KR20190110605A - 돼지 코로나바이러스 백신 - Google Patents

돼지 코로나바이러스 백신 Download PDF

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KR20190110605A
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스캇 애커만
조셉 랄프 헤르만
루이스 알레잔드로 헤르난데즈
레아 안 홉스
애런 브이. 이에르
션 오코너
애비 레이 패터슨
에릭 마틴 본
조셉 길버트 빅토리아
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베링거 인겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인크.
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Abstract

본 발명은 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 및/또는 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)를 포함하는 코로나바이러스 감염과 관련된 질병에 대해 돼지를 방어하기 위한 백신에 관한 것이다. 상기 백신은 일반적으로 불활성화/사멸 PEDV (예를 들어, 화학적으로 불활성화된 PED 바이러스) 및/또는 재조합 PEDV 항원 및/또는 아쥬반트로 불활성화/사멸 PDCoV (예를 들어, 화학적으로 불활성화된 PDCoV 바이러스) 및/또는 재조합 PDCoV 항원 및 아쥬반트를 포함한다. PEDV 및/또는 PDCoV와 관련된 질병에 대해 돼지를 방어하는 방법 및 돼지 유행성 설사 바이러스 및/또는 돼지 델타코로나바이러스 백신의 제조 방법이 또한 제공된다.

Description

돼지 코로나바이러스 백신
서열 목록
본 출원은 37 C.F.R. 1.821 - 1.825에 따른 서열 목록을 포함한다. 크기가 480 kb인 10-0176-WO-SEQ로 명명된 서열 목록의 ASCII 텍스트 파일의 내용은 2017년 1월 23일자로 작성되어 EFS-Web을 통해 출원서와 함께 전자적으로 제출되었으며, 이의 전문은 본 출원에 참조로서 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 돼지 유행성 설사 바이러스 (porcine epidemic diarrhea virus: PEDV) 및 돼지 델타코로나바이러스 (porcine deltacoronavirus: PDCoV)에 기인하는 질병으로부터 돼지를 방어하는 면역원성 조성물, 및 PEDV와 PDCoV 항원 둘 다를 제공하는 조합 백신에 관한 것이다. 10일령 미만의 새끼 돼지에서의 높은 사망률 (최대 100%)로 인해, 흔히 함께 나타나는 유행성 장 질환은 미국 돼지 업계의 주요 경제적 관심사이다.
돼지 유행성 설사 바이러스는 돼지에서 급성 설사, 구토 및 탈수를 유발하는 외피성 포지티브-센스 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 이것은 유럽에서 최초로 확인되었지만, 한국, 중국, 일본, 필리핀 및 태국을 비롯한 많은 아시아 국가에서 점점 더 문제가 되었다. 2013년 4월에, PEDV는 미국 중서부에서 돼지에 출현하여 신속하게 전국으로 퍼졌다. 2013년 10월까지, PEDV는 18개의 주에서 돼지 무리에서 검출되었다. PEDV 감염의 경제적인 영향은 이미 상당하였다. PEDV의 북 아메리카 분리주가 확인되었지만 (문헌 [Huang, et al., 2013], [Stevenson et al., 2013]), 완전히 허가받은 백신은 미국에서 시판되지 않는다. 따라서, PEDV와 관련된 질병에 대해 돼지를 방어할 수 있는 백신을 개발해야 할 지속적인 필요성이 존재한다. 비경구적 방법 (예를 들어, 근육내, 피하 또는 정맥내) 뿐만 아니라 점막 경로 (경구 또는 비강내)를 통해 투여될 수 있는 신생 북 아메리카 PEDV 주에 대해 효과적인 백신을 개발하는 것이 유리할 것이다.
PEDV는 알파코로나바이러스 (Alphacoronavirus) 속의 코로나바이러스 아과 (코로나비리내(Coronavirinae))의 구성원이며 (문헌 [Bridgen et al., 1993]), 1971년에 영국에서 최초로 확인되었고, 이후에 벨기에, 중국, 헝가리, 이탈리아, 일본, 한국 및 태국과 같은 기타 국가에서 확인되었다 (문헌 [Oldham J. 1972], [Pensaert and De Bouck P. 1978], [Chen et al., 2008], [Nagy et al., 1996], [Martelli et al., 2008], [Takahashi et al., 1983], [Chae et al., 2000] 및 [Puranaveja et al., 2009]). 이러한 과의 기타 구성원에는 돼지 호흡기 코로나바이러스 (Porcine Respiratory Coronavirus: PRCV), 혈구응집성 뇌척수염 코로나바이러스 (Hemagglutinating Encephalomyelitis Coronavirus: PHE) 및 전염성 위장염 바이러스 (Transmissible Gastroenteritis Virus: TGEV)가 포함된다. 비록 PEDV 및 TGEV 바이러스가 관련되어 있고 임상 징후가 매우 유사하지만, 면역 교차 방어는 없다.
PEDV는 5' 캡과 3' 폴리아데닐화 꼬리를 갖는 대략 28 kb의 포지티브-센스 단일 가닥 RNA 게놈을 갖는 외피성 바이러스이다. (문헌 [Pensaert and De Bouck P. 1978]). 상기 게놈은 4종의 구조 단백질 (스파이크 (spike: S), 외피 (envolope: E), 막 (membrane: M) 및 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid: N)) 및 3종의 비구조 단백질 (레플리카아제 1a 및 1b 및 ORF3)을 암호화하는 적어도 7종의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame: ORF), 3' 비번역 영역 (UTR) 및 5' UTR을 포함하며, 이들은 5'-레플리카아제 (1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3'의 순서로 게놈 상에 배열되어 있다 (문헌 [Oldham J. 1972; and Bridgen et al., 1993]) 미네소타 MN (GenBank: KF468752.1), 아이오와 IA1 (GenBank: KF468753.1) 및 아이오와 IA2 (GenBank: KF468754.1)로 특성화된 처음 3종의 신생 북 아메리카 PEDV 게놈 서열은, 폴리아데노신 꼬리를 제외하고는 동일한 크기의 28,038개의 뉴클레오타이드 (nt)를 가지며, 프로토타입 PEDV CV777 바이러스주 (GenBank: AF353511.1)와 게좀 조직을 공유한다. 이들 3종의 북 아메리카 PEDV 서열은 99.8 내지 99.9%의 뉴클레오타이드 동일성을 공유하였다. 특히, MN 및 IA2 주는 전체 게놈에 걸쳐서 단지 11개만의 뉴클레오타이드 차이가 있었다.
PEDV S 단백질은 1,383개의 아미노산 (amino acids: aa)으로 구성된 I형 당단백질이다. 상기 S 단백질은 다른 코로나바이러스의 S 단백질과 이의 상동성에 기초하여 S1 (1-789 aa)과 S2 (790-1,383 aa) 도메인으로 나누어질 수 있다 (문헌 [Chang et al., 2002], [Cruz et al., 1994], [Godet, et al., 1994], [Jackwood et al., 2001], [Sturman and Holmes, 1984] 및 [Sun et al., 2008] 참조). 코로나바이러스 중 S 단백질은 표면 항원이고, 여기서, 이것은 바이러스 진입을 매개하기 위해 숙주 세포 수용체 당단백질과 상호 작용을 조절하고, 자연 숙주에서 중화 항체의 유도를 자극하는데 역할을 한다. 따라서, 상기 S 당단백질은 PEDV에 대해 효과적인 백신의 개발을 위한 주요 목표이다.
PEDV M 단백질은 바이러스 조립 과정에서 중요한 역할을 하는 가장 풍부한 외피 성분이며, 또한 바이러스를 중화시키는 항체를 유도한다. 마찬가지로, 뉴클레오캡시드에 구조적 기반을 제공하는 비리온 RNA에 결합하는 PEDV N 단백질은, 또한 세포 매개성 면역의 유도에 중요할 수 있다 (문헌 [Saif,　L., 1993]).
PEDV에서 유일한 보조 유전자 (accessory gene)는 ORF3이다. 보조 유전자는 일반적으로 필드 바이러스주 (field strain)에서 유지되지만, ORF3의 변경은 병독성에 영향을 주는 것으로 생각되며, 세포 배양 개조 (cell culture adaptation)은 ORF3 유전자를 변경시켜 병독성을 감소시키는데 사용되었다 (문헌 [Song et al., 2003]). 실제로, ORF3 유전자의 조사를 통해, 연구자들은 2006년 이래로 중국에서 면역화된 돼지 무리에서 PEDV의 새로운 유전자군의 출현을 도표화하였다. 이들 바이러스주 및 중국에서 PEDV의 지리학적 재출현의 계통 발생학 연구는, 엄청난 손상을 가하는 장 질환을 유발하는 필드 주가 유럽 바이러스주 및 백신 바이러스주 유래의 ORF3과 유전적으로 상이하다는 것을 증명하였다 (문헌 [Park et al., 2011]).
PEDV의 상이한 바이러스주는 병독성의 가변적인 수준으로 존재하는 것으로 널리 공지되어 있다. 1980년대 및 1990년대 동안, PEDV는 유럽 전역에서, 예를 들어, 벨기에, 영국, 독일, 프랑스, 네덜란드 및 스위스 국가에서 유행하였다. 유럽에서 보고된 사례의 빈도는 이후에 점점 줄어들었고/거나, PEDV에 기인하는 질병은 백신의 상업적 개발을 시작하기 위한 충분한 경제적 중요성은 없었다 (문헌 [Song and Park, 2012]). PEDV의 발생은 1980년대 이래로 중국에서 문서화되었 지만, 2010년 이래로 출현하는 설사의 대규모 발생과 관련된 PEDV 변이체 바이러스주는 보다 급성이고 보다 중증이었다. 따라서, 백신 개발의 시도는 주로 아시아 국가에서 수행되었다 (문헌 [Song and Park, 2012]). 2010년 이래로 출현한 변이체는 젖먹이 새끼 돼지에서 80~90% 이환율 및 50~90% 사망률을 갖는 것으로 보고되었다 (문헌 [Bi et al., 2012], [Pan et al., 2012] 및 [Li et al., 1012]). 최근 증거는 중국에서 출현한 병독성 형태의 PEDV가 생 백신 바이러스주의 진화의 결과일 수 있다는 것을 시사한다 (문헌 [Chen et al., 2010]).
돼지의 장에 영향을 미치는 장 질환으로서, PEDV는 분변-경구 노출을 통해 확산된다. 오염된 트럭 및 장비는 미경험 (naive) 동물에 대한 감염의 빈번한 공급원이다. PEDV 감염의 임상 징후는 전염성 위장염 바이러스 (TGEV) 감염과 유사하다 (문헌 [Pijpers et al., 1993]). 3주령 이하의 돼지에서, 임상 징후 (급성 물 설사, 구토, 및 탈수 포함)는 PEDV 감염 후 24시간만에 나타날 수 있으며, 100% 사망률로 이어진다. 암퇘지 및 수퇘지 뿐만 아니라, PEDV-감염된 비육용 돼지 및 육성용 돼지도 설사 및 구토를 일으킬 수 있다. 동물은 또한 식욕부진의 징후를 나타낼 수 있으며, 무기력할 수 있다. 고령 돼지에 미치는 완전한 영향은 아직 결정되지 않지만, 사료 효율 감소, 시장 출시일 추가 (additional days to market) 및 2차 감염에 대한 감염된 동물의 감수성이 또한 존재한다. 암퇘지의 경우, 신체 상태 감소는 생식 능력에 부정적인 영향을 줄 수 있다. 보고들에 따르면, PEDV는 북 아메리카 무리에서 풍토병이 되어 지속적인 설사 및 다른 시험감염 (challenge)을 초래할 수 있다는 징후가 있는 것으로 나타났다.
PEDV로 감염된 동물의 내장에서의 육안 및 조직학적 변화는 중국에서 관찰된 것들과 미국에서 유사하며, 본질적으로 바이러스는 돼지의 장의 융모를 파괴시켜 영양분을 흡수하지 못하게 한다. 황 등 (문헌 [Huang et al., 2012])은, 미네소타 및 아이오와 발생에서 질병으로 쓰러진 동물이 소장에 한정되는 육안 병리학적 병변을 나타냈으며, 소장이 황색 유체로 팽창된 얇은 반투명 벽을 특징으로 하였다는 것을 보고하였다. 조직학적 평가에 따르면, 소장의 영역은 융모 둔감 (blunting) 및 융합 및 고유층의 융모의 최소의 림프아구성 침윤을 나타내는 것으로 드러났다.
황 등 (문헌 [Huang et al., 2012])은 미국에서 발생한 PEDV의 3종의 상이한 바이러스주 - MN (GenBank 수탁 번호 KF468752) 및 IA1 (GenBank 수탁 번호 KF468753) 및 IA2 (GenBank 수탁 번호 KF48754)로 각각 명명된, 미네소타로부터의 1종 및 아이오와로부터의 2종을 특성화하였다. 황의 계통 발생학 조사는 PEDV 바이러스주를 2개의 별개의 유전자군으로 나누고, 유전자군 1 (G1) 및 유전자군 2 (G2)로 명명하였다. 스파이크 유전자의 N-말단 도메인 (N-terminal domain: NTD)에서의 유의한 변화는 유전자군 1 및 2로 구분지었다. 황 등 (문헌 [Huang et al., 2013])은, N-말단 도메인 (NTD)에서의 제2 결실 영역 (DR2)이 DR1보다 더 높은 정도의 항원 변화를 갖는 것으로 보인다고 제시하는데, 이는 신생 북 아메리카 바이러스주가 G1a 백신 바이러스주와 항원적으로 덜 관련될 수 있다는 것을 시사한다.
유전자군 1은 적어도 3종의 클러스터 1a, 1b 및 R을 포함한다. 하위군 1a는 초기 유럽, 중국 및 한국 분리주, 예를 들어, 프로토타입 CV777 바이러스주 (벨기에, 1978, GenBank: AF353511.1) 및 바이러스주 LZC (중국 간쑤성, 2006; GenBank: EF185992) 및 SM98 (한국, 1998; GenBank: GU937797.1)을 포함한다. 하위그룹 1b는 5종의 바이러스주 - 한국으로부터의 1종 (DR13 약독화 백신 바이러스주, GenBank: JQ023162.1), 및 nsp3에서의 공통 "유전적 서명 (genetic signature)" 8-aa 결실 및 C 말단에서의 대량 ORF3 결실에 의해 결합된 중국으로부터의 나머지를 포함한다. 하위군 "R"은 다른 유전자군의 재조합과 관련된다. 그러나, 2010년 이래로 중국에서 발생한 것들 및 2013년 이래로 북 아메리카에서 발생한 것들을 비롯한 새로운 신생 PEDV 바이러스주는, 유전자군 G2a에 속한다. 중국 바이러스주 AH2012 (GenBank 수탁 번호 KC210145) 및 북 아메리카 바이러스주는 여러 가지의 고유한 뉴클레오타이드 변화를 공유하며, 유전자군 2a에 함께 클러스터화된다. 바이러스주 MN 및 IA2에 대한 AH2012와의 뉴클레오타이드 동일성은 99.6%이었으며, 바이러스주 IA1은 99.5%이었다. 연구자들은, AH2012-유사 바이러스가 가능하게는 동중국 지역으로 전염된 다음, 미국으로 운반되고, 아마도 북 아메리카 바이러스주와 가장 밀접한 조상인 것으로 추측하였다. 유전자군 2a의 구성원들은 유전자군 1a의 프로토타입 PEDV 바이러스주 CV777과 단지 대략 96.9%의 유사성을 공유한다 (문헌 [Bridgen, et al., 1993], [Huang et al., 2013], GenBank: AF353511.1). 이와 같이, 역사적인 CV777-유도된 G1a 바이러스주 또는 DR13-유도된 G1b 바이러스주를 기반으로 하는 약독화 PEDV 백신은, 새로운 신생 중국 및 북 아메리카 G2a PEDV 바이러스주와 항원적으로 덜 관련될 수 있으며, 따라서, 불충분한 백신 후보일 수 있다.
밀접하게 관련된 북 아메리카 분리주 US/콜로라도/2013 (GenBank 수탁 번호 KF272920.1)도 또한 마탈러 등 (문헌 [Marthaler et al., 2013])에 의해 보고되었다. 북 아메리카 분리주와 유사하게, CO/13의 완전한 PEDV 게놈은 GenBank에서 이용가능한 다른 완전한 PEDV 게놈과 96.5 내지 99.5%의 뉴클레오타이드 동일성을 가지며, 중국 바이러스주 AH2012 (GenBank 수탁 번호 KC210145)와 가장 높은 뉴클레오타이드 동일성 (99.5%)을 갖는다. 이것은 2a 유전자군의 구성원이다. PEDV 기준 바이러스주 CV777의 완전한 게놈과 CO/13의 완전한 게놈을 비교하면, CO/13은 1-nt 삽입 (48번 위치에서) 및 5' UTR에서의 5개의 뉴클레오타이드의 결실 (73번 및 83 내지 86번 위치에서)을 포함하는 것으로 증명된다. 이러한 북 아메리카 바이러스는 여러 가지의 삽입/결실과 함께 단지 82%의 뉴클레오타이드 동일성을 공유하는 20,696번 및 21,125번의 게놈 위치에서 S1 내의 증가된 상이성 (divergence)을 나타낸다.
이의 게놈 서열, 전달 방식 및 효능이 상이한 여러 가지 PEDV 백신이 개발되어 왔다. 유럽 CV777 바이러스주의 세포 배양 개조는 PEDV 발생이 심각한 아시아 국가에서 사용되었다. 이들은 1990년대 이래로 사용되고 있었다.
1980년대 초에, 일본 연구자들은 감염된 돼지의 설사로부터 원인 PED 바이러스주 83P-5를 단리하였다. 쿠사나기 등 (문헌 [Kusanagi et al., 1989])은 VERO 세포 (Vero cell)에서 바이러스주를 단리하고 개조하였다. 세포 배양 개조된 PEDV (P-5V) (83P-5)의 약독화 바이러스 백신은 1997년 이래로 일본에서 암퇘지에 사용되었다. 100번째 계대된 83P-5 바이러스주는 일본에서 약독화 PEDV 백신으로서 사용하기 위해 Nisseiken Co., Ltd.에 의해 허가되었다 (문헌 [Sato et al., 2011]). 83P-5 바이러스주의 개조 및 약독화는 약독화 DR13 바이러스주와 서열 유사성을 갖는 S 단백질의 세포외 일부에서 돌연변이를 나타낸 것으로 보고되었다 (문헌 [Sato et al., 2011], Strain 83P-5 Spike gene sequence at 100th passage, GenBank: AB548621.1 참조). 이러한 후자의 일본 백신이 효과적인 것으로 고려되지만, 모든 암퇘지들이 이들의 새끼 돼지에게 면역력을 건네줄 수 있는 것은 아니었다 (문헌 [Usami et al., 1998]). 일본 바이러스주 및 유럽 바이러스주는 유전자군 G1a 또는 G1b의 구성원이다. 상기에서 논의한 바와 같이, 이들 약독화 백신 바이러스주는 유전자군 2a의 새로운 신생 중국 바이러스주 보다 상이성 북 아메리카 바이러스주와 덜 관련된다.
유전자군 G1b의 구성원인 약독화 한국 PEDV 바이러스주 DR13 (100번의 계대 수준) (GenBank: JQ023162.1)에 의한 경구 백신접종은 백신으로서 효과적인 것으로 나타났다. 바이러스주는 허가되었으며, 2004년 이래로 한국에서 경구 백신으로서 사용되었고, 2011년에 필리핀에서 등록되고 시판되었다 (문헌 [Song and Park., 2012]). 그러나, 약독화 DR13은 시험감염된 새끼 돼지에서 바이러스 배출 (virus shedding)의 기간을 유의하게 변화시키지 않는 것으로 보고되었다 - 면역 방어가 불완전하다는 것을 나타냄. 더욱이, 고도의 약독화 PEDV에 의한 경구 면역화만이 매우 높은 용량의 백신에서 방어를 부여하였다 (문헌 [Song and Park., 2012]).
다른 공지된 백신은 PEDV 및 TGEV 사백신의 조합 SUISHOT® PT-100 ((주)중앙백신연구소, 한국) 및 PEDV 사백신 SUISHOT® PED를 포함한다. (주)중앙백신연구소를 통해 제공된 바이러스주 및 서브타입은 공지되어 있지 않다. 또 다른 한국 회사인 (주)코미팜도 또한 유전자군 G1a의 PEDV 바이러스주 SM98P를 포함하는 상표명 PRO-VAC®으로 시판되는 사백신, 생백신 및 조합 백신 시리즈를 제공한다. Qilu Animal Health Products Factory of China도 또한 바이러스주 및 서브타입이 공지되지 않은 PEDV 및 TGEV를 포함하는 사백신 조합을 중국에서 시판한다.
돼지 델타코로나바이러스 SDCoV 또는 SDCV로도 또한 알려저 있으며 본 출원에서 상호교환적으로 사용되는 새로운 신생 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)는, 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)와 유사하며, 종종 신생 동물의 이환율과 연루되어 있고 돼지 산업에 대한 질병의 전세계 확산 및 영향에 기여한다. PDCoV는 유사한 이환율 패턴을 갖는 PEDV 이후 짧은 시간 내에 미국을 덮쳤다. 미국에서는 PEDV와 달리 델타코로나바이러스가 새끼 돼지의 사망을 유발하는 것 같지 않지만, 새끼 돼지에서 심각한 설사, 구토 및 체중 감소를 비롯하여 급성 이환율을 유발한다. PEDV 감염보다 경미하지만, PDCoV 감염은 신생 돼지에서 30~40%의 사망률을 초래할 수 있다. 보다 심각한 질병은 PEDV, 로타바이러스 및 TGEV에 의한 공동 감염에서 나타날 수 있다 (문헌 [Marthaler et al., 2014a] 및 [Wang et al., 2014]). 또한, 2015년 5월에, 공동 감염으로 존재할 때 질병의 중증도에 잠재적으로 기여하는 3번째의 새로운 돼지 오쏘레오바이러스 (porcine orthoreovirus: PORV) 체가 미국에서 검출되었다. PDCoV 및 다른 공동 감염체의 발병 기전 및 임상적 의의에 대한 더 많은 지식이 필요하지만, PEDV 및 PDCoV의 최근 공동 출현은 무리에 대한 질병의 중증도 및 영향을 잠재적으로 증진시켰다.
돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)는 델타코로나바이러스 속의 코로나바이러스 과 (코로나비리대 (Coronaviridae))의 구성원이다. 상기 바이러스는 홍콩특별행정구 (Hong Kong SAR)에서 2009년에 수집된 퇘지 직장 면봉 샘플 중에서 확인되었지만 (문헌 [Woo, P.C., et al., Discovery of seven novel Mammalian and avian coronaviruses in the genus deltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source of alphacoronavirus and betacoronavirus and avian coronaviruses as the gene source of gammacoronavirus and deltacoronavirus. J Virol, 2012. 86(7): p. 3995-4008]), 어떠한 질병과도 관련되지 않은 것으로 알려졌다. 본 출원에서 PDCoV로서 지칭되는 SDCV는 오하이오 및 인디애나에서 2014년 2월에 미국 돼지 무리에서 최초로 검출되었으며, 다른 주로 신속히 퍼졌다 (문헌 [Hu, H., et al., Isolation and Characterization of Porcine Deltacoronavirus from Pigs with Diarrhea in the United States. J Clin Microbiol, 2015. 53(5): p. 1537-1548], [Chen, Q., et al., Pathogenicity and pathogenesis of a United States porcine deltacoronavirus cell culture isolate in 5-day-old neonatal piglets. Virology, 2015. 482: p. 51-59], [Li, G., et al., Full-Length Genome Sequence of Porcine Deltacoronavirus Strain USA/IA/2014/8734. Genome Announc, 2014. 2(2)], [Marthaler, D., et al., Rapid detection, complete genome sequencing, and phylogenetic analysis of porcine deltacoronavirus. Emerg Infect Dis, 2014a. 20(8): p. 1347-50], [Marthaler, D., et al., Complete Genome Sequence of Strain SDCV/USA/Illinois121/2014, a Porcine Deltacoronavirus from the United States. Genome Announc, 2014b. 2(2)], [Wang, L., B. Byrum, and Y. Zhang, Detection and genetic characterization of deltacoronavirus in pigs, Ohio, USA, 2014. Emerg Infect Dis, 2014. 20(7): p. 1227-30], [Jung, K., et al., Pathogenicity of 2 porcine deltacoronavirus strains in gnotobiotic pigs. Emerg Infect Dis, 2015. 21(4): p. 650-4]). PDCoV는 또한 2014년 4월에 한국 (문헌 [Lee, S. and C. Lee, Complete Genome Characterization of Korean Porcine Deltacoronavirus Strain KOR/KNU14-04/2014. Genome Announc, 2014. 2(6)]), 중국 본토 (문헌 [Dong, N., et al., Porcine Deltacoronavirus in Mainland China. Emerg Infect Dis, 2015. 21(12): p. 2254-5] 및 [Song, D., et al., Newly Emerged Porcine Deltacoronavirus Associated With Diarrhoea in Swine in China: Identification, Prevalence and Full-Length Genome Sequence Analysis. Transbound Emerg Dis, 2015. 62(6): p. 575-80]) 및 일본 (ISERPD 2015)에서 검출되었다.
확인 후, 3개의 연구 그룹들은, 임상 사례로부터의 세포 배양 유도 물질 및/또는 조직 균질물에 의한 감염이 무균 새끼 돼지 및/또는 통상의 새끼 돼지에서 급성 위장 임상 징후를 유발한다는 것을 확인하였다 (문헌 [Chen et al., 2015], [Ma, Y., et al., Origin, evolution, and virulence of porcine deltacoronaviruses in the United States. MBio, 2015. 6(2)] 및 [Vitosh-Sillman, S., et al., Histopathological and immunohistochemical characterization of pigs experimentally infected with porcine deltacoronavirus. in American Association of Swine Veterinarians. 2015. Orlando, FL]). PDCoV는, 구토 및 탈수 (문헌 [Ma, et al., 2015])와 함께, 임상 징후의 발병 후 8~9일에 분만 돈사의 암퇘지 및 새끼 돼지에서 급성 설사를 일으키는 것으로 나타났다 (문헌 [Li et al., 2014]). 상기 바이러스는 돼지 장 코로나바이러스 (porcine enteric coronavirus: PEDV), 전염성 위장염 코로나바이러스 (transmissible gastroenteritis coronavirus: TGEV) 및 돼지 오쏘레오바이러스 (porcine orthoreovirus: PORV)와 유사한 임상 징후 및 증상을 나타낸다.
막스 등 (WO201600757A2)은 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 및 PDCoV에 기인하는 질병으로부터 돼지를 방어한다고 주장하는 면역원성 조성물을 기술하고 있다. 그러나, 북 아메리카 콜로라도 계통 바이러스에 기반하는 막스 등의 PEDV 백신은 약독화된 유럽 INDEL-바이러스주 Calaf14 (대조 동물에서 단지 23.8%의 사망률을 초래함)로 시험감염될 때 부분적으로만 방어하는 것 (예를 들어, 사망률, 체중 감소 또는 설사의 임상 증상의 보통 감소와 비교할 때)이 명백하다. 더욱이, 막스 등도 또한 델타코로나바이러스 백신을 기술하고 있지만, 질병의 임상 증상의 방어 또는 감소는 1가 PDCoV 백신 또는 2가 PEDV 및 PDCoV 백신에 의해 입증되지 않았다.
따라서, 필요한 것은 PEDV 및 PDCoV에 기인하는 질병의 임상 징후를 감소시키고, 바이러스 배출의 감소를 비롯하여, 면역화된 동물에서 방어 면역을 유도할 수 있는 PEDV 및 PDCoV 백신이다.
본 발명은 당해 분야에서의 문제점을 극복하는 면역원성 조성물, 백신 및 관련 방법들을 제공한다. 본 발명은 돼지 유행성 설사 바이러스, 또는 PEDV 및/또는 돼지 델타코로나바이러스 또는 PDCoV와 같은 코로나바이러스 과 (코로나비리대)의 외피성 (+) 단일 가닥 RNA 바이러스의 불활성화/사멸 및/또는 재조합 형태를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 출원은 PEDV 및 PDCoV 감염과 관련된 질병이 있는 돼지에서 임상 증상을 감소시키는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명의 PDCoV 분리주 (NSVL) (서열 번호 1 및 2) 및 PDCoV 2.0307 및 PDCoV 5.0327 (각각 서열 번호 5, 6, 9 및 10)은 다른 북아메리카 및 아시아 바이러스주의 것과 유사한 유전적 프로파일을 갖는다. 본 발명의 PEDV 분리주 BI1251-125-10 (본 출원에서 "125-10"으로 지칭함) (서열 번호 29, 32)은 유전자군 2a의 보고된 다른 북 아메리카 PEDV의 것과 유사한 유전적 프로파일을 갖는 치명적인 북 아메리카 RNA 바이러스주이다. PEDV 유도체 분리주는 "125-10 p30" (서열 번호 34, 36)은 북 아메리카 유전자군 2a와 일치하는 유전적 프로파일을 또한 갖는 계대 약독화 바이러스이다.
본 발명의 면역원성 조성물 및 백신은 불활성화/사멸 PDCoV (예를 들어, 화학적으로 불활성화된 NSVL 분리주 (서열 번호 1 및 2)) 및/또는 PDCoV 2.0307 및 PDCoV 5.0.327 분리주 (각각 서열 번호 5 및 6 및 서열 번호 9 및 10), 및/또는 불활성화/사멸 PEDV (예를 들어, 화학적으로 불활성화된 PEDV 분리주 "125-10" 또는 "125-10 p30" (각각 서열 번호 29 또는 32 및 서열 번호 33 또는 서열 번호 36))을 포함하며, 전형적으로는 또한 아쥬반트를 포함한다. 백신은 또한 기타 성분, 예를 들어, 보존제(들), 항균제들, 안정화제(들), 예를 들어, 백신의 저장 수명을 연장시킬 수 있는 안정화제, 에멀젼, 및 다른 돼지 병원체에 대한 항원을 포함할 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물 및 백신은 곤충 세포에서 PDCoV 및/또는 PEDV 스파이크 단백질, 예를 들어, PDCoV 스파이크 단백질 (예를 들어, 서열 번호 4, 8, 12, 18 또는 28의 아미노산 서열을 암호화하는 서열 번호 3, 7, 11, 17 또는 27의 핵산 서열 포함) 및/또는 PEDV 스파이크 핵산 서열 (서열 번호 31, 35, 47 또는 53의 아미노산 서열을 암호화하는 서열 번호 30, 34 , 46 또는 52 포함)을 발현하는 재조합 바큘로바이러스를 통해 하나의 비제한적인 예로 발현되는 스파이크 항원을 포함하며, 전형적으로는 또한 아쥬반트를 포함한다. 백신은 또한 기타 성분, 예를 들어, 보존제(들), 안정화제(들), 및 다른 돼지 병원체에 대한 항원을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 바람직한 PDCoV 및/또는 PEDV 스파이크 핵산 서열은 스파이크 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 적어도 PDCoV 스파이크 폴리펩타이드 서열 번호 3, 7, 11, 17 또는 27, 또는 이의 기능성 단편, 및/또는 PEDV 스파이크 서열 번호 30, 34, 46 또는 52, 이의 기능성 단편과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 또는 89%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93% 또는 94%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 96.1%, 96.2%, 96.3%, 96.4%, 96.5%, 96.6%, 96.7%, 96.8%, 96.9%, 97%, 97.1%, 97.2%, 97.3%, 97.4%, 97.41%, 97.42%, 97.43%, 97.44%, 97.45%, 97.46%, 97.47%, 97.48%, 97.49%, 97.5%, 97.51%, 97.52%, 97.53%, 97.54%, 97.55%, 97.56%, 97.57%, 97.58%, 97.59%, 97.6%, 97.61%, 97.62%, 97.63%, 97.64%, 97.65%, 97.66%, 97.67%, 97.68%, 97.69% 97.7%, 97.71%, 97.72%, 97.73%, 97.74%, 97.75%, 97.76%, 97.77%, 97.78%, 97.79%, 97.8%, 97.81%, 97.82%, 97.83%, 97.84%, 97.85%, 97.86%, 97.87%, 97.88%, 97.89%, 97.9%, 97.91%, 97.92%, 97.93%, 97.94%, 97.95%, 97.96%, 97.97%, 97.98%, 97.99%, 98%, 98.01%, 98.02%, 98.03%, 98.04%, 98.05%, 98.06%, 98.07%, 98.08%, 98.09%, 98.1%, 98.11%, 98.12%, 98.13%, 98.14%, 98.15%, 98.16%, 98.17%, 98.18%, 98.19%, 98.2%, 98.21%, 98.22%, 98.23%, 98.24%, 98.25%, 98.26%, 98.27%, 98.28%, 98.29%, 98.3%, 98.31%, 98.32%, 98.33%, 98.34%, 98.35%, 98.36%, 98.37%, 98.38%, 98.39%, 98.4%, 98.41%, 98.42%, 98.43%, 98.44%, 98.45%, 98.46%, 98.47%, 98.48%, 98.49%,98.5%, 98.51%, 98.52%, 98.53%, 98.54%, 98.55%, 98.56%, 98.57%, 98.58%, 98.59%, 98.6%, 98.61%, 98.62%, 98.63%, 98.64%, 98.65%, 98.66%, 98.67%, 98.68%, 98.69%, 98.7%, 98.71%, 98.72%, 98.73%, 98.74%, 98.75%, 98.76%, 98.77%, 98.78%, 98.79%, 98.8%, 98.81%, 98.82%, 98.83%, 98.84%, 98.85%, 98.86%, 98.87%, 98.88%, 98.89%, 98.9%, 98.91%, 98.92%, 98.93%, 98.94%, 98.95%, 98.96%, 98.97%, 98.98%, 98.99%, 99%, 99.01%, 99.02%, 99.03%, 99.04%, 99.05%, 99.06%, 99.07%, 99.08%, 99.09%, 99.1% , 99.11%, 99.12%, 99.13%, 99.14%, 99.15%, 99.16%, 99.17%, 99.18%, 99.19%, 99.2%, 99.21%, 99.22%, 99.23%, 99.24%, 99.25%, 99.26%, 99.27%, 99.28%, 99.29%, 99.3%, 99.31%, 99.32%, 99.33%, 99.34%, 99.35%, 99.36%, 99.37%, 99.38%, 99.39%, 99.4%, 99.41%, 99.42%, 99.43%, 99.44%, 99.45%, 99.46%, 99.47%, 99.48%, 99.49%, 99.5%, 99.51%, 99.52%, 99.53%, 99.54%, 99.55%, 99.56%, 99.57%, 99.58%, 99.59%, 99.6%,99.61%, 99.62%, 99.63%, 99.64%, 99.65%, 99.66%, 99.67%, 99.68%, 99.69%, 99.7%, 99.71%, 99.72%, 99.73%, 99.74%, 99.75%, 99.76%, 99.77%, 99.78%, 99.79%, 99.8%, 99.81%, 99.82%, 99.83% 99.84%, 99.85%, 99.86%, 99.87%, 99.88%, 99.89%, 99.9%, 99.91%, 99.92%, 99.93%, 99.94%, 99.95%, 99.96%, 99.97%, 99.98% 및 99.99%의 서열 동일성을 가질 것이다. 본 출원에 사용되는 바와 같이, 특히 "서열 번호 X와의 서열 동일성" 또는 "동일한 서열 번호 X"라는 용어 각각은 "서열 번호 X의 길이를 넘어서는 서열 번호 X의 서열과의 서열 동일성" 또는 "서열 번호 X의 길이를 넘어서는 서열 번호 X의 서열과 동일한"이라는 용어와 각각 등가인 것으로 이해된다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 바람직한 스파이크 폴리펩타이드는 PDCoV 서열 번호 4, 8, 12, 18 또는 28 및/또는 서열 번호 4, 8, 12, 18, 28, 31, 35, 47 및/또는 53과 적어도 80%의 상동성, 예를 들어, 서열 번호 4, 8, 12, 18, 28, 31, 35, 47 및/또는 53과 적어도 85%의 상동성, 예를 들어, 서열 번호 4, 8, 12, 18, 28, 31, 35, 47 및/또는 53과 적어도 85%의 상동성, 예를 들어, 서열 번호 4, 8, 12, 18, 28, 31, 35, 47 및/또는 53과 적어도 90%의 상동성, 예를 들어, 서열 번호 4, 8, 12, 18, 28, 31, 35, 47 및/또는 53과 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는 PEDV 스파이크 서열 번호 31, 35, 47 또는 53에 정리된 서열을 갖는 폴리펩타이드이다.
"백신" 및 "면역원성 조성물"이라는 용어는 본 출원에서 넓은 의미에서 백신으로 접종된 동물에서 면역 반응을 자극할 수 있는 투여가능한 형태의 임의의 유형의 생물학적 제제를 지칭하는 것으로 정의된다. 일반적으로, 백신은 바이러스 자체 (예를 들어, 사멸/불활성화되거나 약독화됨) 또는 바이러스의 면역원성 (항원성) 성분을 기반으로 할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 백신 (면역원성 조성물)은 바람직하게는 바이러스제를 사멸된/불활성화된 형태 또는 하위 단위 백신으로서 존재하는 바이러스의 항원 부분으로 포함한다. 본 출원에서, "방어"라는 용어는, 면역원성 조성물과 관련하여 사용될 때, 문제의 질환 또는 병태와 관련된 임의의 증상의 개선 (부분적이거나 완전한 개선)을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물에 의한 PDCoV 및/또는 PEDV로 감염된 돼지의 임상 증상의 감소는, 일반적으로 바이러스 배출 및/또는 PDCoV 및/또는 PEDV에 의한 감염과 관련된 임상적 증상 (예를 들어, 급성 물 설사, 급성 구토, 탈수, 식욕부진, 기면증, 우울증, 및 10일령 미만의 돼지에서의 높은 사망률) 중 하나 이상의 감소를 초래한다. 마찬가지로, 본 발명의 면역원성 조성물에 의한 PDCoV 및/또는 PEDV로 감염된 돼지의 임상 증상의 감소는, 일반적으로 바이러스 배출 및/또는 PDCoV 및/또는 PEDV에 의한 감염과 관련된 임상적 증상 (예를 들어, 급성 물 설사, 급성 구토, 탈수, 식욕부진, 기면증, 우울증, 및 10일령 미만의 돼지에서의 높은 사망률) 중 하나 이상의 감소를 초래한다.
