KR100568193B1

KR100568193B1 - 전염성 에프 낭병의 예방을 위한 전염성 에프 낭병바이러스 항원결정부위를 포함한 ｄｎａ 백신

Info

Publication number: KR100568193B1
Application number: KR1020040016198A
Authority: KR
Inventors: 권혁무
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2004-03-10
Filing date: 2004-03-10
Publication date: 2006-04-27
Also published as: KR20050090888A

Abstract

본 발명은 전염성 F 낭병(Infectious bursal disease, IBD)의 예방을 위한 DNA 백신에 관한 것으로, 상세하게는 국내에서 분리된 조류의 전염성 F 낭병 바이러스 (IBDV)의 항원결정부위 염기서열을 포함하는 DNA 백신을 개발하여 기존의 IBDV 및 변이형 IBDV를 함께 예방 및 치료할 수 있는 DNA 백신에 관한 것이다.

전염성 F 낭병, IBD, IBDV, DNA 백신, 조류

Description

전염성 에프 낭병의 예방을 위한 전염성 에프 낭병 바이러스 항원결정부위를 포함한 ＤＮＡ 백신 {DNA vaccine comprising IBDV antigenic determinant sequence for preventing infectious bursal disease}

도 1은 IBDV의 게놈 중 A 유전자의 구조이고, PCR에 사용되는 프라이머의 명칭, 위치 및 PCR 산물 크기를 나타낸 도이고,

도 2는 IBDV SH/92 주에서 RT-PCR을 수행하여 전기영동한 도이고,

도 3는 pcDNA-VP2(레인 1) 및 pcDNA-VP243(레인 2)으로 시험관내 전사/번역반응시킨 결과, 발현된 바이러스 단백질을 SDS-PAGE한 결과도이고,

도 4a는 COS-7 세포에 Fugene6 시약만 처리한 대조군이고, 도 4b는 COS-7 세포에 Fugene6 시약과 pcDNA-VP2 플라스미드를 트랜스펙션시켜 단백질발현을 형광으로 관찰한 도이고, 도 4c는 COS-7 세포에 Fugene6 시약과 pcDNA-VP243 플라스미드를 트랜스펙션시켜 단백질발현을 형광으로 관찰한 도이고, 도 4d는 COS-7 세포에 Fugene6 시약 처리 후, 30시간 후에 계대한 다음, 대조군 세포를 관찰한 도이고, 도 4e는 COS-7세포에 pcDNA-VP2 플라스미드를 트랜스펙션시킨 후 30시간 후에 계대한 다음의 세포를 관찰한 도이고,

도 5a는 베로세포에 pcDNA-VP243로 면역화시킨 마우스에서 수득한 혈청으로 간접적으로 면역형광분석을 한 도이고, 도 5b는 IBDV SH/92 바이러스주로 감염된 베로세포에서 pcDNA-VP243로 면역화시킨 마우스에서 수득한 혈청으로 간접적으로 면역형광분석을 한 도이고,

도 6은 IBDV SH/92 바이러스주에 의한 감염 10일 후에 DNA 백신에 의한 닭 F낭(Bursa of Fabricius)의 형태를 찍은 사진이고,

도 7은 IBDV SH/92 바이러스주에 의한 감염 후, DNA 백신에 의한 닭 말초혈액림프구의 분열촉진인자의 반응 결과를 나타낸 도이고,

도 8는 IBDV SH/92 바이러스주에 의한 감염 후, DNA 백신에 의한 닭 스플레노사이트의 분열촉진인자의 반응 결과를 나타낸 도이고,

도 9a는 정상대조군인 닭 F낭(Bursa of Fabricius)의 조직염색결과를 나타낸 도이고, 도 9b는 IBDV SH/92 바이러스주에 의한 감염 후, DNA 백신을 접종하지않은 닭의 F낭 조직염색결과를 나타낸 도이고, 도 9c는 IBDV SH/92 바이러스주에 의한 감염 후, pcDNA 벡터를 접종한 닭의 F낭 조직염색결과를 나타낸 도이고, 도 9d는 IBDV SH/92 바이러스주에 의한 감염 후, pcDNA-VP2를 접종한 닭의 F낭 조직염색결과를 나타낸 도이고, 도 9e는 IBDV SH/92 바이러스주에 의한 감염 후, pcDNA-VP243를 접종한 닭의 F낭 조직염색결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 전염성 F 낭병(Infectious bursal disease, IBD)의 예방 및 치료를 위한 DNA 백신에 관한 것으로, 상세하게는 전염성 F 낭병 바이러스 (IBDV)의 항원결정부위를 포함하는 DNA 백신을 제조하는 방법을 개발하여 기존의 IBDV 및 변이형 IBDV를 함께 예방할 수 있는 DNA 백신을 제공한다.

전염성 F 낭병 바이러스 (Infectious bursal disease virus, IBDV)가 원인체인 전염성 F 낭병 (Infectious bursal disease, IBD) 또는 감보로병 (Gumboro disease)은 조류에서 경제적으로 피해가 크고 전염성이 높은 질병이다 (LukertPD and Saif YM; Infectious bursal disease:Disease of poultry, 10th ed., Iowa State University Press, pp721-738, 1997). 감염 후 IBDV는 조류의 특이 면역 기관인 F낭의 발육 중인 B 임파구에서 급속히 증식하여 면역 억제를 일으키고 다른 질병에 대한 감수성을 증가시킨다.

IBDV는 이중나선 RNA(double stranded RNA)로 구성된 두 개의 절편 (A와 B)으로 구성되어 버나비리데(Birnaviridae)의 아비버나바이러스(Avibirnavirus)에 속한다 (Murphy et al.;Virus taxonomy, Springer, pp240-244, 1995). 절편 A (약 3.3 kbp)는 VP2, VP3, 그리고 VP4로 되는 109-Kda의 전구체 폴리단백질(precursor polyprotein)과 VP5를 발현한다. 그 중에서 VP2 (약 494 아미노산)는 구조의존형으로 중화항체와 혈청형의 특이성과 관계 있는 항원 부위(antigenic region)를 포함하고 있다. 절편 B (약 2.9 kbp)는 이중나선 RNA 중합효소(dsRNA polymerase)인 VP1을 발현한다.

병원성이 강한 IBDV (highly virulent IBDV)가 1987년에 유럽에서 나타난 이 후 전 세계적으로 확인되고 있으며, 항원성이 다른 IBDV도 계속 나타나고 있어 양계산업에 큰 피해를 주고 있다. 비록 IBDV는 다수의 생바이러스 백신에 의하여 방어될 수 있지만 야외에서 종종 모체이행 항체 때문에 방어가 어려울 수도 있다 (Isamail NM and Saif YM; Avian Dis., 32, pp757-759, 1998). 또한 생백신은 중간정도의 F낭 위축을 일으켜 세균의 기회 감염을 가능하게 할 수 있고, 항원성과 병원성이 불안전 할 수 있어 항원적 또는 병원성 변이주를 생성할 수 있다. 따라서 좀더 안전하고 효과적인 백신개발이 요구된다.

DNA 백신은 항원부위를 암호화하고 있는 유전자를 포함하는 벡터 (plasmid)를 직접 숙주에 투여하여 면역반응을 유도하는 새로운 백신 방법이다. DNA 백신은 다음과 같은 이유로 고전적인 백신 방법의 대안으로 제시되고 있다. 첫째, DNA 백신은 바이러스의 유전자 중에서 항원결정 부위를 포함한 일부만을 사용하기 때문에 바이러스의 병원성이 회복될 가능성이 없고, 면역이 저하된 개체에서 감염을 일으키지 않기 때문에 안전하다. 둘째, 항원을 만드는 과정 중에 필요한 단백질 정제 과정이 필요하지 않아 시간과 비용이 절약된다. 셋째, 항원단백질이 숙주세포내에서 만들어지기 때문에 바이러스가 자연 감염된 후에 만들어진 단백질과 유사하고 항원의 종류와 접종부위에 따라 Th1과 Th2 반응을 생성할 수 있어 세포 및 체액성면역 반응을 함께 유도할 수 있다. 넷째, DNA 백신은 지속적인 면역이 가능하다. 다섯째, 동일한 플라스미드 내에 특정바이러스의 아형(subtype)이나 심지어 다른 바이러스의 유전자를 동시에 포함하는 멀티플(multiple) 백신도 가능하다. 이와 같은 이유 등으로 DNA 백신은 미래의 가장 합리적인 백신으로 대두되고 있다.

