ES2206446T3 - Virus recombinante que expresa un antigeno carcinoembrionico y metodos de uso del mismo. - Google Patents
Virus recombinante que expresa un antigeno carcinoembrionico y metodos de uso del mismo.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN VIRUS DE VACUNA/ANTIGENO CARCINOEMBRIONICO RECOMBINANTE (CEA) U OTRO VECTOR VIRAL QUE EXPRESA CEA SOBRE LA SUPERFICIE DE LAS CELULAS INFECTADAS Y QUE PROVOCA UNA RESPUESTA INMUNE IN VIVO DIRIGIDA CONTRA CEA O LAS CELULAS QUE EXPRESAN CEA Y UNA COMPOSICION FARMACEUTICA QUE LO CONTIENE. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A LOS METODOS DE TRATAMIENTO DE LOS PACIENTES QUE TIENEN CELULAS CARCINOMA EN LAS QUE SE EXPRESA CEZ Y METODOS DE ESTIMULACION DEL SISTEMA INMUNOLOGICO CONTRA CEA.
Description
Virus recombinante que expresa un antígeno
carcinoembriónico y métodos de uso del mismo.
La presente invención se refiere, en general, a
un virus recombinante. En particular, la presente invención se
refiere a vectores de vaccinia o a otros vectores virales
recombinantes en los que se inserta un antígeno carcinoembriónico,
que son capaces de inducir una respuesta inmune activa.
El antígeno carcinoembriónico (CEA) es una
proteína de 180.000 daltons muy glicosilada que se expresa en la
mayoría de los carcinomas gastrointestinales, incluyendo un gran
número de tumores colorrectales primarios y metastásicos, y también
se encuentra en algunos tejidos normales derivados del endodermo,
aunque en concentraciones mucho menores.
El CEA se describió por primera vez en 1965,
aunque no se aisló el gen ni se determinó su secuencia hasta 1987
(véase Oikawa et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.
142:511-518 (1987)). El CEA es uno de los antígenos
asociados a tumores oncofetales más estudiados. El CEA se ha usado
clínicamente en la vigilancia de pacientes postoperatorios después
de la resección de un tumor primario. Además, se han usado
satisfactoriamente anticuerpos monoclonales (MAb)
anti-CEA en el diagnóstico por imagen de tumores de
colon primarios, y en la inmunolocalización de enfermedades
metastásicas (véase, por ejemplo Sikorska et al., Cancer Det.
Prev. 12:321355 (1988); Goldenberg et al., "Cancer diagnosis
and therapy with radiolabeled antibodies", En: C.W. Vogel
(ed.), Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimaging and
Therapy of Cancer, pág. 259-280, New York:
Oxford University Press, 1987; Mach et al., Immunol. Today
2:239-249 (1981)).
Aunque el CEA generalmente se considera sólo
débilmente inmunogénico en seres humanos (no se han encontrado
indicios de inmunidad humoral o mediada por células contra CEA en
pacientes normales o con cáncer), la presente invención se refiere a
la co-presentación de CEA con un inmunógeno fuerte
para inducir una respuesta anti-CEA in vivo,
por ejemplo, en inmunoterapia de tumores.
El virus vaccinia es muy inmunogénico y estimula
tanto respuestas humorales como respuestas mediadas por células;
también es capaz de presentar antígenos tumorales con antígenos del
complejo de histocompatibilidad celular principal. Además, el uso de
virus vaccinia recombinantes in vivo es ventajoso debido a su
seguridad, eficacia y coste. La virulencia del virus puede reducirse
usando diferentes cepas del virus; la deleción del gen de la
timidina quinasa (TK) viral o porciones del mismo también produce un
virus vaccinia muy atenuado; el virus es estable durante largos
períodos de tiempo y puede administrarse fácilmente a poblaciones
grandes; el coste de desarrollo de una vacuna con vaccinia como
vector es menor que el de muchos otros métodos de desarrollo de
vacunas; y el virus vaccinia recombinante puede usarse en individuos
previamente expuestos al virus vaccinia sin reducir la
inmunogenicidad del antígeno co-presentado con el
mismo.
Se han preparado construcciones de virus vaccinia
recombinantes y se han empleado eficazmente en el pasado contra una
diversidad de enfermedades infecciosas, incluyendo la hepatitis B,
el virus del herpes simple, la parainfluenza de tipo 3, y el virus
de la fiebre de Lassa (Moss et al., Nature
311:67-69 (1984); Wachsman et al., Biosci.
Rep. 8:323:334 (1988); Spriggs et al., J. Virol. 62:
1293-1296 (1988); Fisher-Hoch et
al., Proc. Nat. Acad. Sci. ESTADOS UNIDOS
86:317-321 (1989), respectivamente). También se ha
demostrado protección a la exposición tumoral en modelos animales
usando virus vaccinia recombinantes (véase, Lathe et al.,
Nature (Londres) 326:878-880 (1987); Bernards
et al., Proc. Nat. Acad. Sci. ESTADOS UNIDOS
84:6854-6858 (1987); Estin et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. ESTADOS UNIDOS 85:1052-1056
(1988)).
La presente invención proporciona métodos para
tratar carcinomas que expresan la proteína CEA, incluyendo
carcinomas gastrointestinales y otros carcinomas que expresan CEA,
que comprenden el uso de un CEA-virus vaccinia
recombinante. "Tratamiento de carcinomas" se define como la
estimulación del sistema inmune contra células del carcinoma que
expresan CEA mediante la administración (inmunización o vacunación)
a un paciente de un CEA/virus vaccinia recombinante que induce una
respuesta inmune a CEA.
La invención se define de acuerdo con las
reivindicaciones adjuntas.
Esta invención se refiere a virus recombinantes
que expresan el antígeno asociado a tumores humanos CEA. Las
construcciones virales de acuerdo con esta invención expresan un
producto proteico (CEA) que se reconoce por anticuerpos monoclonales
anti-CEA. Además, el virus recombinante induce una
respuesta inmune humoral y/o mediada por células contra CEA cuando
se usa in vivo.
Una realización preferida de esta invención,
comprende un CEA-virus vaccinia recombinante
denominado RV-CEA construido por la inserción de un
fragmento de la endonucleasa de restricción Sma I de 2,4 kilobases
(kb) de CEA (que comprende la secuencia codificante completa para la
región codificante CEA--A de 2.106 nucleótidos, incluyendo una
porción de las dos regiones no traducidas 5' y 3') en un genoma de
virus vaccinia mediante recombinación homologa. El virus resultante
expresa CEA en la superficie de las células infectadas.
Esta invención permite que la construcción
RV-CEA, u otra construcción de virus
vaccinia-CEA obtenida de acuerdo con los principios
generales descritos en este documento, sirva como agente terapéutico
en el tratamiento de carcinomas humanos que expresan CEA.
La fig. 1 es un diagrama esquemático de la
construcción del plásmido PSC 11-CEA. Un sitio de
restricción Sma I para la inserción de segmentos genéticos extraños
esta en yuxtaposición al promotor p7.5 de vaccinia que alinea el
promotor viral con el sitio de inicio del gen clonado. El gen LacZ
de E. coli que codifica la beta galactosidasa está bajo la
regulación del promotor p11 del virus vaccinia. El gen LacZ y el
sitio de clonación SmaI están contenidos dentro de segmentos de las
secuencias del gen de la timidina quinasa (TK) de vaccinia derecho
(TK-R) e izquierdo (TK-L). Estas
secuencias virales dirigen la inserción del plásmido recombinante en
el gen TK de vaccinia de tipo silvestre. El gen TK de vaccinia es un
gen viral no esencial, y la recombinación homóloga con el plásmido
de clonación PSC 11 produce un virus deficiente en TK (fig. 1A). El
segmento génico del inserto es un clon de ADNc de CEA que contiene
95 pares de bases en la región 5' no traducida, 264 pares de bases
de la región 3' no traducida y 2.106 pares de bases de secuencias
codificantes. P_{1} y P_{2} son cebadores usados para la
amplificación de ADN por PCR. El ADNc se unió por medio de la
formación de extremos romos al sitio de clonación SmaI de
PSC-11 (fig. 1B). La construcción quimérica
resultante, denominada PSC-11-CEA,
se orientó por mapeo con la endonucleasa de restricción Bam H1.
La fig. 2 ilustra placas inducidas con
vaccinia-CEA recombinante. Las placas de cultivo de
tejidos muestran una monocapa confluente de células HuTK 143B
infectadas con (A) virus de tipo silvestre, V-WR, o
(B) el virus vaccinia-CEA recombinante,
Rv-CEA. La infección viral se propagó en medios
suplementados con BUDR a 25 \mul/ml y X-Gal a 300
\mug/ml. Los virus recombinantes producen placas azules evidentes
en estas condiciones.
La fig. 3 es un análisis de transferencia de
Southern de un virus vaccinia-CEA recombinante.
V-WR y Rv-CEA digeridos con Hind III
hibridaron con (A) una sonda de ADN de virus vaccinia radiomarcada o
(B) una sonda de ADN de la beta galactosidasa radiomarcada. La
transferencia de Southern (A) muestra la ausencia del fragmento J
Hind III de 5,1 kilobases (kb) en la construcción
Rv-CEA. La transferencia de Southern (B) muestra la
presencia de un fragmento Hind III de 9,2 kilobases (kb) que
contiene el gen de la beta-galactosidasa que
representa la construcción del plásmido recombinante del fragmento J
Hind III de vaccinia.
La fig. 4 ilustra la detección de virus
recombinantes por hibridación de placas directa. Se transfirieron
(A) V-WR, (B) Rv-CEA, o (C) virus
vaccinia-beta-galactosidasa
recombinantes desde una monocapa de células a una membrana de nylon
y se hicieron hibridar con una sonda de CEA radiomarcada.
La fig. 5 es un análisis por reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) de vaccinia-CEA recombinante.
Se recogieron placas virales con palillos y se sometieron a análisis
de PCR usando cebadores construidos a partir del extremo 5' y 3' del
gen de CEA. Se sometieron a electroforesis alícuotas de la reacción
de PCR, se transfirieron a una membrana de nylon y se hibridaron con
una sonda de CEA radiomarcada. Calle 1, control positivo de CEA;
calles 2-9, aislados de virus vaccinia recombinantes
(Rv-CEA) individuales; calle 10, tipo silvestre
(V-WR).
La fig. 6 muestra la detección inmunológica de
CEA en células usando el MAb anti-CEA
COL-1 en tinción inmunofluorescente y las
correspondientes micrografías ópticas de una monocapa de células
infectadas con virus vaccinia. El panel (A) es una fotomicrografía
óptica de células HuTK-143B infectadas con vaccinia
recombinante (Rv-CEA). El panel (B) es la tinción
inmunofluorescente de células HuTK-143B infectadas
con vaccinia recombinante (Rv-CEA) y tratadas con el
MAb COL-1. El panel (C) es un fotomicrografía óptica
de células HuTK 143B infectadas con el tipo silvestre
(V-WR). El panel (D) es la tinción
inmunofluorescente de células infectadas con el tipo silvestre
(V-WR) con el Mab COL-1. El panel
(E) es una fotomicrografía óptica de células HuTK143B infectadas con
vaccinia recombinante (Rv-CEA). El panel (F) es la
tinción inmunofluorescente de células HUTK143B infectadas con
vaccinia recombinante (Rv-CEA) tratadas con el Mab
B72.3.
La fig. 7 compara la respuesta del anticuerpo
anti-CEA en ratones inmunizados con virus vaccinia
de tipo silvestre y CEA-virus vaccinia recombinante.