당해 분야의 통상의 기술자들은 본 출원에서 사용되는 조성물이 공지된 주사가능한 생리학적으로 허용되는 멸균 용액을 도입할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 비경구 주사 또는 주입을 위한 즉시 사용가능한 용액을 제조하기 위해, 수성 등장성 용액, 예를 들어, 식염수 또는 혈장 단백질 용액이 용이하게 이용가능하다. 또한, 본 발명의 면역원성 조성물 및 백신 조성물은 수의학적으로 허용되는 담체, 희석제, 등장화제, 안정화제 또는 아쥬반트를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은, 불활성화/사멸 PDCoV 및/또는 PEDV, 약독화 PDCoV 및/또는 PEDV, 및/또는 PDCoV 및/또는 PEDV로부터 유도된 재조합 스파이크 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 PDCoV 감염 및/또는 PEDV 감염 단독, 또는 서로의 조합 또는 다른 공동 감염과의 조합에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 면역 반응은 PDCoV 또는 PEDV의 하나 이상의 혈청형 또는 바이러스주에 대해 유발된다. 본 발명의 조성물은 PDCoV 감염, PEDV 감염 및/또는 PEDV/PDCoV 공동 감염을 예방하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 면역 반응은 하나 이상의 PDCoV 유전자형 및/또는 PEDV 유전자형/유전자군에 의한 감염에 관련되거나 이들에 기인한 1종 이상의 임상 징후의 발생 빈도 또는 중증도를 감소시킨다.
본 출원에서, 본 발명의 조성물을 투여할 수 있는 적합한 대상체 및 이를 필요로 하는 대상체는 바이러스 관련 감염, 질병 또는 병태를 위한 예방적 치료가 필요한 동물을 포함할 수 있다. 면역 반응이 본 발명의 조성물 또는 방법을 사용하여 자극되는 동물은, 가축, 예를 들어, 돼지, 소, 가금 (예를 들어, 닭, 오리, 거위 또는 칠면조), 염소 및 양, 및 사육 동물, 예를 들어, 마우스, 토끼, 개, 고양이 및 말을 포함한다. 바람직한 동물은 돼지, 쥐과 동물 (murid), 에퀴드 (equid), 토끼목 동물 및 소과 동물 (bovid)를 포함한다. 가장 바람직하게는, 면역 반응은 돼지에서 자극된다.
본 발명은, PDCoV 및/또는 PEDV 감염의 임상 징후의 발생 빈도 또는 중증도가, 본 출원에서 제공된 바와 같은 면역원성 조성물을 투여받지 않은 대상체에 비해, 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 보다 더 바람직하게는 적어도 30%, 보다 더 바람직하게는 적어도 50%, 보다 더 바람직하게는 적어도 70%, 가장 바람직하게는 100% 만큼 감소되도록, 불활성화/사멸 PDCoV 백신, 불활성화/사멸 PEDV 백신 및/또는 본 출원에서 제공된 바와 같은 PDCoV 및/또는 PEDV로부터 유도된 재조합 스파이크 항원과의 조합 및 바람직하게는 담체 분자를 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, PDCoV 감염 및/또는 PEDV 감염과 관련되거나 이들에 기인하는 1종 이상의 임상 징후의 발생 빈도 또는 중증도를 감소시키는 방법을 또한 제공한다. 이러한 임상 징후는 물 설사, 구토, 및 탈수를 포함한다. 이들 임상 징후 중 임의의 것은 2a의 유전자군, 또는 G1a, G1b 또는 G2b를 포함하는 임의의 다른 PEDV 유전자군을 갖는 PEDV에 의한 감염으로 인해 발생할 수 있다. 마찬가지로, 이들 임상 징후 중 임의의 것은 다양한 유전자형의 PDCoV에 의한 감염 및/또는 공동 감염으로 인해 발생할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 PEDV의 화학적으로 불활성화된 형태를 포함한다. 화학적으로 불활성화된 PDCoV (서열 번호 1 또는 2, 5 또는 6, 9 또는 10) 바이러스를 포함하는 백신이 특히 바람직하다. 추가로, 본 발명의 면역원성 조성물은 PEDV의 화학적으로 불활성화된 형태를 포함할 수 있다. 화학적으로 불활성화된 PEDV (서열 번호 29 또는 32, 또는 서열 번호 33 또는 36) 바이러스를 포함하는 백신이 특히 바람직하다. 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지된 다양한 화학적 불활성화제는 바이러스를 불활성화시키는데 사용될 수 있다. 에틸렌이민 및 관련 유도체, 예를 들어, 바이너리 (binary) 에틸렌이민 ("BEI") 및 아세틸에틸렌이민은, SDCo 및/또는 PED 바이러스를 불활성화시키는데 사용하기에 적합한 화학적 불활성화제의 예이다. 기타 화학적 불활성화제, 예를 들어, 베타-프로피오락톤 또는 알데하이드 (예를 들어, 포름알데하이드 및 글루타르알데하이드)도 또한 바이러스를 불활성화시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물 및/또는 백신은 일반적으로 바람직하게는 특히 생체접착성 특성을 가질 수 있는 아쥬반트를 포함하고, 특히, 바이러스는 비강내 투여할 수 있도록 설계된다. 적합한 아쥬반트의 예로는 가교된 아크릴산 중합체와 같은 가교된 올레핀계 불포화 카복실산 중합체가 포함된다. 본 출원에 사용되는 "가교된 아크릴산 중합체"라는 용어는, 혼합물 중 주요 단량체로서 아크릴산을 포함하는 단량체 혼합물로부터 형성된 중합체 및 공중합체를 지칭한다. 적합한 가교된 아크릴산 중합체의 예로는 상표명 카보폴® 934P (CARBOPOL® 934P) 및 카보폴® 971 (B.F.Goodrich Co., Cleveland, Ohio)로 시판되는 것들이 포함된다. 본 발명의 백신에서 사용하기 위한 하나의 특히 적합한 아쥬반트는 약 20,000 cPs 이하의 브룩필드 점도 (pH 7.5의 1.0 wt.% 수용액으로 20 rpm에서 측정)를 갖는 가교된 아크릴산 중합체이다. 생체접착성 아쥬반트가 바람직한 경우, 새로이 절제된 토끼 위 조직의 2개의 조각 사이에서 측정될 때 적어도 약 50 dyne/cm2의 생체접착 특성 (미국 특허 US 4,615,697에 기재된 절차에 따라 측정)을 갖는 아쥬반트를 사용하는 것이 유리할 수 있다.
본 발명은 또한 본 출원에 기재된 바와 같은 면역원성 조성물 중 임의의 것을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다.
"면역화시키는"이라는 용어는 면역화시키고자 하는 대상체에게 면역원성 조성물을 투여하여 이러한 면역원성 조성물에 포함되어 있는 항원에 대하여 면역학적 반응을 유발시키는 능동 면역화에 관한 것이다.
바람직하게는, 면역화는 한 무리에서 특정 PDCoV 감염 단독 또는 PEDV 감염과의 조합의 발병률을 감소시키거나, 특정 PDCoV 및/또는 PEDV 감염에 기인하거나 이들과 관련된 임상 징후의 중증도를 감소시킨다.
또한, 본 출원에서 제공된 바와 같은 면역원성 조성물을 필요로 하는 대상체의 상기 면역원성 조성물에 의한 면역화는 PDCoV 및/또는 PEDV 감염에 의한 대상체의 감염을 예방한다. 보다 더 바람직하게는, 면역화는 PDCoV 및/또는 PEDV 감염에 대해 효과적이면서 장기간 지속되는 면역학적 반응을 유발한다. 상기 기간은 2개월 이상, 바람직하게는 3개월 이상, 보다 바람직하게는 4개월 이상, 보다 바람직하게는 5개월 이상, 보다 바람직하게는 6개월 이상 지속될 것이라는 것을 이해해야 할 것이다. 면역화는 면역화된 모든 대상체에서 효과적일 수 없다는 것을 이해해야 한다.
바람직하게는, 일반적으로, 즉, 면역화 없이, PDCoV 감염 및/또는 PEDV 감염에 기인하거나 이들과 관련된 임상 징후를 발생시킬 한 무리의 대상체가 이러한 맥락에서 예상된다. 한 무리의 대상체가 효과적으로 면역화되는 지의 여부는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 지체 없이 결정될 수 있다. 바람직하게는, 면역화는, 주어진 한무리의 대상체 중 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 100%에서의 임상 징후가, 비면역화되거나 본 발명 이전에 이용가능했던 면역원성 조성물로 면역화되지만 후속적으로 특정 PDCoV 및/또는 PEDV에 의해 감염된 대상체와 비교하여, 발병률 또는 중증도에서 적어도 10% 만큼, 보다 바람직하게는 적어도 20% 만큼, 보다 더 바람직하게는 적어도 30% 만큼, 보다 더 바람직하게는 적어도 40% 만큼, 보다 더 바람직하게는 적어도 50% 만큼, 보다 더 바람직하게는 적어도 60% 만큼, 보다 더 바람직하게는 적어도 70% 만큼, 보다 더 바람직하게는 적어도 80% 만큼, 보다 더 바람직하게는 적어도 90% 만큼, 보다 더 바람직하게는 적어도 95% 만큼, 가장 바람직하게는 100% 만큼 감소된다면, 효과적일 것이다.
이를 필요로 하는 대상체에서 PDCoV 및/또는 PEDV에 기인하는 임상 징후를 예방하는 방법 또는 PDCoV 및/또는 PEDV와 관련된 질병에 대해 돼지를 방어하는 방법은, 불활성화/사멸 PDCoV 및/또는 불활성화/사멸 PEDV 및/또는 PDCoV 및/또는 PEDV로부터 유도된 스파이크 항원을 포함하는 면역원성 조성물 및/또는 백신을 돼지에게 투여하는 것을 포함한다. 백신은 비강내, 경구 및/또는 비경구 (예를 들어, 근육내) 투여를 비롯하여 다양한 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 상기 방법의 하나의 실시형태에서, 예를 들어, 불활성화 PDCoV 및/또는 불활성화 PEDV를 함유하는 면역원성 조성물은 근육내로 1회 이상 (예를 들어, 2~4주의 간격으로) 투여된다. 상기 방법의 또다른 실시형태에서, 예를 들어, 불활성화 PEDV를 포함하는 백신은 경구로 1회 이상(예를 들어, 2 내지 4주 간격으로) 투여된다. 대안적인 실시형태에서, 경구 투여는 백신의 적어도 1회 근육내 투여 후에 이루어지고/지거나 이에 선행할 수 있다 (예를 들어, 백신의 비경구 투여 2~4주 후 및/또는 전). 이상적으로, 주어진 무리의 모든 돼지를 처방된 간격으로 백신접종하여 질환의 증상 확산에 대해 방어한다.
불활성화/사멸 PDCoV 백신, 불활성화/사멸 PEDV 백신 또는 조합 PDCoV/PEDV 면역원성 조성물을 제조하는 방법이 또한 제공된다. PDCoV의 제조를 위해, 상기 방법은 전형적으로 돼지 정소 세포에 PDCo 바이러스, 예를 들어, 서열 번호 1 또는 2, 5 또는 6, 및 9 또는 10의 PDCo 바이러스를 접종하는 것을 포함한다. 일반적으로 적어도 CPE가 관찰될 때까지 접종된 돼지 정소 세포를 인큐베이션 처리한 다음, 인큐베이션 처리된 세포로부터 PED 바이러스를 수확한다. 상기 수확된 바이러스 함유 유체를 화학적 불활성화제, 예를 들어, 바이너리 에틸렌이민으로 처리하여, 불활성화/사멸 PDCo 바이러스를 형성할 수 있다. 전형적으로, 불활성화된 바이러스를 추가로, 예를 들어, 농축 및 다른 성분과의 블렌딩으로 처리하여 시판 제형을 제조한다. 예를 들어, 불활성화 바이러스 함유 유체를 농축하고 아쥬반트 및/또는 1종 이상의 다른 돼지 병원체에 대한 항원(들)과 블렌딩할 수 있다. PEDV의 제조를 위해, 상기 방법은 전형적으로 시미안 세포 (simian cell)에 PED 바이러스, 예를 들어, 서열 번호 29 또는 서열 번호 33의 PED 바이러스를 접종하는 것을 포함한다. 일반적으로 적어도 CPE가 관찰될 때까지 접종된 시미안 세포를 인큐베이션 처리한 다음, 인큐베이션 처리된 세포로부터 PED 바이러스를 수확한다. 상기 수확된 바이러스 함유 유체를 화학적 불활성화제, 예를 들어, 바이너리 에틸렌이민으로 처리하여, 불활성화/사멸 PED 바이러스를 형성할 수 있다. 전형적으로, 불활성화된 바이러스를 추가로, 예를 들어, 농축 및 다른 성분과의 블렌딩으로 처리하여 시판 제형을 제조한다. 예를 들어, 불활성화 바이러스 함유 유체를 농축하고 아쥬반트 및/또는 1종 이상의 다른 돼지 병원체에 대한 항원(들)과 블렌딩할 수 있다.
PDCoV 및/또는 PEDV 스파이크 단백질을 발현하는 재조합 바큘로 바이러스를 통해 곤충 세포에서 생성된 재조합적으로 발현된 스파이크 항원 백신을 제조하는 방법이 또한 제공된다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 상기 방법은, 예를 들어, PDCoV 스파이크-Fc 항원 작제물 (서열 번호 17) 및/또는 PDCoV 스파이크 바큘로디스플레이 작제물 (서열 번호 27) 및/또는 PEDV 2a 스파이크 작제물 (서열 번호 46) 및/또는 PEDV 2b 스파이크 작제물 (서열 번호 52)을 비롯하여 PDCoV 스파이크 암호화 서열 (예를 들어, 서열 번호 3, 7, 11, 17 또는 27) 및/또는 PEDV 스파이크 암호화 서열 (서열 번호 30, 34, 46 또는 52)을 바큘로바이러스 벡터에 클로닝하고, Sf9 곤충 세포를 공동 형질감염시켰다.
본 출원은 또한 다음의 조합을 포함하는 키트에 관한 것이다: (1) 백신을 돼지에게 투여할 수 있는 디스펜서; 및 (2) PDCoV 및/또는 PEDV와 관련된 질병에 대하여 방어할 수 있는 화학적으로 불활성화된 PDCoV 및/또는 화학적으로 불활성화된 PEDV 및/또는 PDCoV 및/또는 PEDV로부터 유도된 재조합 스파이크 항원 함유 백신. 상기 키트는 이의 내용물을 액적으로서, 예를 들어, 에어로졸, 분무 스프레이 및/또는 액체 액적으로서 투약할 수 있는 디스펜서 및, 예를 들어, 비강내로 및/또는 근육내로 투여될 때, PDCoV 및/또는 PEDV와 관련된 질병에 대해 방어할 수 있는 백신 형태를 포함할 수 있다.
본 출원 전체에 걸쳐, 텍스트는 본 발명의 조성물 및/또는 관련 방법의 다양한 실시형태에 관한 것이다. 기재된 다양한 실시형태는 다양한 예시적인 예를 제공하는 것으로 의도되며, 대안적인 종류의 기재로서 해석되지 말아야 한다. 오히려, 본 출원에서 제공된 다양한 실시형태의 기재는 범위가 중복될 수 있다는 것에 유의해야 한다. 본 출원에서 논의된 실시형태는 단지 예시적인 것이며, 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
하기의 도면들은 본 명세서의 일부를 형성하며, 본 발명의 특정 양태들을 추가로 증명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본 출원에서 제시된 특정 실시형태들에 대한 상세한 설명과 함께 이들 도면들 중 1개 이상을 참조하면 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 PDCoV 분리주/바이러스주에 대한 완전 게놈 뉴클레오타이드 이웃 연결 계통수를 도시한 것이다. 축척은 p 거리를 나타낸다. GenBank 수탁 번호는 2개 문자의 주 또는 3개 문자의 국가 코드 (CHN - 중국, TJK - 태국, LAO - 라오스)와 함께 표시된다.
도 2는 PDCoV 분리주/바이러스주에 대한 스파이크 아미노산 이웃 연결 계통수를 도시한 것이다. 축척은 p 거리를 나타낸다. GenBank 수탁 번호는 2개 문자의 주 또는 3개 문자의 국가 코드 (CHN - 중국, TJK - 태국, LAO - 라오스)와 함께 표시된다.
도 3a는 PDCoV S1-IgG2a Fc 바큘로바이러스 - PDCoV S1-IgG2a Fc의 단백질 지도의 개략도를 도시한 것이다.
도 3b는 PDCoVS BD 바큘로디스플레이 바큘로바이러스 - PDCoVS BD의 단백질 지도의 개략도를 도시한 것이다.
도 4는 위약 (그룹 3)과 비교한 PDCoV 프로토타입 (각각 그룹 1, 2, 4, BaculoS-BD-PDCoV, 전체 세포 PDCoV 및 BaculoS-FC-PDCoV)에 대한 혈청학적 연구를 도시한 것이다.
도 5는 위약 (그룹 3)과 비교한 S1-IgG2a-Fc 기반 ELISA에 의해 검출된 PDCoV 프로토타입 (각각 그룹 1, 2, 4, BaculoS-BD-PDCoV, 전체 세포 PDCoV 및 BaculoS-FC-PDCoV)에 의한 백신접종 후의 혈청학적 반응을 도시한 것이다.
도 6a는 PEDV 2a BD 바큘로디스플레이 바큘로바이러스의 단백질 지도의 개략도를 도시한 것이다.
도 6b는 PEDV 2b BD 바큘로디스플레이 바큘로바이러스의 단백질 지도의 개략도를 도시한 것이다.
도 7은 PEDV BD 시험감염 후 그룹 및 일수에 의한 생존성을 도시한 것이다.
도 8은 백신접종된 동물에서의 IgA 수준을 도시한 것이다.
본 발명은 불활성화/사멸된 형태의 PDCoV 및/또는 PEDV 및/또는 재조합적으로 발현된 PDCoV 및/또는 PEDV-스파이크 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 상기 면역원성 조성물은 PDCoV 및/또는 PEDV와 관련된 질병에 대해 돼지를 방어하기 위해 설계된다. 상기 면역원성 조성물은 전형적으로 화학적으로 불활성화/사멸된 형태의 PDCoV 및/또는 PEDV를 포함하며, 화학적으로 불활성화/사멸된 PDCoV 및/또는 PEDV 바이러스를 포함하는 것이 특히 바람직하다. 또 다른 실시형태에서, 상기 면역원성 조성물은 PDCoV 및/또는 PEDV 스파이크 단백질을 발현하는 재조합 바큘로바이러스를 통해, 예를 들어, 곤충 세포에서 생성된, 재조합 발현된 PDCoV 및/또는 PEDV 스파이크 항원을 포함한다.
일반적으로, 본 발명은 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)의 1종 이상의 항원 및 아쥬반트를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서, 상기 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)는 a) 서열 번호 1, 5 또는 9에 의해 암호화되고/되거나 서열 번호 1, 5 또는 9의 서열을 포함하고/하거나 서열 번호 1, 5 또는 9의 RNA 등가물을 포함하거나; b) 서열이 서열 번호 1, 5 또는 9와 적어도 99% 동일하고/하거나 서열 번호 1, 5 또는 9의 RNA 등가물과 적어도 99% 동일하거나; c) 스파이크 단백질이 서열 번호 3, 7 또는 11의 핵산 서열에 의해 암호화되거나; d) 스파이크 단백질이 서열 번호 3, 7 또는 11과 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되거나; e) 서열 번호 2, 6 또는 10에 의해 암호화되거나; 및 f) 서열이 서열 번호 2, 6 또는 10과 적어도 99% 동일한 임의의 PDCoV이다.
특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물 상기 문장에 따른 바와 같으며, 여기서, 상기 아쥬반트는 수중유형 에멀젼이다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 면역원성 조성물은 재조합 항원 또는 불활성화된 전체 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 항원이다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 항원은 불활성화된 전체 PDCoV 항원이다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 PDCoV 항원은 화학적으로 불활성화된다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 PDCoV 항원은 에틸렌이민, 바이너리 에틸렌이민, 아세틸에틸렌이민 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물을 포함하는 화학적 불활성화제에 의한 처리에 의해 화학적으로 불활성화된다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 PDCoV는 바이너리 에틸렌이민에 의한 처리에 의해 화학적으로 불활성화된다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 아쥬반트는 EMULSIGEN® 수중유형 에멀젼계 아쥬반트이다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 불활성화된 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)는 서열 번호 1, 5 또는 9를 포함하고/하거나 서열 번호 1, 5 또는 9의 RNA 등가물을 포함한다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 PDCoV 항원은 재조합 항원이다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 재조합 항원은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 면역원성 성분을 포함한다: a) 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 스파이크 단백질의 항원을 암호화하는 단리된 핵산으로서, 상기 재조합 스파이크 폴리펩타이드가 서열 번호 4, 8, 12, 18 또는 28과 적어도 90%의 상동성을 갖는, 단리된 핵산; b) a)의 단리된 핵산을 포함하는 재조합 벡터; c) a)의 단리된 핵산에 의해 암호화되는 재조합 PDCoV 스파이크 단백질; 및 d) 이들의 임의의 조합.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 면역원성 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함한다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 수중유형 에멀젼은 EMULSIGEN® 수중유형 에멀젼계 아쥬반트이다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 면역원성 조성물은 1종 이상의 추가의 항원을 추가로 포함한다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 추가의 항원은 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)의 항원이고, 상기 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)는 a) 서열 번호 29 또는 33에 의해 암호화되고/되거나 서열 번호 29 또는 33의 서열을 포함하고/하거나 서열 번호 29 또는 33의 RNA 등가물을 포함하거나; b) 서열이 서열 번호 29 또는 33과 적어도 99% 동일하고/하거나 서열 번호 29 또는 33의 RNA 등가물과 적어도 99% 동일하거나; c) 스파이크 단백질이 서열 번호 30, 34, 46 또는 52의 핵산 서열에 의해 암호화되거나; d) 스파이크 단백질이 서열 번호 30, 34, 46 또는 52와 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되거나; e) 서열 번호 32 또는 36에 의해 암호화되거나; f) 서열 번호 32 또는 36과 적어도 99% 동일한 서열에 의해 암호화되는 임의의 PEDV이다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 추가의 PEDV 항원은 재조합 항원 또는 불활성화된 전체 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)이다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 항원은 불활성화된 전체 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)이다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 항원은 재조합 PEDV 항원이다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 재조합 항원은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 면역원성 성분을 포함한다: a) 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 스파이크 단백질의 항원을 암호화하는 단리된 핵산으로서, 상기 항원이 서열 번호 31, 35, 47 또는 53과 적어도 90%의 상동성을 갖는, 단리된 핵산; b) a)의 단리된 핵산을 포함하는 재조합 벡터; c) a)의 단리된 핵산에 의해 암호화되는 재조합 PEDV 스파이크 단백질; 및 d) 이들의 임의의 조합.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 재조합 항원은 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)의 구조 단백질 M, E 또는 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 면역원성 성분을 포함한다.　
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 면역원성 성분은 단리된 핵산이다.　
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 면역원성 성분은 재조합 벡터이다.　
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 면역원성 성분은 재조합 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 스파이크 단백질이다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 면역원성 성분은 조합이다.　
본 발명은 또한 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같은 면역원성 조성물을 돼지에게 투여하는 것을 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)와 관련된 질병의 임상 증상을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 방법은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 불활성화된 전체 PDCoV 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 돼지에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 방법은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 재조합 항원으로서 상기 PDCoV 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 돼지에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 방법은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 투여되는 면역원성 조성물은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 면역원성 성분을 포함한다: a) 서열 번호 1에 의해 암호화되고/되거나 서열 번호 1, 5 또는 9의 서열을 포함하고/하거나 서열 번호 1, 5 또는 9의 RNA 등가물을 포함하는 것; b) 서열이 서열 번호 1, 5 또는 9와 적어도 99% 동일하고/하거나 서열 번호 1, 5 또는 9의 RNA 등가물과 적어도 99% 동일한 것; c) 스파이크 단백질이 서열 번호 3, 7, 11, 17 또는 27의 핵산 서열에 의해 암호화되는 것; d) 스파이크 단백질이 서열 번호 3, 7, 11, 17 또는 27과 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되는 것; e) 서열 번호 2, 6 또는 10에 의해 암호화되는 것; 및 f) 서열이 서열 번호 2, 6 또는 10과 적어도 99% 동일한 것.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 방법은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 투여되는 면역원성 조성물은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 면역원성 성분을 포함한다: a) 서열 번호 1, 5 또는 9의 서열에 의해 암호화되거나 이를 포함하는 것; b) 서열이 서열 번호 1, 5 또는 9와 적어도 99% 동일한 것; d) 스파이크 단백질이 서열 번호 3, 7, 11, 17 또는 27의 핵산 서열에 의해 암호화되는 것; 및 e) 스파이크 단백질이 서열 번호 3, 7, 11, 17 또는 27과 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되는 것.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 방법은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 투여되는 면역원성 조성물은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 면역원성 성분을 포함하는 재조합 항원을 포함한다: a) 돼지 유행성 설사 바이러스, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 스파이크 단백질의 항원을 암호화하는 단리된 핵산으로서, 상기 재조합 스파이크 폴리펩타이드가 서열 번호 4, 8, 12, 18 또는 28과 적어도 90%의 상동성을 갖는, 단리된 핵산; b) a)의 단리된 핵산을 포함하는 재조합 벡터; c) a)의 단리된 핵산에 의해 암호화되는 재조합 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 스파이크 단백질; 및 d) 이들의 임의의 조합.
본 발명은 또한 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같은 면역원성 조성물을 돼지에게 투여하는 것을 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 및 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)와 관련된 질병의 임상 증상을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 바람직하게는 상기 면역원성 조성물은 PDCoV의 1종 이상의 항원 및 1종 이상의 추가의 항원을 포함하고, 여기서, 상기 추가의 항원은 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)의 항원이다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 방법은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 상기 면역원성 조성물을 상기 돼지에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 추가의 PEDV 항원은 재조합 항원 또는 불활성화된 전체 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)이다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 방법은 상기 문장에서 기재된 바와 같으며, 상기 문장 중 어느 한 문장에 기재된 바와 같은 면역원성 조성물을 상기 돼지에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 다음을 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)와 관련된 질병에 대해 돼지에서 면역원성 반응을 유도하기 위한 키트에 관한 것이다: a) 면역원성 조성물을 돼지에게 투여할 수 있는 디스펜서; 및 b) 상기 문장 중 어느 한 문장에 기재된 바와 같은 면역원성 조성물.
본 발명은 또한 a) 면역원성 조성물을 돼지에게 투여할 수 있는 디스펜서; 및 b) 상기 문장 중 어느 한 문장에 기재된 바와 같은 면역원성 조성물을 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)와 관련된 질병에 대해 돼지에서 면역원성 반응을 유도하기 위한 키트에 관한 것이며, 여기서, 보다 구체적으로는 상기 항원은 불활성화된 전체 PDCoV 항원이고, 보다 더 구체적으로는 상기 PDCoV 항원은 화학적으로 불활성화되고; 보다 구체적으로는 상기 PDCoV 항원은 에틸렌이민, 바이너리 에틸렌이민, 아세틸에틸렌이민 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물을 포함하는 화학적 불활성화제에 의한 처리에 의해 화학적으로 불활성화되고; 바람직하게는 상기 PDCoV는 바이너리 에틸렌이민에 의한 처리에 의해 화학적으로 불활성화되고, 보다 구체적으로는 상기 아쥬반트는 EMULSIGEN® 수중유형 에멀젼계 아쥬반트이고; 보다 더 바람직하게는 상기 불활성화된 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)는 서열 번호 1, 5 또는 9를 포함하고/하거나 서열 번호 1, 5 또는 9의 RNA 등가물을 포함한다.
본 발명은 또한 a) 면역원성 조성물을 돼지에게 투여할 수 있는 디스펜서; 및 b) 상기 문장 중 어느 한 문장에 기재된 바와 같은 면역원성 조성물을 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)와 관련된 질병에 대해 돼지에서 면역원성 반응을 유도하기 위한 키트에 관한 것이며, 여기서, 보다 구체적으로는 상기 PDCoV 항원은 재조합 항원이고, 보다 더 구체적으로는 상기 재조합 항원은 a) 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 스파이크 단백질의 항원을 암호화하는 단리된 핵산으로서, 상기 재조합 스파이크 폴리펩타이드가 서열 번호 4, 8, 12, 18 또는 28과 적어도 90%의 상동성을 갖는, 단리된 핵산; b) a)의 단리된 핵산을 포함하는 재조합 벡터; c) a)의 단리된 핵산에 의해 암호화되는 재조합 PDCoV 스파이크 단백질; 및 d) 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 면역원성 성분을 포함하고, 보다 더 구체적으로는 이러한 면역원성 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하고; 보다 더 구체적으로는 상기 수중유형 에멀젼은 EMULSIGEN® 수중유형 에멀젼계 아쥬반트이다.
본 발명은 또한 a) 면역원성 조성물을 돼지에게 투여할 수 있는 디스펜서; 및 b) 상기 문장 중 어느 한 문장에 기재된 바와 같은 면역원성 조성물을 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 및 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)와 관련된 질병에 대해 돼지에서 면역원성 반응을 유도하기 위한 키트에 관한 것이며, 구체적으로는 상기 추가의 항원은 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)이고 상기 문장 중 어느 한 문장에 기재된 바와 같은 임의의 PEDV 항원이다.
본 발명은 또한 a) 면역원성 조성물을 돼지에게 투여할 수 있는 디스펜서; 및 b) 상기 문장 중 어느 한 문장에 기재된 바와 같은 면역원성 조성물을 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 및 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)와 관련된 질병에 대해 돼지에서 면역원성 반응을 유도하기 위한 키트에 관한 것이며, 구체적으로는 상기 추가의 항원은 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)이고 상기 문장 중 어느 한 문장에 기재된 바와 같은 임의의 재조합 PEDV 항원 또는 임의의 불활성화된 전체 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)이다.
본 발명은 또한 a) 면역원성 조성물을 돼지에게 투여할 수 있는 디스펜서; 및 b) 상기 문장 중 어느 한 문장에 기재된 바와 같은 면역원성 조성물을 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 및 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)와 관련된 질병에 대해 돼지에서 면역원성 반응을 유도하기 위한 키트에 관한 것이며, 구체적으로는 상기 추가의 항원은 상기 문장 중 어느 한 문장에 기재된 바와 같은 임의의 재조합 PEDV 항원이다.
본 발명은 또한 다음 단계를 추가로 포함하는, 상기 문장 중 어느 한 문장에 기재된 바와 같은 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 면역원성 조성물의 제조 방법에 관한 것이다: a) 돼지 정소 세포에 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)를 접종하는 단계; b) 상기 접종된 돼지 정소 세포를 인큐베이션 처리하는 단계; c) 상기 인큐베이션 처리된 세포로부터 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)를 수확하는 단계; 및 d) 상기 수확된 세포를 화학적 불활성화제, 바람직하게는 에틸렌이민, 바이너리 에틸렌이민, 아세틸에틸렌이민 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물로 처리하여 불활성화된 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 항원을 형성시키는 단계.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 방법은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)는 다음의 추가의 특징을 포함함다: a) 서열 번호 1, 5 또는 9의 서열에 의해 암호화되거나 이를 포함하는 서열; b) 서열 번호 1, 5 또는 9와 적어도 99% 동일한 서열; c) 서열 번호 3, 7, 11, 17 또는 27의 핵산 서열에 의해 암호화되는 스파이크 단백질; 및 d) 서열 번호 3, 7, 11, 17 또는 27과 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되는 스파이크 단백질.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 방법은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)는 서열 번호 1, 5 또는 9 및/또는 서열 번호 1, 5 또는 9의 RNA 등가물의 추가의 특징을 포함한다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 방법은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 돼지 정소 세포는 AI-ST 세포이다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 방법은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 화학적 불활성화제는 바이너리 에틸렌이민을 포함한다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 방법은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 수중유형 에멀젼계 아쥬반트 EMULSIGEN®을 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 항원에 첨가하는 단계의 추가의 특징을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는, 상기 문장 중 어느 한 문장에 기재된 바와 같은 재조합 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 항원을 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법에 관한 것이다: a) 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)의 항원을 숙주 세포에서 발현시키는 단계; b) 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 세포의 항원을 수확하는 단계; 및 c) 단계 b)의 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 항원에 수중유형 에멀젼계 아쥬반트를 첨가하는 단계.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 방법은 상기 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)는 다음을 포함한다: a) 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 스파이크 단백질의 항원을 암호화하는 단리된 핵산으로서, 상기 재조합 스파이크 폴리펩타이드가 서열 번호 3, 7, 11, 17 또는 27과 적어도 90%의 상동성을 갖는, 단리된 핵산; b) a)의 단리된 핵산을 포함하는 재조합 벡터; c) a)의 단리된 핵산에 의해 암호화되는 재조합 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 스파이크 단백질; 및 d) 이들의 임의의 조합.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 방법은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)의 항원은 재조합 바큘로바이러스 벡터에 의해 발현된다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 방법은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 상기 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)의 항원은 곤충 세포에서 발현된다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 방법은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, 여기서, 추가의 특징으로서, 상기 수중유형 에멀젼계 아쥬반트는 EMULSIGEN® 수중유형 에멀젼계 아쥬반트이다.
본 발명은 또한 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)와 관련된 질병의 증상의 감소에 사용하기 위한, 상기 문장 중 어느 한 문장에 기재된 바와 같은 PDCoV를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 PDCoV 및 적어도 1종의 추가의 항원을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이며, 여기서, 적어도 1종의 추가의 항원은 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 및/또는 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)와 관련된 질병의 증상의 감소에 사용하기 위한 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)의 항원이다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, PEDV 유전자형 2a의 1종 이상의 항원을 포함하고, 구체적으로는 상기 PEDV는 북 아케리카 기원이다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 상기 문장 중 어느 한 문장에서 기재된 바와 같으며, PDCoV의 1종 이상의 항원을 포함하고, 여기서, 상기 PDCoV는 북 아케리카 기원이다.
보다 일반적인 용어에서, 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지된 다양한 화학적 불활성화제는 바이러스를 불활성화시키는데 사용될 수 있다. 에틸렌이민 및 관련 유도체, 예를 들어, 바이너리 에틸렌이민 (BEI) 및 아세틸에틸렌이민은, PED 바이러스를 불활성화시키는데 사용하기에 적합한 화학적 불활성화제의 예이다. 기타 화학적 불활성화제, 예를 들어, 베타-프로피오락톤, 알데하이드 (예를 들어, 포름알데하이드) 및/또는 세제 (예를 들어, Tween® 세제, Triton® X 또는 알킬 트리메틸암모늄 염)도 또한 바이러스를 불활성화시키는데 사용될 수 있다. 불활성화는 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지된 표준 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 샘플을 주기적 시간 간격으로 수집하고, 잔류하는 생 바이러스에 대해 검정할 수 있다. 적절한 특정 단클론 또는 다클론 항체에 의한 적절한 세포주 및/또는 형광 염색에 미치는 세포병변 효과의 모니터링은, 잔류하는 생 바이러스의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
BEI에 의한 불활성화는 스톡 BEI 용액 (예를 들어, 0.1~0.2 M 2-브로모-에틸아민 하이드로브로마이드를 0.1~0.2 N 수성 NaOH에 첨가하여 형성된 용액)을 바이러스 유체와 약 1~5 mM BEI의 최종 농도로 배합함으로써 수행될 수 있다. 불활성화는 통상적으로 BEI-바이러스 혼합물을 24~72 시간 동안 일정하게 혼합하면서 35~40℃ (예를 들어, 37℃)에서 유지함으로써 수행된다. 바이러스 불활성화는 나트륨 티오설페이트 용액을 BEI 농도 초과의 최종 농도로 첨가한 후 (예를 들어, 과량의 BEI를 중화시키기 위해 17 부피%의 BEI에서 나트륨 티오설페이트를 첨가함), 혼합함으로써 중단될 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 일반적으로 아쥬반트 및, 목적에 따라, 불활성화/사멸 PEDV와 함께 도입되는 Tween® 세제와 같은 1종 이상의 유화제를 포함한다. 적합한 아쥬반트로는, 예를 들어, 비타민 E 아세테이트 피가용화물 (solubilisate), 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 옥사이드, (미네랄) 오일 에멀젼, 비이온성 세제, 스쿠알렌 및 사포닌이 포함된다. 사용될 수 있는 기타 아쥬반트로는 오일계 아쥬반트, 예를 들어, 프로인트 완전 아쥬반트 (Freund's complete adjuvant: FCA) 및 프로인트 불완전 아쥬반트 (Freund's incomplete adjuvant: FIA)가 포함된다. 가교된 올레핀계 불포화 카복실산 중합체, 예를 들어, 카보폴® 971 중합체는 본 발명의 불활성화 PEDV 면역원성 조성물에서 사용하는데 특히 적합한 아쥬반트인 것으로 밝혀졌다.