위와 같은 장점 때문에 DNA 백신은 사람과 동물을 위한 후보 백신으로서 널리 연구되어져 왔으며, 미래의 백신개발을 위하여 커다란 잠재력을 가지는 것으로 여겨지고 있다. 현재까지 동물에 사용될 목적으로 개발된 DNA 백신은 소 허피스바이러스(Bovine herpesvirus), 아비안 인플루엔자 바이러스(Avian influenza virus), 림프구 장막수막염 바이러스(Lymphocytic choriomeningitis virus), 광견병 바이러스(Rabies virus), 소 설사바이러스(bovine diarrhoea virus) 등이 있는데, 대부분의 경우에 중화항체를 생성하고 공격접종에 대하여 방어를 나타내었다. DNA 백신은 외국에서 다양한 항원을 대상으로 제조되어 그 효용성이 확인되어 오고 있는 실정이지만 국내에서는 이에 대한 연구가 거의 이루어지지 않고 있는 실정이다. 그러므로 국내에서도 이 분야에 대한 연구가 매우 시급한 실정이다.

현재 국내에서는 IBDV를 예방하기 위하여 다양한 종류의 국내백신과 외국백신이 수입되어 사용되고 있다. 그러나 외국과 마찬가지로 국내에도 다양한 변이주가 존재하는 상황에서 기존 백신들의 효과는 의문시된다. 특히 국내에 존재하는 IBDV와 수입되는 백신에 사용되는 IBDV의 항원형에 대한 정확한 분석 없이 이들 백신의 무분별한 사용은 완전한 예방 효과 없이 경제적인 손실을 초래하고 새로운 변이형 바이러스의 원인이 될 수 있다. 이러한 이유로 본 연구에서는 IBDV의 항원결정부위를 포함하는 DNA 백신을 제조하는 방법을 개발하여 기존의 IBDV 및 변이형 IBDV를 함께 예방할 수 있는 방법을 찾고자 하였다.

이러한 목적을 위하여 전염성 F 낭병의 원인 바이러스주로, 국내에서 분리된 매우 치명적인 IBDV(highly virulent IBDV)인 SH/92 주(strain)의 항원 결정 부위 로 알려진 VP2 유전자와 VP2뿐만 아니라 VP4와 VP3를 함께 발현시킬 수 있는 절편 A 부위(segment A region)을 플라스미드 pcDNA에 클로닝한 후, 유전자의 발현을 확인하고, 생체내 (In vivo) 실험으로 마우스에 DNA 백신을 접종한 후 면역반응을 확인하였고, 닭에 백신 후 공격 접종하여 폐사율, B/B 비율, 항체 역가, 림프구 증식 분석, 그리고 F낭(bursa of Fabricius)의 조직병리학적 검사를 통하여 DNA 백신의 효과를 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 국내의 조류에 있어서 치명적인 전염성 F 낭병의 예방을 위한 DNA 백신을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 국내분리주 전염성 F 낭병 바이러스(infectious bursal disease virus, IBDV) SH/92 바이러스주의 VP2, VP3 또는 VP4 유전자를 포함하는 조류의 전염성 F 낭병 예방 및 치료를 위한 DNA 백신용 플라스미드를 제공한다.

상세하게는, 본 발명은 IBDV의 VP2 유전자를 포함하는 pcDNA-VP2 플라스미드 또는 IBDV의 VP2 유전자를 포함하는 pcDNA-VP2 플라스미드를 제공한다.

또한, 본 발명은 pcDNA-VP2 또는 pcDNA-VP243 및 허용되는 담체를 함유하는 조류의 전염성 F 낭병의 예방 및 치료용 DNA 백신을 제공한다.

상기 pcDNA-VP2에서 VP2는, 국내에서 분리된 매우 치명적인 IBDV(highly virulent IBDV)인 SH/92 주(strain)의 항원 결정 부위로 알려진 VP2 단백질 부위를 암호화하는 염기서열로, SH/92 바이러스주에서 발현되어 분리된 cDNA로부터 수득될 수 있다. 또한, pcDNA-VP243에서 VP243은, 바이러스에서 VP2 단백질 뿐만 아니라 VP4와 VP3를 함께 발현시킬 수 있는 절편 A 부위(segment A region)를 암호화하는 염기서열이다.

국내에서 분리된 IBDV SH/92 주의 경우 5주령과 7주령의 SPF 닭에서 80%의 폐사율을 나타내는 매우 치명적인 IBDV주이다 (권용국 등; 농업과학논문집, 37, pp637-47, 1995).

상기 조류는 닭, 칠면조, 거위, 오리, 꿩, 메추라기, 비둘기, 타조 같은 조류를 포함한다.

이 VP2 및 VP243 염기서열들은, IBDV SH/92 바이러스 주에서 RNA를 추출하여, RT-PCR을 수행하여 cDNA을 수득한 다음, 상기 RT-PCR 산물인 cDNA, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 사용한 PCR을 시행하여 VP2 cDNA를 제조할수 있고, 상기 RT-PCR 산물인 cDNA, 서열번호 3 및 서열번호 5 의 프라이머를 사용한 PCR을 시행하여 VP243 cDNA를 제조할 수 있다.

상기 PCR 산물들인 VP2 cDNA 및 VP243 cDNA를 pcDNA3.1/V5/His-TOPO와 라이게이션하고, 이를 당 업계에서 통상적인 형질전환(transformation)방법으로 대장균에 형질전환시켜, VP2 cDNA 조각이 들어간 pcDNA-VP2 플라스미드를 갖는 클론 및 VP243 cDNA 조각이 들어간 pcDNA-VP243 플라스미드를 갖는 클론을 수득할 수 있다.

상기 cDNA는 염기서열 분석을 통하여 VP243 cDNA 서열을 확인할 수 있으며, DNA 염기서열은 서열번호 1로 표기되며, 그의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표기된다.

본 발명의 전염성 F낭병의 DNA 백신으로 사용할 수 있는 pcDNA-VP243 플라스미드를 갖는 균주는 2004년 02월 24일자로 한국농용미생물보존센터(KACC)에 기탁번호 제 KACC 95028 호로서 기탁하였다.

본 발명의 pcDNA-VP2 및 pcDNA-VP243 플라스미드를 사용하여 시험관내 전사/번역 실험을 수행하여, 정상적인 단백질이 발현되는 것을 확인하였고 또한 이를 COS-7 세포주에서 발현시켜 1차 계대배양시에도 발현됨을 확인하였다.

pcDNA-VP2 및 pcDNA-VP243 플라스미드의 DNA 백신으로의 효과를 검증하기 위하여, 마우스 및 닭에 백신으로 접종하여 면역화시키고, 국내의 아주 치명적인 병원성 IBDV SH/92 바이러스주로 공격접종한 후 생존율, B/B 비율, 항체역가, F낭 폴리클(follicle)의 림포이드 괴사(lymphoid necrosis) 그리고/또는 파괴 (depletion) 등으로 검증하여, 본 발명의 pcDNA-VP2 및 pcDNA-VP243 플라스미드를 함유하는 DNA 백신이 우수한 방어 효과를 나타냄을 확인하였다.

또한 본 발명의 DNA 백신은 단일제로 사용하거나 약효를 증강시킬 수 있는 다른 유효성분과 함께 복합제로 사용할 수 있고, 그 예로 사이토카인을 발현할 수 있는 플라스미드와 함께 투여될 수 있으며, 이에 사용할 수 있는 사이토카인으로는 인터페론-γ, 림포탁틴(lymphotactin), 인터루킨-2, 인터루킨-4, 인터루킨-8, 인터루킨-12, 인터루킨-15, 인터루킨-1β, GM-CSF(granulocyte macrophage-colony stimulating factor), TGF-β, EGF(epidermal growth factor) 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 DNA 백신은 플라스미드 DNA와 함께 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 어쥬반트 또는 부형제와 함께 사용할 수 있다.

그 예로 본 발명의 DNA 백신을 위한 담체는 수화된 단백질, 락토오즈 등의 하나이상의 안정화제를 포함한 생리학적으로 균형맞춰진 배양배지를 사용할 수 있으며 0.01 내지 0.1M의 인산완충액 또는 0.8%의 생리식염수를 사용할 수 있다. 추가적으로, 약학적으로 허용가능한 담체는 용액 또는 비용액, 현탁액, 에멀젼의 형태를 사용할 수 있다. 비용액 용매의 예로 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일 같은 식물성 오일 및 에틸 올레이트와 같은 주사용 유기 에스터가 있다. 용액성 담체는 물, 알콜용액, 에멀젼 또는 생리식염수 및 완충배양액같은 현탁액을 사용할 수 있다.

그리고, 본 발명의 DNA 백신을 위한 어쥬반트로는 완전 프로인트 어쥬반트(complete Freund's adjuvant), 불완전 프로인트 어쥬반트, 리포펙틴(lipofectin), 피로탁시(lipotaxi), CaPO₄, 25 내지 30% 슈크로스, DEAE 덱스트란, 폴리브렌(polybrene), 사포닌, 알루미늄 히드록시드와 같은 무기질 젤, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올스(pluronic polyols), 폴리음이온(polyanions), 펩티드(peptides), 오일 또는 탄화수소 에멀젼과 같은 표면활성물질, 디니트로페놀 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

비경구용 부형제는 염화나트륨용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨 등을 사용할 수 있다. 정맥주사용 부형제는 유동성액체 및 보충재, 링거 덱스트로스와 같은 전해질 보충재를 포함한다. 방부제 및 다른 첨가물은 항생제, 항산화제, 킬레이팅 시약, 비활성가스 등과 같은 것을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.

