salmonella para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 14, caracterizada pelo fato de que a dose única da cepa atenuada de Salmonella compreende

entre aproximadamente 10⁵ e 10¹¹, em particular entre aproximadamente 10⁶ e 10¹⁰, mais em particular entre aproximadamente 10⁶ e 10⁹, mais em particular entre aproximadamente 10⁶ e 10⁸, ainda mais em particular entre aproximadamente 10⁶ e 10⁷ unidades formadoras de colônias (CPU) .
16. Cepa atenuada de Salmonella para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 15, caracterizada pelo fato de que é para uso em imunoterapia individualizada contra o câncer, compreendendo a etapa de avaliar o padrão de expressão de PD-L1 e/ou a resposta pré-imune contra PD-L1 de um paciente.