적합한 수중유형 에멀젼에 대한 예는 EMULSIGEN®계 아쥬반트, 예를 들어, EMULSIGEN® (수중유형 에멀젼), EMULSIGEN-D® (수중유형) (디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDA) 포함), EMULSIGEN-P® (수중유형) (등록 상표가 붙은 면역 자극제 포함), EMULSIGEN-75® (수중유형으로 구성된 이중 아쥬반트) (가교된 중합체 포함) 및 EMULSIGEN®-BCL (동물 기원 성분이 없는 수중유형 에멀젼)이다. (MVP Technologies, Inc. Omaha, Nebr., USA). 불활성화 PEDV 또는 재조합 PEDV 단백질을 포함하는 약제학적 조성물/백신 조성물에는, 사실상 수중유형 에멀젼, 바람직하게는 이러한 EMULSIGEN®계 아쥬반트, 보다 바람직하게는 EMULSIGEN® (동물 기원 성분이 없는 수중유형 에멀젼) 및 EMULSIGEN®-BCL (동물 기원 성분이 없는 수중유형 에멀젼)이 아쥬반트로 첨가된다.
투여의 용이성 및 용량의 균일성을 위해 본 발명의 조성물을 투여 단위 형태로 제형화하는 것이 일반적으로 유리하다. 본 출원에서 사용되는 바와 같은 투여 단위 형태는 치료되는 포유 동물 대상체를 위한 단일 투여량으로 맞춰진 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 나타내도록 계산된 소정량의 활성 물질을 함유한다. 불활성화/사멸 PDCoV 및/또는 PEDV, 및/또는 재조합적으로 발현된 PDCoV 및/또는 PEDV 항원의 투여 단위 형태에 대한 설명서는 (a) 활성 물질의 고유한 특징 및 달성되는 특정한 치료 효과; (b) 질병의 치료를 위해 이러한 활성 물질을 배합하는 당해 분야에 내재된 제한; 및 (c) 투여 단위 형태의 의도된 투여 방식과 같은 다른 인자에 의해 영향을 받거나 이에 좌우된다.
주요 활성 성분은 적합한 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 유효량으로 전형적으로 간편하고 효과적으로 투여하기 위해 본 출원에서 개시된 바와 같은 투여 단위 형태로 배합된다. 단위 투여 형태는, 예를 들어, PDCoV 및/또는 PEDV 항원을 1 내지 약 5 비역가 단위 (relative potency unit: "RPU") 범위의 양으로 함유할 수 있다. 이러한 양의 항원은 일반적으로 담체 1 ml 당 약 1 내지 약 25로 존재한다. 보충 활성 성분을 함유하는 조성물의 경우, 투여량은 보충 활성 성분의 일반적 용량 및 투여 방식을 참조하여 결정한다.
본 발명의 백신은 전형적으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된 불활성화 PDCoV 및/또는 PEDV를 포함한다. 주사용으로 적합한 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액과, 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 상기 제형은 바람직하게는 무균성이며, 용이한 주사기 주입성 (Syringeability)이 존재하는 정도의 유체이어야 한다. 투여 형태는 제조 및 저장의 조건하에 안정해야 하며, 전형적으로 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존된다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적절한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 하나의 가능한 담체는 생리 식염수이다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 (나트륨 에틸머큐리-티오살리실레이트), 데오마이신, 겐타마이신 등에 의해 달성될 수 있다. 다수의 경우, 등장화제, 예를 들어, 당류 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사가능한 조성물의 흡수 연장은, 목적에 따라, 흡수 지연제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 중에 사용하여 달성될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 목적하는 양의 불활성화 바이러스를 상기에서 열거된 바와 같은 다양한 다른 성분들과 함께 적절한 용매 중에 도입한 후, 필요에 따라, 여과 멸균시켜 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 활성 성분을 기본 분산 매질 및 상기에서 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클 내로 도입하여 제조될 수 있다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 및 이의 이전에 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.
안정화제를 본 발명의 조성물에 첨가하는 것이 또한 불활성화 바이러스의 안정화를 개선시키는데 유리할 수 있다. 적합한 안정화제로는, 예를 들어, 글리세롤/EDTA, 탄수화물 (예를 들어, 소르비톨, 만니톨, 트레할로오스, 전분, 수크로오스, 덱스트란 또는 글루코오스), 단백질 (예를 들어, 알부민 또는 카제인) 및 단백질 분해 생성물 (예를 들어, 부분 가수분해된 젤라틴)이 포함된다. 목적에 따라, 제형은 당해 분야에 공지된 방법에 의해, 알칼리 금속 포스페이트, 예를 들어, 나트륨 수소 포스페이트, 나트륨 이수소 포스페이트, 칼륨 수소 포스페이트 및/또는 칼륨 이수소 포스페이트와 같은 시약을 사용하여 완충될 수 있다. 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 기타 용매는 백신 제형 중 성분들의 용해도 및/또는 용액의 안정화를 증가시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 제형에서 사용될 수 있는 추가의 첨가제로는 통상적인 산화방지제 및 통상적인 킬레이트화제, 예를 들어, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA)가 포함된다.
본 발명의 조성물 및 방법을 하기 실시예에 의해 예시할 수 있는데, 이것은 본 발명을 예시하기 위해서 및 당해 분야의 통상의 기술자들이 어떻게 이를 제조하고 사용하는지를 교시하는데 도움을 주기 위해서 제시된다. 이들 실시예는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 좁히거나 그렇지 않으면 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 실시는, 달리 명시되지 않는다면, 당해 분야의 기술에 속하는, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 단백질 화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989)], [DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985)], [Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)], [Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)], [Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986)], [Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986)], [Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)], [the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)], [Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press)] 및 [Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)]을 참조한다.
본 발명은 특정한 DNA, RNA, 폴리펩타이드 서열 또는 공정 파라미터에 한정되지 않는다는 것을 이해해야 하는데, 이는 이러한 것들이 물론 다양할 수 있기 때문이다. 본 출원에서 사용되는 용어는 단지 본 발명의 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이며 한정되는 것으로 의도되지 않는다는 것을 또한 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는, 내용이 명백하게 달리 지시하지 않는다면, 복수에 대한 언급을 포함한다는 것에 주의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "항원"에 대한 지칭은 2종 이상의 항원의 혼합물을 포함하며, "부형제"에 대한 지칭은 2종 이상의 부형제의 혼합물을 포함하는 것 등을 들 수 있다.
정의:
달리 정의되지 않는다면, 본 출원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 출원시 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 용어의 의미 및 범위는 명확해야 하지만, 임의의 잠재적 모호성이 있는 경우에는 본 출원에 제공된 정의가 임의의 사전 또는 외부 정의에 우선한다. 또한, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는다면, 단수의 용어는 복수를 포함해야 하며, 복수의 용어는 단수를 포함해야 한다. 본 명세서에서, "또는"의 사용은, 달리 명시되지 않는다면, "및/또는"을 의미한다. 또한, "포함하는"이라는 용어 뿐만 아니라 "포함한다" 및 "포함되는"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 본 출원에서 언급되는 모든 특허 및 간행물은 본 출원에 참조로서 포함된다.
"질병에 대한 방어", "방어 면역", "기능성 면역" 및 유사한 문구들은, 질병 또는 감염에 노출된 비면역화된 대상체에서 예상되는 것보다 유해 효과가 더 적게 나타나는 본 발명의 1종 이상의 치료학적 조성물 또는 이의 조합의 투여에 의해 발생된 질병 또는 병태에 대한 반응을 의미한다. 즉, 감염의 유해 효과의 중증도는 백신접종된 대상체에서 완화된다. 백신접종된 대상체에서, 감염은 감소하거나, 느려지거나, 가능하게는 완전히 예방된다. 본 출원에서, 감염의 완전한 예방을 의미하는 경우, 이것은 구체적으로 명시된다. 완전한 예방이 명시되지 않는다면, 당해 용어는 부분적인 예방을 포함한다.
본 출원에서, "임상 징후의 발생 빈도 및/또는 중증도의 감소" 또는 "임상 증상의 감소"는, 야생형 감염과 비교하여, 그룹 내에서 감염된 대상체의 수를 감소시키거나, 감염의 임상 징후를 나타내는 대상체의 수를 감소 또는 제거하거나, 하나 이상의 대상체에 존재하는 임의의 임상 징후의 중증도를 감소시키는 것을 의미하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 이것은 병원체 부하, 병원체 배출의 임의의 감소, 병원체 전파의 감소 또는 PEDV 증상을 보이는 임의의 임상 징후의 감소를 지칭해야 한다. 바람직하게는, 이들 임상 징후는, 본 발명의 치료학적 조성물을 제공받지 않은 대상체와 비교하여, 상기 조성물을 제공받은 하나 이상의 대상체에서 적어도 10% 감소하여 감염된다. 보다 바람직하게는, 임상 징후는 본 발명의 조성물을 제공받은 대상체에서 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 50% 감소한다.
본 출원에서 사용되는 "증가된 방어"라는 용어는, 백신접종되지 않은 대상체 대조군에 비해 백신접종된 대상체 군에서 감염체, 바람직하게는 PDCoV 및/또는 PEDV에 의한 감염과 관련되는 1개 이상의 임상 증상의 통계학적으로 유의한 감소를 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. "임상 증상의 통계학적으로 유의한 감소"라는 용어는, 백신접종된 대상체 군에서 적어도 1개의 임상 증상의 발생 빈도가 감염체에 의한 시험감염 후에 백신접종되지 않은 대조군보다 적어도 10%, 바람직하게는 20%, 보다 바람직하게는 30%, 보다 더 바람직하게는 50%, 보다 더 바람직하게는 70% 더 낮다는 것을 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"오래 지속되는 방어"는 적어도 3주이지만, 보다 바람직하게는 적어도 3개월, 보다 더 바람직하게는 적어도 6개월 동안 지속되는 "개선된 효능"을 지칭한다. 가축의 경우에서, 오래 지속되는 방어는 동물이 고기용으로 판매되는 평균 연령까지 지속되는 것이 가장 바람직하다.
"면역원성 또는 면역학적 조성물"은 조성물에 대한 세포성 또는 항체-매개성 면역 반응의 숙주에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 1종의 돼지 델타코로나바이러스 및/또는 돼지 유행성 설사 바이러스 및/또는 또는 이들의 면역원성 부분을 포함하는 물질의 조성물을 지칭한다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 면역원성 조성물은 면역 반응을 유도하고, 보다 바람직하게는 PDCoV 및/또는 PEDV 감염의 1개 이상의 임상 징후에 대해 방어 면역을 부여한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 면역원성 조성물은 또한 본 출원에 기재된 PDCoV 및/또는 PEDV 스파이크 폴리펩타이드 중 어느 것을 포함하는 조성물을 지칭한다. 추가의 실시형태에 따르면, 이러한 면역원성 조성물은 상기 PDCoV 및/또는 PEDV 스파이크 단백질을 발현하는 바이러스 벡터, 바람직하게는 재조합 바큘로바이러스의 적어도 일부를 추가로 포함한다. 더욱이, 면역원성 조성물은 i) 바람직하게는 상기에서 기재된 농도의 상기에서 기재된 PDCoV 또는 PEDV 단백질 중 어느 것, ii) 상기 PDCoV 및/또는 PEDV 스파이크 단백질을 발현하는 바이러스 벡터, 바람직하게는 재조합 바큘로바이러스의 적어도 일부, 및 iii) 세포 배양 상청액의 부분을 포함할 수 있다.
따라서, 하나의 양태에 따르면, 본 발명은 유효량의 PDCoV 및/또는 PEDV 스파이크 항원 또는 PDCoV 및/또는 PEDV 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 상기 돼지(들)에게 투여하는 단계를 포함하는 돼지의 무리에서 PDCoV 및/또는 PEDV 감염의 백분율을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서, 상기 PDCoV 및/또는 PEDV 항원은 재조합 PDCoV 및/또는 PEDV 스파이크 항원, 바람직하게는 바큘로바이러스 발현된 PDCoV 및/또는 PEDV 스파이크 단백질이다. 바람직하게는, 이들 재조합 또는 바큘로바이러스 발현된 PDCoV 및/또는 PEDV 스파이크는 본 출원에 기재된 바와 같은 서열을 갖는다.
"면역 반응" 또는 "면역학적 반응"은 관심 대상의 조성물 또는 백신에 대한 세포성 및/또는 항체-매개성 면역 반응의 발생을 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, 면역 또는 면역학적 반응은 다음 효과 중 1개 이상을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다: 관심 대상 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 특이적으로 유도된, 항체, B 세포, 헬퍼 T-세포, 억제 T-세포 및/또는 세포독성 T-세포의 생성 또는 활성화. 바람직하게는, 숙주는 새로운 감염에 대한 내성이 증진되고/되거나 질병의 임상적 중증도가 감소하도록 치료적인 또는 방어적인 면역학적 (기억) 반응을 나타낼 것이다. 이러한 방어는 증상의 수, 증상의 중증도의 감소 또는 병원체의 감염과 관련된 증상 중 1개 이상의 결핍, 바이러스혈증의 발병 지연, 바이러스의 지속성 감소, 전반적인 바이러스 부하의 감소 및/또는 바이러스 배출의 감소에 의해 입증될 것이다.
항원의 "면역학적 방어량" 또는 "면역학적 유효량" 또는 "면역 반응을 일으키는 유효량"은 수용자에서 면역원성 반응을 유도하는데 효과적인 양이다. 면역원성 반응은 진단 목적 또는 기타 시험에 충분할 수 있거나, 질병 인자에 의한 감염에 기인하는, 유해한 건강 영향 또는 이의 합병증을 비롯한 질병의 징후 또는 증상을 예방하기에 충분할 수 있다. 체액성 면역 또는 세포-매개성 면역 또는 둘 다가 유도될 수 있다. 면역원성 조성물에 대한 동물의 면역원성 반응은, 예를 들어, 항체 역가의 측정, 림프구 증식 검정을 통해 간접적으로 평가되거나, 야생형 바이러스주에 의한 시험감염 후 징후 및 증상의 모니터링을 통해 직접적으로 평가될 수 있는 반면, 백신에 의해 부여된 방어 면역은, 예를 들어, 대상체의 사망률, 이환율, 온도 수치, 전반적인 신체 상태 및 전반적인 건강 및 수행과 같은 임상 징후의 감소를 측정함으로써 평가될 수 있다. 면역 반응은 세포성 및/또는 체액성 면역의 유도를 포함할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. "면역원성"은 면역 반응 또는 항원 반응을 일으키는 것을 의미한다. 따라서, 면역원성 조성물은 면역 반응을 유도하는 임의의 조성물일 것이다.
"치료학적 유효량"은 바이러스 또는 세균과 같은 병원체에 의한 감염에 기인하는, 유해한 건강 영향 또는 이의 합병증을 비롯한 질병의 임상 징후 또는 증상을 예방 또는 감소시키는데 충분한 항원 또는 백신을 투여받는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 항원 또는 백신의 양을 지칭한다. 체액성 면역 또는 세포-매개성 면역 또는 체액성 면역과 세포-매개성 면역 둘 다가 유도될 수 있다. 백신에 대한 동물의 면역원성 반응은, 예를 들어, 항체 역가의 측정, 림프구 증식 검정을 통해 간접적으로 평가되거나, 야생형 바이러스주에 의한 시험감염 후 징후 및 증상의 모니터링을 통해 직접적으로 평가될 수 있다. 백신에 의해 부여된 방어 면역은, 예를 들어, 대상체의 사망률, 이환율, 온도 수치, 전반적인 신체 상태 및 전반적인 건강 및 수행과 같은 임상 징후의 감소를 측정함으로써 평가될 수 있다. 치료학적으로 유효한 백신의 양은 사용되는 특정 아쥬반트, 사용되는 특정 항원 또는 대상체의 병태에 따라 달라질 수 있으며, 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체"로는 임의의 용매 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 아쥬반트, 안정화제, 희석제, 보존제, 항균제, 항진균제, 등장화제, 흡착 지연제 등이 포함된다. 일부의 바람직한 실시형태, 특히 동결 건조된 면역원성 조성물을 포함하는 것들에서, 본 발명에 사용하기 위한 안정화제로는 동결 건조 또는 냉동 건조용 안정화제가 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 아쥬반트를 함유한다. 본 출원에서 사용되는 "아쥬반트"로는 알루미늄 하이드록사이드 및 알루미늄 포스페이트, 사포닌,, 예를 들어, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), 유중수형 에멀젼, 수중유형 에멀젼, 수중유중수형 에멀젼이 포함될 수 있다.
에멀젼은 특히 경질 액체 파라핀 오일 (유럽 약전 타입); 스쿠알란 또는 스쿠알렌과 같은 이소프레노이드 오일; 알켄, 특히, 이소부텐 또는 데센의 올리고머화에 의해 생성되는 오일; 선형 알킬기를 함유하는 산 또는 알코올의 에스테르, 보다 특히, 식물 오일, 에틸 올리에이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올리에이트; 분지형 지방산 또는 알코올의 에스테르, 특히, 이소스테아르산 에스테르를 기본으로 할 수 있다. 오일은 유화제와 함께 사용되어 에멀젼을 형성한다. 유화제로는 바람직하게는 비이온성 계면활성제, 특히, 소르비탄의 에스테르, 만나이드의 에스테르 (예를 들어, 안하이드로만니톨 올리에이트), 글리콜의 에스테르, 폴리글리세롤의 에스테르, 프로필렌 글리콜의 에스테르 및 올레산, 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르 (이들은 임의로 에톡시화된다), 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 특히, 플루로닉 (Pluronic) 제품, 특히, L121이 있다. 문헌 [Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995)] 및 [Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)]을 참조한다. 예시적인 아쥬반트로는 문헌 ["Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995]의 147 페이지에 기재된 SPT 에멀젼 및 동 문헌의 183 페이지에 기재된 MF59 에멀젼이 있다.
적합한 수중유형 에멀젼에 대한 예로는 EMULSIGEN®계 아쥬반트, 예를 들어, EMULSIGEN® (수중유형 (o/w) 에멀젼), EMULSIGEN-D® (수중유형 (o/w)) (디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDA) 포함), EMULSIGEN-P® (수중유형 (o/w)) (등록 상표가 붙은 면역 자극제 포함), EMULSIGEN-75® (수중유형 (o/w)으로 구성된 이중 아쥬반트) (가교된 중합체 포함) 및 EMULSIGEN®-BCL (동물 기원 성분이 없는 수중유형 에멀젼)이다. (MVP Laboratories, Inc. Omaha, Nebr., USA). 불활성화 PDCoV, 불활성화 PEDV 및/또는 재조합 PDCoV 및/또는 PEDV 단백질을 포함하는 약제학적 조성물/백신 조성물에는, 사실상 수중유형 에멀젼, 바람직하게는 이러한 EMULSIGEN®계 아쥬반트, 보다 바람직하게는 EMULSIGEN® (수중유형 (o/w) 에멀젼) 및/또는 EMULSIGEN®-BCL (동물 기원 성분이 없는 수중유형 에멀젼)이 아쥬반트로 첨가된다.
수의학적 백신에서 사용하기에 적합한 흡착성 알루미늄 하이드록사이드 겔의 예로는 EHYDRAGEL®, REHYDRAGEL-CG®; REHYDRAGEL-LV; REHYDRAGEL-HPA; REHYDRAPHOS (General Chemical, Berkeley Heights, New Jersey, USA)가 포함된다.
아쥬반트의 추가의 예로는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체, 및 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체로부터 선택되는 화합물이 있다. 유리한 아쥬반트 화합물은 가교되는 아크릴산 또는 메타크릴산과 특히 당류 또는 다가 알코올의 폴리알케닐 에테르의 중합체이다. 이들 화합물은 카보머라는 용어로 공지되어 있다 (문헌 [Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996]). 당해 분야의 통상의 기술자들은 또한 적어도 3개, 바람직하게는 8개 이하의 하이드록실기를 갖는 폴리하이드록실화 화합물과 가교되고, 적어도 3개의 하이드록실기의 수소 원자가 적어도 2개의 탄소 원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼로 대체되어 있는 상기 아크릴계 중합체를 기재하고 있는 미국 특허 US 2,909,462를 참조할 수 있다. 바람직한 라디칼로는 2 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 라디칼, 예를 들어, 비닐, 알릴 및 기타 에틸렌계 불포화기가 있다. 불포화 라디칼은 그 자체에 메틸과 같은 다른 치환체를 함유할 수 있다. 카보폴.RTM. (폴리아크릴산으로도 또한 공지됨) (BF Goodrich, Ohio, USA)의 명칭으로 시판되는 제품이 특히 적절하다. 이들은 알릴 수크로오스 또는 알릴 펜타에리트리톨과 가교되어 있다. 이들 중에서도, CARBOPOL.RTM. 974P (폴리아크릴산으로도 또한 알려짐), CARBOPOL.RTM. 934P (폴리아크릴산으로도 또한 알려짐) 및 CARBOPOL.RTM. 971P (폴리아크릴산으로도 또한 알려짐)가 언급될 수 있다. CARBOPOL.RTM. 971P (폴리아크릴산으로도 또한 알려짐)가 가장 바람직하다. 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체 중에서도, 말레산 무수물과 에틸렌의 공중합체인 EMA (Monsanto) 공중합체가 있다. 이들 중합체가 물에 용해되면, 면역원성 조성물, 면역학적 조성물 또는 백신 조성물 자체가 도입될 아쥬반트 용액을 수득하기 위해서는 중화될 산 용액이 바람직하게는 생리학적 pH로 생성된다.
추가의 적절한 아쥬반트로는 다수의 다른 것들 중에서도 RIBI 아쥬반트 시스템 (Ribi Inc.), 블록 공중합체 (CytRx, Atlanta Ga.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), 모노포스포릴 지질 A, 아비리딘 지질-아민 아쥬반트, 이. 콜라이 (재조합체 또는 기타)로부터 유래된 열-불안정성 장독소, 콜레라 독소, 무라밀 디펩타이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
아쥬반트는 용량 당 약 100 μg 내지 약 10 mg의 양으로, 바람직하게는 용량 당 약 100 μg 내지 약 10 mg의 양으로, 보다 바람직하게는 용량 당 약 500 μg 내지 약 5 mg의 양으로, 보다 더 바람직하게는 용량 당 약 750 μg 내지 약 2.5 mg의 양으로, 가장 바람직하게는 용량 당 약 1 mg의 양으로 첨가될 수 있는 것으로 예상된다. 그렇지 않으면, 아쥬반트는 최종 생성물의 약 0.01 부피% 내지 50 부피%의 농도, 바람직하게는 약 2 부피% 내지 30 부피%의 농도, 보다 바람직하게는 약 5 부피% 내지 25 부피%의 농도, 보다 더 바람직하게는 약 7 부피% 내지 약 22 부피%의 농도, 가장 바람직하게는 10 부피% 내지 20 부피%의 농도로 존재할 수 있다.
"희석제"로는 물, 식염수, 덱스트로오스, 에탄올, 글리세롤 등이 포함될 수 있다. 등장화제로는 특히 염화나트륨, 덱스트로오스, 만니톨, 소르비톨 및 락토오스가 포함될 수 있다. 안정화제로는 특히 알부민 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리염이 포함된다.
"분리된"은 자연 상태로부터 "사람의 수작업에 의해" 변화되는 것으로 의미하며, 즉, 자연에서 발생한다면 원래 환경으로부터 변화 또는 제거되거나, 변화 및 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 생물체에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 "단리되지" 않지만, 자연 상태의 공존 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 상기 용어가 본 출원에서 사용되는 바와 같이 "단리된다".
"안전성"은, 다음을 포함하는, 백신접종 후에 백신접종된 동물에서 유해한 결과의 부재를 지칭하지만, 이에 한정되는 것은 아니다: 바이러스 기반 백신의 병독성으로의 잠재적 복귀, 임상적으로 유의한 부작용, 예를 들어, 백신 투여 부위에서의 지속적인 전신 질환 또는 용납불가능한 염증.
본 출원에서 사용되는 "백신접종" 또는 "백신접종하는"이라는 용어 또는 이의 변형태는, 동물에게 투여될 때, PDCoV 및/또는 PEDV에 대해 상기 동물에서 면역 반응을 - 직접적으로 또는 간접적으로 - 유도하거나 유도할 수 있는 본 발명의 면역원성 조성물의 투여를 포함하는 방법을 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 맥락에서, "사망률"은 PDCoV 감염, PEDV 감염 및/또는 PDCoV 및 PEDV에 의한 공동 감염에 기인하는 사망을 지칭하며, 상기 감염이 너무 심각하여 동물을 안락사시켜 고통을 방지하고 생명에 인도적 결말을 제공하는 상황을 포함한다.
본 출원에서, "유효 용량"은, 항원이 투여되는 동물에서 임상 증상의 감소를 제공하는 면역 반응을 유도하거나 유도할 수 있는 항원의 양을 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"서열 동일성"은 당해 분야에서 공지된 바와 같이 2개 이상의 폴리펩타이드 서열들 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열들, 즉, 기준 서열과 기준 서열과 비교되는 주어진 서열 사이의 관계를 지칭한다. 서열 동일성은, 이러한 서열들의 줄 사이의 일치로 결정될 때, 최고 수준의 서열 유사성을 생성하기 위해 서열을 최적으로 정렬한 후에, 주어진 서열을 기준 서열과 비교함으로써 결정된다. 이러한 정렬시, 서열 동일성은 위치별 기반으로 확인되며, 예를 들어, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 특정 위치에서 동일하면, 서열은 해당 위치에서 "동일하다". 이어서, 이러한 위치 동일성의 총 수를 기준 서열 중의 뉴클레오타이드 또는 잔기의 총 수로 나누어 % 서열 동일성을 수득한다. 서열 동일성은, 다음 문헌에 기재된 것들을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 공지된 방법에 의해 용이하게 산정될 수 있으며, 이들 문헌의 교시 내용은 본 출원에 참조로 포함된다: 문헌 [Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988)], [Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993)], [Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)], [Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)], [Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991)] 및 [Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)]. 서열 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험되는 서열들 사이에서 최대 일치를 제공하도록 설계된다. 서열 동일성을 결정하기 위한 방법은 주어진 서열들 사이의 서열 동일성을 결정하는 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램으로 명문화되어 있다. 이러한 프로그램의 예로는 GCG 프로그램 패키지 (문헌 [Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)]), BLASTP, BLASTN 및 FASTA (문헌 [Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)])가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. BLAST 프로그램은 NCBI 및 다른 출처로부터 공개적으로 이용가능하다 (문헌 [BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894], [Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)], 이들 문헌의 교시 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다). 이들 프로그램은 주어진 서열과 기준 서열
사이에 최고 수준의 서열 동일성을 생성하기 위해 디폴트 갭 가중치를 사용하여 서열을 최적으로 정렬한다. 한 예시로서, 기준 뉴클레오타이드 서열과, 예를 들어, 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 보다 더 바람직하게는 95%의 "서열 동일성"을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오타이드에서, 주어진 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열가 기준 서열과 동일하지만, 주어진 폴리뉴클레오타이드 서열이 기준 뉴클레오타이드 서열의 각 100개의 뉴클레오타이드 당 15개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 보다 더 바람직하게는 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있는 것으로 의도된다. 환언하면, 기준 뉴클레오타이드 서열에 비해 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 보다 더 바람직하게는 95%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오타이드에서, 기준 서열 내의 뉴클레오타이드의 15%, 바람직하게는 10%, 보다 더 바람직하게는 5% 이하가 또 다른 뉴클레오타이드로 치환 또는 결실될 수 있거나, 기준 서열 내의 총 뉴클레오타이드의 15%, 바람직하게는 10%, 보다 더 바람직하게는 5% 이하의 뉴클레오타이드 수가 기준 서열 내로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이러한 돌연변이는 기준 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 이러한 말단 위치들 사이에 어디에서나 일어날 수 있거나, 기준 서열 내의 뉴클레오타이드들 중에서 개별적으로 또는 기준 서열 내에서 1개 이상의 연속 그룹으로 산발적으로 일어날 수 있다. 유사하게, 기준 아미노산 서열과, 예를 들어, 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 보다 더 바람직하게는 95%의 서열 동일성을 갖는 주어진 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩타이드에서, 폴리펩타이드의 주어진 아미노산 서열이 기준 서열과 동일하지만, 주어진 폴리펩타이드 서열이 기준 아미노산 서열의 각 100개의 아미노산 당 15개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 보다 더 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있는 것으로 의도된다. 환언하면, 기준 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 보다 더 바람직하게는 95%의 서열 동일성을 갖는 주어진 폴리펩타이드 서열을 수득하기 위해, 기준 서열 내의 아미노산 잔기의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 더 바람직하게는 5% 이하가 또 다른 아미노산으로 치환 또는 결실될 수 있거나, 기준 서열 내의 아미노산 잔기의 총 수의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 더 바람직하게는 5% 이하의 아미노산 수가 기준 서열 내로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이러한 변경은 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카복시 말단 위치에서 또는 이러한 말단 위치들 사이에 어디에서나 일어날 수 있거나, 기준 서열 내의 잔기들 중에서 개별적으로 또는 기준 서열 내에서 1개 이상의 연속 그룹으로 산발적으로 일어날 수 있다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치들은 보존적 아미노산 치환에 의해 달라진다. 하지만, 보존적 치환은 서열 동일성을 결정할 때 일치로서 포함되지 않는다.
"보존적 치환"은, 전반적인 기능성을 유의하게 변화시키지 않도록 하는 아미노산 잔기의 치환 또는 크기, 소수성 등을 비롯한 유사한 특징 또는 특성을 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의한 치환을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "서열 상동성"은 보존적 치환들을 무시하는 2개의 서열들의 관련성을 결정하는 방법을 지칭한다. 서열 상동성을 결정하기 위해, 2개 이상의 서열을 최적으로 정렬하고, 필요에 따라, 갭을 도입한다. 환언하면, 기준 아미노산 서열과 95%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 수득하기 위해, 기준 서열 내의 아미노산 잔기 중 85%, 바람직하게는 90%, 보다 더 바람직하게는 95%가 일치하거나 또 다른 아미노산에 의한 보존적 치환을 포함해야 하거나, 기준 서열 내의 보존적 치환을 포함하지 않는 총 아미노산 잔기 중 15% 이하, 바람직하게는 10%, 보다 더 바람직하게는 5% 이하의 아미노산 수를 기준 서열 내로 삽입될 수 있다. 동족체 서열은 바람직하게는 적어도 50개, 보다 더 바람직하게는 100개, 보다 더 바람직하게는 250개, 보다 더 바람직하게는 500개의 아미노산의 스트레치 (stretch)를 포함한다.
"서열 상동성" 또는 "% 동일성"이라는 용어는 본 출원에서 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 % 동일성을 결정하기 위해서는 서열을 최적의 비교 목적을 위해 정렬시킨다는 것이 본 출원에서 정의된다 (예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산의 서열에 갭을 도입할 수 있다). 이어서, 상응하는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 또는 뉴클레오타이드 잔기들을 비교한다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 또는 뉴클레오타이드 잔기에 의해 점유될 때, 분자들은 해당 위치에서 동일하다. 2개의 서열들 사이의 % 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 (즉, 중첩 위치) × 100). 바람직하게는, 2개의 서열들은 동일한 길이이다. 서열 동일성이 단백질에 관하여 사용되는 경우, 동일하지 않은 잔기 위치는 종종 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하며, 여기서, 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성 (예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기 대신에 치환되므로, 분자의 기능적 특성을 변화시키지 않는 것으로 인식된다. 서열이 서로 보존적 치환에서 상이할 때, % 서열 동일성은 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조정될 수도 있다. 이러한 보존적 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는 것으로 언급된다.
서열 비교는 비교하고자 하는 2개의 서열의 전체 길이 또는 2개의 서열의 단편에 대해 수행될 수 있다. 전형적으로, 비교는 비교하고자 하는 2개의 서열의 전체 길이에 대해 수행될 것이다. 그러나, 서열 동일성은, 예를 들어, 20, 50, 100개 또는 그 이상의 연속 아미노산 잔기의 영역에 걸쳐 수행될 수 있다.
통상의 기술자는 2개의 서열 사이의 상동성을 결정하기 위해 여러 가지 상이한 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다는 사실을 인식할 것이다. 예를 들어, 2개의 서열 사이의 서열의 비교 및 % 동일성의 측정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 2개의 아미노산 또는 핵산 서열들 사이의 % 동일성은 Accelrys GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.accelrys.com/products/gcg/에서 이용가능)의 GAP 프로그램 내에 통합된 니들만 및 운치 알고리즘 (문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)])을 사용하고, Blosum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 결정한다. 통상의 기술자라면, 이러한 모든 상이한 파라미터가 약간 상이한 결과를 산출하지만, 2개의 서열들의 전반적인 % 동일성이 상이한 알고리즘을 사용할 때 유의하게 변화되지 않는다는 것을 인식할 것이다.
본 발명의 단백질 서열 또는 핵산 서열은, 예를 들어, 다른 계열 구성원 또는 관련 서열을 확인하기 위해서 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 추가로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 BLASTN 및 BLASTP 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해 BLASTP 프로그램, 스코어 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 수득하기 위해, Gapped BLAST는 문헌 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, BLASTP 및 BLASTN)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/에 있는 미국 국립생물정보센터 (National Center for Biotechnology Information)의 홈페이지를 참조한다.
본 발명의 청구된 PEDV는 또한 PEDV 분리주 1251-125-10 ("125-10")의 변이체 및 이의 하위 단편의 변이체를 포괄해야 한다. 이러한 변이체는 오클라호마 바이러스주 (서열 번호 29 및 34)의 특징과 본질적으로 동일한 면역학적 특징을 갖는다. "본질적으로 동일한 면역학적 특성을 갖는"이라는 용어는, 상기 변이체가 하기에 기재되는 바와 같은 PEDV에 기인하는 임상 징후를 치료 또는 예방하거나 하기에 기재되는 바와 같은 효능 파라미터를 개선하는데 본질적으로 효과적이다는 것을 포괄한다 (이에 한정되는 것은 아니다).
본 발명의 청구된 PDCoV는 또한 PDCoV 분리주 NSVL, PDCoV 2.0307 및 PDCoV 5.0327의 변이체 및 이의 하위 단편의 변이체를 포괄해야 한다. 이러한 변이체는 NSVL 바이러스주 (서열 번호 1 및 2) 및 분리주 PDCoV 2.0307 (서열 번호 5 및 6) 및 PDCoV 5.0327 (서열 번호 9 및 10)의 특징과 본질적으로 동일한 면역학적 특성을 갖는다. "본질적으로 동일한 면역학적 특성을 갖는"이라는 용어는, 상기 변이체가 본 출원에서 기재된 바와 같은 PDCoV에 기인하는 임상 징후를 치료 또는 예방하거나 본 출원에 기재된 바와 같은 효능 파라미터를 개선하는데 본질적으로 효과적이다는 것을 포괄한다 (이에 한정되는 것은 아니다). 백신에 사용될 수 있는 다양한 PDCoV 바이러스주 이외에, 이의 하위 단편을 비롯한 재조합 SPIKE 단백질 항원도 또한 백신에 사용될 수 있다. 마찬가지로, 예시적인 스파이크 단백질 서열은 PDCoV 분리주 또는 하기에 열거된 "변이체"의 본질적으로 동일한 면역학적 특성을 갖는 것들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
PDCoV 서열 (서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 17, 18, 27 및 28) 또는 PEDV 서열 (서열 번호 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 46, 47, 52 및 53) (예를 들어, 폴리펩타이드 또는 핵산 서열)에 관하여 "변이체"라는 용어는 실질적으로 유사한 서열을 의미하는 것을 의도된다. 오픈 리딩 프레임을 포함하는 뉴클레오타이드 서열의 경우, 변이체는 유전 암호의 축퇴로 인해 원래 단백질의 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 이들 서열을 포함한다. 변이체 뉴클레오타이드 서열은 또한, 예를 들어, 부위 특이적 돌연변이유발을 사용하여 생성되고 오픈 리딩 프레임의 경우에는 원래의 단백질을 암호화하는 것들 뿐만 아니라 코돈 최적화를 목적으로 원래의 단백질에 관하여 아미노산 치환을 갖는 폴리펩타이드 암호화하는 것들과 같이 합성으로 유도된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 변이체는 표준 파라미터를 사용하여 기술된 정렬 프로그램 중 1개를 사용하여 기준 서열과 비교하여 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 또는 89%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93% 또는 94%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 96.1%, 96.2%, 96.3%, 96.4%, 96.5%, 96.6%, 96.7%, 96.8%, 96.9%, 97%, 97.1%, 97.2%, 97.3%, 97.4%, 97.41%, 97.42%, 97.43%, 97.44%, 97.45%, 97.46%, 97.47%, 97.48%, 97.49%, 97.5%, 97.51%, 97.52%, 97.53%, 97.54%, 97.55%, 97.56%, 97.57%, 97.58%, 97.59%, 97.6%, 97.61%, 97.62%, 97.63%, 97.64%, 97.65%, 97.66%, 97.67%, 97.68%, 97.69% 97.7%, 97.71%, 97.72%, 97.73%, 97.74%, 97.75%, 97.76%, 97.77%, 97.78%, 97.79%, 97.8%, 97.81%, 97.82%, 97.83%, 97.84%, 97.85%, 97.86%, 97.87%, 97.88%, 97.89%, 97.9%, 97.91%, 97.92%, 97.93%, 97.94%, 97.95%, 97.96%, 97.97%, 97.98%, 97.99%, 98%, 98.01%, 98.02%, 98.03%, 98.04%, 98.05%, 98.06%, 98.07%, 98.08%, 98.09%, 98.1%, 98.11%, 98.12%, 98.13%, 98.14%, 98.15%, 98.16%, 98.17%, 98.18%, 98.19%, 98.2%, 98.21%, 98.22%, 98.23%, 98.24%, 98.25%, 98.26%, 98.27%, 98.28%, 98.29%, 98.3%, 98.31%, 98.32%, 98.33%, 98.34%, 98.35%, 98.36%, 98.37%, 98.38%, 98.39%, 98.4%, 98.41%, 98.42%, 98.43%, 98.44%, 98.45%, 98.46%, 98.47%, 98.48%, 98.49%,98.5%, 98.51%, 98.52%, 98.53%, 98.54%, 98.55%, 98.56%, 98.57%, 98.58%, 98.59%, 98.6%, 98.61%, 98.62%, 98.63%, 98.64%, 98.65%, 98.66%, 98.67%, 98.68%, 98.69%, 98.7%, 98.71%, 98.72%, 98.73%, 98.74%, 98.75%, 98.76%, 98.77%, 98.78%, 98.79%, 98.8%, 98.81%, 98.82%, 98.83%, 98.84%, 98.85%, 98.86%, 98.87%, 98.88%, 98.89%, 98.9%, 98.91%, 98.92%, 98.93%, 98.94%, 98.95%, 98.96%, 98.97%, 98.98%, 98.99%, 99%, 99.01%, 99.02%, 99.03%, 99.04%, 99.05%, 99.06%, 99.07%, 99.08%, 99.09%, 99.1% , 99.11%, 99.12%, 99.13%, 99.14%, 99.15%, 99.16%, 99.17%, 99.18%, 99.19%, 99.2%, 99.21%, 99.22%, 99.23%, 99.24%, 99.25%, 99.26%, 99.27%, 99.28%, 99.29%, 99.3%, 99.31%, 99.32%, 99.33%, 99.34%, 99.35%, 99.36%, 99.37%, 99.38%, 99.39%, 99.4%, 99.41%, 99.42%, 99.43%, 99.44%, 99.45%, 99.46%, 99.47%, 99.48%, 99.49%, 99.5%, 99.51%, 99.52%, 99.53%, 99.54%, 99.55%, 99.56%, 99.57%, 99.58%, 99.59%, 99.6%,99.61%, 99.62%, 99.63%, 99.64%, 99.65%, 99.66%, 99.67%, 99.68%, 99.69%, 99.7%, 99.71%, 99.72%, 99.73%, 99.74%, 99.75%, 99.76%, 99.77%, 99.78%, 99.79%, 99.8%, 99.81%, 99.82%, 99.83% 99.84%, 99.85%, 99.86%, 99.87%, 99.88%, 99.89%, 99.9%, 99.91%, 99.92%, 99.93%, 99.94%, 99.95%, 99.96%, 99.97%, 99.98% 및 99.99%의 서열 동일성을 가질 것이다.