Se inmunizaron ratones hembra C57/BL6, de 8 semanas de edad, 10 por
grupo, tres veces a intervalos de 14 días por medio de la inyección
intraperitoneal de 100 \mul de lisado bruto que contenía 1 x
10^{8} pfu de virus vaccinia (V-WR) o su derivado
recombinante (Rv-CEA). Se recogieron muestras de
suero dos semanas después de la inmunización primaria y una semana
después de la tercera inmunización. El anticuerpo
anti-CEA se cuantificó por un ensayo de
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
La fig. 8 muestra el efecto de la administración
de la construcción CEA-vaccinia recombinante sobre
el crecimiento de una línea de células de adenocarcinoma de ratón
transducida y que expresa el CEA humano. A diez ratones hembra
C57/BL6 por grupos se les inyectaron por vía subcutánea 2 x 10^{5}
células de tumor MCA38 de carcinoma de colon murino que expresaban
CEA. Siete días después, se les administraron por medio de
escarificación de la cola 10 \mul de 1 x 10^{10} pfu de vaccinia
de tipo silvestre (V-WR) o vaccinia recombinante
(Rv-CEA) seguido de dos inoculaciones adicionales
separadas por 14 días. Se midieron los tumores subcutáneos en dos
dimensiones semanalmente y los volúmenes se calcularon por la
fórmula: anchura^{2} x longitud \div 2. El panel (A) muestra el
crecimiento de los tumores de 10 ratones individuales en los que se
inoculó el virus vaccinia de tipo silvestre (V-WR).
El panel (B) muestra el crecimiento de tumores de 10 ratones
individuales en los que se inoculó virus vaccinia recombinante
(Rv-CEA) que contenía CEA humano.
La fig. 9 ilustra la prevención del crecimiento
subcutáneo de una línea de células de adenocarcinoma de ratón
transducida con CEA humano y que lo expresa después de 3
inmunizaciones usando la construcción de
CEA-vaccinia recombinante. Se inmunizaron diez
ratones hembra C57/BL6 por grupo por escarificación de la cola con
10 \mul de vaccinia de tipo silvestre bruto (V-WR)
o vaccinia recombinante (Rv-CEA). Las inmunizaciones
se administraron a intervalos de 14 días. Las vacunaciones se
administraron en los días -30, -16 y -2. Dos días después de la
última inmunización, se trasplantaron por vía subcutánea 2 x
10^{5} células de carcinoma de colon MCA38 que expresaban CEA
humano. El panel (A) muestra el crecimiento de los tumores de 10
animales individuales inmunizados con virus de tipo silvestre
(V-WR). El panel (B) muestra el crecimiento de
tumores de 10 animales inmunizados con virus vaccinia recombinante
(Rv-CEA) que contenía CEA humano.
La fig. 10 muestra el efecto de la administración
de ciclofosfamida en combinación con la construcción de
CEA-vaccinia recombinante sobre el crecimiento de
una línea de células de adenocarcinoma de ratón que expresan CEA
humano. A ratones hembra C57/BL6 se les administró ciclofosfamida
(100 mg/kg) por inyección intraperitoneal, dos días antes de la
implantación del tumor. Se trasplantaron 2 x 10^{5} células de
adenocarcinoma MCA38 que expresaban CEA humano por inyección
subcutánea y, dos días después, a los ratones se les administraron
por escarificación de la cola 10 \mul de 1 x 10^{10} pfu de
vaccinia de tipo silvestre (V-WR) o vaccinia
recombinante (Rv-CEA) seguido de dos inoculaciones
adicionales separadas por 14 días. Los tumores subcutáneos se
midieron en dos dimensiones semanalmente y se calcularon los
volúmenes. El panel (A) muestra el crecimiento de los tumores de 10
ratones individuales que recibieron ciclofosfamida y se inocularon
con el virus vaccinia de tipo silvestre (V-WR). El
panel (B) muestra el crecimiento de tumores de 10 ratones
individuales inoculados con virus vaccinia recombinante
(Rv-CEA) que contenía CEA humano. Las flechas
indican los días de inoculaciones de las vacunas.
La fig. 11 muestra el efecto de la administración
de la interleuquina-2 humana recombinante (rh
IL-2) y la construcción de
CEA-vaccinia recombinante sobre el crecimiento de
una línea de células de adenocarcinoma murino que expresan CEA
humano. A cinco ratones por grupo se les trasplantaron 2 x 10^{5}
células de adenocarcinoma murino MCA38 que expresaban CEA humano. Se
administró interleuquina-2 humana recombinante (rh
IL-2) dos veces al día (25.000 unidades/inyección)
por inyección intraperitoneal en los días +1, +2, +3 y +4 después
del trasplante del tumor. Se administraron 10 \mul de 1 x
10^{10} pfu de virus vaccinia de tipo silvestre
(V-WR) o virus vaccinia recombinante
(Rv-CEA) por escarificación de la cola en el día +2.
Se administraron dos inmunizaciones posteriores separadas por 14
días. Las flechas indican los días de inmunización y las estrellas
indican los días de las inyecciones de interleuquina humana
recombinante (rh IL-2). El panel (A) muestra el
crecimiento tumoral en animales que recibieron
interleuquina-2 humana recombinante (rh
IL-2) sola. El panel (B) muestra el crecimiento
tumoral en animales que recibieron rh IL-2 y virus
vaccinia de tipo silvestre (V-WR) durante 42 días.
El panel (C) muestra el crecimiento tumoral en animales que habían
recibido rh IL-2 y virus vaccinia recombinante
(Rv-CEA).
La fig. 12 ilustra el efecto de una vacunación
previa con la construcción CEA-vaccinia recombinante
sobre el crecimiento de una línea de células de adenocarcinoma de
ratón trasplantadas que expresaban CEA humano. Diez ratones por
grupo se vacunaron por escarificación de la cola con 10 \mul de
10^{7} PFU de V-NYC (paneles A y C) o
rV(NYC)-CEA (paneles B y D). Se administraron
tres vacunaciones a intervalos de 14 días. Siete días después de la
última vacunación (día 0), se trasplantaron 2 x 10^{5} células
tumorales por inoculación subcutánea. Los paneles A y B ilustran las
velocidades de crecimiento de la línea celular MC-38
que no expresa CEA, y los paneles C y D ilustran la velocidad de
crecimiento de tumores que expresan CEA,
MC-38-CEA-2. Se
tomaron medidas semanales en dos dimensiones.
La fig. 13 ilustra el tratamiento con
rV(NYC)-CEA de ratones portadores de
adenocarcinomas de colon de ratón MC-38 transducidos
y no transducidos con CEA. A diez ratones por grupo se les
inyectaron por vía subcutánea 2 x 10^{5} células
MC-38 (paneles A y B) o las células
MC-38-CEA-2
transducidas con CEA (paneles C y D) en el día 0. Siete días
después, los animales se vacunaron por escarificación de la cola con
10 \mul de 10^{7} PFU de V-NYC (paneles A y C) o
rV(NYC)-CEA (paneles B y D). Se administraron
dos vacunaciones más separadas por 14 días en los días 21 y 35. Los
tumores se midieron semanalmente en 2 dimensiones.
La fig. 14 ilustra respuestas de anticuerpos a la
inoculación con virus vaccinia recombinante en monos. Los animales
se vacunaron en los días 1, 42 y 84 (flechas) con
V-NYC (símbolos blancos) o
rV(NYC)-CEA (símbolos negros). El anticuerpo
anti-CEA se cuantificó en diferentes puntos de
tiempo por ELISA.
La fig. 15 ilustra la especificidad de la
actividad ADCC de PBMC humanas por antisuero de mono inducido con
rV-CEA. (A). Se ensayaron sueros obtenidos de monos
inoculados dos veces con rV-CEA en un ensayo de
actividad ADCC contra células de tumor murino que expresaban la
proteína CEA. Antes de la adición de PBMC humanas, las células diana
(1 x 10^{4}) se preincubaron durante 1 hora a 37ºC con una
dilución 1:50 de sueros obtenidos antes de la inmunización (símbolos
blancos) o sueros obtenidos 21 días después de la segunda
inmunización (símbolos negros). En los sueros se ensayó la actividad
ADCC contra una línea de células de carcinoma de colon transfectadas
con CEA (cuadrados) o las células tumorales de control no
transducidas (círculos). (B) Igual que A, con la excepción de que
las células efectoras humanas se pretrataron durante 18 horas con
IL-2 (100 U/ml). En los sueros se ensayó la
actividad ADCC contra una línea de células de carcinoma de colon
murino transfectadas con CEA.
La presente invención se refiere a un virus
recombinante que comprende un vector de vaccinia u otros vectores
virales en los que se inserta el antígeno carcinoembriónico (CEA),
expresando dicho virus recombinante CEA o un fragmento antigénico
del mismo sobre la superficie de células infectadas con el mismo e
induciendo dicho virus recombinante una respuesta inmune in
vivo dirigida contra CEA y contra células que expresan CEA.
Preferiblemente, el virus vaccinia es de una cepa
V-WR o NYC en la que se ha insertado o recombinado
ADN que codifica CEA o un fragmento inmunogénico del mismo, o pueden
usarse otras cepas de virus vaccinia humano recombinante. La
obtención de preparaciones de vaccinia recombinante para uso como
inmunógeno se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados
Unidos Nº 4.722.848 y 5.017.487 y en la publicación PCT WO87/022038.
El virus vaccinia puede contener un promotor que aumente la
expresión de CEA, por ejemplo, el promotor tardío sintético del
plásmido PMJ601 (Davison A.J. & Moss, B., Nucl. Acids Res.
18: 4285-4286 (1990)). También pueden usarse
otros vectores virales, como será evidente para el especialista en
la técnica. Éstos incluyen, por ejemplo, baculovirus (descrito, por
ejemplo, en la publicación EPO EP 228 036), adenovirus humano, SV40,
el virus de la viruela de las aves, o el virus del papiloma bovino,
en los que se ha insertado ADN que codifica para CEA o la porción
inmunogénica deseada del mismo.
Además, el CEA puede comprender uno solo o
múltiples epítopos de células T inmunodominantes. Un CEA/virus
vaccinia que consta de RV-CEA se ha depositado en la
ATCC y ha recibido el número de acceso VR 2323. La secuencia de CEA
se describe en Oikawa et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.
142-511-518 (1987) y la
caracterización de clones de ADNc que codifican CEA humano se
describe en Zimmerman et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
84:2960-2964 (1987). Para los fines de la presente
invención, la secuencias pueden derivar de las porciones enteras o
antigénicas de la secuencia de CEA. Pueden alterarselas secuencias
de nucleótidos o aminoácidos o pueden identificarse porciones
antigénicas e insertarse en las preparaciones de vacuna recombinante
de la invención de acuerdo con técnicas con las que estarán
familiarizados los especialistas en la técnica.
En otra realización, la presente invención se
refiere a una composición farmacéutica que comprende el virus
recombinante descrito anteriormente y un diluyente, vehículo o
excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica
de la invención incluyen el CEA/virus vaccinia recombinante en una
cantidad seleccionada dependiendo de la vía de administración. Las
vías se administración preferidas incluyen la vía intravenosa,
intraperitoneal, abrasión dérmica, oral, subcutánea o intradérmica.
Un especialista en la técnica apreciará que las cantidades a
administrar para cualquier protocolo de tratamiento particular
pueden determinarse fácilmente. Sería de esperar que las cantidades
adecuadas estuvieran dentro del intervalo de 10^{5} pfu a 10^{9}
pfu.