이때 또한 약제학적으로 허용 가능한 희석제를 포함하여 사용할 수 있으며, 희석제로는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 말토덱스트린, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이의 복합물을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

이러한 담체 부형제의 예로서 전분, 물, 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액이 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

DNA 백신의 효과를 위해, 투여경로, 접종량, 접종시기, 접종횟수 및 담체 또는 어쥬반트 종류 같은 여러 가지 요소에 의하여 본 발명의 DNA 백신의 조성이 선택될 수 있다.

특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량 정도는 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물(예, 화학요법제)을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다 르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 DNA 백신의 단위 투여량은 0.1㎍ 내지 100 ㎎가 바람직하며, 0.1㎍ 내지 2 ㎎이 가장 바람직하고, 1달에 1회 내지 수회 투여 또는 접종하는 것이 바람직하다.

본 발명의 DNA 백신은 경구, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

비경구 투여는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피 및 동맥내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 의미한다. 본 발명의 DNA 백신의 비경구 투여는 바람직한 순도하에 약제학적으로 허용가능한 담체, 즉 사용되는 농도와 투여량에서 수용체에게 비독성이고 다른 제제 성분과 화합할 수 있는 것을 혼합하여 단위 투여량의 제형으로 조제하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 DNA 백신의 제형은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 제조한 제형은 경구용, 주사용, 도포용으로 사용할 수 있다. 상기 제형은 정제, 캅셀제, 연질캅셀제, 수액제, 과립제, 환제 또는 주사용 형태(용액, 현탁액 또는 유탁액)로 조제할 수 있고, 주사용으로 조제하는 것이 가장 바람직하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 전염성 F 낭병 바이러스 cDNA 제작

1-1. 전염성 F 낭병 바이러스

DNA 백신 제조와 공격접종 실험에 사용한 IBDV는 9 주령의 산란계에서 분리한 IBDV SH/92주(strain)로 국립수의과학검역원에서 F낭 유제액 상태로 분양 받아 사용하였다 (권용국 등; 농업과학논문집, 37, pp637-647, 1995).

1-2. 바이러스 RNA (Viral RNA)의 추출과 정제

F낭 유제액에 2% 소디움 도데실 설페이트(SDS)와 단백질 분해효소 (proteinase K, 250㎍/㎖)를 첨가하고 55℃ 항온 수조에서 5분간 유지시킨 다음 산성페놀:클로로포름 용액 (5:1, pH 4.7, Ambion사, Woodward, USA)과 클로로포름:아이소아밀알콜 용액 (49:1)을 첨가하여 진탕한 후 얼음에 15분간 정치하였다. 12,000rpm에서 20분간 원심 분리한 후 상층액을 새 튜브에 넣고 다시 클로로포름:아이소아밀알콜(49:1)을 첨가하여 진탕한 후 12,000rpm에서 2분간 원심 분리하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 RNA 추출 키트(RNaid kit^®, Bio101사, Carlsbard, USA)를 이용하여 정제하였으며, RNA는 디에틸-피로카보네이트(diethyl-pyrocarbonate, DEPC)로 처리한 멸균 증류수에 부유시켜 -70℃ 냉동고에 보관하면서 cDNA 합성에 이용하였다.

1-3. 올리고뉴클레오타이드 프라이머

IBDV SH/92 주의 VP2와 VP243 유전자를 증폭시키기 위하여 이미 발표된 IBDV 염기 서열을 참고로 하여 프라이머를 합성하여 사용하였다 (도 1 참조) (Kwon HM, et al.; Avian Dis. 44, pp691-6, 2000). SHVP2F(서열번호 3)와 P-IBD₂ (서열번호 4)프라이머쌍은 VP2 유전자를 증폭하기 위하여 사용하였고, SHVP2F(서열번호 3)와 SHVP3(서열번호 5) 프라이머쌍은 VP243 유전자를 증폭하기 위하여 사용하였다.

본 연구에서는 IBDV VP2와 VP243 유전자를 증폭하기 위하여 사용한 포워드 프라이머(forward primer)인 SHVP2F에 진핵생물 번역개시부위 (ATG)를 위하여 코작 염기서열(Kozak sequence, GCCGCCGCC)을 삽입하였다 (서열번호 3 참조).

1-4. IBDV의 RT-PCR

cDNA 합성을 위하여 준비된 dsRNA에 90% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 더하고 98℃에서 5분간 반응시킨 후, 얼음에 5분 이상 정치하였다. 그 다음 RNA에 3㎍랜덤 헥사머 (random hexamer, GIBCOBRL사, Gaithersburg, USA)와 1㎕ 10mM dNTPs (Promega사, Madison, USA)를 더하고 65??에서 5분간 반응시킨 뒤에, 4㎕ 5X 1st strand buffer, 2㎕ 0.1M DTT (GIBCOBRL사), 1㎕ RNase 억제제 (RNase inhibitor, MBI사, Vilnius, Lithuania)를 더하여 25℃에서 10분, 42℃에서 2분간 반응시켰다. 1㎕ 슈퍼스크립트 Ⅱ 역전사효소(Superscript Ⅱ reverse transcriptase, 200unit/㎕, GIBCOBRL사)를 더하고 42℃에서 50분, 70℃에서 15분간 반응시킨 다음, 리보뉴클리아제 H (Ribonuclease H, MBI사)를 첨가한 후 37℃에서 20분, 80℃에서 10분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 증폭시키기 위하여 3㎕ cDNA에 25㎕ PCR 프리믹스 (1.25unit/25㎕ TaKaRa Ex Taq polymerase, 0.4mM dNTPs, Ex TaqTM buffer including 4mM Mg²⁺) (TaKaRa사, Shiga, Japan), 1㎕ 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를 각각 첨가한 후에 전체 반응액이 50㎕가 되도록 멸균증류수를 더하였다. PCR 반응은 94℃에서 30초간 변성 (denaturation), 51℃에서 30초간 어닐링(annealing), 72℃에서 4분간 합성 (polymerization)을 35회 실시하였고, 마지막 반응에서는 합성단계(polymerization)를 74℃에서 15분간 실시하였다. 증폭된 PCR 산물은 EtBr (10㎎/㎖)이 포함된 1% 아가로즈젤에서 전기영동한 후 UV-트랜스일루미네이터(transilluminator)에서 확인하였다.

도 2의 전기영동 결과를 보면, IBDV의 국내 야외분리주인 SH/92주를 RT-PCR로 SHVP2F/P-IBD₂(레인 1)와 SHVP2F/SHVP3(레인 2) 프라이머쌍으로 증폭한 결과, 예상한 크기인 VP2 유전자 1359bp(레인 1)와 VP243 유전자 3039bp(레인 2)의 PCR 생성물을 얻었다. 레인 M은 DNA 사이즈 마커(GibcoBRL사)이다.

실시예 2. 전염성 F 낭병 바이러스에 대한 DNA 백신의 제조

2-1. 전염성 F 낭병 바이러스 cDNA 클로닝

VP2와 VP243 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA 백신을 제조하기 위하여, 증폭된 VP2 와 VP243 유전자의 PCR 생성물을 정제키트 (GENECLEAN^® Turbo kit, Bio101사)를 이용하여 정제하였다. 준비한 cDNA는 진핵 세포 발현 플라스미드 벡터(eukaryotic expression plasmid vector)인 pcDNA3.1/V5/His-TOPO (Invitrogen사, San Diego, USA) 클로닝 벡터에 5분간 라이게이션(ligation) 반응을 시킨 뒤, 2㎕의 라이게이션 반응액을 컴피턴트 세포(competent cell, Escherichia coli, TOP10)에 혼합하여 얼음 위에서 20분간 정치시킨 후, 42℃에서 30초간 열-충격(heat-shock)을 주는 One Shot^®chemical transformation을 실시하였다. 형질전환(Transformation) 반응액에 250㎕의 SOC 배지를 첨가하여 37℃ 진탕배양기에서 225rpm으로 1시간 동안 배양한 후, 반응액을 암피실린(ampicillin, 100㎍/㎖, Sigma사, St. Luis, USA)이 첨가된 LB 아가 (DIFCO사, Sparks, USA)에 도포하고 24시간 배양하였다. 다수의 단일 집락을 암피실린이 첨가된 LB 액체배지에 접종한 다음 24시간 증식시킨 후, 배양균에서 통상의 플라스미드 DNA 추출방법에 따라 플라스미드 DNA를 분리하였다(Sambrook J et al.; Molecular cloning:A Laboratory Manual, 2nd edition, CSHL Press, 1989).

cDNA의 클로닝 여부를 확인하기 위하여 제한효소 Kpn I과 Not I으로 소화시킨 후, 전기영동하여 VP2와 VP243 유전자의 PCR 산물을 가진 클론만을 선택하였다.