PDCoV 서열 (서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 17, 18, 27 및 28) (예를 들어, 폴리펩타이드 또는 핵산 서열)에 관하여 "변이체"라는 용어는 실질적으로 유사한 서열을 의미하는 것을 의도된다. 따라서,　본　발명의 면역원성 조성물은 바람직하게는 GenBank 수탁 번호 KP981395.1로서 기탁된 분리주 NSVL-SCDV (돼지 델타코로나바이러스주 USA/IL/2014/026PDV_P11); GenBank 수탁 번호 KP757890으로서 기탁된 분리주 CHN-AH-2004; GenBank 수탁 번호 KP757891로서 기탁된 분리주 CHN-HB-2014; GenBank 수탁 번호 KP757892로서 기탁된 분리주 CHN-JS-2014; GenBank 수탁 번호 KR131621로서 기탁된 분리주 PDCoV/CHJXNI2/2015; GenBank 수탁 번호 KR150443으로서 기탁된 바이러스주 USA/아칸소61/2015; GenBank 수탁 번호 KR265847로서 기탁된 바이러스주 USA/미네소타442/2014; GenBank 수탁 번호 KR265848로서 기탁된 바이러스주 USA/미네소타214/2014; GenBank 수탁 번호 KR265849로서 기탁된 바이러스주 USA/미시간447/2014; GenBank 수탁 번호 KR265850으로서 기탁된 바이러스주 USA/미시간448/2014; GenBank 수탁 번호 KR265851로서 기탁된 바이러스주 USA/인디애나453/2014; GenBank 수탁 번호 KR265852로서 기탁된 바이러스주 USA/일리노이449/2014; GenBank 수탁 번호 KR265853으로서 기탁된 바이러스주 USA/미네소타/2013; GenBank 수탁 번호 KR265854로서 기탁된 바이러스주 USA/미네소타454/2014; GenBank 수탁 번호 KR265855로서 기탁된 바이러스주 USA/미네소타455/2014; GenBank 수탁 번호 KR265856으로서 기탁된 바이러스주 USA/일리노이272/2014; GenBank 수탁 번호 KR265857로서 기탁된 바이러스주 USA/일리노이273/2014; GenBank 수탁 번호 KR265858로서 기탁된 바이러스주 USA/노스캐롤라이나452/2014; GenBank 수탁 번호 KR265859로서 기탁된 바이러스주 USA/미네소타159/2014; GenBank 수탁 번호 KR265860으로서 기탁된 바이러스주 USA/네브래스카209/2014; GenBank 수탁 번호 KR265861로서 기탁된 바이러스주 USA/네브래스카210/2014; GenBank 수탁 번호 KR265862로서 기탁된 바이러스주 USA/오하이오444/2014; GenBank 수탁 번호 KR265863으로서 기탁된 바이러스주 USA/오하이오445/2014; GenBank 수탁 번호 KR265864로서 기탁된 바이러스주 USA/미네소타292/2014; GenBank 수탁 번호 KR265865로서 기탁된 바이러스주 USA/아이오와459/2014; GenBank 수탁 번호 KT021234로서 기탁된 바이러스주 CH/SXD1/2015; GenBank 수탁 번호 KT266822로서 기탁된 바이러스주 CH/쓰촨/S27/2012; GenBank 수탁 번호 KT336560으로서 기탁된 분리주 CHN-HN-2014; GenBank 수탁 번호 KU051641로서 기탁된 바이러스주 PDCoV/돼지/태국/S5011/2015; GenBank 수탁 번호 KU051649로서 기탁된 바이러스주 PDCoV/돼지/태국/S5015L/2015; GenBank 수탁 번호 KU981059로서 기탁된 바이러스주 NH; GenBank 수탁 번호 KU981060으로서 기탁된 바이러스주 NH 0번 계대 분리주; GenBank 수탁 번호 KU981061로서 기탁된 NH 5번 계대 분리주; GenBank 수탁 번호 KU981062로서 기탁된 바이러스주 NH 10번 계대 분리주; GenBank 수탁 번호 KU984334로서 기탁된 분리주 TT_1115; GenBank 수탁 번호 KX022602로서 기탁된 바이러스주 PDCoV/USA/아이오와136/2015; GenBank 수탁 번호 KX022603으로서 기탁된 바이러스주 PDCoV/USA/미네소타140/2015; GenBank 수탁 번호 KX022604로서 기탁된 바이러스주 PDCoV/USA/네브래스카137/2015; GenBank 수탁 번호 KX022605로서 기탁된 바이러스주 PDCoV/USA/네브래스카145/2015; 및 GenBank 수탁 번호 KX118627로서 기탁된 분리주 P1_16_BTL_0115/PDCoV/2016/Lao와 적어도 약 90%의 전체 뉴클레오타이드 동일성을 갖는 모든 바이러스주를 포함하지만 이에 반드시 한정되지 않는, PDCoV의 모든 인정된 바이러스 주 또는 분리주를 효과적으로 도입할 수 있다.
"유전자군"이라는 용어는 당해 분야에 공지된 바와 같이 속 (genus) 내의 관련된 바이러스를 지칭하며, 이는 유전적 클러스터로 추가로 세분될 수 있다. PEDV의 확인된 유전자군은 하위군 G1a, G1b, R (약독화/조작됨)을 포함하는 그룹 G1; 및 하위군 G2a 및 G2b를 포함하는 G2를 포함한다. G2a 유전자군의 구성원은 수개의 고유한 뉴클레오타이드 변화를 공유하는 중국 바이러스주 AH2012 (GenBank 수탁 번호 KC210145) 및 북 아메리카 바이러스주를 포함한다. 바이러스주 MN 및 IA2는 각각 AH2012와 99.6%의 뉴클레오타이드 동일성을 가지며, 바이러스주 IA1은 99.5%의 뉴클레오타이드 동일성을 갖는다. 연구자들은, AH2012-유사 바이러스가 가능하게는 동중국 지역으로 전염된 다음, 미국으로 운반되고, 아마도 북 아메리카 바이러스주와 가장 밀접한 조상인 것으로 추측하였다. 유전자군 2a의 구성원들은 유전자군 1a의 프로토타입 PEDV 바이러스주 CV777과 단지 대략 96.9%의 유사성을 공유한다 (문헌 [Bridgen, et al., 1993], [Huang et al., 2013], GenBank: AF353511.1). 이와 같이, 역사적인 CV777-유도된 G1a 바이러스주 또는 DR13-유도된 G1b 바이러스주를 기반으로 하는 약독화 PEDV 백신은, 새로운 신생 중국 및 북 아메리카 G2a PEDV 바이러스주와 항원적으로 덜 관련될 수 있다.
밀접하게 관련된 북 아메리카 PEDV 분리주 US/콜로라도/2013 (GenBank 수탁 번호 KF272920.1)도 또한 마탈러 등 (문헌 [Marthaler et al., 2013])에 의해 보고되었다. 북 아메리카 분리주와 유사하게, CO/13의 완전한 PEDV 게놈은 GenBank에서 이용가능한 다른 완전한 PEDV 게놈과 96.5 내지 99.5%의 뉴클레오타이드 동일성을 가지며, 중국 바이러스주 AH2012 (GenBank 수탁 번호 KC210145)와 가장 높은 뉴클레오타이드 동일성 (99.5%)을 갖는다. 중국 바이러스주 AH2012는 2a 유전자군의 구성원이다. PEDV 기준 바이러스주 CV777의 완전한 게놈과 북 아메리카 분리주 CO/13의 완전한 게놈을 비교하면, CO/13은 1-뉴클레오타이드 삽입 (48번 위치에서) 및 5' UTR에서의 5개의 뉴클레오타이드의 결실 (73번 및 83 내지 86번 위치에서)을 포함하는 반면, 스파이크 유전자는 16개의 뉴클레오타이드의 삽입 (20804번, 20810 내지 20820번, 20843번 및 21053 내지 21055번 위치) 및 7개의 뉴클레오타이드의 결실 (20853번 및 21118 내지 21124번 위치)를 포함하는 것으로 나타난다.
오래된 프로토타입 바이러스주와 비교하여 종종 자연적으로 약독화된 "INDEL" 바이러스주로도 지칭되는 PEDV의 다른 변이체가 출현하였다. 이들도 또한 바이러스가 생약독화되거나 불활성화되는 백신으로 사용될 수 있다. 이러한 경우, 최소의 추가 계대만이 안전한 백신 약독화를 제공하기 위해 필요할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 예시적인 백신 바이러스는 스파이크 단백질에 대해 또는 전체 바이러스 서열에 기초하여 측정된 아미노산 또는 암호화 뉴클레오타이드 서열에 관계없이 이러한 바이러스주와 적어도 95%, 96%, 96.1%, 96.2%, 96.3%, 96.4%, 96.5%, 96.6%, 96.7%, 96.8%, 96.9%, 97%, 97.1%, 97.2%, 97.3%, 97.4%, 97.41%, 97.42%, 97.43%, 97.44%, 97.45%, 97.46%, 97.47%, 97.48%, 97.49%, 97.5%, 97.51%, 97.52%, 97.53%, 97.54%, 97.55%, 97.56%, 97.57%, 97.58%, 97.59%, 97.6%, 97.61%, 97.62%, 97.63%, 97.64%, 97.65%, 97.66%, 97.67%, 97.68%, 97.69% 97.7%, 97.71%, 97.72%, 97.73%, 97.74%, 97.75%, 97.76%, 97.77%, 97.78%, 97.79%, 97.8%, 97.81%, 97.82%, 97.83%, 97.84%, 97.85%, 97.86%, 97.87%, 97.88%, 97.89%, 97.9%, 97.91%, 97.92%, 97.93%, 97.94%, 97.95%, 97.96%, 97.97%, 97.98%, 97.99%, 98%, 98.01%, 98.02%, 98.03%, 98.04%, 98.05%, 98.06%, 98.07%, 98.08%, 98.09%, 98.1%, 98.11%, 98.12%, 98.13%, 98.14%, 98.15%, 98.16%, 98.17%, 98.18%, 98.19%, 98.2%, 98.21%, 98.22%, 98.23%, 98.24%, 98.25%, 98.26%, 98.27%, 98.28%, 98.29%, 98.3%, 98.31%, 98.32%, 98.33%, 98.34%, 98.35%, 98.36%, 98.37%, 98.38%, 98.39%, 98.4%, 98.41%, 98.42%, 98.43%, 98.44%, 98.45%, 98.46%, 98.47%, 98.48%, 98.49%,98.5%, 98.51%, 98.52%, 98.53%, 98.54%, 98.55%, 98.56%, 98.57%, 98.58%, 98.59%, 98.6%, 98.61%, 98.62%, 98.63%, 98.64%, 98.65%, 98.66%, 98.67%, 98.68%, 98.69%, 98.7%, 98.71%, 98.72%, 98.73%, 98.74%, 98.75%, 98.76%, 98.77%, 98.78%, 98.79%, 98.8%, 98.81%, 98.82%, 98.83%, 98.84%, 98.85%, 98.86%, 98.87%, 98.88%, 98.89%, 98.9%, 98.91%, 98.92%, 98.93%, 98.94%, 98.95%, 98.96%, 98.97%, 98.98%, 98.99%, 99%, 99.01%, 99.02%, 99.03%, 99.04%, 99.05%, 99.06%, 99.07%, 99.08%, 99.09%, 99.1% , 99.11%, 99.12%, 99.13%, 99.14%, 99.15%, 99.16%, 99.17%, 99.18%, 99.19%, 99.2%, 99.21%, 99.22%, 99.23%, 99.24%, 99.25%, 99.26%, 99.27%, 99.28%, 99.29%, 99.3%, 99.31%, 99.32%, 99.33%, 99.34%, 99.35%, 99.36%, 99.37%, 99.38%, 99.39%, 99.4%, 99.41%, 99.42%, 99.43%, 99.44%, 99.45%, 99.46%, 99.47%, 99.48%, 99.49%, 99.5%, 99.51%, 99.52%, 99.53%, 99.54%, 99.55%, 99.56%, 99.57%, 99.58%, 99.59%, 99.6%,99.61%, 99.62%, 99.63%, 99.64%, 99.65%, 99.66%, 99.67%, 99.68%, 99.69%, 99.7%, 99.71%, 99.72%, 99.73%, 99.74%, 99.75%, 99.76%, 99.77%, 99.78%, 99.79%, 99.8%, 99.81%, 99.82%, 99.83% 99.84%, 99.85%, 99.86%, 99.87%, 99.88%, 99.89%, 99.9%, 99.91%, 99.92%, 99.93%, 99.94%, 99.95%, 99.96%, 99.97%, 99.98% 및 99.99%의 서열 동일성 또는 더 높은 서열 동일성을 갖는 것들을 또한 포함한다.
"북 아메리카 기원의 PEDV"라는 용어는 서열 번호 29 및/또는 33 및/또는 서열 번호 32 및/또는 36을 포함하는 PEDV 분리주, 및/또는 서열 번호 29 및/또는 33과 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고/갖거나 서열 번호 29 및/또는 33의 RNA 등가물과 적어도 99% 동일한 임의의 PEDV 분리주, 및/또는 스파이크 단백질이 서열 번호 30, 34, 46 또는 52에 의해 암호화되는 PEDV 분리주, 및/또는 스파이크 단백질이 서열 번호 30, 34, 46 또는 52와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 임의의 PEDV 분리주, 및/또는 발현된 스파이크 단백질이 서열 번호 31, 35, 47 또는 53과 적어도 90%의 상동성을 갖는 임의의 PEDV 분리주을 의미한다.
"클레드 (clade)"라는 용어는 당해 분야에 공지된 바와 같이 계통수에서 조상 및 이의 모든 자손, 단일 "가지 (branch)"로 이루어진 그룹을 지칭한다. 조상은 일례로서 개체, 개체군 또는 종일 수 있다. 유전자군은 다중 클레드를 포함할 수 있으며, 예를 들어, AH2012는 북 아메리카 분리주와 상이한 클레드로 존재한다.
추가의 실시형태에 따르면, 본 발명은 또한 본 출원에 기재된 바와 같은 이러한 핵산 분자 중 임의의 것을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 환언하면, 본 발명은 임의의 이러한 스파이크, M, E, N PEDV 단백질, 또는 이들의 일부의 암호화 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 벡터는 임의의 이러한 스파이크, M, E, 및/또는 N PEDV 단백질 또는 단백질의 일부의 발현을 가능하게 하는 발현 벡터이다. 본 발명에 따른 벡터는 시험관내에서 또는 생체내에서 세균, 효모 또는 동물 세포의 형질감염 또는 감염에 적합한 것들이다.
벡터 및 발현용 벡터 (또는 재조합체)를 제조 및/또는 사용하기 위한 방법은 특히 다음 문헌에 개시된 방법들에 의하거나 이들 방법들과 유사할 수 있다: 미국 특허 US 4,603,112, US 4,769,330, US 5,174,993, US 5,505,941, US 5,338,683, US 5,494,807, US 4,722,848, US 5,942,235, US 5,364,773, US 5,762,938, US 5,770,212, US 5,942,235 및 US 382,425, 국제공개공보 WO 94/16716, WO 96/39491 및 WO 95/30018; 문헌 [Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996], [Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996], 스미스 등의 미국 특허 US 4,745,051 (재조합 바큘로바이러스), 문헌 [Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.)], [Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165], [Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406], 유럽 공개특허 EPA 0 370 573, 1986년 10월 16일자로 출원된 미국 특허 출원 US 920,197, 유럽 공개특허 EP 0 265 785; 미국 특허 US 4,769,331 (재조합 헤르페스바이러스), 문헌 [Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996], [Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996], [Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996], [Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996], [Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991], 미국 특허 US 5,591,439 및 US 5,552,143; 국제공개공보 WO 98/00166; 1996년 7월 3일자로 출원되고 특허결정된 미국 출원 US 08/675,556 및 US 08/675,566 (재조합 아데노바이러스); 문헌 [Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993], [Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65], [Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990], [Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434], 국제공개공보 WO 91/11525, 문헌 [Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561], [Science, 259: 1745-49, 1993] 및 [McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996] 및 미국 특허 US 5,591,639, US 5,589,466 및 US 5,580,859, 및 국제공개공보 WO 90/11092, WO 93/19183, WO 94/21797, WO 95/11307 및 WO 95/20660; 문헌 [Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors]. 또한, 국제공개공보 WO 98/33510; 문헌 [Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (lentiviral expression system)], 스탠포드 등의 미국 특허 US 4,945,050; 문헌 [Fischbachet al. (Intracel)]; 국제공개공보 WO 90/01543; 문헌 [Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (DNA vector systems)], 스조카 등의 미국 특허 US 4,394,448 (DNA를 생세포에 삽입하는 방법); 맥코믹 등의 미국 특허 US 5,677,178 (세포병변 바이러스의 용도) 및 미국 특허 US 5,928,913 (유전자 전달용 벡터); 및 본 명세서에 인용된 기타 문헌들을 참조한다.
바람직한 바이러스 벡터는, 특히 생산 세포가 곤충 세포인 경우, BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)와 같은 바큘로바이러스를 포함한다. 바큘로바이러스 발현 시스템이 바람직하지만, 당해 분야의 통상의 기술자는 다른 발현 시스템이 본 발명의 목적, 즉, HG의 세포 배양물 상청액 내로의 발현에 실행될 것으로 이해한다. 이러한 다른 발현 시스템은 H5 발현을 배지 내로 유도하기 위해 신호 서열의 사용을 필요로 할 수 있다.
유효 용량:
본 출원에 기재된 화합물은 PDCoV 및/또는 PEDV-관련 질병을 예방하기 위한 치료학적 유효 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 투여량은 백신을 투여받는 숙주 뿐만 아니라, 숙주의 크기, 체중 및 연령과 같은 인자에 좌우될 것이다.
제형에서 사용되는 본 발명의 면역원성 조성물의 정확한 양은 투여 경로 및 대상체의 특성 (예를 들어, 연령, 크기, 질환의 단계/수준)에 좌우될 것이며, 진료 의사의 판단 및 표준 임상 기술에 따른 각 대상체의 상황에 따라 결정되어야 한다. 면역화 유효량 (effective immunizing amount)은 대상체에서 PDCoV 및/또는 PEDV 감염 질환을 치료하거나 예방하기에 충분한 양이다.
조성물의 면역원성은 당해 분야에 공지된 임의의 면역검정법을 사용하여 조성물에 의한 면역화 후의 시험 대상체의 면역 반응을 모니터링함으로써 결정될 수 있다. 체액성 (항체) 반응 및/또는 세포-매개성 면역의 생성은 면역 반응의 징후로서 간주될 수 있다. 시험 대상체는 동물, 예를 들어, 돼지, 마우스, 햄스터, 개, 고양이, 토끼, 소, 말, 양, 가금 (예를 들어, 닭, 오리, 거위 및 칠면조) 및 사람을 포함할 수 있다.
시험 대상체의 면역 반응은 다음과 같은 다양한 접근법으로 분석될 수 있다: 공지된 기술, 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 측정법 (enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 면역 블롯, 면역 침강법, 바이러스 중화 등에 의해 검정되는, 면역원성 접합체에 대한 생성된 면역 혈청의 반응성; 또는 감염 질환 인자의 수준, 예를 들어, 바이러스 수준을 검정하기 위한 당해 분야에 공지된 방법으로 (예를 들어, 대상체 유래의 샘플의 배양으로) 또는 당해 분야에 공지된 다른 기술로 측정되는, 병원체에 의한 감염으로부터의 면역화 숙주의 방어 및/또는 면역화 숙주에서 병원체에 의한 감염으로 인한 증상의 약화. 감염 질환 인자의 수준은 또한 면역글로불린이 유도되는 항원의 수준을 측정하여 결정될 수 있다. 감염 질환 인자의 수준의 감소 또는 감염 질환의 증상의 개선은 조성물이 효과적이다는 것을 나타낸다.
본 발명의 치료제는, 동물의 생체내에서 사용 전에, 목적하는 치료적 또는 예방적 활성에 대해 시험관내에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 특정 치료제의 투여가 지시되는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있는 시험관내 검정은, 특정 질환 또는 장애가 있는 대상체로부터 배양된 세포 또는 세포주 유래의 적절한 세포에 치료제를 노출시키거나 그렇지 않으면 투여하고, 세포에 대한 치료제의 효과를 관찰하는, 시험관내 세포 배양 검정을 포함한다.
대안적으로, 치료제는 감염 질환 인자에 의해 감염에 민감하지만 감염 질환 인자에 의해 감염되지 않은 세포 (대상체로부터 또는 배양된 세포주로부터 배양됨)에 치료제를 접촉시키고, 상기 세포를 감염 질환 인자에 노출시키고, 이어서, 치료제와 접촉한 세포의 감염률이 치료제와 접촉하지 않은 세포의 감염률 보다 낮은지 여부를 측정함으로써 검정될 수 있다. 감염성 질환 인자에 의한 세포의 감염은 당해 분야에 공지된 임의의 방법으로 검정될 수 있다.
또한, 치료제는, 항체가 동물 모델 또는 사람 대상체에서 적합한 시간 간격으로 치료 이전, 도중 또는 이후에 유도되는 분자의 수준을 측정함으로써 검정될 수 있다. 분자의 양의 임의의 변화 또는 변화 부재는 확인될 수 있으며, 대상체에 대한 치료의 효과와 상관 관계가 있다. 분자의 수준은 당해 분야에 공지된 임의의 방법으로 측정될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 PDCoV 및/또는 PEDV에 의한 동물의 백신접종 후, 당해 분야에 공지된 임의의 결합 검정은 생성된 항체와 특정 분자 간의 결합을 검정하기 위해 사용될 수 있다. 이들 검정은 또한 특정 항원에 대한 더 높은 친화성 또는 특이성을 나타내는 항체를 선택하기 위해 수행될 수 있다.
대상체에 대한 투여:
바람직한 투여 경로는 비강내, 경구, 진피내 및 근육내를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 통상의 기술자라면, 본 발명의 조성물이 또한 다른 투여 경로에 의해서 뿐만 아니라, 1개, 2개 또는 그 이상의 용량으로 투여될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 이러한 다른 경로는 피하, 피내, 정맥내, 혈관내, 동맥내, 복강내, 경막내, 기관내, 피내, 심장내, 폐엽내, 척수내, 폐내 및 질내를 포함한다. 치료의 목적하는 지속 기간 및 유효성에 따라, 본 발명에 따른 조성물은, 예를 들어, 수일, 수주 또는 수개월 동안 매일 1회 또는 수회, 또한 간헐적으로 다양한 투여량으로 투여될 수 있다.
하기 실시예들은 본 발명의 바람직한 실시형태를 입증하기 위해 포함된다. 당해 분야의 통상의 기술자라면, 하기 실시예들에 개시되는 기술들이 본 발명의 실시에서 잘 기능하도록 본 발명자들에 의해 발견된 기술들을 나타내기 때문에, 발명의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있다는 것을 인식해야 한다. 그러나, 당해 분야의 통상의 기술자라면, 본 개시 내용을 고려하여, 다수의 변화가 개시되는 특정 실시형태에서 이루어질 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고도 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 수득할 수 있다는 것을 인식해야 한다.
실시예
실시예 1: PEDV 바이러스주의 단리 및 생성
돼지 유행성 설사 바이러스 백신, 사 바이러스를 생산하기 위해, PEDV (분리주)의 마스터 시드 (master seed) 배양물을 먼저 생산하였다. 이러한 마스터 시드로부터, PEDV의 배양물을 성장시킨 다음, 불활성화시켰다. 이어서, 돼지 유행성 설사 바이러스 백신을 제조하기 위해 불활성화 바이러스 배양물을 아쥬반트와 혼합하였다. 하기 방법을 사용하여 돼지 유행성 설사 바이러스 백신을 생산하였다.
극심한 설사를 나타내는 동물 또는 동물 유래의 조직을 2013년에 획득하였다. 이들 동물에서 점막 스크래핑 (mucosal scraping)으로부터의 균질물을 생성하고, 0.2 마이크론 시린지 필터를 통해 여과하고, 여과물을 사용하여 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO)에 접종하였다. 변형된 MEM, 돼지 트립신, 트립토오스 포스페이트 브로쓰, 효모 추출물 및 HEPES 완충액을 포함하는 PEDV 유지 배지의 존재하에 바이러스를 성장시켰다. 특유의 합포체 형성 및 세포 단층의 융합을 확인하여 바이러스 성장을 평가하고 시각화하였다. Illumina-기반 MISEQ® 서열 분석기 기술을 사용하여 CPE 양성 물질에 대한 서열 분석을 수행하였다.
PEDV 마스터 시드 바이러스 배양물 (PEDV master seed virus culture: "PEDV MSV")을 생산하기 위해, 돼지 유행성 설사 바이러스주 (분리주) (PEDV 분리주)를 BI VERO 세포에서 단리하고, BI VERO 세포에서 총 19번 계대시킨 다음, 바이러스를 2013 EU VERO 세포에서 30번 계대까지 성장시켰다. 30번째 계대의 바이러스를 희석하고, 마스터 시드 바이러스로 명명된 PEDV KV-1251-125-10-OK로서 기록하였다.
마스터 시드 바이러스로부터, 변형된 최소 필수 배지, 돼지 트립신 (10 μg/ml), 트립토오스 포스페이트 브로쓰 (0.3%), 효모 추출물 (0.02%) 및 1M HEPES 완충액 (2.5%)을 포함하는 PEDV 유지 배지 중에서 2013 EU VERO 세포를 PEDV KV-1251-125-10-OK MSV로 감염시켜 PEDV ("125-10"로서 본 출원에서 지칭되는 KV-1251-125-10-OK)의 배양물 생산하였다. 전형적으로 2013 EU VERO 세포를 최소 용량의 104 TCID50/850 cm2 회전병의 PEDV (125-10) MSV로 감염시켰다. 이러한 배양물을 멸균 일회용 회전병에서 또는 미세담체 비드 상에서 성장시킬 수 있다. 세포병변 효과 (cytopathic effect: "CPE")가 관찰될 때까지, 배양물을 24 내지 48시간 동안 36℃±2℃에서 인큐베이션 처리하였다. 전형적으로, 특유의 합포체는 감염 12시간 이내에 발견될 수 있고, 합포체는 확장하고, 세포 단층은 24~48시간 융합한 후, 세포를 탈락 (sloughing)시킨다. 인큐베이션 동안, 배양물을 PEDV 유도된 CPE에 대해 모니터링하여 순수한 PEDV 바이러스주를 보장하였다. 비정형 CPE가 관찰되거나 오염의 임의의 육안 또는 현미경 증거가 존재하는 경우, 배양물을 폐기하였다. 순수한 바이러스 배양물을 멸균 폴리프로필렌 카보이 내에 무균성으로 수확하였다. 바이러스를 동결 융해시켜 세포 관련 비리온을 방출시키고, 원심분리 또는 0.45 마이크론에 이어 0.2 마이크론의 필터를 통한 여과에 의해 정화하였다. 벌크 바이러스 수확 유체를 시험하여 불활성화 전에 미코플라스마의 부재를 보장하였다. 즉시 불활성화되지 않은 수확 유체를 -70℃ 이하에서 보관하였다.
수확 유체의 부피를 측정하고, 상기 유체의 온도를 36±2℃로 한다. 2-브로모에틸렌아민 (BEA)의 0.4 M 용액을 0.3 N NaOH의 스톡 용액과 혼합하여 바이너리 에틸렌이민 (BEI) 스톡 용액을 생성한 다음, 이를 수확 유체에 첨가하여 최종 농도 5 mM의 BEI를 수득한다. 상기 유체를 계속하여 최소 24시간 동안 교반한다. 5 mM의 최종 최소 농도를 수득하기 위해 1.0 M 나트륨 티오설페이트 용액을 첨가하여 임의의 잔류 BEI를 중화시킨다. 불활성화 유체를 -70±3℃에서 장기간 동안 또는 4±3℃에서 단기간 동안 보관할 수 있다.
BEI에 의한 처리 후, PEDV를 대표하는 CPE를 유도하는 능력에 대해 배양물을 시험하여 바이러스의 불활성화를 보장하였다. BEI 처리된 바이러스 유체를 VERO 세포 상에 계대시키고, VERO 세포에 대해 임의의 바이러스 감염을 확인함으로써 이러한 과제를 수행하였다. 불활성화 검정이 완료될 때까지, BEI 처리된 배양 유체를 전형적으로 -70℃ 이하에서 보관하였다.
불활성화 PEDV 배양물을 아쥬반트 EMULSIGEN®-BCL과 20% 함유율 (inclusion rate)로 완전히 블렌딩하여 벌크 시리얼을 형성함으로써, 불활성화 바이러스를 아쥬반트 첨가된 백신으로서 제형화하였다. 1회 또는 10회 용량 (2.0 ml/용량)을 포함하는 바이알 내로 이동될 때까지, 벌크 시리얼을 2 내지 8℃에서 유지하였다.
실시예 2: 돼지 델타코로나바이러스주의 단리 및 생성
돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)를 국가 수의 검사 실험실 (National Veterinary Service laboratory: NVSL; Ames, IA)로부터 구입하였다. 2014년에 일리노이의 돼지 장 샘플로부터 본 바이러스를 NVSL에서 단리하였다. 5 μg/mL TPCK 트립신의 존재하에 무혈청 배지에서 돼지 고환 (ST) 세포상에서 바이러스를 단리하였다. 원래의 바이러스는 NVSL에서 2회의 플라크 정제 과정을 거쳤으며, 바이러스의 10번째 계대를 출발 물질로서 사용하였다.
10번 계대 바이러스를 접종하고 HEPES, 트립토오스 포스페이트 브로쓰, 효모 추출물 및 돼지 트립신을 포함하는 변형된 최소 필수 배지를 함유하는 PDCoV 유지 배지에 의해 BI에서 돼지 고환 (ST) 세포에 적응시켰다. 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 24~48시간 동안 인큐베이션 처리하고, PDCoV-유도된 세포병변 효과의 증거를 관찰하였다. CPE가 완료되고 세포가 탈락되었 때, 플라스크를 한 번 동결-해동하고 용해물을 수확하였다. 이어서, 계속적인 계대를 위해 수확된 물질을 새로운 단층에 접종하였다. 이러한 방법으로 12번 계대를 통해 계대를 계속하였다. 12번 계대로부터 수확된 바이러스를 "AI-ST 2015" 세포로 명명된 대체 유도체 돼지 고환 (ST) 세포 계통에 접종하고 적응시켰다. P16 바이러스를 수득하기 위해 11번 및 12번 계대와 동일한 방식으로 AI-ST 2015 세포에서 바이러스의 계대를 4번 더 수행하였다. P16 바이러스를 회전병에 접종하여 최종 "P17" 마스터 시드 바이러스 분리주를 생산하고, 이를 수확하고, 0.2 μm 필터를 통해 여과하고, 풀링하여 벌크 바이러스 스톡을 수득하고, -60℃ 이하에서 저장하였다. 마스터 시드 바이러스 "P17"의 평균 역가는 4.91log10 FAID50/mL인 것으로 결정되었다.
실시예 3: PEDV 분리주 및 PDCoV 분리주의 게놈 서열 분석
샘플 제조 및 분석:
추출 전, 바이러스 조직 배양 상청액을 DNasedhk RNase의 칵테일로 전처리하여 잔류 숙주 세포 게놈 핵산을 제거하였다. 이어서, RNEASY® 바이러스 RNA 추출 키트 (Qiagen, Cat #52906)를 사용하여 뉴클레아제-처리된 샘플로부터 바이러스 게놈 RNA를 추출하였다. 추출 후, 샘플을 다시 DNase로 처리하여 바이러스 게놈 RNA를 추가로 농축하였다. 후속적으로, 무작위로 프라이밍된 역전사 및 클레노우 단편 처리를 통해 바이러스 게놈 RNA를 이중 가닥 cDNA (ds cDNA)로 전환시켰다. 이어서, NEXTERA®XT 라이브러리 제조 키트 (Cat #FC-131-1024)를 사용하여 Illumina MISEQ® 서열 분석기 기반 서열분석을 위한 라이브러리를 생성하기 위해 ds cDNA 생성물을 사용하였다. 각 샘플을 특유의 태그로 5'- 및 3'-말단 둘 다에 바코드 처리하여 생물정보 미스-비닝 (bioinformatic mis-binning)의 가능성을 최소화하였다. 500-사이클 키트 (Cat # MS-102-2003)를 사용하여 MISEQ® 서열 분석기에서 이러한 라이브러리를 실행시키고, NextGene (버전 2.3.4)과 Sequencher 소프트웨어 (버전 5.1)의 조합을 사용하여 데이터를 분석하였다. 고품질 서열을 25 초과의 Q-스코어 중앙값을 포함하는 것으로 선택하고, 3'-말단에서 3개 이하의 부적절한 (uncalled) 염기 또는 16 이하로 측정된 Q-스코어를 갖는 3개의 연속 염기를 컷오프하여 손질하였다. 이어서, 35 bp 스트레치에 대해 85% 초과의 일치의 기준을 사용하여 서열들을 새롭게 조립하여 각 분리주에 대한 추정되는 완전한 게놈을 생성하였다. 이어서, 단일 뉴클레오타이드 다형태 (single nucleotide polymorphism: SNP) 또는 가변적인 작은 삽입/결실을 증명하기 위해 각각에 대한 추정되는 완전한 게놈 서열을 주형-기반 정렬에 의해 증명하였다.
PEDV 분리주 1251-125-10의 경우, 저품질 데이터를 손질한 후 136bp의 평균 길이로 총 570,253개의 서열들을 생성하였다. 이들 서열들 중에서, 484,247개 (84.9%)를 단일 콘틱 27,995 bp 길이로 조립하고, 이것은 BLASTn 분석을 통해 단일 가닥 RNA 알파코로나바이러스 PEDV와 강한 동일성을 나타냈다. 총 11개의 위치는 단일 뉴클레오타이드 또는 작은 삽입/결실에서 다형태를 나타냈으며, 이들 위치는 표 1에 열거되어 있다.
Figure pct00001
1251-125-10 (서열 번호 29)의 추정되는 완전한/거의 완전한 PEDV 게놈을 PEDV의 가장 밀접한 중국 AH2012 (GenBank 수탁 번호: KC210145) 및 북 아메리카 콜로라도 2013 분리주 (GenBank 수탁 번호 AGO58924)에 대해 정렬하였다. 두 분리주에 대한 동일성은 99.2%를 초과하는데, 이는 두 바이러스주와의 매우 밀접한 관계를 유전자군 2a에서 둘 다 나타낸다.
다음으로, 면역원성 스파이크 단백질 서열을 PEDV 스파이크 단백질의 더 큰 GenBank 리포지토리 (repository)와의 단백질 동일성/유사성에 대해 검사하였다. 다시, 제출된 가장 밀접한 GenBank 분리주는 미소네타 대학 수의학 진단 실험실 (University of Minnesota Veterinary diagnostic laboratory)에 의해 기탁된 북 아메리카 콜로라도 2013 바이러스주 (GenBank 수탁 번호: AGO58924)로부터 유래되었으며, 이는 99.5% 초과의 동일성(1380/1386의 동일한 아미노산) (서열 번호 X)을 나타냈다. 6개의 아미노산 변화 중에서, 1개는 23,101번 위치에서의 다형태에 기인하며, 이것은 주로 CGA (Arg) 또는 소수로 CAA (Gln)를 838번 위치에서 암호화한다. 북 아메리카 콜로라도 2013 바이러스주는 이러한 위치에서 Gln을 포함한다.