La presente invención hace que se pueda utilizar
un método para tratar a un paciente portador de un carcinoma en el
que las células del carcinoma expresan CEA, que comprende
administrar al paciente el virus recombinante descrito
anteriormente. Más específicamente, las células del carcinoma son
células del carcinoma gastrointestinal, de mama, pancreático, de
vejiga, de ovarios, de pulmón o de próstata o son carcinoderivados
del epitelio que expresan epítopos de CEA. El método descrito
anteriormente preferiblemente puede comprender también la
administración de un modificador de la respuesta biológica junto con
el virus recombinante. Preferiblemente, el modificador de la
respuesta biológica se selecciona entre el grupo compuesto por
interleuquina-2 (IL-2),
interleuquina 6 (IL-6), interferón, factor de
necrosis tumoral (TNF) y ciclofosfamida, cuya preparación y
disponibilidad son conocidas para los especialistas en la técnica.
Por ejemplo, la preparación de la IL-2 humana
recombinante se describe con detalle en las Patentes de Estados
Unidos Nos. 4.738.927 y 4.992.367, y la expresión de TNF se describe
con detalle en la Patente de Estados Unidos Nº 4.650.674. El método
descrito anteriormente también puede comprender la administración de
un adyuvante junto con el virus recombinante. Un especialista en la
técnica apreciará que las cantidades a administrar para cualquier
protocolo de tratamiento particular pueden determinarse fácilmente.
Los adyuvantes adecuados incluyen, pero sin limitación, geles
minerales, por ejemplo, hidróxido de aluminio, alumbre, sustancias
tensioactivas tales como lisolecitina, polioles pluronic,
polianiones, péptidos, emulsiones de aceite y similares.
La presente invención también hace que se pueda
utilizar un método para estimular el sistema inmune de un mamífero
contra CEA con el fin de prevenir el establecimiento y crecimiento
de células de carcinoma, que comprende administrar al mamífero el
virus recombinante descrito anteriormente en una cantidad suficiente
para efectuar dicha estimulación. El virus vaccinia puede ser de la
cepa NYC, o puede estar recombinado con una cepa de virus vaccinia
humana atenuada. El método descrito anteriormente preferiblemente
puede comprender además la administración, junto con el virus
recombinante, de un modificador de la respuesta biológica
(preferiblemente, el modificador de la respuesta biológica se
selecciona entre el grupo compuesto por
interleuquina-2 (IL-2),
interleuquina-6 (IL-6), interferón,
factor de necrosis tumoral (TNF) y ciclofosfamida). El método
descrito anteriormente también puede comprender la administración de
un adyuvante con el virus recombinante. Un especialista en la
técnica apreciará que las cantidades a administrar para cualquier
protocolo de tratamiento particular pueden determinarse fácilmente.
Las vías de administración preferidas son las que se han descrito
anteriormente.
La presente invención se describe con más detalle
en los siguientes ejemplos no limitantes.
Se construyeron virus vaccinia recombinantes en
general como se describe por Mackett et al., ("The construction
and characterization of vaccinia virus recombinants expressing
foreign genes" En: D.M. Glover (ed.) DNA Cloning; A
Practical Approach, pág. 191-211. Oxford Press
(1985)). Específicamente, se aisló un clon de ADNc de CEA humano a
partir de una biblioteca de células tumorales de colon humano. Se
aisló poli A + ARN de células GEO (Laboratory of Tumor Immunology
and Biology, NCI). Se sintetizó ADNc por transcripción inversa y se
convirtió en ADN de doble cadena por la ADN polimerasa. Se unieron
enlazadores que contenían los sitios de enzimas de restricción Hind
III y Bam H1 al ADNc y éste se insertó en el vector de clonación
direccional lambda orf-8 (de acuerdo con los métodos
descritos por Meissner et al., PNAS
84:4171-4175 (1987)). Se detectaron placas
recombinantes que contenía CEA usando procedimientos de hibridación
de ácidos nucleicos. Se purificaron placas positivas y se
secuenciaron. Se descubrió que un clon de 2,8 kilobases (kb)
contenía la región codificante entera de CEA (2.106 nucleótidos),
sobre 100 nucleótidos de la región 5' no traducida, incluyendo la
cola de poli A. Se aisló un fragmento Sma I de 2,4 kilobases (kb) a
partir de este clon y se unió por medio de la formación de extremos
romos al sitio de restricción Sma I del plásmido donador
pSC-11. La orientación del inserto del plásmido se
determinó por digestión con la endonucleasa BamHI y análisis. La
construcción del plásmido resultante se denominó
PSC-11-CEA (figura 1).
Recombinación homologa de PSC
11-CEA con virus vaccinia que tiene un gen TK no
esencial en el fragmento J Hind III del virus quimérico viral
(véase Mackett et al., Id.; PNAS
79:7415-7419 (1982)). La presencia del gen
LacZ de PSC 11-CEA que codifica para la
beta-galactosidasa en el virus recombinante
proporcionó un método de selección.
El virus recombinante rV-CEA se
construyó como se indica a continuación: se infectó una placa de
cultivo de tejidos de 60 mm de células CV-1, células
de riñón de mono verde africano (ATCC Nº CCL 70), casi confluentes,
con aproximadamente 0,20 unidades formadoras de placas/célula
(pfu/célula.) de V-WR durante aproximadamente dos
horas a 37ºC. Mientras progresaba la infección, se preparó un
precipitado de ADN de pSC 1-CEA usando 1 mililitro
(ml) de tampón de transfección (NaCl 0,14 M, Kcl 5 mM,
Na_{2}HPO_{4} 1 mM, dextrosa al 0,1% y HEPES (ácido
4-[2-hidroxietil]-1-piperazina-etanosulfónico)
20 mM, con el pH ajustado a 7,0-7,1, 5 \mug de ADN
del plásmido pSC 11-CEA quimérico, y 1 \mug de ADN
de virus vaccinia, como vehículo. Esta solución se mezcló y se
añadieron aproximadamente 50 \mul de CaCl_{2} 2,5 M, la mezcla
se agitó suavemente y se almacenó a temperatura ambiente durante
aproximadamente 20 minutos mientras precipitaba el ADN.
Después de la infección, se retiró por aspiración
el inóculo viral de la monocapa de CV-1 que después
se aclaró dos veces con 1 x solución salina tamponada con fosfato
(PBS). El ADN precipitado se añadió a la monocapa de
CV-1 gota a gota y se dejó sobre las células a
temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos, después de
lo cual se añadieron 5 ml de medio de cultivo limpio (medio de
Dulbecco; Gibco/BRL) suplementado con suero de ternero fetal (FCS)
al 5% y las células se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 3
horas. Después se aspiró el medio de la placa y se reemplazó por 5
ml de medio nuevo suplementado con FCS al 5%, y las células se
incubaron de nuevo a 37ºC, esta vez durante aproximadamente 48
horas.
Después de la incubación, las células se rasparon
para introducirse en el medio de cultivo y se recogieron por
centrifugación. El sedimento celular se resuspendió en 0,5 ml de MEM
(Medio Esencial Mínimo; Gibco/BRL). Los virus de la descendencia se
liberaron de las células por tres ciclos de
congelación-descongelación, seguido de sonicación de
las células durante aproximadamente 1 minuto en un sonicador con
baño de agua a 450 vatios.
Los virus de la descendencia, así como el control
de tipo silvestre V-WR, se cultivaron en monocapas
confluentes de células HuTK^{-}143B, una línea de células de
osteosarcoma humano con un gen timidina quinasa deficiente (ATCC Nº
CRL 8303), en presencia de 5-bromodesoxiuridina a 25
\mug/ml (BuDR; obtenido en Boehringer Mannheim Biochemicals) y
5-bromo-4-cloro-3-indoil-beta-D-galactosidasa
a 300 \mug/ml (X-Gal; Gibco/BRL). Los clones de
virus recombinantes se seleccionaron por crecimiento en las células
HuTK^{-}143B como se pone de manifiesto por la formación de placas
azules (figura 2B).
Después, las placas después se aislaron y los
virus de la descendencia se purificaron por cinco vueltas de
purificación en placa usando condiciones de selección similares a
las descritas anteriormente. Se prepararon lisados de alta
titulación de los aislados virales purificados por pasos sucesivos
en matraces decultivo de tejidos de acuerdo con técnicas
convencionales (véase Mackett et al., (1982), supra). En
general,se obtuvieron titulaciones de 1 x 10^{8} pfu/ml a 1 x
10^{9} pfu/ml. Las soluciones madre de virus se almacenaron a
-70ºC.
Se extrajo ADN de virus
vaccinia-CEA recombinante y los genomas virales se
analizaron por digestión con la endonucleasa de restricción Hind III
y transferencia de Southern. Para los fines de esta discusión, sólo
se hará referencia al aislado de virus vaccinia-CEA
recombinante preferido, rV-CEA. Para obtener
muestras de ADN viral recombinante y de control de tipo silvestre,
se infectaron monocapas casi confluentes de células HuTK^{-}143B
con aproximadamente 30 pfu/célula de V-WR o
rV-CEA, generalmente como se ha descrito
anteriormente. Se dejó que las infecciones progresaran hasta que se
observó un efecto citopático máximo, aproximadamente a las 24 horas,
después de lo cual las células se rasparon para introducirlas en el
medio de cultivo, se sedimentaron por centrifugación y se
resuspendieron en aproximadamente 50 \mul de 1 x PBS.
A cada muestra se le añadieron 300 \mul de
tampón con bajo contenido de sal Tris-HCl
[Tris(hidroximetil)aminometano] 20 mM tamponado a pH
8, EDTA (ácido etilendiamina tetra-acético) 10 mM, y
SDS (dodecil sulfato sódico) al 0,75%, y 20 \mul de proteinasa K
(10 mg/ml de Boehringer Mannheim Biochemicals) y se mezclaron. La
mezcla se incubó durante una noche a 37ºC con agitación, se extrajo
dos veces con una mezcla de fenol/cloroformo y dos veces con
cloroformo solo. Se añadió acetato sódico pH 5,0 a 0,3 N y se
añadieron dos volúmenes de etanol para precipitar el ADN. El ADN se
recogió por centrifugación y se lavó dos veces con etanol al 70%, se
secó y se analizó como se describe más adelante.
El ADN de V-WR y
rV-CEA se digirió con la endonucleasa Hind III de
acuerdo con las instrucciones del fabricante (Gibco/BRL), se sometió
a electroforesis en un gel de agarosa al 0,6% a 45 voltios durante
una noche, el ADN se transfirió a una membrana de nylon Biotran
(ICN) y se hibridó con una sonda de ADN de virus vaccinia marcada
con p^{32}-dCTP. El ADN de virus vaccinia se aisló
de acuerdo con este procedimiento establecido. Veinte unidades
A_{260} de virus vaccinia de tipo silvestre purificado (\approx
50 \mug) se llevaron a un volumen final de 1,2 ml en
Tris-HCl
[Tris(hidroximetil)aminometano] 50 mM; pH
7-8. A esta solución se le añadieron 0,1 ml de SDS
(dodecil sulfato sódico) al 10%, 0,2 ml de sacarosa al 60%, 0,4 ml
de Proteinasa K (10 mg/ml; Boehringer Mannheim Biochemicals) y se
incubó a 37ºC durante 4 horas. Esta solución se extrajo dos veces
con un volumen igual de fenol equilibrado con
Tris-HCl 50 mM pH 7-8 y una vez con
fenol/cloroformo (1:1). Se añadieron un décimo del volumen de
acetato sódico 1 M (pH 7,0) y 2,5 volúmenes de etanol y el ADN se
dejó precipitar a -20ºC durante una noche. El ADN se recogió por
centrifugación, el sobrenadante se aspiró, y el sedimento se lavó
con etanol al 95% y se secó al aire. El sedimento seco se
resuspendió en 100 \mul de H_{2}O y la concentración se
determinó por absorbancia a 260 nm. Veinticinco ng de este ADN se
marcaron con P^{32}-dCTP usando el sistema de
marcaje de ADN con cebadores aleatorios de Gibco/BRL de acuerdo con
las instrucciones de los fabricantes. Los filtros se prehibridaron
durante una noche a 37ºC en formamida al 40% (Clonetech) y 5 x
Denhardts (Ficoll 400 al 0,1% (Sigma); polivinil pirrolidona al 0,1%
(Sigma) y BSA al 0,1% (Albúmina de Suero Bovino; Boehringer Mannheim
Biochemicals); 3 x SSC (NaCl 0,45 M; citrato sódico 0,045 M),
sulfato de dextrano al 2,5% (Sigma) y ADN de Esperma de Salmón
desnaturalizado a 0,1 mg/ml (Lofstrand Laboratories). Se añadieron
1 x 10^{6} cpm/ml de dCTP de sonda marcada con dCTP de virus
vaccinia desnaturalizado y se hicieron hibridar a 37ºC durante una
noche con agitación. El filtro se lavó dos veces durante 15 minutos
en 2X SSC y SDS al 0,1% a temperatura ambiente y después dos veces
durante 15 minutos en 0,1 X SSC, SDS al 0,1% a 65ºC. La macha de
transferencia de expuso a una película de rayos X durante 4 horas,
se reveló y se analizó con respecto a la presencia de una banda de
5,1 kilobases (kb) que correspondía al fragmento J Hind III de tipo
silvestre.