2-2. 클로닝된 플라스미드 염기서열분석

VP2와 VP243 유전자가 클로닝된 것으로 확인된 플라스미드는 유전자의 삽입방향(orientation)과 클로닝된 유전자의 DNA 염기서열을 결정하기 위하여 베이스 스테이션 자동염기서열 분석기 (Base station automatic sequencer, MGA Research, USA)을 사용하였으며 그 결과는 하기 서열번호 1에 나타내었으며, 이의 아미노산서열은 하기 서열번호 2에 나타내었다. pcDNA-VP2에 클로닝된 VP2 유전자의 염기서열을 비교한 결과 pcDNA-VP243에 클로닝된 VP243 유전자에 포함된 VP2 유전자 부분과 동일하였다. 결정된 염기서열은 Genbank (accession number ; AF533670, 2003. 3. 1. 이후 공개예정)에 등록하였다. 결정된 염기서열은 DNASIS (Hitachi Software Engineering, San Francisco, U.S.A)로 기존의 IBDV 염기서열과 비교하여 VP2와 VP243 유전자가 올바른 방향으로 삽입된 클론을 선택하였다. 선택된 클론의 집락을 암피실린이 첨가된 LB 액체배지에 접종 후 37℃ 진탕배양기에서 24시간 배양한 다음 플라스미드 DNA 정제 키트 (EndoFree^TM Plasmid Giga Kit, QIAGEN사, USA)를 이용하여 대량의 플라스미드 DNA를 확보하였다.

IBDV VP2 유전자와 VP243 유전자로 만든 플라스미드 DNA 백신을 각각 pcDNA-VP2와 pcDNA-VP243으로 각각 명명하였고, IBDV 유전자가 포함되지 않은 벡터를 벡터 대조군(VC)으로 사용하였다.

상기 플라스미드 DNA 백신을 제조하기 위하여 사용한 진핵세포 발현 플라스미드 벡터인 pcDNA3.1/V5/His-TOPO 클로닝 벡터는 인간 사이토메갈로바이러스 (human cytomegalovirus, CMV) immediate immediate-early promoter에 의하여 전사가 조절되고, mRNA 안정을 위한 소 성장 호르몬 (bovine growth hormone, BGH)의 폴리 A 시그날(poly A signal)을 포함하고 있다.

실시예 3. 시험관내 전사 및 번역 실험

pcDNA-VP2와 pcDNA-VP243에 클로닝된 VP2와 VP243 유전자가 올바르게 클로닝되었는지의 여부를 확인하기 위하여, 시험관내 전사 및 번역 (in vitro transcription/translation) 실험을 실시하였다. 시험관내 전사 및 번역 실험을 위하여 TnT^®T7 퀵 커플드 전사/번역 시스템 (Quick Coupled Transcription/Translation Systems, Promega사)과 트랜센드^TM 비색분석 번역 탐색 시스템(Transcend^TM Colorimetric Translation Detection System, Promega사)을 이용하였다.

2㎍ 플라스미드 (pcDNA-VP2 또는 pcDNA-VP243)를 마스터 믹스 (master mix), 메티오닌 (methionine), 트랜센드^TM 비오틴-리실-tRNA (Transcend^TM Biotin-Lysyl-tRNA)와 혼합 후, 30℃에서 90분간 반응시킨 다음 트리스-글라이신 SDS-폴리아크릴아마이드젤에 전기영동하였다. 젤을 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane)에 100V로 60분간 블랏팅 (blotting)시킨 후, 스트렙타아비딘-알칼라인 포스파타제 (Streptavidin-Alkaline Phospatase)를 1:2500으로 희석하여 도포하고, 60분간 반응시켰다. TBS와 증류수로 각각 2회 세척한 후, 기질을 도포하고 30분간 반응시킨 후 결과를 확인하였다.

pcDNA-VP2와 pcDNA-VP243에 의하여 발현된 IBDV의 단백질 VP2, VP4 그리고 VP3를 확인하였다 (도 3 참조). 레인 1은 pcDNA-VP2를 발현시킨 단백질이고, 레인 2는 pcDNA-CP243을 발현시킨 단백질이며, 레인 M은 SDS-PAGE 분자량 표준마커(BIO-RAD사)이다.

pcDNA-VP243에 의하여 발현된 pVP2, VP4, 그리고 VP3 모두 예상했던 크기의 단백질을 확인할 수 있어 VP243 유전자가 올바르게 클로닝되고 발현되는 것으로 확인할 수 있었다. pcDNA-VP2에서 발현된 VP2는 예상했던 것과 다소 차이가 있는데, 이는 산체스와 로드리게스(Sanchez와 Rodriguez, 1999)가 확인한 VP2 유전자보다 짧게 리버스 프라이머(reverse primer)인 P-IBD₂를설계하였기 때문으로 판단된다.

실시예 4. pcDNA-VP2 및 pcDNA-VP243 플라스미드 DNA 발현확인

4-1. pcDNA-VP2 및 pcDNA-VP243 플라스미드 DNA 트랜스펙션

플라스미드 DNA의 트랜스펙션을 위하여 수의과학검역원에서 분양 받은 COS-7 세포주를 4 웰 챔버 슬라이드에 DMED 배지 (Dulbecco's modified Eagle medium, GIBCOBRL사)에 7.4% 소디움 바이카보네이트(sodium bicarbonate, Sigma사), 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS, GIBCOBRL사)을 첨가한 성장배지(growth medium)로 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 24시간 증식시켜 약 70%의 단일층(monolayer)을 이루도록 하였다. 챔버 안의 배지를 DMEM에 7.4%소디움 바이카보네이트, 3% FBS를 첨가한 유지용 배지 (maintenance medium)로 교환한 뒤, 1.2㎍의 플라스미드와 4㎕의 FuGENE^TM 6 트랜스펙션 시약(FuGENE^TM 6 Transfection Reagent, Roche사, Indianapolis, USA)의 반응액을 세포에 첨가한 후 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 80시간 동안 배양한 뒤에 간접형광항체법으로 트랜스펙션 결과를 확인하였다. 트랜스펙션된 세포에서 클로닝된 유전자의 발현유지 여부를 확인하기 위하여 pcDNA-VP2를 COS-7 세포에 트랜스펙션 시킨 후, 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 30 시간 배양한 다음, 0.025% 트립신-EDTA (GIBCOBRL사)로 소화시켜 4 웰 챔버 슬라이드에 옮겨 30시간 더 배양한 후 간접형광항체법으로 트랜스펙션 결과를 확인하였다.

4-2. 간접형광항체법(Indirect florescence antibody assay)을 이용한 pcDNA-VP2 및 pcDNA-VP243 플라스미드 DNA 발현탐색

COS-7 세포에 플라스미드 DNA를 트랜스펙션시킨 다음 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 80시간 동안 배양한 뒤에 4 웰 챔버 슬라이드의 배지챔버(media chamber)를 제거한 뒤 슬라이드를 PBS (pH 7.4)로 1분간 세척 후 4% 파라포름알데히드 용액 (paraformaldehyde solution)으로 10분간 고정하였다. 고정된 세포를 PBS에 3분간 세척 후 4℃, 2% 트리톤 X-100(Triton X-100)에 20분 정치시킨 다음 PBS로 2회 세척하였고, 이를 다시 5% 우혈청알부민용액(bovine serum albumin solution)으로 블로킹한 후에, IBDV 양성 혈청(IBDV polyclonal antibody)을 1:100으로 희석하여 도포한 뒤 5% CO₂, 37℃ 습윤배양기에서 30분간 반응시켰다. 슬라이드를 PBS로 3회 세척 후, 항-닭 IgG FITC 접합체(anti-chicken IgG FITC conjugate, Sigma사)를 1:200으로 희석하여 도포한 뒤, 5% CO₂, 37℃ 습윤배양기에서 30분간 반응시킨 후, PBS로 5회 세척하였다. 슬라이드의 세포를 완전히 건조시킨 뒤 글리세린 버퍼(glycerin buffer)를 떨어뜨리고 커버슬라이드(coverglass)를 덮은 후 형광현미경으로 면역원인 VP2와 VP243 단백질의 발현을 확인, 관찰하였다(도 4a 내지 4e 참조).

본 실험의 간접형광항체법에서 사용한 항체는 IBDV 폴리클로날 항체이기 때문에 pcDNA-VP243의 경우 VP2와 VP3 모두 이 분석법으로 검출될 수 있으므로, pcDNA-VP2를 COS-7 세포에 트랜스펙션시킨 후, 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 30시간 배양 후, 세포를 계대한 다음 다시 30시간 배양한 후에도 간접형광항체법으로 VP2의 발현을 확인하였다(도 4e 참조).