PDCoV의 경우, 12개의 개별적으로 단리된 샘플을 서열분석하였다. 바이러스 RNA를 농축하기 위해 바이러스 입자 보호된 핵산 분해 (RNase + DNase) 후에 물질을 추출하였다. 추출 후, 핵산을 DNase로 처리하여 RNA를 농축하였다. 랜덤 6량체에 의한 프라이밍을 사용하여 역전사 및 클레노우 처리를 통해 이중 가닥 cDNA를 생성하였다. 이어서, 이들 생성물을 라이브러리 생성에 사용하였다.
NEXTERA® XT 라이브러리 제조 키트 (Illumina, Cat # FC-131-1024)를 사용하여 라이브러리 생성을 통해 MISEQ® 서열 분석기 기반 서열분석을 위해 샘플을 처리하였다. 각 샘플을 특유의 태그로 5'- 및 3'-말단 둘 다에 바코드 처리하여 생물정보 미스-비닝의 가능성을 최소화하였다. 500-사이클 키트 (Illumina, Cat # MS-102-2003)를 사용하여 MISEQ™ 서열 분석기에서 라이브러리를 실행시키고, NEXTGENE® 서열분석 소프트웨어 (SoftGenetics, LLC, 버전 2.3.4.2)와 SEQUENCER® 소프트웨어 (Gene Codes Corp., 버전 5.1)의 조합을 사용하여 데이터를 분석하였다. 고품질 서열을 25 초과의 Q-스코어 중앙값을 포함하는 것으로 선택하고, 3'-말단에서 3개 이하의 부적절한 (uncalled) 염기 또는 16 이하로 측정된 Q-스코어를 갖는 3개의 연속 염기를 컷오프하여 손질하였다. 35 bp 스트레치에 대해 85% 초과의 일치의 기준을 사용하여 이들 서열들을 새롭게 조립하고 기준 파일에 대해 정렬하였다. 카시지 (Carthage) 및 NVSL PDCoV 바이러스주 (NSVL, 돼지 델타코로나바이러스주 USA/IL/2014/026PDV_P11, Genbank 수탁 번호 KP981395.1)에 대한 새로운 서열 조립체 또는 MISEQ® 서열 분석기 유도된 기준물로부터 정렬용 기준 서열을 생성하였다.
전반적으로, 각각의 BI 바이러스 분리주와 다른 바이러스주 ("카시지" 최초 분리주 및 NVSL 바이러스주) 사이의 유전적 유사성은 높았으며 (> 99.8%의 동일성), NVSL 및 BI-ST 세포 성장 바이러스의 변이체 사이의 차이는 훨씬 적은 변화를 나타냈다 (> 99.95%의 동일성) (표 2). PDCoV 분리주/바이러스주에 대한 완전한 게놈 뉴클레오타이드 이웃 연결 계통수 및 PDCoV 분리주/바이러스주에 대한 스파이크 아미노산 이웃 연결 계통수를 각각 개략적으로 도시하는 도 1 및 2를 또한 참조한다. 축척은 p 거리를 나타낸다.
NVSL 및 BI-ST 세포 성장 바이러스의 변이체 사이의 유사성은 일부 샘플의 공유 기원으로 인해 발생할 가능성이 높다. 하나의 주목할만한 서열 차이는 배양된 PDCoV_2201-1 분리주 내의 스파이크 (229~231번 아미노산 위치)에서 프레임내 9 bp 결실의 존재이지만, 돼지로부터의 원래의 균질물 또는 물질에서 관찰되지 않는다. "카시지" 분리주와 알려진 관계가 없는 BI PDCoV-5.0327 분리주는 또한 "BI-ST"세포주에서 동일한 결실을 나타내지만 NVSL-ST 세포주에서는 나타내지 않기 때문에, 이러한 위치는 IN/DEL 변이성에 대한 "핫스팟"인 것으로 보인다. 이러한 변화는 바이러스의 조직 배양 적응을 나타낼 수 있다.
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 4: 전체 PEDV 및 PDCoV 분리주의 불활성화
PEDV 바이러스 또는 풀의 각각의 로트 (lot)를 불활성화에 대해 VERO 세포에서 계대에 의해 시험하였다. 75 cm2의 24시간 세포 배양물을 2.0 mL의 불활성화 PEDV 유체로 접종하고, 36±3℃에서 48시간 동안 유지하였다. VERO 세포의 1개의 플라스크는 비접종된 채로 남겨둔다. 양성 바이러스 대조군의 경우, VERO 세포의 하나의 배양물을 양성 대조군 PEDV로 접종하였다. 인큐베이션 처리 기간의 말기에, 세포 단층을 PEDV의 CPE 정형에 대해 검사하였다. 물질을 3회 냉동 및 해동시킨 다음, 2 ml의 각 물질을 1일령 VERO 세포에 접종하였다. 배양물을 37±2℃에서 48시간 동안 유지해야 한다. 제2 계대 후, 제3 계대를 수행한다. 인큐베이션 처리 및 계대 후, 면역 형광 염색의 결핍에 의해 측정되는 BEI 처리된 바이러스 유체 중 바이러스-감염된 세포의 부재는 충분한 불활성화 시험을 구성한다. 양성 대조군 바이러스로 접종된 대조군 세포는 PEDV를 대표하는 CPE를 나타내야 하며, 비접종된 플라스크는 PEDV CPE의 어떠한 증거도 나타내지 않아야 한다.
PDCoV 바이러스 수확은 37℃에서 24시간 동안 5 mM BEI로 비활성화된다. 불활성화 후, 수확물을 나트륨 티오 설페이트로 중화시킨다. 불활성화는 불활성화된 수확물의 TCID50 평가에 의해 확인하였다. 불활성화된 물질에서는 어떠한 생 바이러스도 검출되지 않았다. 10 kd의 중공 섬유 PES 카트리지 (GC Healthcare cat#UFP-10-C-3MA)를 사용하여 불활성화된 중화 바이러스 수확물을 농축시킨다. 농축된 항원을 변형된 최소 필수 배지 (최종 농도 = 10X)로 무균성으로 희석시킨다. 희석된 항원의 일부를 Emulsigen D® (MVP Laboratories, item#10005408)와 조합하여 12.5% 제형을 달성한다.
실시예 5: PDCoV 스파이크 항원을 암호화하고 발현하는 재조합 바큘로바이러스의 작제
PDCoV S1-IgG2a Fc 바큘로바이러스의 제조
프라이머 P2967167A (서열 번호 13) 및 P2967167B (서열 번호 14)를 사용하여 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 스파이크 (aa 1-673)의 S1 영역을 플라스미드 DNA로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 프라이머 P2967167C (서열 번호 15) 및 P2968014E (서열 번호 16)를 사용하여 짧은 GGS 링커 및 힌지 영역을 포함하는 돼지 IgG2a의 Fc 영역을 플라스미드 DNA로부터 증폭시켰다. 프라이머 P2967167A (서열 번호 13) 및 P2968014E (서열 번호 16)를 사용하여 중첩-확장 PCR에 의해 2개의 단편을 융합시켜 개시 코돈의 5' 바로 옆에 코작 공통 서열을 함유하는 PDCoV S1-IgG2a Fc 암호화 서열 (서열 번호 17)을 생성하였다. 도 3a의 개략도를 참조한다. 최종 암호화 서열을 BamHI 및 NotI 제한 부위에 의해 플 랭킹시켜 바큘로바이러스 전달 플라스미드 pVL1393 내로 클로닝을 용이하게 하였다. 완료되면, 플라스미드 pVL1393-PDCoV S1-IgG2a Fc를 선형화된 BaculoGold 바큘로바이러스 DNA와 함께 사용하여 Sf9 곤충 세포를 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하였다.
PDCoVS BD 바큘로디스플레이 바큘로바이러스의 제조
플라스미드 DNA로부터 2개의 중첩 단편 (N-말단 및 C-말단)에서 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 유래의 PDCoV 스파이크 유전자를 클로닝하였다. 프라이머 P2967002C (서열 번호 23) 및 P2967002D (서열 번호 24)를 사용하여 N-말단 단편을 증폭시키면서, 프라이머 P2967002E (서열 번호 25) 및 P2967002F (서열 번호 26)를 사용하여 C-말단 단편을 증폭시켰다. 고유 신호 서열 및 C-말단 꼬리를 제거하기 위해 N-말단 및 C-말단 단편을 증폭시켰다. 프라이머 P290194A (서열 번호 19) 및 P2967002D (서열 번호 20)를 사용하여 중첩-확장 PCR (OE-PCR)에 의해 N-말단 단편을 오토그라파 칼리포니카 뉴클레오폴리헤드로바이러스 (Autographa californica nucleopolyhedrovirus: AcNPV) gp64 신호 서열 (O2967002A) (서열 번호 21)과 융합시켰다. 프라이머 P290194B (서열 번호 20) 및 P2967002E (서열 번호 25)를 사용하여 OE-PCR에 의해 C-말단 단편을 AcNPV gp64 C-말단 꼬리 암호화 서열 (O2967002B) (서열 번호 22)과 융합시켰다. 프라이머 P290194A (서열 번호 19) 및 P290194B (서열 번호 20)를 사용하여 OE-PCR에 의해 2개의 생성된 단편을 융합시켜 개시 코돈의 5' 바로 옆에 코작 공통 서열을 함유하는 PDCoV 스파이크 바큘로디스플레이 (PDCoVS BD) 암호화 서열 (서열 번호 27)을 생성하였다. 도 3b의 개략도를 참조한다. 최종 암호화 서열을 BamHI 및 NotI 제한 부위에 의해 플 랭킹시켜 바큘로바이러스 전달 플라스미드 pVL1393 내로 클로닝을 용이하게 하였다. 완료되면, 플라스미드 pVL1393-PDCoVS BD를 선형화된 BaculoGold 바큘로바이러스 DNA와 함께 사용하여 Sf9 곤충 세포를 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하였다.
실시예 6: PEDV 스파이크 항원을 포함하는 약제학적 조성물 (백신)의 제조:
불활성화 PEDV 물질의 경우, 5 mM BEI를 사용하여 PEDV 바이러스 수확물을 최소 24시간 동안 불활성화시키고, 정화하고, 0.45 μm 여과하였다.
중화 후, 다양한 아쥬반트를 첨가하고, 하기 백신/약제학적 조성물을 생성하였다.
실시예 7: PDCoV 스파이크 항원을 포함하는 약제학적 조성물 (백신)의 제조:
PDCoV 항원 (BacluloS-BD-PDCoV 및 BaculoS-FC-PDCoV)의 배치를 3L 스피너에서 성장시켰다. 감염의 경우, SF+ 세포에 1.0~2.1의 대략적인 MOI로 바이러스를 접종하였다. 플라스크를 100 rpm으로 설정된 교반과 함께 27℃에서 인큐베이션 처리하였다. 감염 후 5일째에 수확을 개시하였다. 수확시, 세포 생존율은 24% 내지 26%이었으며, 생존 세포/mL는 0.31 x 106 내지 0.36 x 106이었다. 10,000 x g에서 10분 동안 원심 분리하여 수확액을 정화하고 0.2 μm 여과하였다. 정화된 수확액을 Emulsigen® D와 조합하여 12.5% 제형을 달성한다.
실시예 8: 불활성화 PDCoV 및 바큘로바이러스 스파이크 백신에 의한 돼지의 접종 및 혈청학적 반응의 평가
연구 목적은 통상적인 새끼 돼지에서 PDCoV 백신 프로토타입의 혈청학적 반응을 평가하는 것이었다. PDCoV의 스파이크 단백질이 다양한 백본에서 발현되는 몇몇 프로토타입 백신을 생성하였다. 또한, 전체 세포 불활성화된 바이러스 제제를 생성하였다.
실험군의 설명에 대해서는 하기 표 3을 참조한다. 그룹 1~4를 무작위로 배정하고, 동일한 돈사에 수용하였다. 추가로, 대략 4주령에 젖을 뗀 엄격한 대조군 동물 (그룹 5)을 본 연구에 포함시켰다. D0에서, 돼지를 4개의 그룹으로 무작위로 배정하고, 2 mL 용량의 각각의 프로토타입 PDCoV 백신 또는 위약을 투여하였다. D21에서, 돼지는 각각의 프로토타입 백신의 2차 또는 부스터 투여를 제공받았다. 각각의 백신접종시 및 D35에서 치료제의 투여 전에 돼지로부터 혈청액 및 타액을 수집하였다. 샘플을 혈청전환의 증거에 대해 검정하였다. 일반적인 건강 관찰을 매일 돈사마다 기록하였다. 백신의 투여 후 최소 3일 동안 주사 부위를 반응에 대해 관찰하였다.
Figure pct00004
IFA에 의해 검출되는 백신접종 후의 혈청학적 반응
간접 면역형광 분석법 (Indirect Immunofluorescent assay: IFA)
1:40 내지 1:320의 2배 연속 희석물을 1x 포스페이트 완충된 식염수 (PBS; Gibco c#10010-023)에서 각 샘플로부터 제조하였다. 100 μl의 각각의 희석 샘플을 PDCoV 감염된 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 처리하였다. 인큐인큐베이션 처리후, 혈청을 제거하고 단층을 1xPBS로 2 회 세척하였다. 이어서, 10 μl/웰의 FITC-접합된-염소-항-돼지-IgG 항체의 1:100 희석물을 사용하여 세포를 염색하였다. 역가는 비감염된 대조군 웰과 비교하여 PDCoV 염색을 나타내는 최대 혈청 희석물로 보고되었다.
D-8, D21 및 D35에서의 혈청학적 반응은 하기 표 4에 그룹별로 제시되어 있다. 일자별 및 그룹별 최소 제곱 평균 및 검출 빈도는 표 5에 제시되어 있다. 백신접종 전에는 어떠한 동물도 검출가능한 혈청학적 반응을 나타내지 않았다. (도 4를 참조한다.)
신호 백신접종 후, 동물의 20~73%는 BaculoS-BD 프로토타입으로 백신접종된 동물에서 반응을 나타냈다. D35까지, 전체 세포 또는 BaculoS-FC 프로토타입으로 백신접종된 모든 동물은 검출가능한 반응을 나타냈다. BaculoS-BD 프로토타입으로 백신접종된 동물의 50%만이 D35까지 검출가능한 반응을 나타냈다.
프로토타입 또는 위약으로 백신접종된 돼지에서 혈청학적 반응들 사이에는 D-8에 어떠한 유의한 차이도 관찰되지 않았다. D21 및 D35까지, 혈청학적 반응은 프로토타입 백신을 투여받은 동물에서 더 높았다 (모든 일자에서 모든 그룹에 대해 p < 0.002). 수치적으로, BaculoS-FC 및 전체 세포 프로토타입 백신은 BaculoSBD 작제물과 비교하여 D35까지 더 높은 IgG 반응을 자극하는 것으로 나타났다.
Figure pct00005
S1-IgG2a-Fc 기반 ELISA로 검출되는 백신접종 후의 혈청학적 반응
PDCoV IgG ELISA
정제된 PDCoV-S1-IgG2aFc 항원 (BIVI L#3091-141; 0.2 mg/mL)을 카보네이트 완충액 (BIVI L#3144-180)으로 1:6666.67 희석하였다. ELISA 플레이트 (높은 결합 96 웰 플레이트; Greiner cat#655061)를 100 μl/웰의 희석 항원으로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션 처리하였다. 자동화 플레이트 세척기를 사용하여 플레이트를 300 μl/웰의 TBST (0.05% Tween 20)로 5회 세척하였다. 세척 단계 후, 150 μl의 차단 용액 (카제인 차단제, Thermo catalog#37532)을 웰 당 첨가하고, 플레이트를 15~30℃에서 1시간 동안 인큐베이션 처리하였다. 1:200의 희석물 (음성 대조군 및 시험 샘플)로 카제인 차단제에서 초기 혈청 희석물을 제조하였다. 인큐베이션 처리 후, 카제인 차단제를 플레이트로부터 제거하고, 시험 샘플의 연속 2배 희석물 (카제인 차단제에서 제조)을 1:200에서 12800까지 제조하였다. 음성 대조군의 연속 2배 희석물을 1:200에서 1:204800까지 제조하였다. 100 μl/웰의 최종 부피로 플레이트상에 희석물을 제조하였다. 플레이트를 진탕하면서 (100 rpm) 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 처리하였다. 인큐베이션 처리 후, 플레이트를 전술한 바와 같이 세척하였다. HRP 접합된 염소-항-돼지-IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch catalog#114-035-003)의 1:2000 희석물 (카제인 차단제 중에서)을 제조하고, 100 μl를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 100 rpm으로 진탕하면서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 처리한 다음, 전술한 바와 같이 세척하였다. 검출을 위해, 100 μl/웰의 제조된 TMB 기질 (KPL cat#50-76-00)을 웰 당 첨가하였다. 플레이트를 15~30℃에서 10분 동안 인큐베이션 처리하였다. 100 μl/웰의 1N HCl로 반응을 정지시키고, 자동화 플레이트 판독기로 450 nm에서 즉시 판독하였다.
결과는 다음 계산을 통해 생성되었다. 먼저, 최종 5개의 음성 혈청 희석물 웰로부터 평균 및 표준 편차 광학 밀도 (OD) 판독값을 계산하였다. 이어서, 컷오프를 평균 + 3개의 표준 편차로서 확립하였다. 각각의 샘플 광학 밀도 판독값 (초기 희석물에서)을 당해 플레이트에 대한 배경 컷오프로 나누었다. 데이터는 신호 : 배경 비율로서 보고되었다.
D-8, D21 및 D35에서의 혈청학적 반응은 그룹별로 제시되어 있다. 일자별 및 그룹별 최소 제곱 평균 및 검출 빈도는 표 5에 제시되어 있다 (또한 도 5 참조). 백신접종 전에는 어떠한 동물도 검출가능한 혈청학적 반응을 나타내지 않았다.
제2 백신접종 후, 동물의 40~45%는 그룹에 관계없이 반응을 나타냈다. D35까지, 전체 세포 또는 BaculoS-FC 프로토타입으로 백신접종된 모든 동물은 검출가능한 반응을 나타냈다. 프로토타입 또는 위약으로 백신접종된 돼지에서 혈청학적 반응들 사이에는 D8 또는 D21에 어떠한 유의한 차이도 관찰되지 않았다. D35까지, 혈청학적 반응은 프로토타입 백신을 투여받은 동물에서 더 높았다 (그룹 1, 2 및 4에 대해 각각 p = 0.0039, < 0.0001 또는 < 0.0001).IFA 결과와 유사하게, BaculoS-FC 및 전체 세포 프로토타입 백신은 BaculoS-BD 작제물과 비교하여 D35까지 더 높은 IgG 반응을 자극하였다.
Figure pct00006
실시예 9: PEDV 바큘로바이러스 백신의 효능
하기 연구는 2개의 2-mL 용량의 사멸된 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 백신 또는 바큘로바이러스 작제물 백신에 의한 백신접종에 대해 혈청학적 반응을 평가하였으며, 이는 3주령의 돼지에게 어느 하나의 백신의 투여 후에 측정되었다. 1차 결과는 치료된 돼지에서 백신접종 후 수집된 혈청 샘플에 대한 형광성 초점 중화 (fluorescent focus neutralizing: FFN)로 시험된 혈청학이다.
연구 그룹은 다음을 포함하였다: T01 = PBS (n=10); T02 = 6.93 log TCID50/ml BEI PEDV + 20% EMULSIGEN®-BCL (n=20); T03 = PEDV 스파이크 Ag와의 바큘로바이러스 (n=9); PEDV 스파이크 Ag와의 6x 농축된 바큘로바이러스 (n=10); PEDV 스파이크 Ag와의 트립신 바큘로바이러스 (n=10); 및 조건부 허가된 사멸된 양성 대조군 백신 (POS CON) (n=10). D0에, 2-mL 치료제를 돼지의 우측 목에 근육내 투여하였다. 제2 치료는 D14에 T01~T05에 대해 좌측 목에, D21에 T06에 대해 투여받았다.
PEDV2a-BD의 제조
본 연구에서, 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 2a 유래의 스파이크 유전자를, 플라스미드 DNA로부터 2개의 중첩 단편 (N-말단 및 C-말단)에서 클로닝하였다. 프라이머 P1360110A (서열 번호 37) 및 PEDV-S2-R (서열 번호 38)을 사용하여 N-말단 단편을 증폭시키면서, 프라이머 PEDV-S1-F (서열 번호 39) 및 P1360110B (서열 번호 40)를 사용하여 C-말단 단편을 증폭시켰다. 고유 신호 서열 및 C-말단 꼬리를 제거하기 위해 N-말단 및 C-말단 단편을 증폭시켰다. 프라이머 P290194A (서열 번호 45) 및 PEDV-S2-R (서열 번호 38)을 사용하여 중첩-확장 PCR (OE-PCR)에 의해 N-말단 단편을 오토그라파 칼리포니카 뉴클레오폴리헤드로바이러스 (AcNPV) gp64 신호 서열 (O1360110C) (서열 번호 41)과 융합시켰다. 프라이머 P290194B (서열 번호 43) 및 PEDV-S1-F (서열 번호 44)를 사용하여 OE-PCR에 의해 C-말단 단편을 AcNPV gp64 C-말단 꼬리 암호화 서열 (O1360110D) (서열 번호 42)과 융합시켰다. 프라이머 P290194A (서열 번호 45) 및 P290194B (서열 번호 43)를 사용하여 OE-PCR에 의해 2개의 생성된 단편을 융합시켜 개시 코돈의 5' 바로 옆에 코작 공통 서열을 함유하는 PEDV 스파이크 바큘로디스플레이 (PEDVS BD) 암호화 서열 (서열 번호 46)을 생성하였다. 최종 암호화 서열을 BamHI 및 NotI 제한 부위에 의해 플 랭킹시켜 바큘로바이러스 전달 플라스미드 pVL1393 내로 클로닝을 용이하게 하였다. 완료되면, 플라스미드 pVL1393-PEDVS BD를 선형화된 BaculoGold 바큘로바이러스 DNA와 함께 사용하여 Sf9 곤충 세포를 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하였다. 도 6a를 참조한다. PEDV 2a BD 바큘로디스플레이 바큘로바이러스의 개략도.
Figure pct00007
혈청학:
백신접종 (D28 및 D35) 후 혈청변환은 20% EMULSIGEN® BCL로 아쥬반트 첨가된 PEDv 백신 (T02; 표 7)으로 백신접종된 돼지의 20%에서 일어났으며, 트립신-성장 PEDV 스파이크-바큘로바이러스(T05; 표 7)로 백신접종된 돼지의 60%에서 일어났다. 모든 치료 그룹에 대한 ≥1:20 혈청반응 양성 돼지의 기하 평균 역가는 하기 표 7에 제시되어 있다. 모든 돼지의 치료 그룹에 의한 역가의 빈도 분포는 표 8에 제시되어 있다.
Figure pct00008
Figure pct00009
결론:
혈청변환은 6.93 log10 TCID50/mL PEDV를 BEI로 불활성화하고 20% EMULSIGEN® BCL로 아쥬반트 첨가하여 제형화된 실험 백신의 2회 투여 후 T02 돼지의 20%에서 일어났다. 혈청변환은 PEDV 스파이크 당단백질로 제형화된 실험적인 재조합 트립신 성장 바큘로바이러스 백신의 2회 투여 후 T05 돼지의 60%에서 일어났다.
실시예 10: PEDV 2a BD 바큘로바이러스 백신의 효능
본 연구의 주요 목적은 통상적인 암퇘지 모델에서 프로토타입 PEDV 배큘로바이러스 백신의 효능을 평가하는 것이었다. 36마리의 암퇘지를 5개의 그룹으로 무작위로 배정하였다. 암퇘지를 분만 5 및 2주 전에 실험적인 PEDV 백신, 위약, 시판 양성 대조군으로 근육내 백신접종하거나, 백신접종하지 않은 채로 남겨두었다 (엄격한 대조군). 사용된 그룹 및 백신의 간략한 설명은 하기 표 9에 열거되어 있다. 임신, 분만 및 시험감염 기간 전체에 걸쳐, 암퇘지 및 돼지로부터 혈청 및 배설물 샘플을 수집하여 항-PEDV-항체 및 PEDV RNA의 존재를 모니터링하였다. 임상 징후를 매일 1회 기록하였다.
본 연구의 1차 결과 파라미터는 돼지 사망률이었다. 69%의 돼지 사망률, 임상 징후의 존재 및 위약 그룹의 돼지 유래의 배설물 물질 중 PEDV RNA의 확인에 기초하여, 본 연구에 사용된 시험감염 모델은 유효한 것으로 간주되었다. 암퇘지에서 2회 용량의 BaculoS-NT 작제물의 사용은 돼지 사망률을 유의하게 감소시킬 수 있었다. 이에 비해, 현재 시판되고 있는 PEDV 백신은 또한 돼지 사망률을 줄일 수 있었지만, 감소는 유의하지 않았다. BaculoS-NT 프로토타입은 트립신의 존재하에 성장하지 않았으며 12.5% EMULSIGEN® D로 아쥬반트 첨가되었기 때문에, 본 프로토타입은 생산에 선호되는 형식이며 21일의 휴약 기간을 가질 것으로 예상된다.
본 연구의 2차 결과 파라미터는 돼지에서 임상 징후를 예방하는 백신 프로토타입 능력이었다. 모든 돼지 중 93% 초과는 최소 연속 2일 동안 순수한 액체 설사를 나타냈기 때문에, 어떠한 백신 프로토타입 또는 시판 제품도 심각한 임상 징후의 발생을 예방할 수 없었다. 유사하게, 어떠한 백신도 돼지에서 임상 징후의 기간을 감소시킬 수 없었다.
Figure pct00010
암퇘지를 분만 5 및 2주 전에 실험적인 PEDV 백신, 위약, 시판 양성 대조군으로 근육내 백신접종하거나, 백신접종하지 않은 채로 남겨두었다 (엄격한 대조군). 임신 동안, 각 백신접종 전에 혈액 및 배설물 샘플을 수집하고, 각각 혈청전환 및 배출의 증거에 대해 검정하였다. 임상 관찰을 암퇘지 마다 매일 기록하였다.
돼지 사망률:
병독성 PEDV 분리주에 의한 시험감염 후 돼지 사망률은 백신 효능을 평가하는데 사용된 1차 결과 파라미터이었다. 시험감염 기간 동안 그룹별 사망률의 요약은 하기 표 10에 제시되어 있다. 그룹별 및 일자별 생존성은 도 7에 제시되어 있다. ("그룹별 및 일자별 생존 돼지의 백분율") D0에서, 적절한 크기의 멸균 바늘 및 시린지를 사용하여 2 mL 용량의 백신을 건강한 암퇘지의 우측 목 근육 조직 내로 투여하였다. D21에서, 목의 좌측에 주사한다는 것을 제외하고는 과정은 동일하였다.
시험감염 물질은 PEDV 바이러스 성장 배지 (HEPES, 트립토오스 포스페이트 브로쓰 및 효모 추출물을 포함하는 변형된 최소 필수 배지)에서 1.0 x 103의 역가로 희석된 병독성 PEDV 스톡 물질 (PEDV 1251-140-4; p5; L#2842-174; 역가 = 2.02 x 105 TCID50/mL)이었다. 이전 연구와 유사하게, 대부분의 사망 건수는 시험감염 물질에 대한 노출 후 8일 이내에 관찰되었다.
전반적으로, 모든 그룹은 감염 48시간 이내에 대부분의 돼지에 존재하는 임상 징후와 유사한 경향을 나타냈다. 임상 징후는 DPC6을 통해 모든 그룹에서 50% 초과의 돼지에 존재하였다. DPC7에서 DPC11까지, 임상 징후가 해결되었다. DPC13까지, 어떠한 임상 징후도 임의의 돼지에서 관찰되지 않았다.
분석:
생물 통계학. 분석을 위해 모든 데이터를 SAS® 버전 9.4로 불러왔다. 빈도 분포를 비롯한 치료 그룹별 데이터 목록 및 요약 통계를 생성하였다. 한배새끼 및 수용 효과를 적절하게 포함하여 분석을 수행하였다. 그룹 및 한배새끼에 의한 돼지의 시험감염 후 사망률을 열거하였으며, 그룹별로 요약하기 위해 기술 통계량 평균값, 중앙값, 최소값 및 최대값을 사용하였다. 그룹 및 한배새끼에 의한 사망률은 과대산포로서 피어슨 카이 제곱을 사용하는 일반화 선형 모형을 이용하여 분석하였다. 이어서, 위약 그룹과 비교하여 각 치료 그룹에 대한 모델 기반의 예방 분율 및 95% 신뢰 구간을 추정하였다. 과대산포로서 피어슨 카이 제곱을 사용하는 일반화 선형 모형은 연령, 치료 스코어 및 출산경력이 사망률에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하기 위해 이러한 요인들을 고정 효과로서 추가한 사망률 데이터에 한 번 더 적합화되었다. 연구 무작위화 데이터를 나열하였다. 빈도 분포를 사용하여 돼지에 대한 배설물 스코어를 그룹별 및 일자별로 나열하고 요약하였다. 요약은 시험감염 전과 시험감염 동안 개별적으로 수행되었다. 빈도 분포를 사용하여 암퇘지에 대한 임상 징후 (배설물, 구토, 주사 부위 병변, 젖마름증 및 치료)의 스코어를 그룹별 및 일자별로 분만 전후에 개별적으로 열거하고 요약하였다. 기술 통계량 중앙값, 최소값 및 최대값을 사용하여 돼지 체중 데이터를 한배새끼별, 그룹별 및 일자별로 나열하고 요약하였다. 고정 효과로서 그룹 및 분만시 체중, 무작위 효과로서 한배새끼 및 수용 돈사를 사용하는 혼합 모델에 의해 평균 일일 체중 증가 (Average Daily Weight Gain: ADWG)를 분석하였다. 그룹 간의 최소 제곱 평균 및 이의 대비를 추정하고, 상응하는 표준 오차 및 95% 신뢰 구간을 추정하였다. 맹장, 결장, 소장 및 폐 병변에 대한 내용물 및 장기에 대한 병리학 데이터 및 위 기록을 비롯한 돼지에 대한 부검 데이터는, 사망률로 구분된 그룹별로 각 변수에 대한 총수를 사용하여 나열되고 요약되었다. 임의의 병변의 존재 여부도 또한 그룹별 총수 및 백분율을 사용하여 요약하였다. 암퇘지에 대한 PED 바이러스 혈청 항체 역가 (FFN), 돼지 및 암퇘지 각각에 대한 혈청 IgA 전체 세포 ELISA, 암퇘지에 대한 IgA 및 IgG baculos ELISA, 암퇘지 및 돼지에 대한 IgA 및 IgG IDEXX ELISA 및 PCR을 비롯한 실험실 데이터를 먼저 나열하였다. 다음으로, 기하 평균 (FFN) (FFN의 경우 표준 편차는 제공되지 않음) 또는 평균 (ELISA, PCR)을 사용하여, 그룹별 및 일자별 기술 통계량 평균값, 최소값, 최대값 및 표준 편차를 계산하였다. 다음으로, 그룹별 및 일자별 최소 제곱 평균, 표준 오차 및 95% 신뢰 구간은 무작위 효과로서 한배새끼 및 수용 돈사를 사용하는 혼합 모델을 이용하여 추정하였다. 그룹 쌍 사이의 최소 제곱 평균의 대조 및 상응하는 95% 신뢰 구간을 추정하였다.
Figure pct00011
본 연구의 1차 결과 파라미터는 돼지 사망률이었다. 이러한 파라미터에 기초하여, 암퇘지에서 2회 용량의 BaculoS-NT 작제물의 사용은 돼지 사망률 (PF= 0.48)을 유의하게 감소시킬 수 있었다. 이에 비해, 현재 시판되고 있는 PEDV 백신은 또한 돼지 사망률을 줄일 수 있었지만, 감소는 유의하지 않았다 (그룹 4). BaculoS-NT 프로토타입은 트립신의 존재하에 성장하지 않았으며 12.5% EMULSIGEN® D로 아쥬반트 첨가되었기 때문에, 본 프로토타입은 생산에 선호되는 형식이며 21일의 휴약 기간을 가질 것으로 예상된다.
본 연구의 2차 결과 파라미터는 돼지 및 암퇘지에서 임상 징후를 예방하는 백신 프로토타입 능력이었다. 모든 돼지 중 93% 초과는 최소 연속 2일 동안 순수한 액체 설사를 나타냈기 때문에, 어떠한 백신 프로토타입 또는 시판 제품도 심각한 임상 징후의 발생을 예방할 수 없었다. 유사하게, 어떠한 백신도 돼지에서 임상 징후의 기간을 감소시킬 수 없었다. 임상 징후의 해결 후, PEDV RNA는 DPC14에서 동물의 12~33%에서 확인되었다. 이것은 백신접종이 콜로니화에 대해 방어하지 않았다는 것을 시사한다. 그룹 당 1~3마리의 암퇘지에서, 적어도 연속 2일 동안 심각한 설사를 관찰하였다. 이것은 백신이 시험감염된 돼지에 의해 배출된 많은 양의 바이러스에 대한 노출에 대해 암퇘지를 완전히 방어할 수 없었다는 것을 나타낸다. 또한, 암퇘지의 대부분 (14/16)은 검출가능한 양의 바이러스가 장간막 림프절에 존재하였는데, 이는 백신접종이 콜로니화를 방지하지 않았다는 것을 나타낸다.
백신접종된 암퇘지의 대부분은 2회 용량의 백신접종 후 검출가능한 IgG (및 FFN) 반응을 나타냈으며, 역가는 위약-백신접종된 대조군과 비교하여 더 높았다 (데이터는 나타내지 않음). IgG ELISA 및 FFN 결과는 매우 유사하기 때문에, FFN 검정은 주로 IgG를 검출하는 것 같다. IgG는 바이러스를 중화시킬 수는 있지만, 그룹 사이의 명확한 차이가 분명하지 않았기 때문에 PEDV 백신 효능의 유일한 결정인자일 것 같지는 않다.
측정된 IgA ELISA (IDEXX)로서 IgA 수준에 기초하여, 미경험 및 백신접종된 암퇘지는 DPC13/14에 의해 유사한 혈청 및 모유 IgA 역가를 나타냈다. 그러나, DPC3에서 수집된 혈청, 초유 및 모유에서의 증가된 IgA 역가는 백신접종된 동물에서 주목되었다. 백신접종된 암퇘지 중 생존 돼지들도 또한 최고 IgA 역가를 나타냈기 때문에, 이러한 데이터는 장 감염에서 IgA의 중요성을 강조하는 이전에 공개된 문헌을 뒷받침한다. (도 8를 참조한다)
실시예 11: PEDV2b 바큘로바이러스 백신의 제조
돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 2b 유래의 스파이크 유전자를 2개의 중첩 단편 (N-말단 및 C-말단)에서 제조하였다. 프라이머 P290194A (서열 번호 48) 및 P3183131B (서열 번호 49)를 사용하여, 오토그라파 칼리포니카 뉴클레오폴리헤드로바이러스 (AcNPV) gp64 신호 서열과 PEDV 2b 스파이크의 아미노산 22-400의 융합을 포함하는 합성 DNA로부터 N-말단 단편을 증폭시켰다. 프라이머 P3183131A (서열 번호 50) 및 P290194B (서열 번호 51)를 사용하여, AcNPV gp64 C-말단 꼬리 암호화 서열을 이미 포함한 pVL1393-PEDVS BD 플라스미드 DNA로부터 C-말단 단편을 증폭시켰다. 프라이머 P290194A (서열 번호 48) 및 P290194B (서열 번호 51)를 사용하여 OE-PCR에 의해 2개의 생성된 단편을 융합시켜 개시 코돈의 5' 바로 옆에 코작 공통 서열을 함유하는 PEDV 2b 스파이크 바큘로디스플레이 (PEDVS 2b BD) 암호화 서열 (서열 번호 52)을 생성하였다. 최종 암호화 서열을 BamHI 및 NotI 제한 부위에 의해 플 랭킹시켜 바큘로바이러스 전달 플라스미드 pVL1393 내로 클로닝을 용이하게 하였다. 완료되면, 플라스미드 pVL1393-PEDVS 2b BD를 선형화된 BaculoGold 바큘로바이러스 DNA와 함께 사용하여 Sf9 곤충 세포를 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하였다. 도 6b를 참조한다. PEDV 2b BD 바큘로디스플레이 바큘로바이러스의 단백질 지도의 개략도.
실시예 12: PEDV 및 PDCoV 효능 연구
돼지에서 사멸 PEDV 백신 및/또는 사멸 PDCoV 백신 또는 다른 프로토타입 백신의 효능을 평가하기 위해 하기 연구를 설계하였다. 1차 결과 파라미터는 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 및/또는 PDCoV에 의한 시험감염 후 새끼 돼지 사망률이다. 제2 결과 파라미터는 어미 동물 혈청학이다. 측정된 기타 파라미터는 다음을 포함하였다: 백신접종 후 암퇘지에서의 임상 징후 (ISL 포함); 백신접종 후 암퇘지에서의 바이러스 배출 (qRT-PCR을 통해); 새끼 돼지에서의 임상 징후; 및 새끼 돼지에서의 PEDV 및/또는 PDCoV 혈청학.
PEDV 연구:
분만 4 및 2주전 (D0 및 D14)에, 각각의 임신한 어미 동물은 다음 치료제 중 하나를 2 mL로 3가지 경로 (근육내, 비강내 및 경구)에 의해 투여받았다: 포스페이트 완충된 식염수인 T01 (음성 대조군, NC); 20% EMULSIGEN® BCL로 아쥬반트 첨가 T02 (BEI-VH); 백신접종되지 않은/시험감염되지 않은 대조군으로서 역할을 하는 T03 (엄격한 대조군, SC). 4마리의 동물이 있는 T06을 제외하고, 그룹 당 8마리의 동물을 사용하였다. D35 또는 D36에, 돼지를 경구에 의해 1 ml의 2.0 log10 TCID50/mL PEDV 바이러스 수확물로 시험감염시켰다. 어미 동물 및 돼지에서의 임상 징후 (구토 및 설사)를 시험감염 단계 동안 매일 관찰하였다. 분만 4 및 2주전 (D0 및 D14), 새끼 돼지 시험감염 전날 (D34 또는 D35) 및 오프-테스트 당일 (D57)에 어미 동물로부터 혈청을 수집하였다.