El ADN de V-WR reveló un modelo
de restricción de virus vaccinia típico (véase McCarron et al.,
Virol. 86:88-101 (1978)) incluyendo una banda
de 5,1 kilobases (kb) que correspondía al fragmento J Hind III. Por
el contrario, el ADN de rV-CEA no reveló la banda
Hind III de 5,1 kb debido a la inserción de la construcción
quimérica del plásmido en el gen TK viral.
Como se muestra en la figura 3A, un fragmento
Hind III J de 5,1 kilobases (kb) en el ADN de V-WR
de tipo silvestre hibridó con la sonda de ADN de virus vaccinia. No
se encontró ninguna banda correspondiente en el ADN de
rV-CEA en este intervalo de tamaños. De esta manera,
el ARN de rV-CEA carece claramente del fragmento J
Hind III de 5,1 kilobases (kb).
Para determinar el tamaño del fragmento J
recombinante, se hibridaron transferencias de Southern que contenían
V-WR digerido con Hind III, rV-CEA y
ADN genómico humano con una sonda marcada con
p^{32}-dCTP contra el gen de la
beta-galactosidasa de E. coli. La reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) se realizó usando dos oligómeros
específicos de 20 bases como cebadores (5'GGGAAAACCCTGGCGTTACC 3' y
5' TCGAATCAGCAACGGCTTGC 3') que se unieron a un fragmento de 1
kilobase (kb) del gen de la beta-galactosidasa. Éste
se amplificó por PCR a partir de VSC 8, la banda de 1 kilobase (kb)
se cortó desde un gel de agarosa al 0,8% y se marcó usando el
sistema de marcaje de cebadores aleatorios de Gibco/BRL de acuerdo
con las instrucciones de los fabricantes; la secuencia se tomó de
Shapira et al., Gene 25:71-82 (1983).
Como se muestra en la figura 3B, el gen de la
beta-galactosidasa está presente en el virus
recombinante como se demuestra por la banda característica a 9,2 kb
en la transferencia de ADN viral de RV-CEA. Este
resultado es coherente con el tamaño esperado del fragmento J Hind
III recombinante. El gen de la beta-galactosidasa
está ausente en el genoma de vaccinia de tipo silvestre, y en el ADN
genómico humano.
\newpage
La presencia del gen de CEA en el genoma del
virus vaccinia recombinante se determinó por hibridación del ADN y
análisis por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
En el estudio de hibridación, se infectaron
monocapas casi confluentes de células HuTK^{-} 143B cultivadas en
placas de cultivo de tejidos de 60 mm con aproximadamente 10
pfu/célula de rV-CEA, V-WR como
control negativo y virus
vaccinia-beta-galactosidasa
recombinante (VSC 8; obtenido del Dr. Bernard Moss, NIAID, Bethesda,
MD) como control positivo. VSC 8 es un virus vaccinia recombinante
que contiene el gen LacZ de E. coli insertado en el gen TK de
vaccinia (Chakrabarti et al., Mol. Cell. Biol.
5:3403-3409 (1985)). Las células infectadas se
incubaron a 37ºC durante aproximadamente 24 horas y después de la
incubación, el ADN viral se transfirió directamente a membranas de
nylon por aplicación de la membrana directamente sobre la monocapa
de células durante aproximadamente 10 minutos. Después de completar
la transferencia de ADN, la membrana se retiró de la placa, se
desnaturalizó, se neutralizó y se sumergió en 2X SSC (NaCl 0,3 M,
citrato sódico 0,03 M) durante varios minutos. A continuación, el
ADN formó enlaces cruzados con la membrana por exposición a
radiación ultravioleta (UV) durante aproximadamente 2 minutos usando
un lámpara de transferencia de ADN (Foto Dyne, New Berlin. WI).
Después de la exposición UV, las membranas se hibridaron con una
sonda de CEA marcada con P^{32-}dCTP y se expusieron a una
película de rayos X durante una noche. La sonda de CEA tenía un
fragmento PST I de 560 pares de bases escindido del vector pGEM 7
(Dr. John Shively, City of Hope, Duarte, California). Veinticinco ng
de este fragmento se marcaron con dCTP^{32} usando el sistema de
marcaje de cebadores aleatorios de Gibco/BRL de acuerdo con las
instrucciones de los fabricantes. La sonda de hibridó con las
manchas de transferencia descritas anteriormente.
Como se muestra en la figura 4, las placas de
rV-CEA (figura 4B) hibridaron bien con la sonda de
CEA, mientras que las placas de V-WR (figura 4A) y
VSC 8 (figura 4C) no lo hicieron.
Para los estudios de PCR, se cultivaron monocapas
casi confluentes de células HuTK^{-}143B en placas de cultivo de
tejidos de 60 mm, infectadas con aproximadamente 10 pfu/célula de
rV-CEA o V-WR, y se incubaron a 37ºC
durante aproximadamente 24 horas. Después de la infección, las
monocapas se cubrieron con capas de agarosa, fijando de esta manera
la localización de las placas virales sobre la placa. Después se
aislaron las placas individuales por transferencia con un palillo de
dientes, se pusieron en aproximadamente 1 ml de 1 x PBS, sin calcio
o magnesio, y se llevaron a ebullición durante aproximadamente 10
minutos seguido de refrigeración en hielo.
Se realizó una reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) convencional de acuerdo con las instrucciones del
fabricante usando el kit de amplificación suministrado por Cetus
Corp. Para este estudio, se construyeron cebadores
oligonucleotídicos que reconocían el segmento de ADNc de CEA
completo para cebar la reacción de PCR, es decir, se
construyeron cebadores a partir del extremo 5' y 3' del gen de CEA
(véase la figura 1A, P_{1} y P_{2}). Como control negativo se
usó una placa de virus vaccinia de tipo silvestre.
Después de 30 ciclos de amplificación viral, se
sometieron a electroforesis muestras de cada aislado de placa en un
gel de agarosa al 1%, se transfirieron a una membrana de nylon y se
hibridaron con la sonda de CEA radiomarcada como se ha descrito
anteriormente. Los resultados se muestran en la figura 5. Todos los
aislados recombinantes y el control positivo de CEA (calles
1-9) hibridaron con la sonda del gen de CEA,
mientras que el ADN de virus vaccinia de tipo silvestre (calle 10)
no mostró ninguna hibridación.
La expresión y la localización de la proteína CEA
se determinó por tinción inmunofluorescente de células infectadas
con V-WR y rV-CEA usando el MAb
COL-1, un anticuerpo monoclonal murino dirigido
contra y reactivo con CEA (Muraro et al., Cancer Res.
45:5769-5780 (1985)). Para ensayar la expresión de
la proteína CEA, se inocularon monocapas casi confluentes de células
HuTK^{-} 143B con 30 pfu/célula de V-WR o
rV-CEA y se incubaron a 37ºC durante aproximadamente
5 horas. Después se aspiró el inóculo viral de las células y la
monocapa se lavó 3 veces con 1 x PBS. Las células después se fijaron
durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente usando una
solución recién preparada de paraformaldehído al 2% en PBS. Después
de la fijación, las células se lavaron 3 veces con medio esencial
mínimo (MEM; Gibco/BRL) y se "bloquearon" con BSA al 1% en PBS
durante aproximadamente 30 minutos.
Después del tratamiento anterior, las células
bloqueadas fijadas se trataron por la adición de 1 \mug/ml de MAb
COL-1 o MAb B72.3 (Laboratory of Tumor Immunology
and Biology, NCI), un anticuerpo murino de control negativo que no
es reactivo con CEA, y se agitaron a temperatura ambiente durante
aproximadamente 1 hora. Las células después se lavaron 5 veces con 1
x PBS y se añadió un segundo anticuerpo de cabra
anti-ratón conjugado con fluorescencia (Kirkegaard
Perry Laboratories, Inc.) a una dilución de 1:100. Después de
aproximadamente 30 minutos, las células se lavaron 5 veces con 1 x
PBS y la expresión y localización celular del CEA se determinó por
medio del uso de un microscopio de inmunofluorescencia. La tinción
inmunofluorescente fue máxima 5 horas después la infección viral. La
incubación adicional con virus condujo a la citolisis de células
infectadas y a la degradación de la proteína de membrana.
Como se muestra en la figura 6A y B, las células
infectadas con vaccinia recombinante (rV-CEA)
mostraron una tinción de la superficie celular característica con el
MAb COL-1 bajo fluorescencia, expresando el virus
vaccinia recombinante (rV-CEA) CEA en la membrana
celular de las células infectadas, lo cual es coherente con la
localización celular normal de CEA. Por el contrario, las células
infectadas con el virus de vaccinia de tipo silvestre
(V-WR) no mostraron ninguna tinción
inmunofluorescente con COL-1 (figura 6C y D). La
tinción inmunofluorescente con el anticuerpo de control negativo del
mismo isotipo B72.3 no indujo ninguna imagen sobre las células
infectadas con el virus vaccinia recombinante
(rV-CEA) (figura 6E y F).
Se inocularon ratones hembra C57/BL6 de ocho
semanas de edad (Frederick Cancer Research Facility), 10 por muestra
de ensayo, tres veces a intervalos de 14 días mediante inyección
intraperitoneal (IP) con 100 \mul de lisado bruto que contenía
aproximadamente 1 x 10^{8} pfu de vaccinia de tipo silvestre
(V-WR) o recombinante (rV-CEA).
Aproximadamente dos semanas después de la inyección primaria y una
semana después de la inyección terciaria, se extrajo sangre de cada
ratón y los sueros se separaron. Como se muestra en la tabla 1
presentada a continuación y en la figura 7, los ratones
desarrollaron titulaciones de anticuerpo contra CEA en
aproximadamente los 14 días siguientes a la inoculación, una
respuesta que se reforzó por una inmunización posterior.
| Respuesta Inmune contra el Antígeno CEA Humano y Antígenos de Virus Vaccinia en Ratones | ||||
| Inmunizados con rV-CEA y V-WR | ||||
| Inmunizado con | Anticuerpo contra CEA^{a} | Anticuerpo contra VV^{b} | ||
| 14 días | 35 días | 14 días | 35 días | |
| V-WR | <0,05 (0,009-0,09) | <0,03 (0,01-0,05) | ++ | +++ |
| rV-CEA | 1,56 (0,7-3,12) | 12,5 (6,25-50,0) | ++ | +++ |
^{a} El anticuerpo
anti-CEA se expresó como la concentración
(\mug/ml) de MAb COL-1 específico de CEA necesaria
para proporcionar una reactividad ELISA equivalente a A405. Los
números entre paréntesis son los intervalos de diez ratones. Los
resultados mostrados son para los sueros recogidos 14 días después
de la primera inoculación y 7 días después de la tercera
inoculación. Los antisueros de los ratones se diluyeron
1:100.