상기 실시예 3의 시험관내 전사/번역실험(In vitro transcription /translation)과 상기 실시예 4의 COS-7 세포에서의 발현 실험에서 모두 원하는 단백질의 발현이 이루어짐을 확인하였다.

실시예 5. pcDNA-VP2 및 pcDNA-VP243 플라스미드 DNA 백신의 마우스 접종 실험

5-1. 실험동물

4-8주령의 ICR 마우스를 암수구별 없이 사용하였으며 물과 사료는 자유급식 하였다. 사육실의 온도는 21-26℃ 습도는 60-70%로 유지시켰으며, 조명은 12시간 간격으로 조절하였다.

5-2. 실험군의 분류

정상대조군(Normal control, NC) 그룹은 DNA백신을 접종하지 않은 군, 벡터 대조군 (vector control, VC) 그룹은 IBDV 유전자가 삽입되지 않은 벡터를 접종한 군, 그리고 DNA 백신접종군은 pcDNA-VP243을 접종한 군으로 정하여 실험하였다. 접 종군은 3주 간격으로 2회 플라스미드를 왼쪽과 오른쪽 넓적다리 근육(thigh muscle)에 각각 40㎍씩 나누어 근육주사하였다.

5-3. IBDV에 대한 항체생성 검사

접종한 플라스미드 DNA 백신에 의한 항체역가를 측정하기 위하여 백신 투여 전과 투여 후 3주일에 미정맥 (tail vein)에서 채혈 후 혈청을 분리하였다. 혈청을 56℃에서 30분간 비동화 시킨 다음 IBD 항체 테스트 키트 (IDEXX사, Portland, USA)를 이용하여 S/P 비율로 양성을 판정하였고, 종말점 역가(endpoints titer)는 다음의 식을 사용하여 계산하였다.

log₁₀titer = 1.09 (log₁₀S/P) + 3.36 (FlockCheck program, IDEXX)

마우스에서 IBD 항체 역가(antibody titer)를 측정하기 위하여, 닭의 혈청에서 항체역가를 측정하기 위하여 사용하는 2차 항체인 염소 항-닭 홀스래디쉬 퍼록시데이즈 접합체(goat anti-chicken horseradish peroxidase conjugate) 대신에 염소 항-마우스 IgG 홀스래디쉬 퍼록시데이즈 접합체(goat anti-mouse IgG peroxidase conjugate, Sigma사)를 사용하였다. 혈청검사 결과 항체 역가가 396 이상인 것을 양성으로 판정하였다.

2차 DNA 백신 접종 3주 후에 채혈한 마우스 혈청내의 항체 역가를 IBD 항 체 테스트 키트를 이용하여 측정하였다 (표 1). 정상 대조군과 벡터 대조군 군에서는 양성반응이 나오지 않았고, DNA 백신인 pcDNA-VP243 DNA 백신을 주사한 pcDNA-VP243군에서는 45.8% (11마리 양성/24마리 접종)의 항체 양성 반응을 나타내었다. 항체 검사에 사용한 항체-캡쳐 ELISA 키트(antibody-capture ELISA kit)는 닭이 IBDV에 노출되었거나 생백신 또는 사백신을 닭에 백신한 후 닭이 성공적으로 백신되었는지 여부를 검사할 목적으로 닭의 면역 상태를 평가하기 위하여 개발된 것이다. 이 ELISA 키트에서는 IBDV에 대한 항체 역가가 396 이상일 때 양성으로 판단한다. 본 실험에서 낮은 역가이지만 IBDV에 대한 항체가 검출되었다는 것은 pcDNA-VP243 DNA 백신이 체액성 면역을 유도할 수 있다는 것을 보여주고 있다. 접종한 마우스 중 일부에서만 항체가 검출된 것은 주사기로 백신을 근육 접종시 접종된 DNA 백신의 균일하지 않은 트랜스펙션 효율이 한 원인으로 지적될 수 있다.

그룹	정상 대조군	벡터 대조군	pcDNA-VP243
IBDV 항체를 갖는 마우스 수 /전체 실험 마우스 수	0/6	0/6	11/24
ELISA 항체 역가 (평균 ± 표준편차)	-	-	493 ± 90

5-4. IBD 항체 양성 마우스 혈청 검사

마우스에서 유도된 IBDV에 대한 항체를 검증하기 위하여 디에틸아미노에틸덱스트란(Diethylaminoethyldextran, DEAE-DEXTRAN, 50㎍/㎖)으로 처리한 베로 세포(Vero cell)에 IBDV SH/92주를 감염시키고 7.4% 소디움 바이카보네이트 (Sigma 사), 3% 우태아혈청 (GIBCOBRL사), 항균-항진균제(GIBCOBRL)를 첨가한 DMEM (GIBCOBRL)으로 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 72시간 배양하였다. IBD 항체 테스트 키트 (IDEXX사)에 의하여 IBD 항체 양성으로 판정된 마우스혈청을 이용하여 간접형광항체법을 실시하였다(도 5a 및 도 5b 참조).

도 5a는 베로세포에 pcDNA-VP243로 면역화시킨 마우스에서 수득한 혈청으로 간접적으로 면역형광분석을 한 도이고, 도 5b는 IBDV SH/92 바이러스주로 감염된 베로세포에서 pcDNA-VP243로 면역화시킨 마우스에서 수득한 혈청으로 간접적으로 면역형광분석을 한 도이며, 세포질 부분에서 양성반응을 보이는 것이 관찰되어 pcDNA-VP243을 접종한 마우스에서 IBDV에 대한 항체가 생성된 것임을 확인할 수 있었다.

실시예 6. IBDV 플라스미드 DNA 백신의 닭 접종 실험

2주령 된 닭에 2주 간격으로 DNA 백신을 접종한 다음, 2주 후에 매우 전염성이 강한 IBDV인 SH/92 주를 구강으로 공격 접종한 후, 폐사율, B/B 비율, 체액성 그리고 세포매개성 면역유도, 비장과 F낭의 육안소견과 병리조직학적 소견 등을 조사하여 백신의 효능을 검증하였다.

6-1. 실험동물

특정병원체가 없는(Specific pathogen free, SPF) 수정란 (SPAFAS사, Norwich, USA)을 부화시킨 병아리를 격리소(isolator)에서 물과 사료를 자유롭게 공급하면서 사육하며 실험에 사용하였다.

6-2. 실험군의 분류 및 접종

실험은 다음과 같이 5군으로 나누어 실시하였다. 정상 대조군(NC)은 DNA백신과 챌린지(challenge) 바이러스인 IBDV SH/92를 모두 접종하지 않은 군이고, 챌린지 대조군(CC)은 DNA 백신 대신에 PBS를 접종하고 IBDV SH/92주(strain)만을 공격 접종한 군이며, 벡터 대조군(VC)은 DNA 백신 대신에 IBDV의 VP2 유전자 또는 VP243 유전자가 삽입되지 않은 벡터를 접종하고 IBDV SH/92를 공격접종한 군이고, pcDNA-VP2 (VP2)군과 pcDNA-VP243 (VP243)군은 각각 DNA 백신인 pcDNA-VP2와 pcDNA-VP243을 접종하고 IBDV SH/92주를 공격 접종한 군이다.

VC군, pcDNA-VP2군, 그리고 pcDNA-VP243군은 상기 각각의 플라스미드들을 2주령 된 병아리에 2주 간격으로 2회에 걸쳐, 넓적다리 근육(thigh muscle)과 복강에 각각 100㎍씩 주사하였다.

6-3. IBDV 공격접종

2차 접종 2주 후에 정상 대조군을 제외한 나머지 4개군 (NC, VC, VP2, VP243)에 IBDV SH/92주를 수당 1 x 10^4.8 수정란 치사량 (egg lethal dose, ELD₅₀/100㎕)을 구강으로 공격 접종하였다. 공격접종용 IBDV로 사용한 SH/92 주의 경우 5주령과 7주령의 SPF 닭에서 80%의 폐사율을 나타내는 매우 치명적인 IBDV주이다(권용국 등; 농업과학논문집, 37, pp637-647, 1995). 공격접종 후 10일 동안 임상증상을 관찰하고 폐사율을 기록하였다.

공격접종 10일 후 폐사율 조사에서, 챌린지 대조군과 벡터 대조군의 경우 각각 90% (9/10)와 70% (7/10)의 폐사율을 나타내었고, pcDNA-VP2군과 pcDNA-VP243군의 경우 각각 50% (5/10)와 30% (3/10)의 폐사율을 나타내어 pcDNA-VP243군이 가장 낮은 폐사율을 나타내었다 (표 2). 본 실험에서 공격접종은 2차 백신 2주 후인 6주령에 실시하여 90%의 폐사율을 나타내어 공격접종은 올바르게 진행된 것으로 판단하였다. 공격접종 후 생존율에서 pcDNA-VP234군 (70%)이 가장 높게 나타냈는데, 이는 pcDNA-VP243 백신의 경우 백신 후 닭 체내에서 자연상태의 IBDV와 가장 비슷한 특성을 가진 바이러스 단백질을 생성할 수 있기 때문으로 여겨진다.