D0 및 D14에, PEDV 프로토타입 면역원성 조성물을 암퇘지에게 투여하였다. 각 백신접종에서, 암퇘지는 총 6 mL의 물질을 투여받았으며, 여기서, 2 mL를 근육내, 비강내 및 경구 경로로 투여하였다. 근육내 투여 경로의 경우, 2 mL 주사를 귀 아래의 목 근육 조직 내로 제공하였다. 투여를 위한 목 측을 초기 및 부스터 백신접종을 위해 교대로 사용하였다. 경구 투여 경로의 경우, 시린지에 부착된 8Fr 폴리프로필렌 카테터 (2.7 mm 직경 X 254 mm 길이)를 사용하여 2 ml를 꼬리 구강인두를 통해 전달하였다. 비강내 경로의 경우, 시린지에 부착된 4.5인치 카테터를 사용하여 1 ml를 각 비공내로 주사하였다.
Figure pct00012
Figure pct00013
백신 효능:
돼지 사망률: 병독성 PEDV 분리주에 의한 시험감염 후 돼지 사망률은 백신 효능을 평가하는데 사용된 1차 결과 파라미터이었다. 시험감염 기간 동안 그룹별 사망률의 요약은 하기에 나열되어 있다. 사망률이 55%이고 모든 한배새끼들이 T01 (NC)에서 감염되었기 때문에, 시험감염은 충분히 치명적인 것으로 고려되었다. T01 (NC)과 비교하여, T02 (BEI-VH)는 0.20의 PF (95% CI) (-0.550, 0.586)를 갖는 돼지 사망률의 수치 감소를 나타냈다. 95% CI (-0.550, 0.586)는 0을 포함하였기 때문에, 감소는 통계상으로 유의하지 않았다. (표 13 참조).
초과 이항 변동 (extra-binomial variation)은 기초 이항 분포를 사용할 때 T02 (BEI-VH) PF에 대해 넓은 신뢰 구간을 초래하는 본 연구에서 분명하였다. 사망률은 그룹 내의 한배새끼들 중에서도 매우 가변적이었으며, T02 (BEI-VH)의 경우 0% 내지 100%의 범위를 포함한다.
장내 샘플 또는 장내 내용물을 부검시에 수집하였으며, PEDV 항원을 검출하기 위해 qRT-PCR로 시험하였다. 피크 사망률의 시간 동안 동물로부터 시험된 샘플 중에서, PEDV는 샘플 중 55.5%에서 검출되었다.
Figure pct00014
암퇘지 혈청학:
형광성 초점 중화 (FFN) 검정: FFN 검정을 사용하여 백신접종 및 시험감염 후 어미 동물 바이러스 중화 반응을 평가하였다. 그룹별로 열거된 기하 평균 역가는 암퇘지로부터 혈액을 수집한 날짜에 대해 하기에 제시되어 있다.
백신의 2회 용량 후, T02 (BEI-VH)에서의 암퇘지의 2/8 (25%)는 중화 항체의 검출가능한 수준을 나타냈다. 중화 항체의 검출가능한 수준은 어떠한 다른 그룹에서도 관찰되지 않았다.
PEDV에 대한 측면 노출 후, 노출된 치료 그룹에서의 모든 암퇘지는 중화 항체의 검출가능한 수준을 나타냈다. T03 (SC) 그룹에서의 동물은 시험 전체에 걸쳐 여전히 혈청반응 음성이었다. D57 (노출 후 대략 21일째)에서의 기하 평균 역가는 백신접종이 T01 (NC)과 비교하여 수치적으로 높은 역가를 초래하였다는 것을 나타냈다. T02 (BEI-VH) 그룹에서의 암퇘지는, T01 (NC)에서의 암퇘지에 대한 200의 GMT와 비교하여, 대략 3배 높은 역가인 613의 GMT를 나타냈다 (p = 0.005). T02 (BEI-VH) 그룹에서의 복수의 샘플이 시험된 최고 희석물 (1:640)에서 검출가능한 중화 항체를 나타냈기 때문에, 이러한 결과는 그룹들 사이의 차이의 보수적인 추정치를 나타낼 것 같다.
Figure pct00015
S1 기반 ELISA 데이터:
S1 기반 ELISA를 사용하여 백신접종 및 시험감염 후 PEDV-스파이크 단백질에 대한 어미 동물의 반응을 평가하였다. 초유, 모유 및 혈청에 대한 검정 결과는 샘플을 수집한 날짜에 대해 그룹별로 열거되어 있다.
돼지 시험감염시, T02 (BEI-VH)에서의 암퇘지는 T01 (NC)에서의 암퇘지와 비교하여 혈청에서 유의하게 더 높은 기하 평균 역가를 나타냈다 (p = 0.0005). PEDV에 대한 노출 후, 2개의 그룹 사이에는 더 큰 유의차가 있었다 (p<0.0001).
초유 및 모유에서 항-PEDV IgA의 기하 평균 역가에서의 유의차는 T02 (BEI-VH)와 T04 (NC) 사이에서 관찰되지 않았다.
Figure pct00016
돼지 혈청학:
부검시 돼지로부터 혈청을 수집하여 중화 항체의 존재를 평가하였다. 하기 표 16은 양성 돼지의 기하 평균 FFN 역가를 그룹별로 나타낸다. 표 16은 또한 시험된 동물의 수에 대해 20 이상의 GMT을 갖는 돼지의 수로서 표현되는 검출 빈도를 포함한다. 모든 이용가능한 샘플에 대해 시험을 수행하였다. 사망과 부검 사이의 시간 차이로 인해, 수많은 돼지로부터의 샘플을 수득할 수 없었다.
FFN 역가에 대한 기술 통계량을 사망 상태 (사망: 예/아니오) 및 그룹 (전체) 별로 하기에 열거한다. 전체적으로, 백신접종된 그룹에서의 돼지의 유사한 비율이 부검 시점에 상관없이 혈청전환되었다 (또는 모계 항체를 가졌다). 그러나, T01 (NC)에서, 오프-테스트 전에 사망한 돼지의 더 높은 백분율이, 연구 기간 동안 생존 돼지 (43%)와 비교하여, 역가를 나타냈다 (88%).
전체 돼지 역가를 그룹별로 살펴보면, 사망률 추정치는 T02 (BEI-VH)에 대해 전체 그룹 FFN 백분율과 역비례하게 관련되었다.
Figure pct00017
시험감염 후 임상적 관찰:
돼지 배설물 스코어: 돼지에서 비정상 배설물 관찰의 기간에 대한 기술 통계량을 그룹 및 사망 상태 (사망: 예/아니오) 별로 하기에 열거한다. 전체적으로, 동일한 사망 상태를 갖는 돼지에서의 비정상 배설물 스코어의 기간 중앙값은 그룹들 사이에서 유사하였다. 사망하거나 안락사시킨 동물에서, 비정상 배설물 스코어의 기간 중앙값이 수치적으로 더 짧았다. 이러한 경향은 T01 (NC) 돼지에서 가장 분명하였으며, 이들 동물 대부분이 시험감염 후 첫주 이내에 사망하였다는 사실의 다음일 것 같다.
Figure pct00018
돼지에서의 배설물 스코어의 중증도는 하기 표 18에 빈도로 요약된다. 모든 치료 그룹에서, 돼지의 높은 부분 (>91%)은 시험감염 후 적어도 하나의 관찰 동안 2의 배설물 스코어로 나타났다.
Figure pct00019
결론:
돼지 사망률의 20% 감소는 T01 (NC) 그룹과 비교하여 T02 (BEI-VH)에서 관찰되었다. 3가지 투여 경로를 본 연구에서 시도하였다. 3가지 경로를 사용하였지만, IM 이외의 경로가 아쥬반트 및 백신 제형을 기반으로 하는 T02 (BEI-VH)의 효능에 기여하는 것으로는 예상되지 않는다. 전반적으로, 6.04 log TCID50/ml의 최소 불활성화전 역가를 갖는 20% EMULSIGEN-BCL® 백신으로 아쥬반트 첨가된 불활성화 PEDV 백신은 새끼 돼지 및 암퇘지에서 보다 양호한 면역 반응을 유도하는 것으로 보인다. 바람직한 백신접종 스케줄은 3주령 이상의 새끼 돼지에 대한 2주 간격으로 3개의 2 ml 용량의 IM 투여 경로이다. 백신접종 후 암퇘지에서의 임상 징후는 T02 (BEI-VH)에서 관찰되지 않았으며, 다른 치료 그룹에서 제한되었다. 백신접종의 사용은 정상 출산 돼지의 백분율에 영향을 미치지 않는 것으로 보였다 (데이터는 나타내지 않음).
2개의 개별적인 검정 (초점 형광성 중화, S1 기반 ELISA)에 의해 어미 동물 혈청학을 2차 파라미터로서 평가하였다. 2개의 검정은, T01 (NC)과 비교하여, 백신접종 및 노출 후 T02 (BEI-VH)에서 역가의 유의한 증가를 나타냈다. FFN 검정의 공지된 제한으로 인해, 샘플을 또한 S1 기반 ELISA에 의해 시험하였다. 스파이크 단백질의 S1 도메인이 중화 에피토프를 포함하는 것으로 예상되기 때문에, 이러한 ELISA를 선택하였다.
PEDV에 대한 측면 노출 후, 노출된 치료 그룹에서의 모든 동물은 중화 항체의 검출가능한 수준을 나타냈다. T02 (BEI-VH)에서의 암퇘지는 T01 (NC) 동물과 비교하여 대략 3배 높은 역가를 나타냈다. 이것은, 백신의 사용이 초기 일차 반응을 자극하고, 시험감염 바이러스에 대한 노출 후 더 높은 이차 반응을 초래하였다는 증거이다. T02 (BEI-VH) 그룹에서의 복수의 샘플이 시험된 최고 희석물 (1:640)에서 검출가능한 중화 항체를 나타냈기 때문에, 이러한 결과는 그룹들 사이의 차이의 보수적인 추정치를 나타낼 것 같다.
Figure pct00020
PDCoV 연구
본 연구의 목적은 숙주 동물에서 프로토타입 PDCoV 백신의 효능을 결정하는 것이었다. PDCoV의 시험감염 물질 및 질병 모델을 개발하기 위한 예비 연구에 기초하여, 백신접종되지 않은 새끼 돼지는 시험감염 1주일 이내에 체중 감소 및 설사를 나타내고 회복되었다. 어떠한 사망도 관찰되지 않았다.
Figure pct00021
돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)에 대한 시험감염 바이러스주를 확립하기 위해, 2개의 내부 시험감염 분리주 (그룹 3 및 4)를 BI-ST 세포에서 성장시키고, NVSL PDCoV 분리주 (일리노이 2014)와 비교하였다. 그룹 3 및 4에서의 분리주는 이들이 보유한 돌연변이 및 NVSL (일리노이 2014) 분리주와 이들의 유전적 거리에 기초하여 선택되었다. 그룹 3 바이러스 (BI PDCoV-5.0327)는 스파이크 당단백질에서 3개의 아미노산 결실 및 NSVL PDCoV 분리주와 비교하여 ORF1AB 유전자의 2개의 변화를 나타냈다. 그룹 4 바이러스 (BI PDCoV 2.0307)는 스파이크 당단백질에서 4개의 아미노산 차이 및 NVSL PDCoV 분리주와 비교하여 ORF1AB 유전자에서 3개의 차이를 나타냈다.
시험감염 새끼 돼지는 설사에 대해 스코어를 매겼으며, 여기서, 시험감염 후 0 = 정상, 1 = 비정상 (순수한 액체가 아님) 또는 2 = 심각한 설사 (순수한 액체 배설물)이다. 어떠한 설사도 음성 대조군에서 관찰되지 않았다. 추가로, NVSL PDCoV로 시험감염된 그룹은 시험감염 후 어떠한 임상 징후, 체중 감소, 구토 또는 설사도 나타내지 않았다. 그룹 3 및 4에서의 새끼 돼지는 구토 및 체중 감소를 수반하는 심각한 설사 (2의 스코어)를 경험하는 이들의 100%에서 심각한 임상 징후를 나타냈다. 또한, 그룹 3 및 4에서의 암퇘지는 설사 (시험감염 후 D6~D8)로 고통받았으며 치료받았다. 이전에 공개된 연구는 PDCoV로 감염된 새끼 돼지들 중에서 장기간의 감염 (및 바이러스 배출)을 기술하였다. 이들의 관찰은 본 발명자들의 결과와 일치한다.
NVSL PDCoV 및 음성 대조군에서의 동물은 시험감염 후 체중 증가를 나타냈다. 대조적으로, 2개의 시험감염 분리주 BI PDCoV-5.0327 (그룹 3) 및 BI PDCoV 2.0307 (그룹 4)로 시험감염된 동물은, 대조군과 비교하여, 동일한 기간 동안 덜 강력한 체중 증가를 나타냈다.
효능 연구:
Figure pct00022
효능 연구를 위해, 분만 5 및 2주전에 적절한 경로로 4개 그룹의 암퇘지를 표 21에서 상세히 기술된 바와 같은 각 백신 제형으로 백신접종한다. 혈청전환 검정을 위해 각 백신접종시 치료제의 투여 전에 암퇘지로부터 혈청을 수집하였다. 각 백신접종시 암퇘지로부터 배설물 샘플을 수집하고, 백신 배출의 증거에 대해 검정하였다.
면역화된 암퇘지로부터의 새끼 돼지는 분만시 시험에 등록된다. 대략 5~7일령에 경구 경로를 사용하여 새끼 돼지를 1.0 mL의 시험감염 물질로 접종한다.
새끼 돼지와 암퇘지 모두를 시험감염 후 (DPC) 0일부터 DPC14일까지 매일 1회 임상 징후에 대해 모니터링한다. 시험감염 후 배설물 및 혈청 샘플을 모든 새끼 돼지 및 암퇘지로부터 채취한다. 배설물 샘플을 PDCoV RNA의 존재에 대해 시험하고, 혈청을 항-PDCoV 항체의 존재에 대해 시험한다. 모든 암퇘지로부터 초유를 분만시 또는 그 근처에서 수집한다. DPC3에서 및 DPC10 내지 DPC14 사이의 한 시점에서 모든 암퇘지로부터 모유를 수집한다. 초유 및 모유를 항-PDCoV 항체의 존재에 대해 시험한다. DPC21에서 말단 혈청 수집과 함께 DPC 0, 7 및 21에서 새끼 돼지의 체중을 모니터링한다.
본 출원에서 개시되고 청구된 모든 조성물들 및 방법들은 본 개시 내용에 비추어 과도한 실험 없이도 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물들 및 방법들이 바람직한 실시형태의 관점에서 기재되었지만, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화들을 본 출원에서 기재된 조성물들 및 방법들, 및 상기 방법의 단계들 또는 단계들의 순서에 적용할 수 있다는 것은 당해 분야의 통상의 기술자들에게 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 한, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련되어 있는 특정 제제가 본 출원에서 기재된 제제를 대체할 수 있다는 것은 자명할 것이다. 당해 분야의 통상의 기술자들에게 자명한 이러한 모든 유사한 대체 및 변형은 하기 특허청구범위에 정의된 바와 같이 본 발명의 사상, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
하기 참고문헌들은, 본 출원에서 제시된 것들을 보완하는 예시적인 절차상의 세부 사항 또는 다른 세부 사항을 제공할 정도까지, 구체적으로 본 출원에 참조로 포함된다.
참고문헌
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gtattatggg atcttatgat ttcgagtgcg attggacgcc agagatggta tacaatcagg 9060 ctccaatttc attgcagtca ggagtagtta agaaaacttg tacgtggttc ttccacttct 9120 tgtttatggc tattaccatg ctactcgctg ccatgcatgt tttccctgta cacttgtatc 9180 caatagtact gccatgcttc actgtcgtgg cattcctgtt gactttaacc attaaacaca 9240 ctgttgtgtt taccactaca tacttgcttc cgtcactttt gatgatggtt gtaaatgcta 9300 acactttttg gataccgaac acatttctgc gcacctgcta cgaaactata ttcggttccc 9360 caattgctca gcgactgtat ggttacactg ttgctcttta tatgctgatc tatgctggac 9420 ttgcaatcaa ctatacgttg aaaacactcc ggtatagagc aacttcattc ttatcttttt 9480 gcatgcagtg gtttcaatat ggttatgttg cacacattgc gtacaaactg cttaataaac 9540 cctggacaga atcactactc ttcacagcct tcacaatgct aaccagtcat cccttgttgg 9600 ctgctcttag ctggtggcta gctggtcgcg taactctgcc cattatcatg cctgacttag 9660 ctattcgtgt tttggcgtat aacgtcattg gctatgtcat atgtgttcga tttggcctta 9720 tgtggcttgc aaatcggttc acaactgtac ctatgggcac ataccagtat atggtgtctg 9780 tagagcaact taagtacatg atggcagtta agatgtcccc accgcgtaat gcgtttgagg 9840 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10680 tagataatgc acctattgaa ggcgtaccag aagaattccc tgtggtcgtt gagactgtta 10740 gggaaggtgt gccccagttg caaaataatg agctatgttt gcgcaatgtt ttcactgctc 10800 agaacacagc tcaggacttc aatggcaatg aatccactgt aaaatctttt tatgttacta 10860 gaaccggtaa gaagattttg gttgccatta catcaactaa agacaatctt aagactgtga 10920 cctgccttac tgagaccggt aagacagtcc ttaacttgga cccccctatg cgcttcacac 10980 ataccgtagg tggaaaacag tctgttgtct atctctattt tattcagaat attagttcac 11040 tcaacagagg tatggttatt ggccacatct ctgaaactac tatccttcag gcaagtggca 11100 ctcaaattga gtaccagcaa aatgcctctc ttttgaccta tttggctttc gctgtagacc 11160 ctaagacagc ctaccttaag catcttgctg atggtgggtc tcctatacag ggttgtattc 11220 agatgattgc tactatgggt cctggatttg cagttactac taaaccacaa cctaatgagc 11280 atcagtattc ttatggtggt gcttcaattt gtctttattg ccgtgctcat ataccacatc 11340 ctggtgttga tggacggtgc ccctacaaag gccgctttgt tcacatcgac aaagataagg 11400 aacctgtttc cttcgctttg actcatgagc catgcagttc ttgtcaacgg tgggttaatt 11460 atgactgcac ctgcggatct agtctgcaga attcggctta tttaaacgcg 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uauugcaagu gucucagaca aguguguaga 12660 uuuaagaacu ccuugucaga ccuuggcuac uaugucuagc ggaauugcua aacagucagu 12720 caagcccggg cauuuuaauc aacacuucua caagcauuug cuugauagua accuauuaga 12780 ccaacuugga auagacauuc gccacuucua cuauaugcag gauggugaag cggcuaucac 12840 agacuacagc uacuacaggu auaauacccc cacgauggua gauaucaaga uguucuuauu 12900 uugccuugag guggcagaua aguaucuuga gcccuacgaa gguggaugua uuaaugcaca 12960 gucaguugug gucucuaauu uggacaaguc agcgggcuac cccuuuaaca agcuagguaa 13020 ggcucguaac uauuacgaca ugacucaugc cgagcaaaau caacuguuug aguauacaaa 13080 acgcaauguu uugccuacac ucacucagau gaaccuuaag uaugcaauuu cagccaagga 13140 ucgugcucgc acuguggcag gagugucuau aauuagcacc augacuaaca ggcaguacca 13200 ucaaaagaug cugaaaucua uuucacuugc acgcaaucag accaucguga uuggaacaac 13260 caaauucuau ggugguuggg acaacauguu acgacgacug auguguaaua ucaacaaucc 13320 cauuuuagug gguugggauu acccuaagug ugaucguucu augccaaaca ugcugcgcau 13380 ugccgcuucg ugcuugcuag cacgaaaaca cacuugcugu aaccaaagcc agcgauucua 13440 ccguuuggcu aaugaauguu 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guggugugua auucacccac uauacugcgc uguggugauu gcauucgucg 14340 accacuacuu uguugcgucu gugccuacca gcauguuacg cagacuacac auaaacguau 14400 cauugcuauc aacaacuaca ucuguagugu ugagaauugc aaugaggaca auguugaaaa 14460 acuuuucauu ucuggcacug cgauuuauug ugagaaucac aaacccacgc ugugcauacc 14520 cauuguagcu aaugguucug uuuuugguau cuaucgccac acugcccgug guagugauga 14580 cauagaccuc uuuaacgagc uugcuacauc uaacuaugac acuauugaac cuuaucagaa 14640 ggccaaucgu gcaccuuuau cacuuaugcu cuucgcugcu gaaaccauua aggcacucga 14700 ggagucuauc aagaagucau augcuaccgc aaccgucaag gauguguaug accaacgcuu 14760 cauuaaacuu cuaugggaac aggguaaaaa gccgccaccc auaacgaaga accacauuuu 14820 cacuggcuac cauuuuaaca agaauggaaa aacccaaguu ggugauuaca uucuugcuaa 14880 aacagauggc agugacacuu auacuuacag aggaacaucu accuacaaac uccaaacagg 14940 ugauguucua gucuuaaugg cacauguugu uacaccgcuc ucagcacccc cuguguuaac 15000 gcagacaaca uaugucagaa aaucacuuuu acccgacucu guuggugcgu cuuauuaugu 15060 gcaacauuuu aagucauaua augagauagc uaugcagagg guuacaacag uauuaggucc 15120 accaggcaca gguaagucaa ccuuugcuau ugguuuggcu aaguacuuuc ccagugcacg 15180 uauuugcuac acugcgucuu cgcaugcagc aaucgaugca cucugugaaa aagcuuucaa 15240 gacaauaccu guaggccaau gcagucguau cguacccaca cguacaacug uugagugcuu 15300 ucaggaguuu gucguaaaua acacaacugc acaguauauc uucucgacua ucaaugccuu 15360 accugacauu aagugugaca uuguaguugu agaugagguu ucuauguuga ccaauuauga 15420 gcuuuccucu gugaaugcuc guuugguuua caaucacauu guguauguug gugauccuua 15480 ucaguuaccu ucaccuagaa cuaugcuuac gucuggccag cuuucgccag cugacuauaa 15540 cguaguuacu gauauaaugg uacaugcagg agcggauguu augcucgaca ugugcuacag 15600 augcccacgu gaaaucguug agacaguguc uaaacuuguc uacgauaaca aacuaaaagc 15660 ggcgaaaccg aacucaagac aguguuacaa gaccauugug aacuuugguc cuggagacgu 15720 ugcucaugag ggacaaucug ccuacaacga agcacaguug cguuucgcac ucgcauuuag 15780 acaacaaaag cggugggaua acgugacuuu cauaucucca uauaaugcua ugaaugugaa 15840 agcauccuua gcagguuucu cuacucagac cguugacucu ucucaagguu cugaguauga 15900 uuauguuauc uuuugcguga ccacugauuc agcacacgca cuuaacaugg 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aaccagaucu gcaugggcac ucucaccuga gaguagacuc 23460 cuugcaggga uuauggaucc aauggguaca uggaggugca uucccauuga ccacauggcu 23520 ccaauucuca caccagucgu uaagcauggc aagcucaagc uacaugggca agagcuggcc 23580 aauggcauau cagucagaaa uccgccacag gauaugguga uagugucacc aagugacacc 23640 uuucacuaca cuuuuaagaa accuguggaa ucaaacaacg auccagaauu ugcuguucug 23700 auauaccagg gugaccgcgc uucaaacgcu ggacuucaca ccauaaccac uucaaaggcc 23760 ggugacgcuc gccuguauaa guauauguaa ugugcaacug ccaucugcag cugcgagauu 23820 uauauagauu gugcaauaag cggcacauca gaagagagga uguuccugag cuuauugacc 23880 cucucguuaa aacucgcugu uuugcuuaca gucucguggu ucuugcuaau gcuaauccaa 23940 uugcauuuag cauacuaccu cggaaaauuc uuaucaaugg ugagccuuua cugcuugaau 24000 augguagcau auaugguaaa gacuuuauca uucgaccauc gcuccaaguc auucuugaag 24060 augaauuaaa uuaaaguuuu gacaccaauc uaucauggcu gcaccaguag ucccuacuac 24120 ugacgcgucu ugguuucagg ugcucaaagc ucaaaacaaa aaggcuacuc auccucaguu 24180 ucguggcaau ggaguuccgc uuaacuccgc caucaaaccc guugaaaacc auggcuacug 24240 gcugcguuac accagacaaa agccaggugg uacucccauu ccuccauccu augccuuuua 24300 uuauacuggc acagguccca gaggaaaucu uaaguauggu gaacucccuc cuaaugauac 24360 cccagcaacc acucguguua cuuggguuaa ggguucggga gcugacacuu cuauuaaacc 24420 ucauguugcc aaacgcaacc ccaacaaucc uaaacaucag cugcuaccuc uccgauuccc 24480 aaccggagau ggcccagcuc aagguuucag aguugacccc uucaacgcua gaggaagacc 24540 ucaggagcgu ggaaguggcc caagaucuca aucuguuaac uccagaggca caggcaauca 24600 gcccaggaaa cgcgaccaau cugcaccagc ugcgguacgu cguaagaccc agcaucaagc 24660 ucccaagcgg acuuuaccca aggguaaaac cauuucucag guauuuggca accggucucg 24720 uacuggugcc aaugucggcu cugcagacac ugagaagacg gguauggcug auccucgcau 24780 cauggcucua gccagacaug ugccuggugu ucaggaaaug cuuuuugcug gccaccuuga 24840 gagcaacuuu caggcggggg caauuacccu uaccuucucc uacucaauca cagucaagga 24900 ggguucuccu gacuaugaga gacuuaagga ugcgcucaau acggucguua accagaccua 24960 ugagccaccu accaaaccaa cuaaggacaa gaagccugac aaacaagacc agucugcuaa 25020 acccaaacag cagaagaaac cuaaaaaggu aacucugcca gcagacaaac aggauuggga 25080 gugggaugau gcuuuugaga uaaagcagga aucagcagcg uagacaucaa ucuaugucug 25140 uuaaacccac ccaacuccac ucaaauaucu cuuugguucc agagagucgu aguguauagc 25200 cagagagcca gucagagggc gcuaucaugc aaacuagggc uggcuacucu agcacagaau 25260 cacaucccga uaaucaacag ugcuagaagg uugauuauac cauuuaauau gccgaggcca 25320 cgcggaguac gaucgagggu acagcauaau cucaacuuuu guugagccac aauuuuaauc 25380 cuaauuggag aaggccaaag gacuguacua cuuuuguggg uguagcaguc gcccaguggg 25440 aaagcgccaa cuagguuaca auuguggugg ggacaaauua ggggaaauua aauuggcuua 25500 uagcu 25505 <210> 3 <211> 3459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Deltacorona Virus SPIKE antigen CDS (NSVL) cDNA <400> 3 atgaccttat tttgtctcgt tcgagcaaag tttgctgatg atctactcga tttgctcacc 60 ttcccgggtg cacatcgctt cttacataaa cccacgagga attccagcag tctctactcg 120 cgggctaata ataattttga tgttggcgtt cttcctggct accccactaa gaacgttaac 180 ctcttctcac cacttactaa ctccactttg cccattaatg gccttcatcg gagttaccaa 240 ccactcatgc tgaattgtct tactaaaata actaaccaca ctctcagcat gtatctccta 300 cctagtgaga 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gcuccaggug auucuacacc gcgucaaauu gcgacguugg uugucgauac acuugcagau 2520 gcuauaacag accacuuucc ggagaaaacc auugaucuac cugaagacua ucaagucuuu 2580 ucugaccaug augaccuccc acucgcacaa uaccacaucc cugaucaccu gagccuguau 2640 auucaggcua uggaagguga agaugauagu ggugaugaaa uauguauuga ggacgaugau 2700 uacgacuguc cucaagccga cgaagacaca gaaggaguaa uuccccaaca gugggaacuu 2760 ccugauguug auaaauuuuu acucaagauc caggaacgga agaccagcag cgacgaagua 2820 cuuagcgucg acgucuaucc uaaaccagag ccggucggca auguugggau ugacgacagc 2880 gcgucggaaa agaagccaaa uggggacuca guaccggauc cugaggucca uccaacacua 2940 gagagugugg auguugaacg accaaccgaa acagcaaacc aggcuguuga agacaaaccu 3000 ucugauacca ccuuuguggu ugaugaggaa caauuacaag aaucaacacc agaacaugaa 3060 cuccgcuccu augaagggga guuugauucu gaugaugaaa uuauuauucc uauaguacca 3120 guaacaccug cggauuuaaa accacagacu auuacuauaa aggaguacuu uaagucugaa 3180 aaacuugaga cuauuaacga aggauccaca gagucaguua cacaaucuga cgauucguuu 3240 gacgagucau uuguugaugc ugagucugau gauccacaag auccugcugu auaugaugau 3300 acaacaauua uaacggacag cacugaugua ggcgaugagc cugagacaac ucuagcuacc 3360 aucguuaaca caccucugac acucgauaau aacuugccac cugaagccau uaaacaaccc 3420 agcccaacua agguugaguu aguuguuggu gaauuggcga guauuaaauu ugacaauucu 3480 guucuaguca acccugcuaa ugcgcaauua acaaauggcg guggagcugc ucgugcaauu 3540 gcaaaauuag cugguccaaa auaucaagag uacuguaaua guguggcucc uaucucagga 3600 ccgcuuacca cggacucuuu ugaugccaag aaauuuggug uagccugcau cuugcaugua 3660 gugccaccca aagguucuga cccuaaugua caagaacucc uguaucaagc uuacaagagu 3720 auccuuacug aaccagcaca cuauguuaua ccuauacuag gugcugguau cuuuggaugc 3780 aauccagucc acucucugga ugcguucagg aaagcauguc caagugacau aggucguguc 3840 acccuuguca cuaugaacaa aaaccauuug cagguguggg augcucucaa uaggaccauu 3900 guacgcacca cuacugacua ugaucaaguu accaccaagg cccuuacacc ccagggagug 3960 uuagaagcca aucucuuuga uggugaggac uuuguucaag aaccaaaacc cggucaaauc 4020 uaccuugagg uuacugaaga aguucagaac caagccaagg aacuugaccu uaaccuucag 4080 caauacugcg ucuaccugaa gacuugccac cauaaauggg uugugagucg uacgaacggg 4140 uugaugcauc uaaaacaaaa agauaacaau uguuuuguua gugcaggugu aaaccuguuu 4200 caaaacacug cuuaucaacu uagaccugcu auugaugcuc ucuauaggga guaucuuaau 4260 gguaauccaa auagauuugu ugcuuggauc uacgcaucca cuaaccgucg uguuggugag 4320 auggguuguc cacagcaagu uauuucuuug cucguuagua acucugacgc agcauuuuca 4380 gcaacuacag ccuguuguaa caccuacuuu aaccacacag guguuauuuc aguagcucgu 4440 gaauaugacc caauacaacc aaaggucuac ugcaugaagu gugaugugug gacucccuuu 4500 acaccccaga guggaaaagg ugcaguugca auugguauuu cugcagauga accuaccggu 4560 ccugccauua aauuugccgc agcucacugc ugguacacua auggcaagaa aacaguuaau 4620 ggcuaugaca cuaaagcuaa uguuguagcu accuaucaua gguuugacgu gccuaagccu 4680 caacuugucg aggacguggu ugcgcugccu acuaaaaaug acuuugaagu ucucaauguu 4740 gaagaacugc cgcaggauag ugugcuccau uuggacccac cuccuguaca ggccuuacaa 4800 ccuaaggcua accaacacau ugagauucua gaaaacccag auuaucugga cauuuuggau 4860 cuuuggauuc guaaacccaa auucauccuc guaaagucgu ggaguguuuu ggguagagca 4920 cuauguaagg cagguaaagu ugucuuuguc agugcuucgc uuuugacccg uuucuacaau 4980 uaccuuguag agauuggugc ucuugacuca acaauaaggu ugucagucga ucuuaccugu 5040 aaauuuguua gaacgguucu cccaucgucu aacacuguac acaaaacuug ucuuggucug 5100 uauuauucag cccagacacu uuuuguuucu uuagcaccau uccuuauguu accagcugua 5160 guuagucugc uuaauucagg cuauacaauu ggcacauauu uguaugcaaa aacuggcugg 5220 ccuuguaauu acaaugccac gcaacacuuu gauuauaauu cuuacugugc aggugacuug 5280 guuugucaag ccuguuuuga cggucaagac ucccuacauu uguauccgca uuuacguguu 5340 aaucagcagc cccuucagac cacugacuac acuguuuaug cgcuuucacu aauacuacua 5400 uuagcuaaca ugacucuugu caugggcacg cuaauaguua cuuucuuugu gaacuucuau 5460 ggugugcaaa uaccauuuua ugguacacuu uugauagauu aucaauccgc acuggugauu 5520 acuuucucag uguacuacuu uuauaaggua augaaguuuu uccgccaucu cacacaugga 5580 uguaaaauuc caacgugugu gguaugugcc aaacuucgua ccccaccuac uauaacaguu 5640 gagacugucg uucagggcag gaaauaccca ucuguuauug aaacaaaugg cggguuuaca 5700 auuuguaaag aacacaacuu cuauugcaag gacugcucuu uacaaacacc cggcacuuuc 5760 aucccgacag aagcuauuga gucgcucuca cgagcuacca ggcuuagugu caaaccaaca 5820 gcaccagcau ucuuacuugc uagagauguu gagugccaaa cugauguugu cguugcucgc 5880 gcaaugcaua accaaaaugc gcaugugugc auuucaaaau acucugauau ccguaccguu 5940 gaccaacuac uuaagccuac uccacuguuu ucauacacuc ccgauguuau caucgcggca 6000 gacuuugaca acagagguag ucuuaagaca gcuaaagaau uagcuguggu uuugucaaug 6060 gaccuuaaac guacuauaau uaucauugau caggccuauu cuagaccuau ugauaauuau 6120 caggaaguug cuucucguau ugagaaguau uacccaguug caaagaucac acccacaggu 6180 gacaucuuua cagacauuaa gcaagcgacc aauggccaag cuagugacuc ugcuauuaau 6240 gcagcuguuc uggcugucca gcgcggucuu gauuuuacaa uugacaaccc uaacaacaua 6300 uuaccacauu acgccuuuga cuuuucgacc cucaaugcag aagaccaguc uaccauuuug 6360 gagagugguu gugcuaaagg caaucucaag ggcacuaaug uugguguugu ucuuucagcu 6420 agccuuguua cacgucuuag ucagcaggcu auacguguga uugcuaaugc ugcuucacgu 6480 aaugguguua caugcgcugu uacuccuucu acacuuguua ugcgugggaa uauugcaaca 6540 cagcccuuga cucgcaucaa agcuggugca ccucccaugc gucaaaaaau uuuauguguu 6600 auccuggcac uugcuauugu guacuuugcu gcuauggcuu uuggcuuuuu ggcaagucaa 6660 auuacgcuua auacagugcc uacgauuaaa ucugauaucc gcgccucuac cuucuacguu 6720 guuagagaug gagucuugga uacuguucgu ucaaaugaca agugcuuugc aaauaaguuu 6780 uuggcauuug auagcuucau ucaagcaccu uacacuaauu caccugacug uccaguuguu 6840 gugggaguug uugauguaac gacgcacucu auuccuggaa uuccagcagg ugucauucau 6900 agagacgguc ucauacuuaa cauuuaugaa cagucucuuu augaaacuca ucagcgucag 6960 ucuaugguua gggaugcguu gucacucaag acagcaaauc ucuuuaaccu aggcaagcgu 7020 guuguaguag gauacacuca acaugaaguu guugugggua ccuccuauuu uaauucuccu 7080 gcacuuuuua augcaaagug caccuucuua caguaucagg acacuagaca acucuauugc 7140 uaugauacug uuccuacuga acauaagcuc uacucugaug ugcuuccgca cgucgaguau 7200 aaggcuauug acauuaaugg ugaucuuguu ccuuucaaga uaccagagca gauaauguuc 7260 uauccacaua uugugcgcua uacuagcaau uccuauugcc guauggggca uuguuuuaau 7320 acuaacccug guauuugcau uucauuuacg gacgaauuuc cguauaguga aaaugucaaa 7380 ccuggugugu acugugcuga uaccucuuug caguuguuuu caaaccucgu uuugggcacu 7440 guaucuggua uucacaucuu uacaucaaca gcugcauugc uuggaucuac uauugugauc 7500 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aagaugguag gagcucuccu ccaguuaacu guucauacca acaacacagc cacuccagac 8400 uauaaguuug aaaggcucca accaggauca ucgaugacaa uugcuugugc uuaugauggc 8460 auuguacggc augucuauca cgugguccuc caacuuaaua aucuuauuua ugcaagcuuc 8520 cuuaacggag cuugugguag uguggguuac acucuuaagg guaaaacacu cuacuuacau 8580 uacaugcacc acauugaguu uaacaacaaa acucauagug guacagaucu ugaagguaac 8640 uucuauggcc ccuaugugga ugaggaaguu auucagcaac aaacagcauu ccaguauuac 8700 acugauaaug uuguugcuca auuauaugca cacuuacuga cuguugaugc uagaccaaaa 8760 uggcuggcac aaucucagau aaguaucgag gauuucaacu caugggcugc uaacaauucc 8820 uuugcuaacu ucccauguga acaaacuaau auguccuaca uuaugggacu cucgcaaaca 8880 gcucgagucc cuguagaacg uauccucaau accauuauac agcuaaccac caauagagau 8940 ggugcuugua uuaugggauc uuaugauuuc gagugcgauu ggacgccaga gaugguauac 9000 aaucaggcuc caauuucauu gcagucagga guaguuaaga aaacuuguac gugguucuuc 9060 cacuucuugu uuauggcuau uaccaugcua cucgcugcca ugcauguuuu cccuguacac 9120 uuguauccaa uaguacugcc augcuucacu gucguggcau uccuguugac uuuaaccauu 9180 aaacacacug uuguguuuac cacuacauac uugcuuccgu cacuuuugau gaugguugua 9240 aaugcuaaca cuuuuuggau accgaacaca uuucugcgca ccugcuacga aacuauauuc 9300 gguuccccaa uugcucagcg acuguauggu uacacuguug cucuuuauau gcugaucuau 9360 gcuggacuug caaucaacua uacguugaaa acacuccggu auagagcaac uucauucuua 9420 ucuuuuugca ugcagugguu ucaauauggu uauguugcac acauugcgua caaacugcuu 9480 aauaaacccu ggacagaauc acuacucuuc acagccuuca caaugcuaac cagucauccu 9540 uuguuggcug cucuuagcug guggcuagcu ggucgcguaa cucugcccau uaucaugccu 9600 gacuuagcua uucguguuuu ggcguauaac gucauuggcu augucauaug uguucgauuu 9660 ggccuuaugu ggcuugcaaa ucgguucaca acuguaccua ugggcacaua ccaguauaug 9720 gugucuguag agcaacuuaa guacaugaug gcaguuaaga uguccccacc gcguaaugcg 9780 uuugaggugc uuauagccaa cauuagacuu cuugguuugg guggaaaccg uaacauugcu 9840 guuucuacug uccaaaacaa aauucuugau gcaaaagcua cugcuguugu uguugcuaac 9900 cuucuugaaa aggcuggcgu cacaaacaag cacgcuauuu gcaaaaagau ugugaaacuc 9960 cacaaugaua cccuuaaagc caccacuuau gaggagguug agguagcacu ugugaaacuu 10020 cuuucucaca uaauugaguu cuugccaacu gaucagguag augcuuaucu agcugaugcg 10080 gccaaugcuc aacauguuaa uaccuauuuu gacaacuugc uugagaacaa agcuguuguu 10140 caggcuguug ccgauaucaa cauuaaucug gauucuuaua gaauuuauaa ggaggcagau 10200 gcuauuuaua aacgaucugu ugagaugaac gaaucuccgc aggagcaaaa gaaaaagcuu 10260 aaagcuguua acauugcaaa ggcggaaugg gagcgugagg cugcuucuca gcguaagcuu 10320 gaaaagcuug cugaugcugc uaugaagucu auguaucuug cagaacgugc ugaggaucgu 10380 cgcauuaagc uaaccucugg acuuacugca augcuuuacc auaugcuuag acgucuugac 10440 ucagauaggg uaaaagcucu guuugagugc gcuaaggcac aaaucuugcc aauacaugcu 10500 guagucggaa uuucuaauga caaccuuaaa guuauuuuua acgauaagga cagcuacucu 10560 cauuauguag agggcaacac acuuauacau aagggaguuc gcuacacuau ugugaagaaa 10620 cucuccuuag auaaugcacc uauugaaggc guaccagaag aauucccugu ggucguugag 10680 acuguuaggg aaggugugcc ccaguugcaa aauaaugagc uauguuugcg caauguuuuc 10740 acugcucaga acacagcuca ggacuucaau ggcaaugaau ccacuguaaa aucuuuuuau 10800 guuacuagaa ccgguaagaa gauuuugguu gccauuacau caacuaaaga caaucuuaag 10860 acugugaccu gccuuacuga gaccgguaag acaguccuua acuuggaccc cccuaugcgc 10920 uucgcacaua ccguaggugg aaaacagucu guugucuauc ucuauuuuau ucagaauauu 10980 aguucacuca acagagguau gguuauuggc cacaucucug aaacuacuau ccuucaggca 11040 aguggcacuc aaauugagua ccagcaaaau gccucucuuu ugaccuauuu ggcuuucgcu 11100 guagacccua agacagccua ccuuaagcau cuugcugaug gugggucucc uauacagggu 11160 uguauucaga ugauugcuac uauggguccu ggauuugcag uuacuacuaa accacaaccu 11220 aaugagcauc aguauucuua ugguggugcu ucaauuuguc uuuauugccg ugcucauaua 11280 ccacauccug guguugaugg acggugcccc uacaaaggcc gcuuuguuca caucgacaaa 11340 gauaaggaac cuguuuccuu cgccuugacu caugagccau gcaguucuug ucaacggugg 11400 guuaauuaug acugcaccug cggaucuagu cugcagaauu cggcuuauuu aaacgaguaa 11460 cggguucuag ugacgcccgg cuagaacccc ugcagccugg aacucaacca gaugcuguaa 11520 aaagggccuu ccaugugcau aaugauacca ccucugguau auucuuaagc acaaaaucua 11580 acugcgcucg guuuaaaacc acacgcagug cccugccuuu accuaauaag ggagagguug 11640 aauuguacuu uguuacuaag cagugugcag cuaaagucuu cgaaaucgag gaggaaugcu 11700 acaacgcucu uaguacagag cuuuauacua cugaugauac auuugguguc cuugccaaaa 11760 cugaguucuu uaaguuugac aagauaccua augucaaucg ccaguaucug acuaaauaua 11820 cacuccugga cuuggcuuau gcucuacguc auuugucaac