^{b} Se detectaron anticuerpos
anti-virus vaccinia en el ensayo ELISA convencional
y se expresan como lecturas equivalentes a A405 en comparación con
una curva patrón de antisuero policlonal de conejo a diluciones
1:20.000 (+++) y 1:30.000 (++). Los antisueros de ratón se diluyeron
1:100.
Los anticuerpos anti-CEA y
anti-virus vaccinia se cuantificaron en los sueros
por un ensayo con inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) como se
indica a continuación:
Una placa de microtitulación de 96 pocillos se
recubrió con 100 \mul de antígeno de tipo silvestre
(V-WR) (es decir, aproximadamente 1 x 10^{7}
partículas virales) en tampón carbonato sódico 0,1 M, pH 9,6,
durante una noche. Las placas después se bloquearon con BSA al 1% en
solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía glutaraldehído
al 0,1%, se lavaron 3 veces en PBS y se incubaron durante
aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente con los sueros de
ratón obtenidos anteriormente.
Los anticuerpos de suero de ratón que se unieron
al antígeno de vaccinia V-WR se detectaron usando el
kit Inmuno Select de Gibco/BRL. Este kit permite la detección de
anticuerpos primarios de conejo o ratón, policlonales o
monoclonales, asociados con antígenos inmovilizados en un soporte
sólido. Un anticuerpo secundario biotinilado (de cabra
anti-ratón) se une a un conjugado de
estreptavidina-fosfatasa alcalina y este complejo
preformado se añade a la placa ELISA después del anticuerpo
primario. Las placas se lavaron con solución salina tamponada con
Tris (TBS) y el complejo de fosfatasa alcalina resultante se detectó
usando el cromógeno pNPP (p-nitrofenil fosfato). La
reacción se interrumpió por la adición de hidróxido sódico y se leyó
la absorbancia de las muestras a 405 nm por un lector ELISA
(Bio-Tek Microplate Reader, Modelo EL 310). Como
control positivo en las placas anti-vaccinia se usó
un anticuerpo policlonal de conejo anti-vaccinia
(proporcionado por el Dr. Mark Buller, MAID Bethesda, MD).
Se realizaron procedimientos similares usando CEA
como antígeno de ensayo. Se recubrieron placas de microtitulación de
96 pocillos con 100 \mul (250 ng) de proteína CEA purificada
(International Enzyme, San Diego, CA) y se almacenaron a 37ºC
durante una noche. Las placas después se bloquearon con BSA al 1% en
TBS. Después se realizó el procedimiento ELISA descrito
anteriormente, con la excepción de que se usó el MAb
COL-1 como anticuerpo de control positivo.
Los resultados de estos ensayos se recopilaron y
se preparó una curva patrón que correlacionaba las lecturas de A405
con la cantidad de MAb COL-1 añadida. Después se
calculó la cantidad de anticuerpo específico de CEA presente en cada
muestra experimental en equivalentes de MAb a partir de la lectura
de A405 en el intervalo lineal obtenido con las diluciones
apropiadas y la producción de anticuerpos
anti-vaccinia se correlacionó con la producción de
anticuerpos anti-CEA. Los resultados del estudio se
resumen en la figura 7.
En el ensayo ELISA, también se midió la respuesta
in vivo de ratones al propio virus vaccinia analizando los
anticuerpos anti-vaccinia para asegurar que los
ratones se habían inmunizado de manera adecuada con el virus
vaccinia. La tabla 1 muestra la respuesta de anticuerpos al virus
vaccinia y demuestra claramente que los ratones recibieron un
inóculo adecuado de virus.
Para este estudio in vivo, un grupo de
control de ratones recibió 1 x 10^{8} pfu/ml de virus vaccinia de
tipo silvestre (V-WR) a intervalos de 2 semanas.
Estos ratones desarrollaron una respuesta de anticuerpos al virus
vaccinia similar a la de los animales tratados con el virus
recombinante (rV-CEA). Los animales de control no
desarrollaron una respuesta de anticuerpos a CEA (tabla 1; figura
7). Ninguno de los ratones vacunados mostró ningún indicio de
toxicidad durante el período de observación de 42 días después de la
inmunización.
Estos datos sugieren que la inoculación con un
virus vaccinia recombinante (rV-CEA) permite que el
sistema inmune reconozca el CEA humano y cree una respuesta inmune
humoral contra el antígeno.
Se inocularon ratones C57/BL6 hembra de cuatro a
cinco semanas de edad de la Frederick Cancer Research Facility
mediante inyección subcutánea de 2 x 10^{5} células de
adenocarcinoma murino MCA38 que se habían transducido con el gen CEA
humano. Se ha demostrado que estas células expresan el gen CEA
humano que contiene epítopos de COL-1. Se inocularon
diez animales por grupo por escarificación de la cola 7 días después
de la implantación del tumor con 10 \mul de lisado bruto que
contenía 1 x 10^{10} pfu de vaccinia de tipo silvestre,
V-WR, o recombinante, rV-CEA. Se
realizaron una segunda y tercera inmunizaciones a intervalos de 14
días. Se comprobó semanalmente la presencia de tumor en los
animales. Los tumores se midieron por medio de un calibre en dos
dimensiones y el volumen se calculó usando la fórmula: anchura^{2}
x longitud \div2.
La figura 8 muestra los resultados del
crecimiento de tumores subcutáneos establecidos en 7 días de 10
ratones individuales que recibieron virus vaccinia de tipo silvestre
(V-WR; figura 8A) o virus vaccinia recombinante
(rV-CEA, figura 8B). Los animales que recibieron el
virus vaccinia recombinante que contenía CEA humano experimentaron
una reducción dramática en el crecimiento del tumor durante el
transcurso de 42 días; además, dos de los animales que recibieron el
virus vaccinia recombinante (rV-CEA) nunca
desarrollaron tumor. Estos animales sin tumores después se volvieron
a exponer a 2 x 10^{5} células MAC38 transducidas con CEA. Después
de 90 días, seguían sin tumores. Por el contrario, los animales que
recibieron el virus de tipo silvestre (V-WR)
desarrollaron tumores que crecían rápidamente. Los animales que no
recibieron ninguna construcción de vaccinia también desarrollaron
tumores y su velocidad de crecimiento fue similar a la de los
animales que recibieron de tipo silvestre
(V-WR).
Se inocularon ratones C57/BL6 hembra de cinco a
seis semanas de edad, obtenidos de la Frederick Cancer Research
Facility, tres veces, a intervalos de catorce días, con 10 \mul de
lisado bruto que contenía 1 x 10^{10} pfu de virus. Diez animales
por grupo recibieron el virus vaccinia de tipo silvestre
(V-WR) o virus vaccinia recombinante
(rV-CEA). Dos días después de la última
inmunización, se trasplantaron 2 x 10^{5} células de
adenocarcinoma murino MCA38 que se habían transducido con el gen de
CEA humano, por vía subcutánea, en los ratones. Se comprobó
semanalmente la presencia de tumores en los animales. Los tumores se
midieron por medio de un calibre en dos dimensiones y los volúmenes
se calcularon usando la fórmula anchura^{2} x longitud
\div2.
La figura 9 muestra los resultados del
crecimiento de tumores subcutáneos de 10 ratones individuales
después de 3 inmunizaciones con virus vaccinia de tipo silvestre
(V-WR; figura 9A) o virus vaccinia recombinante
(rV-CEA; figura 9B). No sólo se observó una
reducción dramática en el crecimiento del tumor, sino que las
inmunizaciones con vaccinia recombinante (rV-CEA)
retrasaban el inicio del crecimiento de los tumores en
7-10 días. Por el contrario, los animales que
recibieron el virus de tipo silvestre (V-WR)
mostraron tumores que crecían rápidamente a lo largo del período de
observación de 56 días.
Se trataron ratones C57/BL6 hembra de cuatro a
cinco semanas de edad, obtenidos de la Frederick Cancer Research
Facility, con ciclofosfamida (100 mg/kg) por inyección
intraperitoneal. Dos días después de esta inyección, se
trasplantaron por inyección subcutánea 2 x 10^{5} células de
adenocarcinoma murino MCA38 que se habían transducido con el gen de
CEA humano. En diez animales por grupo se inocularon por medio de
escarificación de la cola, dos días después de la implantación del
tumor, 10 \mul de lisado bruto que contenía 1 x 10^{10} pfu de
virus vaccinia de tipo silvestre V-WR o recombinante
rV-CEA. La segunda y tercera inoculaciones de virus
se realizaron a intervalos de 14 días. Se comprobó semanalmente la
presencia de tumores en los animales. Los tumores se midieron por
medio de un calibre en dos dimensiones y el volumen se calculó
usando la fórmula: anchura^{2} x longitud \div 2.
La ciclofosfamida es un agente alquilante que se
cree que modula las respuestas inmunes en animales y seres humanos
portadores de tumores. Se sabe que las células T supresoras son
sensibles a este fármaco a concentraciones que no afectan a otras
subpoblaciones de linfocitos. De esta manera, este fármaco quizás
puede potenciar el reconocimiento inmune celular del hospedador y
las respuestas contra las células tumorales. Demostramos que la
inmunomodulación del sistema inmune del hospedador con
ciclofosfamida administrada antes de la vacunación puede potenciar
la respuesta anti-tumoral a las inmunizaciones.
La figura 10 muestra los resultados del
crecimiento de tumores MCA38 que expresan CEA humano en animales que
recibieron ciclofosfamida e inmunizaciones con vaccinia. Diez
animales individuales recibieron 3 inmunizaciones de vaccinia de
tipo silvestre (V-WR; figura 10A) o recombinante
(rV-CEA, figura 10B) después de la implantación del
tumor. Los animales que recibieron ciclosfosfamida y vaccinia
recombinante (rV-CEA) mostraron una reducción
dramática en el tamaño de los tumores en 49 días. Dos animales no
desarrollaron tumores. Estos animales se han vuelto a exponer a 2 x
10^{5} células de adenocarcinoma murino MCA38 que expresan CEA y
no han desarrollado tumores 120 días después de la exposición. Por
el contrario, los animales que recibieron vaccinia de tipo silvestre
(V-WR) y ciclofosfamida no pudieron detener el
crecimiento del tumor. Los animales que no recibieron vaccinia pero
recibieron ciclofosfamida tampoco pudieron inhibir el crecimiento
del tumor.
Se inocularon por inyección subcutánea en ratones
C57/BL6 hembra de cuatro a cinco semanas de edad obtenidos de la
Frederick Cancer Research Facility, 2 x 10^{5} células de
adenocarcinoma murino MCA38 que expresaban CEA humano. En los días
+1, +2, +3 y +4 después del trasplante del tumor, a los ratones se
les administraron 25.000 unidades de interleuquina-2
humana recombinante purificada (rh IL-2; Cetus
Corp.), 3,6 x 10^{6} unidades/mg, dos veces al día por inyección
intraperitoneal. También en el día +2, los animales recibieron por
medio de escarificación de la cola 10 \mul de 1 x 10^{10} pfu de
virus vaccinia de tipo silvestre (V-WR) o virus
vaccinia recombinante (rV-CEA). Las dos siguientes
inmunizaciones se administraron a intervalos de 14 días. Se comprobó
semanalmente la presencia de tumores en los animales. Los tumores se
midieron por medio de un calibre en dos dimensiones y el volumen se
calculó usando la fórmula: anchura^{2} x longitud \div 2.