또한, 공격접종 10일 후에 혈액, 비장, F낭(bursa)을 채취하여 IBDV SH/92주에 대한 DNA 백신의 효과를 평가하고, 하기에 그 결과를 나타내었다.

6-4. F낭 무게/체중(Bursa weight/Body weight) 비율의 측정과 병리조직학적 검사

공격접종 10일 후에 폐사하지 않고 생존한 모든 군의 닭들을 경추탈골법으로 안락사시킨 후에 체중과 F낭 무게를 측정하여 B/B 비율 (Bursa weight/Body weight x 1000)을 조사하였다.

B/B 비율검사에서 챌린지 대조군과 벡터 대조군의 B/B 비율은 정상 대조군 B/B 비율에 비하여 유의성있게 낮았다(P＜0.05)(표 2). pcDNA-VP2군과 pcDNA-VP243군의 경우 정상 대조군보다 낮은 B/B 비율을 나타내었지만 유의성 있게 낮은 정도는 아닌 것으로 나타났고, 정상 대조군 제외한 나머지 4군의 B/B 비율도 유의성있는 차이를 나타내지는 않았다.

그룹	사망수 (생존율)	B/B 비율 (평균 ± 표준편차)
정상 대조군	0/10 (100)	4.6 ± 1.42
챌린지 대조군	9/10 (10)	0.88
벡터 대조군	7/10 (30)	0.85 ± 0.33
pcDNA-VP2	5/10 (50)	2.22 ± 0.76
pcDNA-VP243	3/10 (70)	2.22 ± 0.90

6-5. IBDV에 대한 항체생성 검사

접종한 플라스미드 DNA 백신에 의한 항체역가를 측정하기 위하여 백신 투여 전과 투여 후 10일에 채혈하여 혈청을 분리하여 항체역가를 ELISA 키트로 검사하였다. 혈청을 56℃에서 30분간 비동화시킨 다음 IBD 항체 테스트 키트 (IDEXX사)를 이용하여 S/P 비율로 양성을 판정하였고, 종말점 역가(endpoints titer)는 상기 수학식 1을 사용하여 계산하였다. 혈청검사 결과 IBDV에 대한 항체 역가가 396 이상인 것을 양성으로 판정하였다.

표 3의 결과를 보면, 공격접종 하기 전에 모든 실험군의 닭에서 IBDV에 대한 양성반응을 나타내는 개체는 없었다. 마우스 접종 실험에서는 2회 백신한 다음 3주 후에 항체 양성인 396이상인 개체가 나타났지만 닭에서는 양성인 개체가 나타나지 종별로 차이가 나타났다. 종의 차이, 백신 양 그리고 백신 접종 방법 등의 차이가 종간의 차이점을 나타내는 원인이 되었을 것으로 추정된다. 조류에서 DNA 백신을 사용하였을 경우 항체가 생성되었다는 연구결과와 생성되지 않았다는 연구결과가 모두 보고 되고 있다. 항체가 발견되지 않는 경우에도 백신한 개체가 공격접종 후 부분적 또는 완전하게 방어되는 것으로 보아 체액성 (또는 세포매개성) 면역 이외에 다른 능동면역이 백신에 의하여 유도되는 것으로 보인다 (Kodihalli등, 1997, 2000; Fynan등, 1993). Chang등(2002)은 IBDV의 segment A를 포함하는 DNA 백신실험에서 다양한 시기에 백신을 접종한 다음 연구자가 사용한 것과 동일한 ELISA 키트 (IDEXX)로 항체를 검사하였으나 키트의 양성 판정 기준인 396이상의 항체역가를 나타내는 개체는 없었지만 IBDV에 대한 공격접종에 닭이 방어효과를 나타내었다고 보고하였다. 그러나 항체검사를 실시하는 체액성 면역 반응 이외에 다른 면역 반응을 검사하지 않아 자세한 방어기전은 제시하지 못하였다. 공격접종 10일 후에 검사한 경우 공격접종을 하지 않은 정상 대조군을 제외한 나머지 군에서는 모두 IBDV에 대한 높은 역가의 항체가 유도되었지만 군간에 유의성 있는 차이는 인정되지 않았다 (표 3).

pcDNA-VP2군과 pcDNA-VP243군의 경우 2회 DNA백신의 접종에 의하여 감작된 B 세포 (그리고/또는 T 세포)가 유도되어 공격 접종시 공격 접종한 바이러스에 의하여 닭이 폐사하기 이전에 면역이 유도되어 폐사를 막을 수 있었을 것으로 추정된다.

그룹	챌린지 전 ELISA 항체 역가 (평균 ± 표준편차)	챌린지 후 ELISA 항체역가 (평균 ± 표준편차)
정상대조군	〈396 (0/10)^C	〈396^a (0/10)^C
챌린지 대조군	〈396 (0/10)	19098^b (1/1)
벡터 대조군	〈396 (0/10)	20985.43 ± 4156.65^b(3/3)
pcDNA-VP2	〈396 (0/10)	4449.34 ± 2998.56^b(5/5)
pcDNA-VP243	〈396 (0/10)	13982.43 ± 6801.49^b(7/7)

참고예. 통계분석

B/B 비율의 경우 원자료를 순위자료로 변환 후 비모수적 방법으로 크루스칼-월리스(Kruskal-Wallis) 검정을 이용하였고 유의한 차이가 있을 경우 처리군간 차이는 둔(Dunn)의 방법으로 검정하였다 (Zar, 1996). 림프구 증식 분석 (Lymphocyte proliferation assay)와 ELISA 자료에 대해서는 일원분산분석법으로 분석하였다. 자료에 대한 등분산성은 레벤(Levene)의 동질성 검정법을 이용하였다 (Hicks와 Turner, 1999). 유의성은 P<0.05로 판단하였고 모든 자료는 통계 패키지 SAS 8.01 (SAS Institute, 2000)를 이용하였다.

실시예 7. 림프구 증식 분석(Lymphocyte proliferation assay)

정상 또는 질병상태의 닭에서의 세포매개성면역반응을 평가하기위하여 사용되는 분석방법으로, 본 발명에서는 IBDV의 공격접종 전후의 면역상태를 알아보기 위하여 분석을 실시하였다.

7-1. 말초혈액림프구와 스플레노사이트 준비

공격접종 7일전과 접종후 10일째에 각 군에서 생존한 닭으로부터 말초혈액림 프구(Peripheral blood lymphocyte, PBL)를 얻기 위하여, 항응고제 ACD (acid citrate dextrose)가 들어있는 주사기로 전혈을 무균적으로 채취하고, 채취한 혈액은 실온에서 2500rpm으로 10분 내지 20분간 원심 분리하여 버피 코트(buffy coat)층을 분리하였다. 그리고, 스플레노사이트(splenocyte, SL)를 얻기 위하여, 비장을 부검 후 무균적으로 채취하여 5㎖ RPMI배지1640 (GIBCOBRL사)를 첨가한 뒤에 갈아서 단일세포현탁액(single cell suspension)으로 만들었다.

7-2. PBL을 이용한 림프구 증식 분석

준비된 PBL의 버피 코트와 비장 세포 현탁액에 각각 10㎖의 PBS를 더하여 섞은 후, 혼합액을 4.5㎖ HISTOPAQUE^®1077 (Sigma사) 위에 올려놓고, 실온에서 2500rpm으로 20분간 원심 분리하여 림포사이트(lymphocyte)를 분리하였다. 10㎖ PBS를 더하여 섞은 후, 실온에서 1500rpm으로 10분간 원심 분리한 뒤 상층액을 버리는 과정을 2회 반복하였으며, 마지막에 PBS 대신 10% 우태아혈청(GIBCOBRL사)을 첨가한 RPMI배지 1640을 사용하여 부유시켰다. 세포수를 8 X 10⁶세포/㎖로 맞춘 후 세포부유액 50㎕/웰을 96 웰 플레이트에 각각 분주하고, 콘카나발린 A(Concanavalin A, Con A, 14㎍/㎖, Sigma사) 첨가군은 Con A를 50㎕/웰 첨가하고, 대조군은 Con A를 첨가하지 않은 배지를 더한 후, 5% CO₂, 37℃ 습윤배양기에서 90시간 배양하였다. Con A 는 IBDV 감염실험에서 감염 초기 동안 PBL과 스플레노사이트의 T 세포 증식을 억제하는 역할을 한다.

10㎕ 셀 카운팅 키트-8 용액 (Cell Counting Kit-8 solution, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 각 웰마다 더하고 5% CO₂, 37℃ 습윤배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후, 450nm의 파장에서 흡광도 (optical density, OD)를 측정하였다. 흡광도의 차이(△)는 ConA로 자극된 세포의 평균 흡광도에서 비자극된 세포의 평균흡광도를 뺀 값으로 구하였다.