aucuaaggau guuauucaag 11880 aaaucuugau caccaugugc ggaaccccug aagauugguu uggggaaaau ugguuugauc 11940 caauugagaa cccauccuuu uacaaggagu uccauaaacu uggggauauu cuuaaccguu 12000 guguucuuaa ugccaauaag uuugcuagug ccuguauaga cgcuggucuu guuggcauau 12060 uaacacccga caaccaagac cuccuggguc agaucuauga cuuuggagau uuuauuauua 12120 cacaaccagg uaauggaugu guggacuuag cauccuauua uucuuauuua augcccauua 12180 uguccaugac ucacauguua aagugugagu guauggauag ugauggcaac ccacuugagu 12240 augauggauu ucaguaugac uucacggacu ucaagcuugg cuuguucgag aaguauuuua 12300 aguacuggga ccguccuuac cauccuaaca cuguugaaug uccagaugac cguugcguau 12360 ugcacugugc gaacuucaau guguuguuug cuauguguau accuaauacg gcauuuggca 12420 aucuuuguuc aagagcuacu guugauggcc accuuguggu ccagacagug gguguacacu 12480 ugaaagaacu cgguauaguc cuuaaccagg acguuaccac acacauggca aauauuaauc 12540 uaaacacucu auugcgauug guuggugauc ccaccacuau ugcaaguguc ucagacaagu 12600 guguagauuu aagaacuccu ugucagaccu uggcuacuau gucuagcgga auugcuaaac 12660 agucagucaa gcccgggcau uuuaaucaac acuucuacaa gcauuugcuu gauaguaacc 12720 uauuagacca acuuggaaua gacauucgcc acuucuacua uaugcaggau ggugaagcgg 12780 cuaucacaga cuacagcuac uacagguaua auacccccac gaugguagau aucaagaugu 12840 ucuuauuuug ccuugaggug gcagauaagu aucuugagcc cuacgaaggu ggauguauua 12900 augcacaguc aguugugguc ucuaauuugg acaagucagc gggcuacccc uuuaacaagc 12960 uagguaaggc ucguaacuau uacgacauga cucaugccga gcaaaaucaa cuguuugagu 13020 auacaaaacg caauguuuug ccuacacuca cucagaugaa ccuuaaguau gcaauuucag 13080 ccaaggaucg ugcucgcacu guggcaggag ugucuauaau uagcaccaug acuaacaggc 13140 aguaccauca aaagaugcug aaaucuauuu cacuugcacg caaucagacc aucgugauug 13200 gaacaaccaa auucuauggu gguugggaca acauguuacg acgacugaug uguaauauca 13260 acaaucccau uuuagugggu ugggauuacc cuaaguguga ucguucuaug ccaaacaugc 13320 ugcgcauugc cgcuucgugc uugcuagcac gaaaacacac uugcuguaac caaagccagc 13380 gauucuaccg uuuggcuaau gaauguugcc aaguacuauc ugaaguggua gucucuggua 13440 acaaccucua uguaaaacca gguggcacua gcagugguga ugcaaccaca gcuuaugcca 13500 auucgguauu uaacaucuua caggugguuu cugcuaaugu agccaccuuc uuaucaacuu 13560 ccaccacgac acaucuuaau aaggacauug cggacuugca ucauagucuu uaugaagaua 13620 uuuaucgugg ugacucuaau gauaucacug ucaucaauag auucuaccag caucuccaaa 13680 guuacuuugg acuuaugaua uugucugaug auggugucgc augcauagac ucagccguug 13740 caaaggcugg agcuguugcu gaucuugaug guuuccgaga cauuuuguuu uaccaaaaca 13800 auguuuacau ggcagacuca aaguguugga cagaaacuga caugaauguu ggcccucaug 13860 aauuuugcuc acagcauacu guguuagcag agcaugaugg uaaaccuuac uacuuaccuu 13920 acccagaugu cucucgcauu cugggugcau gcaucuuugu ggaugacguu aacaaggcug 13980 acccuguuca gaaccuugaa cguuacaucu cacuugcaau ugaugcauau ccccucacca 14040 agguugaccc uauuaagggu aaagucuuuu auuuguuacu agacuacaua cguguucuug 14100 cucaggaguu acaggauggu auccuugaug cuuuccaauc acucacugac augucguaug 14160 uaaauaacuu uaugaaugag gccuuuuaug cucagaugua ugagcaaagu ccuacacuac 14220 aggccagcgg uguuugugug guguguaauu cacccacuau acugcgcugu ggugauugca 14280 uucgucgacc acuacuuugu ugcgucugug ccuaccagca uguuacgcag acuacacaua 14340 aacguaucau ugcuaucaac aacuacaucu guaguguuga gaauugcaau gaggacaaug 14400 uugaaaaacu uuucauuucu ggcacugcga uuuauuguga gaaucacaaa ccuacgcugu 14460 gcauacccau uguagcuaac gguucuguuu uugguaucua ucgccacacu gcccguggua 14520 gugaugacau agaccucuuu aacgagcuug cuacaucuaa cuaugacacu auugaaccuu 14580 aucagaaggc caaucgugca ccuuuaucac uuaugcucuu cgcugcugaa accauuaagg 14640 cacucgagga gucuaucaag aagucauaug cuaccgcaac cgucaaggau guguaugacc 14700 aacgcuucau uaaacuucua ugggaacagg guaaaaagcc gccacccaua acgaagaacc 14760 acauuuucac uggcuaccau uuuaacaaga auggaaaaac ccaaguuggu gauuacauuc 14820 uugcuaaaac agauggcagu gacacuuaua cuuacagagg aacaucuacc uacaaacucc 14880 aaacagguga uguucuaguc uuaauggcac auguuguuac accgcucuca gcacccccug 14940 ugcuaacgca gacaacauau gucagaaaau cacuuuuacc cgacucuguu ggugcgucuu 15000 auuaugugca acauuuuaag ucauauaaug agauagcuau gcagaggguu acaacaguau 15060 uagguccacc aggcacaggu aagucaaccu uugcuauugg uuuggcuaag uacuuuccca 15120 gugcacguau uugcuacacu gcgucuucgc augcagcaau cgaugcacuc ugugaaaaag 15180 cuuucaagac aauaccugua ggccaaugca gucguaucgu acccacacgu acaacuguug 15240 agugcuuuca ggaguuuguc guaaauaaca caacugcaca guauaucuuc ucgacuauca 15300 augccuuacc ugacauuaag ugugacauug uaguuguaga ugagguuucu auguugacca 15360 auuaugagcu uuccucugug aaugcucguu ugguuuacaa ucacauugug uauguuggug 15420 auccuuauca guuaccuuca ccuagaacua ugcuuacguc uggccagcuu ucgccagcug 15480 acuauaacgu aguuacugau auaaugguac augcaggagc ggauguuaug cucgacaugu 15540 gcuacagaug cccacgugaa aucguugaga cagugucuaa acuugucuac gauaacaaac 15600 uaaaagcggc gaaaccgaac ucaagacagu guuacaagac cauugugaac uuugguccug 15660 gagacguugc ucaugaggga caaucugccu acaacgaagc acaguugcgu uucgcacucg 15720 cauuuagaca acaaaagcgg ugggauaacg ugacuuucau aucuccauau aaugcuauga 15780 augugaaagc auccuuagca gguuucucua cucagaccgu ugacucuucu caagguucug 15840 aguaugauua uguuaucuuu ugcgugacca cugauucagc acacgcacuu aacauggcuc 15900 guuugaacgu ugcccuuaca cgugcaaaga uagguauccu ugugguguuu aggcaggcaa 15960 acgaacuuua caauaguuug caguuugaau cuauugauuc acagcuucag ucgagugcug 16020 agaaaaaccu cacaccacug uuuaagcgcu gcggcuauga guauaauggc guccauccag 16080 cucaugcuuu gaccuggcau gauuguggug cagaguaccg cugugaggag ccacuugcua 16140 aauuaguagg aguugccgau ggcacucuua uaucauacaa aacccuagua uccacacuug 16200 gguuucuucc aucacuuaaa auugaugcau aucauaauau guuccuaaca cgugaugcgu 16260 gucgcaccua uguucagagu uggaucggca uagauguuga agcagcacac gccauaaaac 16320 cuaacaccgg gacuaaccug ccauugcaaa uagguuuuag uaccggaaag aauuuuucag 16380 ucacuccaga gggaauuugg guaaacgagc acggaucuug cacugagccc gucccugcca 16440 aaauaccucc uggagaacaa uuucgucacc uuaaaaagga caugcgccag gcgcguccuu 16500 ggaugguugu ucgacgugag auugcuacuc acauugcuga gguagcuccu cacacugauu 16560 auauaugcuu ugucacuugg gcucaccagc uugagcuagc gacaaugcgc uacuuuguca 16620 aacuagguau ggaagagaga ugcuuuugug gcaggcgggc 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ttcatgcatg cagtgctagt acccaacaaa 2820 ttcacacgtg tcaacgcttc tgccggcatt tgtgtggata atacgagagg ctactcattg 2880 cagcctcaac ttatactcta ccagtttaat aactcctgga gagttacacc tagaaatatg 2940 tatgaaccca gactgccccg gcaggctgat ttcatacaat taactgattg cagcgttact 3000 ttttacaaca ccaccgctgc taatcttccc aatattatcc ctgacattat agatgtcaat 3060 caaacagtca gtgatattat tgacaattta cctacagcaa cacctcctca gtgggatgtt 3120 ggtatctata acaacactat tctcaacctc accgttgaga ttaatgatct acaagagcgg 3180 tctaaaaacc tctcacagat tgcagatcgt ttacaaaatt atattgacaa tcttaacaat 3240 actctagttg accttgaatg gctcaacaga gtggaaactt accttaaatg gccgtggtat 3300 atatggcttg ccattgccct ggctcttatt gcatttgtga caatcctcat aacaatcttt 3360 ctttgtactg gttgttgtgg tggttgcttt ggttgttgtg gcggttgttt tggccttttc 3420 tctaagaaga aaaggtatac cgacgaccaa ccaacaccgt cctttaagtt taaggaatgg 3480 <210> 8 <211> 1158 <212> PRT <213> Porcine Deltacorona Virus <400> 8 Met Gln Arg Ala Leu Leu Ile Met Thr Leu Leu Cys Leu Val Arg Ala 1 5 10 15 Lys Phe Ala Asp Asp Leu Leu Asp Leu 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aauuucauug cagucaggag uaguuaagaa aacuuguacg ugguucuucc 9120 acuucuuguu uauggcuauu accaugcuac ucgcugccau gcauguuuuc ccuguacacu 9180 uguauccaau aguacugcca ugcuucacug ucguggcauu ccuguugacu uuaaccauua 9240 aacacacugu uguguuuacc acuacauacu ugcuuccguc acuuuugaug augguuguaa 9300 augcuaacac uuuuuggaua ccgaacacau uucugcgcac cugcuacgaa acuauauucg 9360 guuccccaau ugcucagcga cuguaugguu acacuguugc ucuuuauaug cugaucuaug 9420 cuggacuugc aaucaacuau acguugaaaa cacuccggua uagagcaacu ucauucuuau 9480 cuuuuugcau gcagugguuu caauaugguu auguugcaca cauugcguac aaacugcuua 9540 auaaacccug gacagaauca cuacucuuca cagccuucac aaugcuaacc agucaucccu 9600 uguuggcugc ucuuagcugg uggcuagcug gucgcguaac ucugcccauu aucaugccug 9660 acuuagcuau ucguguuuug gcguauaacg ucauuggcua ugucauaugu guucgauuug 9720 gccuuaugug gcuugcaaau cgguucacaa cuguaccuau gggcacauac caguauaugg 9780 ugucuguaga gcaacuuaag uacaugaugg caguuaagau guccccaccg cguaaugcgu 9840 uugaggugcu uauagccaac auuagacuuc uugguuuggg uggaaaccgu aacauugcug 9900 uuucuacugu ccaaaacaaa auucuugaug caaaagcuac ugcuguuguu guugcuaacc 9960 uucuugaaaa ggcuggcguc acaaacaagc acgcuauuug caaaaagauu gugaaacucc 10020 acaaugauac ccuuaaagcc accacuuaug aggagguuga gguagcacuu gugaaacuuc 10080 uuucucacau aauugaguuc uugccaacug aucagguaga ugcuuaucua gcugaugcgg 10140 ccaaugcuca acauguuaau accuauuuag acaacuugcu ugagaacaaa gcuguuguuc 10200 aggcuguugc cgauaucaac auuaaucugg auucuuauag aauuuauaag gaggcagaug 10260 cuauuuauaa acgaucuguu gagaugaacg aaucuccgca ggagcaaaag aaaaagcuua 10320 aagcuguuaa cauugcaaag gcggaauggg agcgugaggc ugcuucucag cguaagcuug 10380 aaaagcuugc ugaugcugcu augaagucua uguaucuugc agaacgugcu gaggaucguc 10440 gcauuaagcu aaccucugga cuuacugcaa ugcuuuacca uaugcuuaga cgucuugacu 10500 cagauagggu aaaagcucug uuugagugcg cuaaggcaca aaucuugcca auacaugcug 10560 uagucggaau uucuaaugac aaccuuaaag uuauuuuuaa cgauaaggac agcuacucuc 10620 auuauguaga gggcaacaca cuuauacaua agggaguucg cuacacuauu gugaagaaac 10680 ucuccuuaga uaaugcaccu auugaaggcg uaccagaaga auucccugug gucguugaga 10740 cuguuaggga aggugugccc caguugcaaa auaaugagcu auguuugcgc aauguuuuca 10800 cugcucagaa cacagcucag gacuucaaug gcaaugaauc cacuguaaaa ucuuuuuaug 10860 uuacuagaac cgguaagaag auuuugguug ccauuacauc aacuaaagac aaucuuaaga 10920 cugugaccug ccuuacugag accgguaaga caguccuuaa cuuggacccc ccuaugcgcu 10980 ucacacauac cguaggugga aaacagucug uugucuaucu cuauuuuauu cagaauauua 11040 guucacucaa cagagguaug guuauuggcc acaucucuga aacuacuauc cuucaggcaa 11100 guggcacuca aauugaguac cagcaaaaug ccucucuuuu gaccuauuug gcuuucgcug 11160 uagacccuaa gacagccuac cuuaagcauc uugcugaugg ugggucuccu auacaggguu 11220 guauucagau gauugcuacu auggguccug gauuugcagu uacuacuaaa ccacaaccua 11280 augagcauca guauucuuau gguggugcuu caauuugucu uuauugccgu gcucauauac 11340 cacauccugg uguugaugga cggugccccu acaaaggccg cuuuguucac aucgacaaag 11400 auaaggaacc uguuuccuuc gcuuugacuc augagccaug caguucuugu caacgguggg 11460 uuaauuauga cugcaccugc ggaucuaguc ugcagaauuc ggcuuauuua aacgcguaac 11520 ggguucuagu gacgcccggc uagaaccccu gcagccugga acucaaccag augcuguaaa 11580 aagggccuuc caugugcaua augauaccac cucugguaua uucuuaagca caaaaucuaa 11640 cugcgcucgg uuuaaaacca cacgcagugc ccugccuuua ccuaauaagg gagagguuga 11700 auuguacuuu guuacuaagc agugugcagc uaaagucuuc gaaaucgagg aggaaugcua 11760 caacgcucuu aguacagagc uuuauacuac ugaugauaca uuuggugucc uugccaaaac 11820 ugaguucuuu aaguuugaca agauaccuaa ugucaaucgc caguaucuga cuaaauauac 11880 acuccuggac uuggcuuaug cucuacguca uuugucaaca ucuaaggaug uuauucaaga 11940 aaucuugauc accaugugcg gaaccccuga agauugguuu ggggaaaauu gguuugaucc 12000 aauugagaac ccauccuuuu acaaggaguu ccauaaacuu ggggauauuc uuaaccguug 12060 uguucuuaau gccaauaagu uugcuagugc cuguauagac gcuggucuug uuggcauauu 12120 aacacccgac aaccaagacc uccuggguca gaucuaugac uuuggagauu uuauuauuac 12180 acaaccaggu aauggaugug uggacuuagc auccuauuau ucuuauuuaa ugcccauuau 12240 guccaugacu cacauguuaa agugugagug uauggauagu gauggcaacc cacuugagua 12300 ugauggauuu caguaugacu ucacggacuu caagcuuggc uuguucgaga aguauuuuaa 12360 guacugggac cguccuuacc auccuaacac uguugaaugu 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cgcguccuug 16560 gaagguuguu cgacgugaga uugcuacuca cauugcugag guagcuccuc acacugauua 16620 uauaugcuuu gucacuuggg cucaccagcu ugagcuagcg acaaugcgcu acuuugucaa 16680 acuagguaug gaagagaaau gcuuuugugg caggcgggcu uguuucacua auggaacuga 16740 guucgcuugc aaagcacacc auucucucac cauuccacaa ugugauuaug uguacaaucc 16800 auuccucauc gacguggcua cguggggauu cucgggacgg cuuuccacca accaugacgc 16860 ugugugcaca uaucaugcua augcccaugu ugcaucagcu gaugcaauca ugacgguaug 16920 uuuagcuauc caugaacugu ucaguacugu ugacuggaac uuugaauuuc caguaacugc 16980 ugagcaaucg caacuuaaca aggccugucg cuuaguacag gcgaauuacu uaaauauacu 17040 acucacuaca accaaagcca cggugguuca cgauauuggu aacccaaaag guaucccuau 17100 cgugcgcaaa ccugguguua aauaucacuu cuaugaucaa gcacccauug ucaaacacgu 17160 ucaaaaacua aaguacaagc cagagaugga ggcccguuuc accgaugguu ugacuauguu 17220 uuggaauugu aauguugaca cauacccugc uaacgcccuu gugugccgcu acgacacuca 17280 ucggcagaag cauuuaauug gaccuaaugg uucagcacua uauguuaaua agcaugcuuu 17340 ucucaccccu gagaugcaua cuuaugcuac acauaaacuc aacuuggcuc cacucaucua 17400 cuacuccacc acagauugua guagugaaca gccuauuguu guuaccuaca gagauugugu 17460 cacccggugc aauacuggaa aaacucucug uccaaaucau gcucuugaau accaagaguu 17520 uaucaaugca uacaaucuca uggcucgcca uggauuuaau guuuacauac cacgcaaugu 17580 caacguuuac aacuguuggc uuacuuucac uaaucuccaa aaccuugaaa acuuagcuua 17640 caacuguuau uauaagaacu gcaaugcuca cguugauggg cagcuugaug uaguuauuaa 17700 uaauaacgcu guauaugcua aggucgacaa uaaucuuguc aaacuuuucg acaaccgcac 17760 uaacuuaccu gucucagugg ccuuugaaca uuacacuaac aggcauaccc guucacugcc 17820 aacuacacag cuguuaucug guuuaggcgu aaccgccacc agaaauuuca cugugugguu 17880 cgacaaugau acaauuuucc aauacacuau uaauguaucu acguauacug acaucgaccc 17940 uaguacccau guuguccucu gugaugauag guacggaaca gauuggaguc aguuuaacca 18000 acuuccuaau gcaguauucc ucaccaaaac uaaggugaag aaaacagaac cguuuguuug 18060 uacagcacug acccuaaaug gcgucgccau ugacggugaa gagcuauaca ucuauguacg 18120 cuauaacaau caacugacca cauuugcuac uacuuguaca caggguagaa auguugagca 18180 guuuauaccu aaaacaccua uggaaagaga 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uuuaucauuc gaccaucgcu ccaagucauu cuugaagaug 24060 aauuaaauua aaguuuugac accaaucuau cauggcugca ccaguagucc cuacuacuga 24120 cgcgucuugg uuucaggugc ucaaagcuca aaacaaaaag gcuacucauc cucaguuucg 24180 uggcaaugga guuccgcuua acuccgccau caaacccguu gaaaaccaug gcuacuggcu 24240 gcguuacacc agacaaaagc caggugguac ucccauuccu ccauccuaug ccuuuuauua 24300 uacuggcaca ggucccagag gaaaucuuaa guauggugaa cucccuccua augauacccc 24360 agcaaccacu cguguuacuu ggguuaaggg uucgggagcu gacacuucua uuaaaccuca 24420 uguugccaaa cgcaacccca acaauccuaa acaucagcug cuaccucucc gauucccaac 24480 cggagauggc ccagcucaag guuucagagu ugaccccuuc aacgcuagag gaagaccuca 24540 ggagcgugga aguggcccaa gaucucaauc uguuaacucc agaggcacag gcaaucagcc 24600 caggaaacgc gaccaaucug caccagcugc gguacgucgu aagacccagc aucaagcucc 24660 caagcggacu uuacccaagg guaaaaccau uucucaggua uuuggcaacc ggucucguac 24720 uggugccaau gucggcucug cagacacuga gaagacgggu auggcugauc cucgcaucau 24780 ggcucuagcc agacaugugc cugguguuca ggaaaugcuu uuugcuggcc accuugagag 24840 caacuuucag 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aacacuauac 2880 uaucccaccg augguaauag cguuguuccu aucugcuuua agaagaaagg ugguggugau 2940 gucaaauucu cugaugaagu cucuguuaaa accauugacc caguuuauaa ggucucccuu 3000 gaauuugagu ucgagucuga gacuauuaug gcugugcuua auaaggcugu ugguaauugu 3060 aucaagguua caggugguug ggacgauguu guugaguaua ucaauguugc cauugagguu 3120 cuuaaagauc acaucgaugu gccuaaguac uacaucuaug augaggaagg uggcaccgau 3180 ccuaaucugc ccguaauggu uucucagugg ccguugaaug augacacgau cucacaggau 3240 cugcuugaug uugaaguugu uacugaugcg ccaguugauu ucgaggguga ugaaguagac 3300 uccucugacc cugauaaggu ggcagacgug gcuaacucug agccugagga ugacggucuu 3360 aauguagcuc cugaaacaaa uguagagucu gaaguugagg aaguugccgc aaccuugucc 3420 uuuauuaaag auacaccuuc cacaguuacu aaggauccuu uugcuuuuga cuuugcaagc 3480 uauggaggac uuaagguuuu aagacaaucu cauaacaacu gcuggguuac uucuaccuug 3540 gugcagcuac aauugcuugg caucguugau gacccugcaa uggagcuuuu uagugcuggu 3600 agaguugguc caaugguucg caaaugcuau gagucacaaa aggcuaucuu gggaucuuug 3660 ggugaugugu cggcuugccu agagucucug acuaaggacc uacacacacu 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ugccuucuua ugucauuuau 11280 gaaaaugcac gccaacagua ugaagaugcu guuaauaaug guucuccacc ucaguugguu 11340 aagcaauugc gccaugccau gaauguagca aagagcgaau uugaccguga ggcuucuacu 11400 cagcguaagc uugauagaau ggcggaacag gcugcagcac agauguacaa agaggcacga 11460 gcaguuaaua ggaaguccaa aguuguaagu gcuaugcauu cacugcuuuu ugguauguug 11520 agacguuugg acaugucuuc uguagacacc auucucaacu uggcaaagga ugggguugua 11580 ccucugucug ucauaccggc agucagugcu acuaagcuua acauuguuac uucugauauc 11640 gauucuuaua aucguaucca gcgugaggga uguguccacu acgcugguac cauuuggaau 11700 auaauugaua ucaaggacaa ugauggcaag gugguacacg uuaaggaggu aaccgcacag 11760 aaugcugagu cccugucaug gccccugguc cuugggugug agcguauugu caagcuccag 11820 aauaaugaaa uuauuccugg uaagcugaag cagcgcucca uuaaggcaga aggagauggc 11880 auaguuggag aagguaaggc acuuuacaau aaugagggug gacguacuuu uauguaugcu 11940 uucaucucgg acaaaccgga ccugcgugua gucaaguggg aguucgaugg ugguuguaac 12000 acuauugagc uagaaccacc acguaaguuc uugguggauu cuccuaaugg ugcacagauc 12060 aaguaucucu acuuuguucg uaaccuuaac acguuacgua ggggugcugu ucucggcuac 12120 auaggugcca cuguacgcuu gcaggcuggu aaacaaacag aacaggcuau uaacucuuca 12180 uuguugacac uuugcgcuuu cgcuguggau ccugcuaaga ccuacaucga ugcugucaaa 12240 aguggucaca aaccaguagg uaacuguguu aagauguugg ccaaugguuc ugguaaugga 12300 caagcuguua cuaauggugu ggaggcuagu acuaaccagg auucauacgg uggugcgucc 12360 gugugucuau auuguagagc acauguugag cauccaucua uggaugguuu uugcagacug 12420 aaaggcaagu acguacaggu uccacuaggu acaguggauc cuauacguuu uguacuugag 12480 aaugacguuu gcaagguuug ugguuguugg cuggcuaaug gcugcacuug ugacagaucc 12540 auuaugcaaa gcacugauau ggcuuauuua aacgaguacg gggcucuagu gcagcucgac 12600 uagagcccug uaacgguacu gauacacaac auguguaucg ugcuuuugac aucuacaaca 12660 aggauguugc uugucuaggu aaauuccuca aggugaacug uguucgccug aagaauuugg 12720 auaagcauga ugcauucuau guugucaaaa gauguaccaa gucugcgaug gaacacgagc 12780 aauccaucua uagcagacuu gaaaagugug gagccguagc cgaacacgau uucuucacuu 12840 ggaaggaugg ucgugccauc uaugguaacg uuuguagaaa ggaucuuacc gaguauacua 12900 ugauggauuu guguuacgcu uuacguaacu uugaugaaaa caauugcgau guucuuaaga 12960 gcauuuuaau uaagguaggc gcuugugagg aguccuacuu caauaauaaa gucugguuug 13020 acccuguuga aaaugaagac auucaucgug ucuaugcauu guuagguacc auuguuucac 13080 gugcuaugcu uaaaugcguu aaguucugug augcaauggu ugaacaaggu auaguuggug 13140 uugucacauu agauaaucag gaucuuaaug gugauuuuua ugauuuuggu gauuuuacuu 13200 guagcaucaa gggaaugggu auacccauuu gcacaucaua uuacucuuau augaugccug 13260 uuauggguau gacuaauugc cuugcuagug aguguuuugu uaagagugau auauuuggug 13320 aggauuucaa gucauaugac cugcuggaau augauuucac ggagcauaag acagcacucu 13380 ucaacaagua uuucaaguau uggggacugc aauaccaccc uaacugugug gacugcagug 13440 augagcagug cauaguucac ugugccaacu ucaauacguu guuuuccacu acuauaccua 13500 uuacggcauu uggaccuuug ugucgcaagu guuggauuga ugguguucca cugguaacua 13560 cagcugguua ucauuuuaaa caguuaggua uaguuuggaa caaugaccuc aacuuacacu 13620 cuagcaggcu cucuauuaac gaauuacucc aguuuuguag ugauccugca uugcuuauag 13680 caucaucacc agcccuuguu gaucagcgua cuguuugcuu uucaguugca gcgcuaggua 13740 cagguaugac 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gugaugcaac caccgcauau gcaaacucag uuuuuaauau cuuccaagca guaagugcca 14640 auguuaacaa acuucuuagu guugacagca augucuguca uaauuuagaa guuaagcaau 14700 ugcagcguaa gcuuuaugag ugcuguuaua gaucaacuac cgucgaugac caguucgucg 14760 uugaguauua ugguuacuug cguaaacauu uuucaaugau gauucuuucu gaugauggcg 14820 uuguuuguua uaacaaugac uaugcaucac uugguuaugu cgcugaucuu aacgcauuca 14880 aggcuguuuu guauuaccag aacaaugucu ucaugagcgc cucuaaaugu uggaucgagc 14940 cugacauuaa uaaagguccu caugaauuuu gcucgcagca uacuaugcag auugucgaua 15000 aagaugguac uuauuaccuu ccuuacccug auccuucaag aauucucucu gcaggugugu 15060 uuguugauga cguuguuaaa acugaugcag uuguauugcu ugaacguuau gugucauugg 15120 cuauagaugc cuacccguua ucuaagcaug aaaacccuga auauaagaag guguuuuaug 15180 ugcuuuugga uuggguuaag caucuguaca aaacucuuaa ugcuggugug uuagagucuu 15240 uuucugucac acuuuuggaa gauucuacug cuaaauucug ggaugagagc uuuuaugcca 15300 acauguauga gaaaucugca guuuuacaau cugcagggcu uuguguuguu uguggcucuc 15360 aaacuguuuu acguuguggu gauugucuac ggcguccuau gcuuuguacu aagugugcuu 15420 augaucaugu cauuggaaca acucacaagu ucauuuuggc caucacucca uauguguguu 15480 gugcuucaga uugugguguc aaugauguaa cuaagcucua cuuagguggu cuuaguuauu 15540 ggugucauga ccacaagcca cgucuugcau ucccguugug cucugcuggu aauguuuuug 15600 gcuuguacaa aaauucugcu accggcucac ccgauguuga agacuuuaau cgcauugcua 15660 cauccgauug gacugauguu ucugacuaca gguuggcaaa ugaugucaag gacucauugc 15720 gucuguuugc agcggaaacu aucaaggcca aggaggagag cguuaaguca uccuaugcuu 15780 gugcaacacu acaugagguu guaggaccua aagaguuguu gcucaaaugg gaagucggca 15840 gacccaaacc accccuuaau agaaauucgg uuuucacuug uuaucauaua acgaagaaca 15900 ccaaauuuca aaucggugag uuuguguuug agaaggcaga auaugauaau gaugcuguaa 15960 cauauaaaac uaccgccaca acaaaacuug uuccuggcau gguuuuugug cuuaccucac 16020 auaauguuca gccauugcgc gcaccgacca uugcuaauca agaacguuau uccacuauac 16080 auaaguugca uccugcuuuu aacauaccug aagcuuauuc uagcuuagug cccuauuacc 16140 aauugauugg uaagcagaag auuacaacua uucagggacc ucccgguagu gguaaaucuc 16200 acuguguuau agggcuaggu uuguacuauc caggugcacg uauaguguuu acagcuuguu 16260 cucaugcagc ggucgauuca cuuuguguga aagcuuccac ugcuuauagc aaugacaaau 16320 guucacgcau cauaccacag cgcgcucgug uugaguguua ugaugguuuc aagucuaaua 16380 auacuagugc ucaguaccuu uucucuacug ucaaugcuuu gccagagugc aaugcggaca 16440 uuguuguggu ggaugagguc ucuaugugca cuaauuauga cuugucuguc auaaaucagc 16500 gcaucagcua uaggcaugua gucuauguug gugacccuca acagcugccu gcaccacgug 16560 uuaugauuuc acgugguacu uuggaaccaa aggacuacaa cguugucacu caacgcaugu 16620 gugcccuuaa gccugauguu uucuugcaca aguguuaucg cuguccugcu gagauagugc 16680 guacuguguc ugagaugguc uaugaaaacc aauucauucc ugugcaccca gauagcaagc 16740 aguguuuuaa aaucuuuugc aaggguaaug uucagguuga uaaugguuca agcauuaauc 16800 gcaggcaauu ggauguugug cguauguuuu uggcuaaaaa uccuaggugg ucaaaggcug 16860 uuuuuauuuc uccuuauaac agccagaauu auguugccag ccgcaugcua ggucuacaaa 16920 uucagacagu ugacucaucc caggguagug aguaugacua ugucauuuac acacaaacuu 16980 cagauacugc ccaugccugu aauguuaaca gguuuaaugu ugccaucaca agggccaaga 17040 aaggcauauu auguauaaug ugcgauaggu cccuuuuuga ugugcuuaaa uucuuugagc 17100 uuaaauuguc ugauuugcag gcuaaugagg guuguggucu uuuuaaagac uguagcagag 17160 gugaugaucu guugccacca ucucacgcua acaccuucau gucuuuagcg gacaauuuua 17220 agacugauca agaucuugcu guucaaauag guguuaaugg acccauuaaa uaugagcaug 17280 uuaucucguu uauggguuuc cguuuugaua ucaacauacc caaccaucau acucucuuuu 17340 gcacacgcga cuuugccaug cgcaauguua gagguugguu aggcuuugac guugaaggag 17400 cacauguugu uggcucuaac gucgguacaa augucccauu gcaauuaggg uuuucuaacg 17460 guguugauuu uguugucaga ccugaagguu gcguuguaac agagucuggu gacuacauua 17520 aacccgucag agcucgugcu ccaccagggg aacaauucgc acaccuuuug ccuuuacuua 17580 aacgcggcca accaugggau guuguccgca aacguauagu gcagaugugu agugacuacc 17640 uggccaaccu aucagacaua cuaauuuuug uguugugggc uggugguuug gaguugacaa 17700 cuaugcguua uuuugucaag auuggaccaa guaagaguug ugauuguggu aagguugcua 17760 cuuguuacaa uagugcgcug cauacguacu guuguuucaa acaugcccuu gguugugauu 17820 aucuguauaa cccauacugu auugauauac agcagugggg auacaaggga ucacuuagcc 17880 uuaaccacca ugagcauugu aauguacaua gaaacgagca uguggcuucu ggugaugcca 17940 uaaugacucg cugucuggcc auacaugauu gcuuugucaa gaacguugac ugguccauca 18000 cauacccauu uauugguaau gaggcuguua uuaauaagag cggccgaauu gugcaaucac 18060 acacuaugcg gucaguucuu aaguuauaca auccgaaagc cauauaugau auuggcaauc 18120 cuaagggcau uagaugugcc guaacggaug cuaagugguu uugcuuugac aagaauccua 18180 cuaauucuaa ugucaagaca uuggaguaug acuauauaac acauggccaa uuugaugggu 18240 ugugcuuguu uuggaauugc aauguagaca uguauccaga auuuucugug gucugucguu 18300 uugauacucg cuguagguca ccacucaacu uggaggguug uaaugguggu ucacuguaug 18360 uuaauaauca ugcauuccau acaccggcuu uugacaagcg ugcuuuugcu aaguugaagc 18420 caaugccauu uuucuuuuau gaugauacug agugugacaa guuacaggac uccauaaacu 18480 auguuccucu uagggcuagu aacugcauua cuaaauguaa uguugguggu gcugucugua 18540 guaagcauug ugcuauguau cauagcuaug uuaaugcuua caacacuuuu acgucggcgg 18600 gcuuuacuau uugggugccu acuucguuug acaccuauaa ucuguggcag acauuuagua 18660 acaauuugca aggucuugag aacauugcuu ucaaugucgu aaagaaagga ucuuuuguug 18720 gugccgaagg 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aagucaagau ugcacccacg guuacuggga auauuaguau 22920 ucccaccaac uuuaguauga guauuaggac agaauauuua cagcuuuaca acacgccugu 22980 uaguguugau ugugccacau auguuuguaa ugguaacucu cguuguaaac aauuacucac 23040 ccaguacacu gcagcaugua agaccauaga gucagcauua caacucagcg cuaggcuuga 23100 gucuguugaa guuaacucua ugcuuacuau uucugaagag gcucuacagu uagcuaccau 23160 uaguucguuu aauggugaug gauauaauuu uacuaaugug cuggguguuu cuguguauga 23220 uccugcaagu ggcagggugg uacaaaaaag gucuuuuauu gaagaccugc uuuuuaauaa 23280 agugguuacu aauggccuug guacuguuga ugaagacuau aagcgcuguu cuaauggucg 23340 cucuguggca gaucuagucu gugcacagua uuacucuggu gucaugguac uaccuggugu 23400 uguugacgcu gagaagcuuc acauguauag ugcgucucuc aucgguggua uggugcuagg 23460 agguuuuacu ucugcagcgg cauugccuuu uagcuaugcu guucaagcua gacucaauua 23520 ucuugcucua cagacggaug uucuacagcg gaaccagcaa uugcuugcug agucuuuuaa 23580 cucugcuauu gguaauauaa cuucagccuu ugagaguguu aaagaggcua uuagucaaac 23640 uuccaagggu uugaacacug uggcucaugc gcuuacuaag guucaagagg uuguuaacuc 23700 gcagggugca 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caaguggccg ugguggguuu gguugauuau uuucauuguu cucaucuuug uugugucauu 24600 acuaguguuc ugcugcauuu ccacggguug uuguggaugc ugcggcugcu gcugugcuug 24660 uuucucaggu uguuguaggg guccuagacu ucaaccuuac gaaguuuuug aaaaggucca 24720 cgugcaguga uguuucuugg acuuuuucaa uacacgauug acacaguugu caaagauguc 24780 ucaaagucug cuaacuuguc uuuggaugcu guccaagagu uggagcucaa uguaguucca 24840 auuagacaag cuucaaaugu gacggguuuu cuuuucacca guguuuuuau cuacuucuuu 24900 gcacuguuua aagcgucuuc uuugaggcgc aauuauauua uguuggcagc gcguuuugcu 24960 gucauuguuc uuuauugccc acuuuuauau uauuguggug cauuuuuaga ugcaacuauu 25020 auuuguugca cacuuauugg caggcuuugu uuagucugcu uuuacuccug gcgcuauaaa 25080 aaugcgcucu uuauuauuuu uaauacuacg acacuuucuu uccucaaugg uaaagcagcu 25140 uauuaugacg gcaaauccau ugugauuuua gaagguggug accauuacau cacuuuuggc 25200 aacucuuuug uugcuuuugu uaguagcauc gacuuguauc uagcuauacg ugggcggcaa 25260 gaagcugacc uacagcuguu gcgaacuguu gagcuucuug auggcaagaa gcuuuauguc 25320 uuuucgcaac aucaaauugu uggcauuacu aaugcugcau uugacucaau