Algunas veces se han conseguido efectos
antitumorales, tanto en modelos de tumores murinos como en el
tratamiento de seres humanos con cáncer metastásico, usando altas
dosis de citoquinas recombinantes individuales. Por ejemplo,
Rosenberg et al. (N. Eng. J. Med.
131:1485-1492, 1985) han conseguido regresión
tumoral usando altas dosis de interleuquina-2 sola o
en combinación con una terapia celular adoptiva en ratones y seres
humanos. La interleuquina-2 es una proteína liberada
por los linfocitos T adyuvantes activados. Es esencial para la
expansión de los linfocitos T y células T citotóxicas inducidos
contra antígenos que frecuentemente están deprimidos en estados de
malignidad. Se ha demostrado que las células T citotóxicas
expandidas por la interleuquina-2
(IL-2) retienen actividad antitumoral in
vivo.
La interleuquina-2 también
promueve el crecimiento de células destructoras naturales (NK) y
potencia la citotoxicidad de las células destructoras naturales
murinas in vivo. Se demostró que la inmunomodulación del
sistema inmune del hospedador con interleuquina-2
humana recombinante (rh IL-2) administrada antes de
la vacunación recombinante potenciaba las respuestas
antitumorales.
La figura 11 muestra el efecto de la
administración de interleuquina-2 humana
recombinante (rh IL-2) y virus vaccinia recombinante
(rV-CEA) sobre el crecimiento de células de
adenocarcinoma murino MCA38 que expresan CEA humano. Cinco animales
por grupo recibieron interleuquina-2 humana
recombinante (rh IL-2) sola (figura 11A), o
interleuquina-2 humana recombinante más
inmunizaciones posteriores de virus vaccinia de tipo silvestre
(V-WR, figura 11B) o virus vaccinia recombinante
(rV-CEA; figura 11C) por escarificación de la cola
dos días después del trasplante del tumor. Los animales que
recibieron interleuquina-2 humana recombinante (rh
IL-2) más el virus vaccinia recombinante
(rV-CEA) mostraron una reducción dramática en el
crecimiento del tumor durante el transcurso de 42 días. Por el
contrario, los animales a los que se administró la
interleuquina-2 humana recombinante (rh
IL-2) más virus de tipo silvestre
(V-WR) o interleuquina-2 humana
recombinante (rh IL-2) sola desarrollaron tumores
que crecían rápidamente.
Se produjo un CEA-virus vaccinia
recombinante usando la cepa de virus vaccinia del New York City
Board of Health de la ATCC (Nº VR-325; Rockville).
El virus recombinante, denominado,
rV(NYC)-CEA se produjo por recombinación
homóloga del plásmido pSC-11 que contenía el gen CEA
humano como se describe en general en el ejemplo 1 anterior. El
plásmido pSC-11 contenía el gen Lac Z de E.
coli bajo el control del promotor tardío p-11 de
virus vaccinia. El uso de este plásmido proporcionó un método de
selección para obtener partículas virales recombinantes. La
expresión del rV(NYC)-CEA se detectó por
análisis de transferencia de Western usando el MAb
COL-1. El virus se desarrolló en cultivos en
centrifugador de células HeLa, se sedimentó directamente por
centrifugación y se purificó en un gradiente de sacarosa del 20 al
40% de acuerdo con Mackett et al., J. Virol.
49:857-864 (1984).
Los pesos moleculares del producto de CEA
expresado por las construcciones recombinantes
rV(NYC)-CEA y
rV(WR)-CEA se determinaron por análisis de
transferencia de Western usando el MAb COL-1
anti-CEA. Como controles se usaron el producto de
180 kilodaltons de CEA humano purificado y el CEA detectado en un
extracto de la línea de células de carcinoma de colon humano
establecido GEO. También se transfirieron a membranas extractos de
células infectadas con V-NYC,
rV(NYC)-CEA, V-WR y
rV(WR)-CEA y se analizaron con
COL-1. Las células infectadas con
rV(NYC)-CEA expresaron un producto de 90
kilodaltons, mientras que las células infectadas con
V-NYC de tipo silvestre o V-WR no
mostraron CEA. Las células infectadas con el
rV(WR)-CEA, por otra parte, expresaron
productos de 90 y 180 kilodaltons que reaccionaban con
COL-1. Las razones de la variación en el producto de
expresión no se conocen actualmente; sin embargo, el análisis de
transferencia de Northern de células
BS-C-1 infectadas con
rV(NYC)-CEA o
rV(WR)-CEA detectó especies de ARNm de 2,4 a
2,5 kb, indicando que en estas células estaba presente el transcrito
de CEA entero.
La construcción
rV(NYC)-CEA más atenuada se usó para prevenir
el establecimiento de trasplantes de tumor en un modelo animal. Para
determinar si se dirigían efectos antitumorales contra CEA, se
usaron células de carcinoma de colon MC-38 con y sin
el gen CEA humano transducido. También se usó el
V-NYC de tipo silvestre como inmunógeno de control
para averiguar si las respuestas inmunes protectoras generadas eran
la consecuencia del gen CEA humano que se había insertado en la cepa
de vaccinia NYC.
Como se muestra en la fig. 12A y 12B, ni la
construcción de vaccinia de tipo silvestre ni la construcción de
vaccinia recombinante sin el inserto de CEA conferían ninguna
protección contra el crecimiento de células tumorales no
transducidas con CEA trasplantadas. Los tumores de los diez ratones
de cada grupo crecían rápidamente a aproximadamente la misma
velocidad. Los tumores MC-38 no transducidos y
transducidos con CEA crecieron a velocidades similares en animales
de control que no habían recibido inoculación de vaccinia y a la
misma velocidad que los tumores que crecían en ratones que habían
recibido inoculaciones de vaccinia de tipo silvestre
(V-NYC).
Las fig. 12C y 12D comparan la eficacia de
V-NYC frente a rV(NYC)-CEA en
la inhibición del trasplante de células de carcinoma de colon
transducidas con CEA. Como se ve en la fig. 12C, en ratones
vacunados con V-NYC de tipo silvestre, 8/10 de los
tumores trasplantados crecieron rápidamente, y finalmente crecieron
los 10 tumores. Por el contrario, no creció ningún tumor en los 10
ratones vacunados con la construcción de
rV(NYC)-CEA. Además, estos ratones
inmunizados con rV(NYC)-CEA permanecieron sin
tumores durante los 120 días posteriores a la primera exposición al
tumor; en el día 120, se expusieron a 1 x 10^{6} células tumorales
transducidas con CEA y de nuevo permanecieron sin tumores a lo largo
de un período de observación adicional de 120 días. No se observó
toxicidad debido a la administración de
rV(NYC)-CEA o V-NYC.
También se demostró que la vacunación con la
construcción rV(NYC)-CEA era eficaz en el
tratamiento del tumor, es decir, inhibía el crecimiento de tumores
establecidos. Se trasplantaron tumores en animales 7 días antes del
tratamiento con virus vaccinia recombinante. Como se ve en la fig.
13A y 13B, las velocidades de crecimiento de las células de
carcinoma MC-38 (no transducidas con CEA) fueron
similares independientemente de si se usaba la construcción
V-NYC o rV(NYC)-CEA para el
tratamiento. También se observaron velocidades de crecimiento de
tumores similares en ratones que llevaban las células
MC-38 transducidas con CEA cuando se trataron con el
V-NYC de tipo silvestre (fig. 13C). Por el
contrario, sin embargo, se observó un crecimiento tumoral muy
reducido en los 10 ratones portadores de tumores tratados con la
construcción rV(NYC)-CEA (fig. 13D). Además,
tres animales de este grupo que no desarrollaron tumores durante 4
meses se expusieron de nuevo a 1 x 10^{6} células
MC-38 transducidas con CEA y permanecieron sin
tumores a lo largo del período de observación adicional de 120 días.
Los tumores MC-38 no transducidos con CEA
implantados al mismo tiempo en el lado contralateral crecieron en
ese sitio. No se observó ninguna toxicidad debida a la
administración del rV(NYC)-CEA en los
animales tratados.
Se examinó la naturaleza de la respuesta inmune
inducida por la vacuna de vaccinia
rV(NYC)-CEA. Como se ve en la tabla 2, las
titulaciones de suero contra CEA variaban de 1:700 a 1:5.250
(promedio 1:2.255) en ratones que recibieron
rV(NYC)-CEA, observándose titulaciones de o
inferiores a 1:20 (promedio \leq 1:82) en los 14 ratones
inoculados con V-NYC y en los 24 sueros previos a la
inoculación. Todos los sueros de los grupos de
pre-inoculación y de los grupos inoculados con la
construcción de vaccinia también fueron negativos o débilmente
positivos para la reactividad a ovoalbúmina, con la excepción de un
ratón con una titulación de 1:750. También se controló la dinámica
de aumento en la titulación de anticuerpos después de la inoculación
con rV(NYC)-CEA. Después de la primera
inoculación, se observó una elevación modesta en la titulación
anti-CEA, que aumentó en gran medida después de la
segunda y tercera inoculaciones con
rV(NYC)-CEA.
Las respuestas inmunes mediadas por células a la
construcción rV(NYC)-CEA se midieron usando
ensayos de hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH),
linfoproliferación y citotoxicidad. Se determinaron reacciones de
DTH en ratones en los que se había inoculado dos o tres veces
rV(NYC)-CEA o V-NYC por
escarificación de la cola (10 \mul de 10^{7} PFU, administrados
a intervalos de 14 días). Seis días después de la última inoculación
de vaccinia, en la almohadilla de una pata se inyectaron células
MC-38 no transducidas irradiadas (20 \mul de 5 x
10^{5} células MC-38 en PBS) y en la otra se
inyectaron células MC-38 transducidas con CEA
irradiadas (5 x 10^{5} células
MC-38-CEA-2 en PBS).
El espesor de las almohadillas de las patas se midió 48 horas
después de la exposición.
Se detectaron diferencias pequeñas o nulas entre
las almohadillas de las patas en los ratones tratados con solución
de PBS de control, que después se usaron para determinar los valores
basales. Se obtuvieron resultados negativos similares cuando los
ratones se inocularon dos veces con la construcción
V-NYC. Dos de diez ratones en los que se inyectó dos
veces rV(NYC)-CEA mostraron alguna hinchazón
diferencial en la almohadilla de la pata en la que se habían
inyectado las células tumorales transducidas con CEA. Los ratones
inyectados tres veces con la construcción V-NYC
mostraron una respuesta de DTH pequeña o nula a los tumores
transducidos con CEA, mientras que la mayoría de los ratones (14/20)
en los que se había inyectado tres veces la construcción
rV(NYC)-CEA demostró una reactividad de DTH
diferencial a las células tumorales transducidas con CEA. La
diferencia en los resultados de DTH después de 3 inyecciones de
rV(NYC)-CEA frente a la construcción de
V-NYC fue estadísticamente significativa (p <
0,001, ensayo t de Student). De esta manera, los resultados
demostraron que tres administraciones de
rV(NYC)-CEA eran aparentemente superiores a
dos administraciones (valores de p < 0,001 frente a <0,01) en
la inducción de una reacción de DTH contra células tumorales
transducidas con CEA humanas.