도 7의 PBL을 이용한 림프구 증식 분석 결과를 보면, 공격접종 전에 pcDNA-VP2군과 pcDNA-VP243군은 정상 대조군에 비하여 △OD 수치가 유의성 있게 높았으며, 공격접종 7일과 10일 후의 경우 pcDNA-VP2군과 pcDNA-VP243군은 정상 대조군, 챌린지 대조군 그리고 벡터 대조군에 비하여 △OD 수치가 유의성 있게 높았다. 접종 10일 후에 챌린지 대조군과 벡터 대조군의 △OD 수치가 접종 7일후 보다는 약간 높았지만 여전히 pcDNA-VP2군과 pcDNA-VP243군보다는 유의성 있게 낮았다. 이러한 결과는 챌린지 대조군과 벡터 대조군의 경우 공격 접종한 IBDV에 의하여 유도된 여러 가지 요소가 T 세로에 영향을 주어 증식을 억제하였을 것으로 추정되지만, pcDNA-VP2군과 pcDNA-VP243군의 경우 DNA 백신에 의하여 공격접종 전에 이미 분열촉진인자(mitogen)에 의한 증식활성(proliferation activity)이 이미 높아져 있었고 공격접종 후에도 분열촉진인자에 의한 증식활성를 유지하였다. 이는 본 발명의 DNA백신에 의하여 T 세포 등(그리고/또는 B 세포)이 감작되어 공격접종시 세포매개성면역이 방어에 중요한 역할을 하였을 것으로 판단된다.

7-3. 스플레노사이트를 이용한 림프구 증식 분석

공격 접종 10일 후에 생존한 닭의 비장(spleen)으로부터 스플린세포를 준비 하여 림프구증식분석을 실시하였을 때, 챌린지 대조군과 벡터 대조군의 △OD 수치는 정상 대조군, pcDNA-VP2군, 그리고 pcDNA-VP243군에 비하여 유의성 있게 낮게 나타났고, PBL을 이용한 림프구증식분석과는 다르게 pcDNA-VP2군과 pcDNA -VP243군의 △OD 수치가 정상대조군보다 유의성있게 낮게 나타났다(도 8 참조). 이는 스플레노사이트가 챌린지 대조군과 벡터 대조군에 비하여 약하기는 하지만, 공격 접종한 IBDV의 영향을 받았기 때문인 것으로 추정된다.

본 연구에서 DNA 백신 접종 군에서 공격접종 전에 ELISA 키트에 의한 양성기준 이상의 항체가 형성되지는 않았지만 공격 접종 후 고도의 항체 역가가 나타났고, 세포 매개성 면역을 검사하기 위한 림프구 증식활성분석실험에서 DNA 백신군 PBL의 경우 공격접종 전후에 모두 다른 군 보다 모두 유의성 있게 높은 증식활성을 보였고, 스플레노사이트의 경우에도 공격 접종 후에 챌린지 대조군과 벡터 대조군에 비하여 유의성 있게 높은 증식활성 나타내어 DNA 백신 접종이 B 세포와 T 세포를 모두 감작시켜 기억세포(memory cell)를 유도하여 공격 접종시 빠르고 강한 면역을 유도하여 닭을 방어한 것으로 사료된다.

실시예 8. F낭의 조직관찰

상기 실시예 6에서, 닭을 부검 후 각 실질 장기를 검사하였으며, F낭과 비장을 10% 중성 포르말린에 24시간 고정한 다음 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색 후 광학 현미경으로 관찰하였다.

8-1. F낭 조직관찰

조직 검사에서, 정상 대조군의 경우, F낭의 상피는 단순주상상피세포(simple columnar epithelium)로 정상적인 림프구들로 폴리클(follicle)이 구성되어 있고 그 배열이 규칙적이고, 폴리클 내의 수질과 피질의 구분이 명확하며 폴리클간 조직(interfollicular tissue)이 거의 관찰되지 않았다.

챌린지 대조군과 벡터 대조군의 경우, F낭의 상피가 글로불(globule)을 함유한 선상 구조(glandular structure)로 변하였고, 폴리클이 불규칙적인 배열을 보이며 위축되어 있고 폴리클간 조직이 현저하게 증식되어있었다. 폴리클을 구성하던 정상적인 림프구 대신에 수질부위로 다수의 염증세포와 탐식세포들이 동원되어 괴사된 림프구들과 함께 섞여 있었다. 폴리클간 부종(Interfollicular edema)을 보이며 폴리클의 경우 수질 부위는 완전히 파괴되어 세포파편(cellular debris)의 덩어리 형태로 피질에 둘러싸여 있고 일부는 거의 사라져 폴리클의 흔적만을 관찰할 수 있었다.

pcDNA-VP2군의 경우 F낭의 상피와 폴리클간 조직이 많이 증식하였고 폴리클간 부종이 보이지만, 폴리클은 어느 정도 규칙적으로 배열되어 있으며, 약한 위축은 보이나 정상적인 림프구들이 폴리클을 구성하고 있었다. pcDNA-VP243군의 경우 F낭의 상피가 약간 증식하고 일부에서 폴리클간 부종이 관찰되지만 폴리클간 조직의 증식이 거의 없는 정상적인 모습이 관찰되었다. 폴리클의 배열이 규칙적이고 수질과 피질의 구분이 명확하며 약간의 탐식세포와 함께 다수의 정상적인 림프구들로 폴리클이 구성되어 있었다.

육안적인 소견에서 챌린지 대조군과 벡터 대조군의 F낭은 나머지 군에 비해 서 현저하게 위축된 형태를 나타내었다 (도 7).

이상과 같은 F낭의 병리조직학적 소견은 폐사율, B/B 비율 그리고 림프구 증식 분석 등의 결과와 거의 일치되는 결과를 나타내었다. 특히 pcDNA-243군의 경우 bursa의 위축이 관찰되었지만 병리조직학적 소견은 정상 닭과 거의 차이가 없는 것으로 나타나 백신의 효과가 우수한 것으로 판단된다.

이상의 결과를 종합하여 볼 때, 본 발명의 매우 치명적인 IBDV인 SH/92 바이러스주으로 만든 DNA 백신은 그 결과가 매우 우수한 것으로 나타났다. IBDV의 VP2 유전자를 클로닝하여 만든 pcDNA-VP2는 일부 방어 효과가 나타났으나 VP243 유전자 (절편 A)을 클로닝하여 만든 pcDNA-VP243이 더 우수한 효과를 나타내었다. 이는 pcDNA-VP243 DNA 백신에 의하여 발현되는 단백질이 원래 IBDV를 구성하는 단백질과 가장 유사하기 때문으로 판단된다.

본 발명은 국내의 매우 치명적인 IBDV 주를 이용한 최초의 DNA 백신으로 폐사율, B/B 비율, 체액성 면역과 세포 매개성 면역 유도, 병리조직학적 검사등를 종합하여 볼 때, 그 효과가 매우 우수한 것으로 나타나 국내에서 피해가 큰 IBD를 예방하는 백신으로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.