Para evaluar la respuesta linfoproliferativa como
resultado de la vacunación con rV(NYC)-CEA,
se examinaron células T esplénicas aisladas de ratones no
inmunizados o inmunizados 28 días después de la tercera y final
exposición a vaccinia, para determinar la competencia funcional y la
especificidad de antígeno indicada por la proliferación en respuesta
a diversos estímulos (tabla 3). De los tres grupos de linfocitos T
ensayados, sólo los de los ratones inmunizados con
rV(NYC)-CEA respondieron a CEA soluble. La
especificidad de antígeno a CEA se reveló usando ovoalbúmina, un
antígeno soluble irrelevante, que no pudo estimular los linfocitos
en estos ratones. Además de CEA, los linfocitos de ratones
rV(NYC)-CEA respondieron al virus vaccinia
inactivado con UV tras una exposición de recuerdo in vitro.
Además, los linfocitos de ratones que recibieron
V-NYC, pero no de los ratones no inmunizados,
demostraron radioactividad contra virus vaccinia inactivado por UV,
confirmando de esta manera la especificidad contra este antígeno
viral y la competencia funcional del grupo V-NYC.
Finalmente, los tres grupos de linfocitos respondieron fuertemente a
Con A como una medida general de la competencia de las células T
funcionales. De esta manera, la inmunización con
rV(NYC)-CEA, pero no con
V-NYC, indujo la respuesta de células T a CFA, que
se correlacionaba con un efecto antitumoral in vivo.
| Respuestas Linfoproliferativas de Ratones Inmunizados con V-NYC o rV(NYC)-CEA | |||||
| Incorporación de 3H-timidina (cpm)^{2} | |||||
| Inmunógeno^{1} | Medio | ConA | Vaccinia | CEA | Ovoalbúmina |
| rV(NYC)-CEA | 2.679 | 153.247 | 41.982 | 51.963 | 2.502 |
| V-NYC | \pm309 | \pm8079 | \pm3683 | \pm1726 | \pm186 |
| Ninguno | 2.319 | 132.443 | 40.206 | 3.275 | 2.725 |
| \pm270 | \pm5274 | \pm2924 | \pm205 | \pm391 | |
| 747 | 126.120 | 539 | 385 | 486 | |
| \pm72 | \pm6778 | \pm132 | \pm44 | \pm115 |
^{1}Se inocularon ratones C57BL/6 con
1 x 10^{7} PFU de V-NYC o
rV-NYC-CEA por escarificación de la
cola en tres ocasiones distintas a intervalos de 14 días. Después se
purificaron células T esplénicas de tales ratones 28 días después de
la exposición final. Los ratones no inmunizados, que no recibieron
nada, sirvieron como control adicional.
^{2} Se
incubaron linfocitos (1 x 10^{5}/pocillo) en presencia de
esplenocitos singénicos normales irradiados (5 x 10^{5}/pocillo)
sin (control con medio) y con diversos estímulos: Con A
(^{2}\mug/ml), V-NYC inactivado por UV (1 x
10^{7} PFU/ml), CEA purificado (50 \mug/ml; de Vitro
Diagnostics) u ovoalbúmina purificada (50 \mug/ml) durante un
período de hasta 3 (Con A) o 5 (para antígenos) días. Los cultivos
se sometieron a pulsos de [^{3}H]-timidina
(^{1}\muCi/pocillo) durante las 18-24 horas
finales de su período de incubación y la radioactividad incorporada
se determinó por espectroscopía de centelleo líquido. Los datos se
presentan como media de cpm \pm SEM de pocillos por
triplicado.
Para evaluar la presencia de una respuesta de
citotoxicidad anti-CEA inducida por una vacuna en
los animales, se aislaron linfocitos T esplénicos directamente de
ratones inmunizados con V-NYC o
rV(NYC)-CEA 5 días después de la segunda
exposición a vaccinia, ya que la inducción de CTL sería máxima poco
después del refuerzo. Los resultados, mostrados en la tabla 4,
indican que los linfocitos de ratones inmunizados con
rV(NYC)-CEA, pero no con
V-NYC, mediaban la lisis de células tumorales
MC-38-CEA-2 que
llevan el antígeno afín. Por el contrario, en condiciones de
incubación similares con los dos grupos efectores, sólo pudieron
detectarse niveles de fondo de actividad lítica contra
MC-38, la diana tumoral negativa para CEA. En
presencia de Con A, que evita el reconocimiento específico de
antígeno y facilita la citotoxicidad celular dependiente de lectina,
los dos grupos efectores lisaron eficazmente MC-38,
lo cual confirma que los linfocitos de ratones que recibían
V-NYC eran líticamente activos y que la línea de
células tumorales no era resistente intrínsecamente a la lisis.
| Lisis Mediada por Linfocitos Citotóxicos contra Tumores que Expresan CEA | |||||
| Efectores^{1} | Con A^{2} | % de Liberación Específica^{3} | |||
| MC-38-CEA-2 | MC-38 | ||||
| 40:1^{4} | 20:1 | 40:1 | 20:1 | ||
| rV(NYC)-CEA | - | 36\pm3 | 22\pm5 | 14\pm3 | 7\pm2 |
| + | NT | NT | 55\pm4 | 38\pm2 | |
| V-NYC | - | 12\pm3 | 6\pm2 | 10\pm2 | 6\pm1 |
| + | NT | NT | 55\pm5 | 40\pm4 |
^{1}Se inocularon ratones C57BL/6 con
1 x 10^{7} PFU de V-NYC o
rV-NYC-CEA por escarificación de la
cola en tres ocasiones distintas a intervalos de 14 días. Después se
purificaron células T esplénicas de tales ratones 5 días después de
la exposición final..
^{2} Se añadió Con A (2,5
\mug/ml) directamente a los cultivos indicados para inducir una
citotoxicidad celular dependiente de lectina.
^{3}Se
evaluó la actividad lítica contra dianas transducidas con CEA
(MC-38-CEA-2) y no
transducidas (MC-38) en un ensayo de liberación de
^{51}Cr convencional a dos relaciones de efector:diana. Las
reacciones se terminaron después de 16 horas, se determinó el
porcentaje de lisis específica y se presentó como media \pm SEM de
cultivos por triplicado. Se observaron modelos líticos similares en
un ensayo de cuatro horas, aunque las actividades totales fueron
menores. NT no ensayado.
^{4} Las relaciones entre
efector y célula diana fueron de 40:1 y 20:1
Se realizaron estudios para determinar la
respuesta inmune inducida por una vacuna de
rV(MYC)-CEA en primates así como para evaluar
la seguridad de tal vacuna.
Se usaron doce monos rhesus (Macaca
mulatta) macho adultos, de 5 a 7 años de edad. Los monos se
inmunizaron tres o cuatro veces al intervalos de 6 semanas por
escarificación de la piel con 10 \mul o 50 \mul de virus
purificado que contenía 1 x 10^{8} o 5 x 10^{8} unidades
formadoras de placas (PFU) de rV(NYC)-CEA o
V-NYC. Cuatro animales recibieron 1 x 10^{8} PFU
de rV(NYC)-CEA, 4 animales recibieron 5 x
10^{8} PFU de rV(NYC)-CEA y 4 animales
recibieron 5 x 10^{8} PFU de V-NYC. El protocolo
de inmunización se indica con detalle en la tabla 5.
| Protocolo de Inoculación de Monos Rhesus con Vaccinia Virus con CEA Recombinante y de Tipo Silvestre | ||||
| Experimento | Mono Número | Inmunógeno | Dosis^{a,b} | Refuerzos^{c} |
| I | 1 | V-NYC | 5 x 10^{8} | 42, 84, 174 |
| 2 | V-NYC | 5 x 10^{8} | 42, 84, 174 | |
| 3 | rV-(MYC)-CEA | 5 x 10^{8} | 42, 84, 174 | |
| 4 | rV-(NYC)-CEA | 5 x 10^{8} | 42, 84, 174 | |
| 5 | rV-(NYC)-CEA | 1 x 10^{8} | 42, 84, 174 | |
| 6 | rV-(NYC)-CEA | 1 x 10^{8} | 42, 84, 174 | |
| II.. | 7 | V-NYC | 5 x 10^{8} | 42, 84 |
| 8 | V-NYC | 5 x 10^{8} | 42, 84 |
TABLA 5
(continuación)
| Protocolo de Inoculación de Monos Rhesus con Vaccinia Virus con CEA Recombinante y de Tipo Silvestre | ||||
| Experimento | Mono Número | Inmunógeno | Dosis^{a,b} | Refuerzos^{c} |
| 9 | rV(NYC)-CEA | 5 x 10^{8} | 42, 84 | |
| 10 | rV(NYC)-CEA | 5 x 10^{8} | 42, 84 | |
| 11 | rV(NYC)-CEA | 1 x 10^{8} | 42, 84 | |
| 12 | rV(MYC)-CEA | 1 x 10^{8} | 42, 84 | |
| ^{a} dosis por vía dérmica a intervalos de 6 semanas | ||||
| ^{b} el grupo 1 recibió 4 dosis de inmunógeno | ||||
| ^{c} días después de la primera inoculación (día 1) |
Las áreas de las lesiones inducidas por las
vacunas se analizaron 24 horas después de cada inoculación. En
general, se observó más hinchazón después de las dos primeras
inoculaciones en comparación con la tercera o la cuarta inoculación.
Sin embargo, la duración de las lesiones después de cada
inmunización fue aproximadamente igual. La hinchazón de ganglios
linfáticos regionales después de la vacunación fue mayor en algunos
monos después de la primera inmunización en comparación con la
segunda, tercera o cuarta inmunizaciones. En general, no se
observaron diferencias en los parámetros con el uso de las vacunas
de rV(NYC)-CEA o V-NYC.
Los monos que recibieron el vaccinia virus de
tipo silvestre se compararon con los monos que recibieron el
vaccinia virus recombinante con respecto a la temperatura, peso,
linfadenopatía regional y la presencia de esplenomegalia y
hepatomegalia. Se observaron elevaciones leves de la temperatura en
todos los animales después de la vacunación. Se observó una
linfadenopatía regional leve durante varias semanas después de las
inmunizaciones, pero no hubo indicios de pérdida de peso,
hepatomegalia o esplenomegalia en ninguno de los animales, y no se
observaron diferencias entre los animales de control y los animales
vacunados con la vacuna recombinante. En los animales se ensayó el
recuento sanguíneo completo, diferencial, química hepática (albúmina
en suero, bilirrubina, SGOT, SGPT y gamma glutamil transpeptidasa) y
la química renal (niveles de nitrógeno de urea en sangre y de
creatinina en suero), permaneciendo normales todos estos parámetros
en todos los animales a lo largo del período de estudio, o sin que
se observaran diferencias significativas entre los animales
vacunados con la vacuna de tipo silvestre y los vacunados con la
vacuna recombinante.