<110> KWON, HYUKMOO <120> NA vaccine comprising IBDV antigenic determinant sequence for preventing infectious bursal disease <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3039 <212> DNA <213> Infectious bursal disease virus <400> 1 atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60 ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctag agaagcacac tctcaggtca 120 gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180 cctggtttcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240 aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcagg 300 ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcacta 360 aatggcacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420 tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aaatcgggaa cgtcctagta 480 ggggaagggg taaccgtcct cagcttaccc acatcatatg atcttgggta tgtgagactc 540 ggtgacccca ttcccgctat agggctcgac ccaaaaatgg tagcaacatg tgacagcagt 600 gacaggccca gagtctacac cataactgca gccgatgatt accaattctc atcacagtac 660 caagcaggtg gagtaacaat cacactgttc tcagctaata tcgatgccat cacaagcctc 720 agcatcgggg gagaactcgt gtttcaaaca agcgtccaag gccttatact gggtgctacc 780 atctacctta taggctttga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtggc cgcaaacaat 840 gggctaacgg ccggcactga caaccttatg ccattcaata ttgtgattcc aaccagcgag 900 ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tggtggtcag 960 gcgggggatc agatgtcatg gtcagcaagt gggagcctag cagtgacgat ccacggtggc 1020 aactatccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggcaacagga 1080 tctgtcgtta cggtcgccgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140 aagaacctgg tcacagaata tggccgattt gacccaggag ccatgaacta cacaaaattg 1200 atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtct ggccaacaag ggagtacact 1260 gactttcgcg agtacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320 gcatttggct tcaaagacat aatccgggcc ctaaggagga tagctgtgcc ggtggtctct 1380 acactgttcc cacccgccgc tcccctagcc catgcaattg gggaaggtgt agactacctg 1440 ctgggcgatg aggcacaggc tgcttcagga actgctcgag ccgcgtcagg aaaagcaagc 1500 gctgcctcag gccgcataag gcagctaact ctcgccgccg acaaggggta cgaggtagtc 1560 gcgaatctgt ttcaggtgcc ccagaatcct gtagtcgacg ggattctcgc ttcacctggg 1620 atactccgcg gtgcacacaa cctcgactgc gtgttgagag agggtgccac gctattccct 1680 gtggtcatca cgacagtgga agatgccatg acacccaaag cactgaacag caaaatgttt 1740 gctgtcattg aaggcgtgcg agaagatctc caacctccat ctcaaagagg atccttcata 1800 agaactctct ccggacatag agtctatgga tatgctccag atggggtact tccactggag 1860 actgggagag attacaccgt ggtcccaata gatgatgtct gggacgacag cattatgctg 1920 tccaaagacc ccatacctcc tattgtggga aacagcggaa acctagccat agctyacatg 1980 gatgtttttv gaccaaaagt ccctatccat gtggccatga cgggggccct caacgcctat 2040 ggcgagattg agaacgtgag ctttagaagc accaagctcg ccactgcaca ccgacttggc 2100 ctcaagttgg ctggtcccgg tgcatttgac gtgaacaccg ggtccaactg ggcgacgttt 2160 atcaaacgtt ttcctcacaa tccacgcgac tgggacaggc tcccttacct caaccttcca 2220 taccttccac ccaatgcagg acgccagtac gacctggcca tggccgcttc agagttcaaa 2280 gggacccccg aactcgagag cgccgtcaga gccatggaag cagcagccaa cgtggaccca 2340 ctgttccaat ccgcgctcag cgtgttcatg tggctggaag agaatgggat tgtgactgat 2400 atggccaact tcgcactcag cgacccgaac gcccatcgga tgcgcaattt tctcgcaaac 2460 gcaccacaag caggcagcaa gtcgcaaaga gccaagtacg ggacagcagg ctacggagtg 2520 gaggcccggg gccccactcc agaagaagca cagagggaaa aagacacacg gatctcaaag 2580 aagatggaga ccatgggcat ctactttgca acaccagaat gggtagcact caatggacac 2640 cgggggccaa gccccggcca gctaaagtac tggcagaaca cacgagaaat acctgatcca 2700 aacgaggact acctagacta cgtgcatgca gagaagagcc ggttggcatc agaagaacaa 2760 atcctaaggg cagctacgtc gatctacggg gctccaggac aggcagagcc accccaggcc 2820 ttcatagacg aagtcgccaa agtctatgaa atcaaccatg ggcgtggccc caaccaagaa 2880 cagatgaaag atctgccctt gactgcgatg gagatgaagc atcgcaatcc caggcgggct 2940 ccaccaaagc ccaagccaaa acccaatgtt ccaacacaga gaccccctgg tcggctgggc 3000 cgctggatca gggctgtctc tgatgaggac cttgagtga 3039 <210> 2 <211> 1012 <212> PRT <213> Infectious bursal disease virus <400> 2 Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg 1 5 10 15 Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr 20 25 30 Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr 35 40 45 Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro 50 55 60 Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr 65 70 75 80 Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr 85 90 95 Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr 100 105 110 Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr 115 120 125 Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu 130 135 140 Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val 145 150 155 160 Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly 165 170 175 Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys 180 185 190 Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile 195 200 205 Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly 210 215 220 Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu 225 230 235 240 Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile 245 250 255 Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile 260 265 270 Thr Arg Ala Val Ala Ala Asn Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn 275 280 285 Leu Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro 290 295 300 Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln 305 310 315 320 Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr 325 330 335 Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val 340 345 350 Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val 355 360 365 Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val 370 375 380 Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu 385 390 395 400 Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr 405 410 415 Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu 420 425 430 Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile 435 440 445 Arg Ala Leu Arg Arg Ile Ala Val Pro Val Val Ser Thr Leu Phe Pro 450 455 460 Pro Ala Ala Pro Leu Ala His Ala Ile Gly Glu Gly Val Asp Tyr Leu 465 470 475 480 Leu Gly Asp Glu Ala Gln Ala Ala Ser Gly Thr Ala Arg Ala Ala Ser 485 490 495 Gly Lys Ala Ser Ala Ala Ser Gly Arg Ile Arg Gln Leu Thr Leu Ala 500 505 510 Ala Asp Lys Gly Tyr Glu Val Val Ala Asn Leu Phe Gln Val Pro Gln 515 520 525 Asn Pro Val Val Asp Gly Ile Leu Ala Ser Pro Gly Ile Leu Arg Gly 530 535 540 Ala His Asn Leu Asp Cys Val Leu Arg Glu Gly Ala Thr Leu Phe Pro 545 550 555 560 Val Val Ile Thr Thr Val Glu Asp Ala Met Thr Pro Lys Ala Leu Asn 565 570 575 Ser Lys Met Phe Ala Val Ile Glu Gly Val Arg Glu Asp Leu Gln Pro 580 585 590 Pro Ser Gln Arg Gly Ser Phe Ile Arg Thr Leu Ser Gly His Arg Val 595 600 605 Tyr Gly Tyr Ala Pro Asp Gly Val Leu Pro Leu Glu Thr Gly Arg Asp 610 615 620 Tyr Thr Val Val Pro Ile Asp Asp Val Trp Asp Asp Ser Ile Met Leu 625 630 635 640 Ser Lys Asp Pro Ile Pro Pro Ile Val Gly Asn Ser Gly Asn Leu Ala 645 650 655 Ile Ala Xaa Met Asp Val Phe Xaa Pro Lys Val Pro Ile His Val Ala 660 665 670 Met Thr Gly Ala Leu Asn Ala Tyr Gly Glu Ile Glu Asn Val Ser Phe 675 680 685 Arg Ser Thr Lys Leu Ala Thr Ala His Arg Leu Gly Leu Lys Leu Ala 690 695 700 Gly Pro Gly Ala Phe Asp Val Asn Thr Gly Ser Asn Trp Ala Thr Phe 705 710 715 720 Ile Lys Arg Phe Pro His Asn Pro Arg Asp Trp Asp Arg Leu Pro Tyr 725 730 735 Leu Asn Leu Pro Tyr Leu Pro Pro Asn Ala Gly Arg Gln Tyr Asp Leu 740 745 750 Ala Met Ala Ala Ser Glu Phe Lys Gly Thr Pro Glu Leu Glu Ser Ala 755 760 765 Val Arg Ala Met Glu Ala Ala Ala Asn Val Asp Pro Leu Phe Gln Ser 770 775 780 Ala Leu Ser Val Phe Met Trp Leu Glu Glu Asn Gly Ile Val Thr Asp 785 790 795 800 Met Ala Asn Phe Ala Leu Ser Asp Pro Asn Ala His Arg Met Arg Asn 805 810 815 Phe Leu Ala Asn Ala Pro Gln Ala Gly Ser Lys Ser Gln Arg Ala Lys 820 825 830 Tyr Gly Thr Ala Gly Tyr Gly Val Glu Ala Arg Gly Pro Thr Pro Glu 835 840 845 Glu Ala Gln Arg Glu Lys Asp Thr Arg Ile Ser Lys Lys Met Glu Thr 850 855 860 Met Gly Ile Tyr Phe Ala Thr Pro Glu Trp Val Ala Leu Asn Gly His 865 870 875 880 Arg Gly Pro Ser Pro Gly Gln Leu Lys Tyr Trp Gln Asn Thr Arg Glu 885 890 895 Ile Pro Asp Pro Asn Glu Asp Tyr Leu Asp Tyr Val His Ala Glu Lys 900 905 910 Ser Arg Leu Ala Ser Glu Glu Gln Ile Leu Arg Ala Ala Thr Ser Ile 915 920 925 Tyr Gly Ala Pro Gly Gln Ala Glu Pro Pro Gln Ala Phe Ile Asp Glu 930 935 940 Val Ala Lys Val Tyr Glu Ile Asn His Gly Arg Gly Pro Asn Gln Glu 945 950 955 960 Gln Met Lys Asp Leu Pro Leu Thr Ala Met Glu Met Lys His Arg Asn 965 970 975 Pro Arg Arg Ala Pro Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Asn Val Pro Thr 980 985 990 Gln Arg Pro Pro Gly Arg Leu Gly Arg Trp Ile Arg Ala Val Ser Asp 995 1000 1005 Glu Asp Leu Glu 1010

Claims

삭제
삭제
삭제
서열번호 1에 기재된 국내분리주 IBDV(infectious bursal disease virus) SH/92 바이러스주의 VP2 유전자를 포함하는 pcDNA-VP2 플라스미드 또는 VP243 유전자를 포함하는 pcDNA-VP243 플라스미드를 포함하는 조류의 전염성 F 낭병 예방 및 치료용 DNA 백신.