Se evaluaron granulocitos de mono (y humanos) con
respecto a la expresión de antígeno de reacción cruzada no
específica (NCA) y CEA. Se ha demostrado que el gen de CEA pertenece
a la superfamilia de genes de inmunoglobulinas y se ha demostrado
que comparte alguna homología con proteínas expresadas en algunos
tejidos adultos normales, tales como el NCA encontrado en
granulocitos humanos normales. Previamente no se ha demostrado que
el CEA se exprese en granulocitos humanos. La posibilidad de inducir
una reactividad inmunológica cruzada contra NCA se evaluó por
recuento sanguíneo diferencial y ELISA. No hubo diferencias en los
recuentos diferenciales en ninguno de los animales vacunados, y no
se indujo ninguna respuesta anti-NCA por vacunación
con rV(NYC)-CEA. La expresión de NCA en la
superficie de granulocitos de mono se determinó por citometría de
flujo usando anticuerpos monoclonales B6.2 (que como se ha
demostrado previamente reaccionan con el NCA humano; Horan Hand et
al., Int. J. Biol. Markers 7:1-15 (1992)) y
B1.1 (que previamente se ha demostrado que reacciona con un epítopo
compartido por NCA y CEA; Kuroki et al., Int. J. Cancer
44:208-218 (1989)). Los dos anticuerpos mostraron
una reactividad superficial significativa a NCA en la superficie de
los granulocitos de mono. La inmunización de los animales con un
vaccinia virus recombinante que expresaba CEA no indujo ninguna
respuesta inmune aparente contra epítopos de NCA.
Se ensayaron monos inmunizados tanto con respecto
a la respuesta inmune humoral como a la respuesta inmune celular
inducida por rV(NYC)-CEA.
Se analizaron sueros de cada uno de los monos por
ELISA con respecto a la inmunorreactividad a CEA, NCA y ovoalbúmina
(OVA) como antígeno de control. El anticuerpo
anti-CEA se cuantificó por ELISA usando placas de
microtitulación recubiertas con 100 ng de CEA purificado, NCA
(purificado a partir de extractos de ácido perclórico bruto de
pulmón humano normal de acuerdo con Koroki et al., Cancer
Res. 211:713-720 (1981)), u ovoalbúmina (Sigma,
St. Louis) en PBS. Las placas se bloquearon con BSA al 5% en PBS, se
secaron y se almacenaron a -20ºC hasta el uso. Las placas se
incubaron con diversas diluciones de suero de mono así como con el
MAb COL-1 como control estándar durante 1 hora a
37ºC. Las placas se lavaron y el anticuerpo de detectó con antisuero
específico de Fc de IgG de cabra anti-humana
conjugada con peroxidasa de rábano picante (1:8000; Southern
Biotechnology, Inc. Birmingham, AL) seguido de una incubación
durante 10 minutos con 100 \mul de diclorhidrato de
o-fenilendiamina 2,8 mH en peróxido de hidrógeno al
0,015% en tampón fosfato-citrato 0,17, pH 5,0. Las
reacciones se interrumpieron por la adición de 25 \mul de ácido
sulfúrico 4 N y se leyó la absorbancia a 490 nm usando un lector
ELISA de microplacas Bio-Tek.
Los resultados, mostrados en la tabla 6, indican
que todos los sueros pre-inmunes fueron negativos
contra los tres antígenos. En el día 28 después de la inmunización
primaria, se observaron titulaciones de anticuerpo fuertes (mayores
de una dilución de suero 1:1.000) contra CEA en dos de los ocho
monos inoculados con rV(NYC)-CEA. En el día
49, una semana después del primer refuerzo, se observaron
titulaciones de anticuerpo a una dilución de suero igual o mayor que
1:250 en los ocho monos que recibieron
rV(NYC)-CEA y no se observó esta titulación
en ninguno de los monos que recibieron el V-NYC. Se
observaron resultados similares en el día 63. En el día 91 (siete
días después del segundo refuerzo) se observaron titulaciones de
anticuerpo de diluciones en suero mayores de 1:1.000 en todos los
monos ensayados que recibieron rV(NYC)-CEA,
con titulaciones mayores o iguales a 1:5.800 en cuatro monos. En uno
de los ocho monos que recibieron rV(NYC)-CEA
se observó una respuesta inmune a NCA de 1:1.250 en el día 91, pero
también se observó alguna reactividad a OVA en este mono. Otros dos
monos, uno que había recibido V-NYC y otro que había
recibido rV-(NYC)-CEA, también mostraron algunas
titulaciones de anticuerpo contra NCA en el día 91; sin embargo,
también se observaron titulaciones idénticas a OVA, lo que sugiere
una reactividad no específica potencial. De esta manera, parece ser
que el rV(NYC)-CEA inducía una respuesta
fuerte para epítopos expresados en CEA en monos rhesus con una
respuesta pequeña o nula contra epítopos específicos de NCA. La
naturaleza temporal de la respuesta anti-CEA se
representa en la fig. 14.
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se analizó una muestra de suero de un mono 35
días después de la vacunación inicial con rV-CEA por
transferencia de Western para determinar la reactividad a CEA, NCA y
ovoalbúmina. En las transferencias se demostró que el antisuero
reconocía CEA purificado, pero no ovoalbúmina ni NCA purificado. El
suero previo a la inmunización obtenido a partir del mismo mono no
detectaba CEA, NCA ni ovoalbúmina. Como controles positivos se
usaron anticuerpos monoclonales COL-1 y B6.2 que
reconocen CEA y NCA, respectivamente.
La actividad biológica de las inmunoglobulinas
inducidas por la vacuna rV(NYC)-CEA se
analizó por medio de ensayos de citotoxicidad dependientes de
anticuerpo usando células mononucleares de sangre periférica humana
como efectores y líneas de células de tumor murino transducidas con
CEA humano como dianas. Como controles se usaron células no
transducidas. Como se muestra en la fig. 15A, se observó una lisis
específica de las células tumorales que expresaban CEA usando suero
de un mono inmunizado con rV(NYC)-CEA,
mientras que no se observó lisis usando células tumorales no
transducidas como dianas. No se observó lisis con el suero preinmune
o el suero de un mono en el que se había inoculado
V-NYC. Como se muestra en la fig. 15B, la actividad
ADCC del suero de monos inmunizados con rV(NYC) aumentó
usando células mononucleares de sangre periférica humana activadas
con IL-2.
Las respuestas inmunes celulares inducidas por
rV(NYC)-CEA se evaluaron por respuestas de
hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH) y ensayos
linfoproliferativos. Las respuestas de DTH se evaluaron por ensayo
en la piel 7 días después de la última inmunización. Se inyectaron
por vía intradérmica CEA purificado (Vitro Diagnostics, Littleton,
CO) y ovoalbúmina (Sigma, St. Louis, MO) a 100 \mug en 0,1 ml de
PBS. Como control positivo se inyectaron 1 x 10^{7} PFU de
vaccinia virus inactivado por UV (254 nm durante 10 minutos).
Cuarenta y ocho horas después se midieron la hinchazón y el eritema,
se tomaron biopsias de punción de respuestas positivas y la
naturaleza de la reacción de DTH se confirmó por un examen
histopatológico. Los resultados demostraron que los siete monos que
habían recibido rV(NYC)-CEA como inmunógeno y
cuatro de los cinco monos que habían recibido el
V-NYC de control como inmunógeno respondían con una
DTH positiva a la inyección de vaccinia virus V-NYC
inactivado, mientras que ninguno de los doce monos respondieron a la
exposición al antígeno de control ovoalbúmina. Ninguno de los monos
inoculados con V-NYC respondió a CEA como antígeno
de exposición, mientras que siete de los ocho monos inmunizados con
rV(NYC)-CEA respondieron con reacciones de
DTH a las inyecciones de antígeno CEA. Estos resultados se
representan en la fig. 16.
Para los ensayos linfoproliferativos, se aislaron
PBMC a partir de monos inmunizados seis o doce meses después de su
inmunización final. Se aislaron PBMC de sangre heparinizada usando
medio de separación de linfocitos, y las PBMC se cultivaron poniendo
2 x 10^{5} células por pocillo en 0,2 ml de RPMI 1640 suplementado
con suero de ternero fetal inactivado térmicamente al 10% en placas
de 96 pocillos de fondo plano (Costar, Cambridge, MA) durante 6 días
con el antígeno apropiado o durante 3 días con Concanavalina A (Con
A; Sigma). Las células se marcaron durante las 18-24
horas finales de incubación con 1 \muCi por pocillo de
[^{3}H]-timidina (New England Nuclear) y se
recogieron con un recolector de células PHD (Cambridge Technology,
Cambrigde, MA). La radiactividad incorporada se midió por
espectroscopía de centelleo líquido (Beckman LS 3801), y los
resultados de los pocillos por triplicado se promediaron y se
presentaron como media \pm SEM.
Los resultados mostrados en la tabla 7 indicaron
que todos los monos respondían bien, independientemente de si habían
recibido rV(NYC)-CEA o V-NYC.
Se observaron pocas respuestas de linfocitos específicas para CEA, o
no se observó ninguna de estas respuestas, en comparación con la
ovoalbúmina, en los monos inmunizados con V-NYC. Sin
embargo, se observaron respuestas diferenciales a CEA frente a la
albúmina en tres monos inmunizados con
rV(NYC)-CEA incluso a los doce meses después
de la última inmunización. De esta manera, estos resultados y los
resultados de DTH demuestran la capacidad de la vacuna de
rV(NYC)-CEA para inducir respuestas celulares
específicas contra CEA.
(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (19)
1. Un método para preparar virus recombinantes
para uso en el inmunotratamiento de un carcinoma en un mamífero,
donde las células del carcinoma expresan el antígeno
carcinoembriónico (CEA) del mamífero, incluyendo el virus un gen de
CEA de dicho mamífero insertado, con lo que las células infectadas
con el virus expresan dicho CEA en su superficie y el virus es capaz
de inducir en dicho mamífero una respuesta inmune humoral y/o
mediada por células dirigida contra dicho CEA de mamífero y contra
las células que expresan dicho CEA de mamífero, comprendiendo dicho
método la inserción de dicho gen de CEA en dicho virus.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde el virus es un poxvirus.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde el virus es vaccinia.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
donde el virus vaccinia es de la cepa V-WR.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
donde el virus vaccinia es de la cepa NYC.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde el virus es el virus de la viruela de las aves de corral.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde dicho CEA comprende uno o varios epítopos de células T
inmunodominantes.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
donde dicho virus vaccinia contiene un promotor que aumenta la
expresión de CEA.
9. Un método para preparar virus vaccinia
recombinante que consta de rV-CEA (Nº de Acceso de
la ATCC VR 2323), comprendiendo dicho método insertar un gen de CEA
en un virus vaccinia que consta del Nº de Acceso de la ATCC
VR-325.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, donde el mamífero es un ser humano y
dicho CEA es un CEA humano.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde dichas células de carcinoma comprenden células de carcinoma
derivadas de epitelio que expresan epítopos de dicho CEA.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
que comprende además combinar dicho virus recombinante con un
modificador de la respuesta biológica para la administración con
dicho virus recombinante.
13. El método de acuerdo con la reivindicación
12, donde dicho modificador de la respuesta biológica se selecciona
entre interleuquina-2 (IL-2),
interleuquina-6 (IL-6), interferón,
factor de necrosis tumoral (TNF) y ciclofosfamida.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
que comprende además combinar dicho virus recombinante con un
adyuvante para la administración con dicho virus recombinante.
15. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 3 a 14, donde el virus vaccinia se recombina
con una cepa de virus vaccinia humana atenuada.
16. Un método para preparar una composición
farmacéutica, que comprende mezclar un virus recombinante que se
puede preparar por un método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, con un diluyente, vehículo o excipiente
farmacéuticamente aceptable.
17. Uso de un virus recombinante de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para la fabricación
de un medicamento para el tratamiento de un carcinoma.
18. Uso de acuerdo con la reivindicación 17,
donde el carcinoma a tratar es un carcinoma gastrointestinal, de
mama, pancreático, de vejiga, de ovarios, de pulmón o de
próstata.
\newpage
19. Uso de acuerdo con la reivindicación 17,
donde el tratamiento del carcinoma comprende estimular el sistema
inmune de dicho mamífero contra dicho CEA para prevenir el
establecimiento y crecimiento de dichas células de carcinoma.
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