ucaacuagac 25380 gaguaugcua caauuaguga augauaaugg ucuaguaguu aauguuauac uuuggcuuuu 25440 cguacucuuu uuccugcuua uuauaagcau uacuuucguc caauugguua aucugugcuu 25500 cacuugucac cgguugugua auagcgcagu uuacacaccu auagggcguu uguauagagu 25560 uuauaagucu uacaugcaaa uagacccccu cccuaguacu guuauugacg uauaaacgaa 25620 auaugucuaa cgguucuauu cccguugaug aggugauuca acaccuuaga aacuggaauu 25680 ucacauggaa uaucauacug acgauacuac uuguagugcu ucaguauggc cauuacaagu 25740 acucugcguu cuuguauggu gucaagaugg cuauucuaug gauacuuugg ccucuugugu 25800 uagcacuguc acuuuuugau gcaugggcua gcuuucaggu caauuggguc uuuuuugcuu 25860 ucagcauccu uauggcuugc aucacucuua ugcuguggau aauguacuuu gucaauagca 25920 uucgguugug gcgcaggaca cauucuuggu ggucuuucaa uccugaaaca gacgcgcuuc 25980 ucacuacuuc ugugaugggc cgacaggucu gcauuccagu gcuuggagca ccaacuggug 26040 uaacgcuaac acuccuuagu gguacauugc uuguagaggg cuauaagguu gcuacuggcg 26100 uacagguaag ucaauuaccu aauuucguca cagucgccaa ggccacuaca acaauugucu 26160 acggacgugu uggucguuca gucaaugcuu caucuggcac 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ugacaagcuu aagcaacagc agaagcccaa 27060 acaggaaagg ucugacagca gcggcaaaaa uacaccuaag aagaacaaau ccagagccac 27120 uucgaaagaa cgugaccuca aagacauccc agaguggagg agaauuccca agggcgaaaa 27180 uagcguagca gcuugcuucg gacccagggg aggcuucaaa aauuuuggag augcggaauu 27240 ugucgaaaaa gguguugaug ccucaggcua ugcucagauc gccaguuuag caccaaaugu 27300 ugcagcauug cucuuuggug guaauguggc uguucgugag cuagcggacu cuuacgagau 27360 uacauauaau uauaaaauga cugugccaaa gucugaucca aauguagagc uucuuguuuc 27420 acagguggau gcauuuaaaa cugggaaugc aaaaccccag agaaagaagg aaaagaagaa 27480 caagcgugaa accacgcagc agcugaauga agaggccauc uacgaugaug ugggugugcc 27540 aucugaugug acucaugcca auuuggaaug ggacacagcu guugauggug gugacacggc 27600 cguugaaauu aucaacgaga ucuucgacac aggaaauuaa acaauguuug acuggcuuau 27660 ccuggcuaug ucccagggua gugccauuac acuguuauua cugaguguuu uucuagcgac 27720 uuggcugcug ggcuauggcu uugcccucua acuagcgguc uuggucuugc acacaacggu 27780 aagccagugg uaaugucagu gcaagaagga uauuaccaua gcacugucau gaggggaacg 27840 caguaccuuu ucaucuaaac cuuugcacga guaaucaaag auccgcuuga cgagccuaua 27900 uggaagagcg ugccagguau uugacucaag gacuguuagu aacugaagac cugacggugu 27960 <210> 33 <211> 27976 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDV 1251-125-10 (125-10) passage30 Genomic cDNA <400> 33 aattcaacta aacgaaattt tgtccttccg gccgcatgtc catgctgctg gaagctgacg 60 tggaatttca ttaggtttgc ttaagtagcc atcgcaagtg ctgtgctgtc ctctagttcc 120 tggttggcgt tccgtcgcct tctacatact agacaaacag ccttcctccg gttccgtctg 180 ggggttgtgt ggataactag ttccgtctag tttgaaacca gtaactgtcg gctatggcta 240 gcaaccatgt tacattggct tttgccaatg atgcagaaat ttcagctttt ggcttttgca 300 ctgctagtga agccgtctca tactattctg aggccgccgc tagtggattt atgcaatgcc 360 gtttcgtgtc cttcgatctc gctgacactg ttgagggatt gcttcccgaa gactatgtca 420 tggtggtggt cggcactacc aagcttagtg cgtatgtgga cacttttggt agccgcccca 480 aaaacatttg tggttggctg ttattttcta actgtaatta cttcctcgaa gagttagagc 540 ttacttttgg tcgtcgtggt ggtaacatcg tgccagttga ccaatacatg tgtggcgctg 600 acggtaaacc tgttcttcag gaatccgaat gggagtatac 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gcugucucuc uagcaugaau gucucagcaa 11040 auucaacaga augggccuau uguguugacu ugcauaacaa gaucaacuug uguaaugacc 11100 cagaaaaagc gcaggaaaug cuacuugcuu uguuggcauu uuuccuuagu aagaauagug 11160 cuuuugguuu agaugacuua uuggaauccu auuuuaauga caauaguaug uugcagagug 11220 uugcaucuac uuaugucggu uugccuucuu augucauuua ugaaaaugca cgccaacagu 11280 augaagaugc uguuaauaau gguucuccac cucaguuggu uaagcaauug cgccaugcca 11340 ugaauguagc aaagagcgaa uuugaccgug aggcuucuac ucagcguaag cuugauagaa 11400 uggcggaaca ggcugcagca cagauguaca aagaggcacg agcaguuaau aggaagucca 11460 aaguuguaag ugcuaugcau ucacugcuuu uugguauguu gagacguuug gacaugucuu 11520 cuguagacac cauucucaac uuggcaaagg augggguugu accucugucu gucauaccgg 11580 cagucagugc uacuaagcuu aacauuguua cuucugauau cgauucuuau aaucguaucc 11640 agcgugaggg auguguccac uacgcuggua ccauuuggaa uauaauugau aucaaggaca 11700 augauggcaa ggugguacac guuaaggagg uaaccgcaca gaaugcugag ucccugucau 11760 ggccccuggu ccuugggugu gagcguauug ucaagcucca gaauaaugaa auuauuccug 11820 guaagcugaa gcagcgcucc 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gugucgcaag uguuggauug augguguucc acugguaacu acagcugguu aucauuuuaa 13560 acaguuaggu auaguuugga acaaugaccu caacuuacac ucuagcaggc ucucuauuaa 13620 cgaauuacuc caguuuugua gugauccugc auugcuuaua gcaucaucac cagcccuugu 13680 ugaucagcgu acuguuugcu uuucaguugc agcgcuaggu acagguauga cuaaccagac 13740 uguuaaaccu ggccauuuca auaaggaguu uuaugacuuc uuacuugagc aagguuucuu 13800 uucugagggc ucugagcuua cuuuaaagca cuucuucuuu gcacagaagg gugaugcagc 13860 uguuaaggau uuugacuacu auagguauaa uagaccuacu guucuggaca uuugccaagc 13920 ucgcgucgug uaucaaauag ugcaacgcua uuuugauauu uacgaaggug guuguaucac 13980 ugcuaaagag gugguuguua caaaccuuaa caagagcgca gguuauccuu ugaacaaguu 14040 ugguaaagcu ggucuuuacu augagucuuu auccuaugag gaacaggaug aacuuuaugc 14100 uuauacuaag cguaacaucc ugcccacuau gacacagcuc aaccuuaaau augcuauaag 14160 uggcaaagaa cgugcacgca cagugggugg uguuucgcuu uugucaacca ugacuacucg 14220 gcaguaucau cagaaacacc uuaaguccau aguuaauacu aggggcgcuu cgguuguuau 14280 ugguacuacu aaguuuuaug gugguuggga caauaugcuu aagaaccuua 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uaacugcauu acuaaaugua auguuggugg ugcugucugu aguaagcauu gugcuaugua 18540 ucauagcuau guuaaugcuu acaacacuuu uacgucggcg ggcuuuacua uuugggugcc 18600 uacuucguuu gacaccuaua aucuguggca gacauuuagu aacaauuugc aaggucuuga 18660 gaacauugcu uucaaugucg uaaagaaagg aucuuuuguu ggugccgaag gugaacuucc 18720 uguagcugug guuaaugaca aagugcucgu uagagauggu acuguugaua cucuuguuuu 18780 uacaaacaag acaucacuac ccacuaacgu agcuuuugag uuguaugcca agcguaaggu 18840 aggacucacc ccacccauua cgauccuacg uaacuugggu guaguuugua caucuaagug 18900 ugucauuugg gacuaugaag ccgaacgucc acuuacuacu uuuacaaagg auguuuguaa 18960 auauaccgac uuugagggug acgucuguac acucuuugau aacagcauug uugguucauu 19020 agagcgauuc uccaugaccc aaaaugcugu gcuuauguca cuuacagcug uuaaaaagcu 19080 uayuggcaua aaguuaacuu augguuaucu uaaugguguc ccaguuaaca cacaugaaga 19140 uaaaccuuuu acuugguaua uuuacacuag gaagaacggc aaguucgagg accauccuga 19200 uggcuauuuu acccaaggua gaacaaccgc ugauuuuagc ccucguagcg acauggaaaa 19260 ggacuuccua aguauggaua ugggucuguu uauuaacaag uacggacuug 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agaaugucac uaguggugcu guuuauucug uuacgccaug uucuuuuuca 22680 gagcaggcug cauauguuga ugaugauaua guggguguua uuucuaguuu gucuagcucc 22740 acuuuuaaca guacuaggga guugccuggu uucuucuacc auucuaauga uggcucuaau 22800 uguacagagc cuguguuggu guauaguaac auagguguuu guaaaucugg caguauuggc 22860 uacgucccau cucagucugg ccaagucaag auugcaccca cgguuacugg gaauauuagu 22920 auucccacca acuuuaguau gaguauuagg acagaauauu uacagcuuua caacacgccu 22980 guuaguguug auugugccac auauguuugu aaugguaacu cucguuguaa acaauuacuc 23040 acccaguaca cugcagcaug uaagaccaua gagucagcau uacracucag cgcuaggcuu 23100 gagucuguug aaguuaacuc uaugcuuacu auuucugaag aggcucuaca guuagcuacc 23160 auuaguucgu uuaaugguga uggauauaau uuuacuaaug ugcugggugu uucuguguau 23220 gauccugcaa ggggcagggu gguacaaaaa aggucuuuua uugaagaccu gcuuuuuaau 23280 aaagugguua cuaauggccu ugguacuguu gaugaagacu auaagcgcug uucuaauggu 23340 cgcucugugg cagaucuagu cugugcacag uauuacucug gugucauggu acuaccuggu 23400 guuguugacg cugagaagcu ucacauguau agugcgucuc ucaucggugg uauggugcua 23460 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830 Glu Ser Ala Leu Gln Leu Ser Ala Arg Leu Glu Ser Val Glu Val Asn 835 840 845 Ser Met Leu Thr Ile Ser Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala Thr Ile Ser 850 855 860 Ser Phe Asn Gly Asp Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Val Leu Gly Val Ser 865 870 875 880 Val Tyr Asp Pro Ala Ser Gly Arg Val Val Gln Lys Arg Ser Phe Ile 885 890 895 Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Thr Val 900 905 910 Asp Glu Asp Tyr Lys Arg Cys Ser Asn Gly Arg Ser Val Ala Asp Leu 915 920 925 Val Cys Ala Gln Tyr Tyr Ser Gly Val Met Val Leu Pro Gly Val Val 930 935 940 Asp Ala Glu Lys Leu His Met Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Gly Gly Met 945 950 955 960 Val Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ser Tyr Ala 965 970 975 Val Gln Ala Arg Leu Asn Tyr Leu Ala Leu Gln Thr Asp Val Leu Gln 980 985 990 Arg Asn Gln Gln Leu Leu Ala Glu Ser Phe Asn Ser Ala Ile Gly Asn 995 1000 1005 Ile Thr Ser Ala Phe Glu Ser Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln Thr 1010 1015 1020 Ser Lys Gly Leu Asn Thr Val Ala His Ala Leu Thr Lys Val Gln 1025 1030 1035 Glu Val Val Asn Ser Gln Gly Ala Ala Leu Thr Gln Leu Thr Val 1040 1045 1050 Gln Leu Gln His Asn Phe Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile Asp Asp 1055 1060 1065 Ile Tyr Ser Arg Leu Asp Ile Leu Ser Ala Asp Val Gln Val Asp 1070 1075 1080 Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Ser Ala Leu Asn Ala Phe Val Ala 1085 1090 1095 Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Thr Glu Val Gln Ala Ser Arg Lys Leu 1100 1105 1110 Ala Gln Gln Lys Val Asn Glu Cys Val Lys Ser Gln Ser Gln Arg 1115 1120 1125 Tyr Gly Phe Cys Gly Gly Asp Gly Glu His Ile Phe Ser Leu Val 1130 1135 1140 Gln Ala Ala Pro Gln Gly Leu Leu Phe Leu His Thr Val Leu Val 1145 1150 1155 Pro Ser Asp Phe Val Asp Val Ile Ala Ile Ala Gly Leu Cys Val 1160 1165 1170 Asn Asp Glu Ile Ala Leu Thr Leu Arg Glu Pro Gly Leu Val Leu 1175 1180 1185 Phe Thr His Glu Leu Gln Asn His Thr Ala Thr Glu Tyr Phe Val 1190 1195 1200 Ser Ser Arg Arg Met Phe Glu Pro Arg Lys Pro Thr Val Ser Asp 1205 1210 1215 Phe Val Gln Ile Glu Ser Cys Val Val Thr Tyr Val Asn Leu Thr 1220 1225 1230 Arg Asp Gln Leu Pro Asp Val Ile Pro Asp Tyr Ile Asp Val Asn 1235 1240 1245 Lys Thr Leu Asp Glu Ile Leu Ala Ser Leu Pro Asn Arg Thr Gly 1250 1255 1260 Pro Ser Leu Pro Leu Asp Val Phe Asn Ala Thr Tyr Leu Asn Leu 1265 1270 1275 Thr Gly Glu Ile Ala Asp Leu Glu Gln Arg Ser Glu Ser Leu Arg 1280 1285 1290 Asn Thr Thr Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ile Tyr Asn Ile Asn Asn 1295 1300 1305 Thr Leu Val Asp Leu Glu Trp Leu Asn Arg Val Glu Thr Tyr Ile 1310 1315 1320 Lys Trp Pro Trp Trp Val Trp Leu Ile Ile Phe Ile Val Leu Ile 1325 1330 1335 Phe Val Val Ser Leu Leu Val Phe Arg Asn Arg Asn Arg Gln Tyr 1340 1345 1350 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P290194A PEDV 2b BD- FORWARD PRIMER N-terminal fragment <400> 48 ggatccgcca ccatggtatc tg 22 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P3183131B PEDV 2b BD- Reverse PRIMER N-terminal fragment <400> 49 gtcgatgcta tggtccaaaa accag 25 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P3183131A PEDV 2b BD- FORWARD PRIMER 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ttgtgctatg 600 caatatgttt atacacctac ctactacatg cttaatgtta ctagtgcagg tgaggatggc 660 atttattatg aaccatgtac agctaattgc agtggttacg ctgccaatgt gtttgccact 720 gattctaatg gccacatacc agaaggtttt agttttaata attggtttct tttgtccaat 780 gattccactt tgttgcatgg taaggtggtt tccaaccaac ctttgttggt caattgtctt 840 ttggccattc ctaagattta tggactaggc caatttttct cattcaatca aacgatggat 900 ggcgtttgta atggagctgc tgcgcagcgt gcaccagagg ctctgaggtt taatattaat 960 gacacctctg tcattcttgc tgaaggctca attgtacttc acactgcttt aggaacaaat 1020 ctttcttttg tttgcagtaa ttcttcagat cctcatttag ctaccttcac catacctctg 1080 ggtgctaccc aagtacccta ttattgtttt cttaaagtgg atacttacaa ctccactgtt 1140 tataaatttt tggctgtttt acctcctacc gtcagggaaa ttgtcatcac caagtatggt 1200 gatgtttatg tcaatgggtt tggatacttg catctcggtt tgttggatgc tgtcacaatt 1260 aatttcactg gtcatggcac tgacgatgat gtttctggtt tttggaccat agcatcgact 1320 aattttgttg atgcactcat cgaagttcaa ggaaccgcca ttcagcgtat tctttattgt 1380 gatgatcctg ttagccaact caagtgttct caggttgctt ttgaccttga cgatggtttt 1440 taccctattt cttctagaaa ccttctgagt catgaacagc caatttcttt tgttactctg 1500 ccatcattta atgatcattc ttttgttaac attactgtat ctgcttcctt tggtggtcat 1560 agtggtgcca accttattgc atctgacact actatcaatg ggtttagttc tttctgtgtt 1620 gacactagac aatttaccat ttcactgttt tataacgtta caaacagtta tggttatgtg 1680 tctaaatcac aggacagtaa ttgccctttc accttgcaat ctgttaatga ttacctgtct 1740 tttagcaaat tttgtgtttc caccagcctt ttggctagtg cctgtaccat agatcttttt 1800 ggttaccctg agtttggtag tggtgttaag tttacgtccc tttactttca attcacaaag 1860 ggtgagttga ttactggcac gcctaaacca cttgaaggtg tcacggacgt ttcttttatg 1920 actctggatg tgtgtaccaa gtatactatc tatggcttta aaggtgaggg tatcattacc 1980 cttacaaatt ctagcttttt ggcaggtgtt tattacacat ctgattctgg acagttgtta 2040 gcctttaaga atgtcactag tggtgctgtt tattctgtta cgccatgttc tttttcagag 2100 caggctgcat atgttgatga tgatatagtg ggtgttattt ctagtttgtc tagctccact 2160 tttaacagta ctagggagtt gcctggtttc ttctaccatt ctaatgatgg ctctaattgt 2220 acagagcctg tgttggtgta tagtaacata ggtgtttgta aatctggcag tattggctac 2280 gtcccatctc agtctggcca agtcaagatt gcacccacgg ttactgggaa tattagtatt 2340 cccaccaact ttagtatgag tattaggaca gaatatttac agctttacaa cacgcctgtt 2400 agtgttgatt gtgccacata tgtttgtaat ggtaactctc gttgtaaaca attactcacc 2460 cagtacactg cagcatgtaa gaccatagag tcagcattac aactcagcgc taggcttgag 2520 tctgttgaag ttaactctat gcttactatt tctgaagagg ctctacagtt agctaccatt 2580 agttcgttta atggtgatgg atataatttt actaatgtgc tgggtgtttc tgtgtatgat 2640 cctgcaagtg gcagggtggt acaaaaaagg tcttttattg aagacctgct ttttaataaa 2700 gtggttacta atggccttgg tactgttgat gaagactata agcgctgttc taatggtcgc 2760 tctgtggcag atctagtctg tgcacagtat tactctggtg tcatggtact acctggtgtt 2820 gttgacgctg agaagcttca catgtatagt gcgtctctca tcggtggtat ggtgctagga 2880 ggttttactt ctgcagcggc attgcctttt agctatgctg ttcaagctag actcaattat 2940 cttgctctac agacggatgt tctacagcgg aaccagcaat tgcttgctga gtcttttaac 3000 tctgctattg gtaatataac ttcagccttt gagagtgtta aagaggctat tagtcaaact 3060 tccaagggtt tgaacactgt ggctcatgcg cttactaagg ttcaagaggt tgttaactcg 3120 cagggtgcag ctttgactca acttaccgta cagctgcaac acaacttcca agccatttct 3180 agttctattg atgacattta ctctcgactg gacattcttt cagccgatgt tcaggttgac 3240 cgtctcatca ccggcagatt atcagcactt aatgcttttg ttgctcaaac cctcactaag 3300 tatactgagg ttcaggctag caggaagtta gcacagcaaa aggttaatga gtgcgttaaa 3360 tcgcaatctc agcgttatgg tttttgtggt ggtgatggcg agcacatttt ctctctggta 3420 caggcagcac ctcagggcct gctgttttta catacagtac ttgtaccgag tgattttgta 3480 gatgttattg ccatcgctgg cttatgcgtt aacgatgaaa ttgccttgac tctacgtgag 3540 cctggcttag tcttgtttac gcatgaactt caaaatcata ctgcgacgga atattttgtt 3600 tcatcgcgac gtatgtttga acctagaaaa cctaccgtta gtgattttgt tcaaattgag 3660 agttgtgtgg tcacctatgt caatttgact agagaccaac taccagatgt aatcccagat 3720 tacatcgatg ttaacaaaac acttgatgag attttagctt ctctgcccaa tagaactggt 3780 ccaagtcttc ctttagatgt ttttaatgcc acttatctta atctcactgg tgaaattgca 3840 gatttagagc agcgttcaga gtctctccgt aatactacag aggagctcca aagtcttata 3900 tataatatca acaacacact agttgacctt gagtggctca accgagttga gacatatatc 3960 aagtggccgt ggtgggtttg gttgattatt ttcattgttc tcatctttgt tgtgtcatta 4020 ctagtgttca gaaaccgcaa tcgtcagtac taa 4053 <210> 53 <211> 1350 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEDVS 2b BD Expression Casetter Amino Acid Sequence <400> 53 Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His 1 5 10 15 Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Arg Cys Gln Ser Thr Ile Asn Phe Arg 20 25 30 Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val Leu 35 40 45 Gly Gly Tyr Leu Pro Ser Met Asn Ser Ser Ser Trp Tyr Cys Gly Thr 50 55 60 Gly Leu Glu Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile Phe Leu Ser Tyr Ile 65 70 75 80 Asp Ser Gly Gln Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser Gln Glu Pro Phe Asp 85 90 95 Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala Thr Asn Gly Asn His 100 105 110 Asn Ala Ile Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe Pro Asn Asn Asn Thr 115 120 125 Leu Gly Pro Thr Val Asn Asp Val Thr Thr Gly Arg Asn Cys Leu Phe 130 135 140 Asn Lys Ala Ile Pro Ala Tyr Met Gln Asp Gly Lys Asn Ile Val Val 145 150 155 160 Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe Ala Asp Lys Ile 165 170 175 Tyr His Phe Tyr Leu Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val Ala Thr Arg Cys 180 185 190 Tyr Asn Lys Arg Ser Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr Thr Pro Thr Tyr 195 200 205 Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly Ile Tyr Tyr Glu 210 215 220 Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ser Gly Tyr Ala Ala Asn Val Phe Ala Thr 225 230 235 240 Asp Ser Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe Asn Asn Trp Phe 245 250 255 Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Leu His Gly Lys Val Val Ser Asn 260 265 270 Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro Lys Ile Tyr Gly 275 280 285 Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Met Asp Gly Val Cys Asn 290 295 300 Gly Ala Ala Ala Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg Phe Asn Ile Asn 305 310 315 320 Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val Leu His Thr Ala 325 330 335 Leu Gly Thr Asn Leu Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser Ser Asp Pro His 340 345 350 Leu Ala Thr Phe Thr Ile Pro Leu Gly Ala Thr Gln Val Pro Tyr Tyr 355 360 365 Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val Tyr Lys Phe Leu 370 375 380 Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile Thr Lys Tyr Gly 385 390 395 400 Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu Gly Leu Leu Asp 405 410 415 Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp Asp Asp Val Ser 420 425 430 Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp Ala Leu Ile Glu 435 440 445 Val Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys Asp Asp Pro Val 450 455 460 Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu Asp Asp Gly Phe 465 470 475 480 Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu Gln Pro Ile Ser 485 490 495 Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn Ile Thr 500 505 510 Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu Ile Ala Ser 515 520 525 Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg Gln 530 535 540 Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly Tyr Val 545 550 555 560 Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val Asn 565 570 575 Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu Ala 580 585 590 Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser Gly 595 600 605 Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu Ile 610 615 620 Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp Val Ser Phe Met 625 630 635 640 Thr Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly Phe Lys Gly Glu 645 650 655 Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala Gly Val Tyr Tyr 660 665 670 Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn Val Thr Ser Gly 675 680 685 Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu Gln Ala Ala Tyr 690 695 700 Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu Ser Ser Ser Thr 705 710 715 720 Phe Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr His Ser Asn Asp 725 730 735 Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser Asn Ile Gly Val 740 745 750 Cys Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Ser Gln Ser Gly Gln Val 755 760 765 Lys Ile Ala Pro Thr Val Thr Gly Asn Ile Ser Ile Pro Thr Asn Phe 770 775 780 Ser Met Ser Ile Arg Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Tyr Asn Thr Pro Val 785 790 795 800 Ser Val Asp Cys Ala Thr Tyr Val Cys Asn Gly Asn Ser Arg Cys Lys 805 810 815 Gln Leu Leu Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Cys Lys Thr Ile Glu Ser Ala 820 825 830 Leu Gln Leu Ser Ala Arg Leu Glu Ser Val Glu Val Asn Ser Met Leu 835 840 845 Thr Ile Ser Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala Thr Ile Ser Ser Phe Asn 850 855 860 Gly Asp Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Val Leu Gly Val Ser Val Tyr Asp 865 870 875 880 Pro Ala Ser Gly Arg Val Val Gln Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu 885 890 895 Leu Phe Asn Lys Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Thr Val Asp Glu Asp 900 905 910 Tyr Lys Arg Cys Ser Asn Gly Arg Ser Val Ala Asp Leu Val Cys Ala 915 920 925 Gln Tyr Tyr Ser Gly Val Met Val Leu Pro Gly Val Val Asp Ala Glu 930 935 940 Lys Leu His Met Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Gly Gly Met Val Leu Gly 945 950 955 960 Gly Phe Thr Ser Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ser Tyr Ala Val Gln Ala 965 970 975 Arg Leu Asn Tyr Leu Ala Leu Gln Thr Asp Val Leu Gln Arg Asn Gln 980 985 990 Gln Leu Leu Ala Glu Ser Phe Asn Ser Ala Ile Gly Asn Ile Thr Ser 995 1000 1005 Ala Phe Glu Ser Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln Thr Ser Lys Gly 1010 1015 1020 Leu Asn Thr Val Ala His Ala Leu Thr Lys Val Gln Glu Val Val 1025 1030 1035 Asn Ser Gln Gly Ala Ala Leu Thr Gln Leu Thr Val Gln Leu Gln 1040 1045 1050 His Asn Phe Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile Asp Asp Ile Tyr Ser 1055 1060 1065 Arg Leu Asp Ile Leu Ser Ala Asp Val Gln Val Asp Arg Leu Ile 1070 1075 1080 Thr Gly Arg Leu Ser Ala Leu Asn Ala Phe Val Ala Gln Thr Leu 1085 1090 1095 Thr Lys Tyr Thr Glu Val Gln Ala Ser Arg Lys Leu Ala Gln Gln 1100 1105 1110 Lys Val Asn Glu Cys Val Lys Ser Gln Ser Gln Arg Tyr Gly Phe 1115 1120 1125 Cys Gly Gly Asp Gly Glu His Ile Phe Ser Leu Val Gln Ala Ala 1130 1135 1140 Pro Gln Gly Leu Leu Phe Leu His Thr Val Leu Val Pro Ser Asp 1145 1150 1155 Phe Val Asp Val Ile Ala Ile Ala Gly Leu Cys Val Asn Asp Glu 1160 1165 1170 Ile Ala Leu Thr Leu Arg Glu Pro Gly Leu Val Leu Phe Thr His 1175 1180 1185 Glu Leu Gln Asn His Thr Ala Thr Glu Tyr Phe Val Ser Ser Arg 1190 1195 1200 Arg Met Phe Glu Pro Arg Lys Pro Thr Val Ser Asp Phe Val Gln 1205 1210 1215 Ile Glu Ser Cys Val Val Thr Tyr Val Asn Leu Thr Arg Asp Gln 1220 1225 1230 Leu Pro Asp Val Ile Pro Asp Tyr Ile Asp Val Asn Lys Thr Leu 1235 1240 1245 Asp Glu Ile Leu Ala Ser Leu Pro Asn Arg Thr Gly Pro Ser Leu 1250 1255 1260 Pro Leu Asp Val Phe Asn Ala Thr Tyr Leu Asn Leu Thr Gly Glu 1265 1270 1275 Ile Ala Asp Leu Glu Gln Arg Ser Glu Ser Leu Arg Asn Thr Thr 1280 1285 1290 Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ile Tyr Asn Ile Asn Asn Thr Leu Val 1295 1300 1305 Asp Leu Glu Trp Leu Asn Arg Val Glu Thr Tyr Ile Lys Trp Pro 1310 1315 1320 Trp Trp Val Trp Leu Ile Ile Phe Ile Val Leu Ile Phe Val Val 1325 1330 1335 Ser Leu Leu Val Phe Arg Asn Arg Asn Arg Gln Tyr 1340 1345 1350

Claims (52)

  1. 돼지 델타코로나바이러스 (porcine deltacoronavirus: PDCoV)의 1종 이상의 항원 및 아쥬반트를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)가,
    a) 서열 번호 1, 5 또는 9에 의해 암호화되고/되거나 서열 번호 1, 5 또는 9의 서열을 포함하고/하거나 서열 번호 1, 5 또는 9의 RNA 등가물을 포함하거나;
    b) 서열이 서열 번호 1과 적어도 99% 동일하고/하거나 서열 번호 1, 5 또는 9의 RNA 등가물과 적어도 99% 동일하거나;
    c) 스파이크 단백질 (spike protein)이 서열 번호 3, 7, 11, 17 또는 27의 핵산 서열에 의해 암호화되거나;
    d) 스파이크 단백질이 서열 번호 3, 7, 11, 17 또는 27과 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되거나;
    e) 서열 번호 2, 6 또는 10에 의해 암호화되거나;
    f) 서열이 서열 번호 2, 6 또는 10과 적어도 99% 동일한
    임의의 PDCoV인, 면역원성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아쥬반트가 수중유형 에멀젼인, 면역원성 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 재조합 항원 또는 불활성화된 전체 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 항원인, 면역원성 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원이 불활성화된 전체 PDCoV 항원인, 면역원성 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 PDCoV 항원이 화학적으로 불활성화되는, 면역원성 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 PDCoV 항원이 에틸렌이민, 바이너리 (binary) 에틸렌이민, 아세틸에틸렌이민 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물을 포함하는 화학적 불활성화제에 의한 처리에 의해 화학적으로 불활성화되는, 면역원성 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 PDCoV가 바이너리 에틸렌이민에 의한 처리에 의해 화학적으로 불활성화되는, 면역원성 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아쥬반트가 EMULSIGEN® 수중유형 에멀젼계 아쥬반트인, 면역원성 조성물.
  9. 제4항에 있어서, 불활성화된 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)가 서열 번호 1, 5 또는 9를 포함하고/하거나 서열 번호 1, 5 또는 9의 RNA 등가물을 포함하는, 면역원성 조성물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PDCoV 항원이 재조합 항원인, 면역원성 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 재조합 항원이 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 면역원성 성분을 포함하는, 면역원성 조성물:
    a) 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 스파이크 단백질의 항원을 암호화하는 단리된 핵산으로서, 상기 재조합 스파이크 폴리펩타이드가 서열 번호 4, 8, 12, 18 또는 28과 적어도 90%의 상동성을 갖는, 단리된 핵산;
    b) a)의 단리된 핵산을 포함하는 재조합 벡터;
    c) a)의 단리된 핵산에 의해 암호화되는 재조합 PDCoV 스파이크 단백질; 및
    d) 이들의 임의의 조합.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는, 면역원성 조성물.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수중유형 에멀젼이 EMULSIGEN® 수중유형 에멀젼계 아쥬반트인, 면역원성 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 1종 이상의 추가의 항원을 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 추가의 항원이 돼지 유행성 설사 바이러스 (porcine epidemic diarrhea virus: PEDV)의 항원이고, 여기서, 상기 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)가,
    a) 서열 번호 29에 의해 암호화되고/되거나 서열 번호 29 또는 33의 서열을 포함하고/하거나 서열 번호 29 또는 33의 RNA 등가물을 포함하거나;
    b) 서열이 서열 번호 29 또는 33과 적어도 99% 동일하고/하거나 서열 번호 29 또는 33의 RNA 등가물과 적어도 99% 동일거나;
    c) 스파이크 단백질이 서열 번호 30, 34, 46 또는 52의 핵산 서열에 의해 암호화되거나;
    d) 스파이크 단백질이 서열 번호 30, 34, 46 또는 52와 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되거나;
    e) 서열 번호 32 또는 36에 의해 암호화되거나;
    f) 서열 번호 32 또는 36과 적어도 99% 동일한 서열에 의해 암호화되는
    임의의 PEDV인, 면역원성 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 추가의 PEDV 항원이 재조합 항원 또는 불활성화된 전체 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)인, 면역원성 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항원이 불활성화된 전체 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)인, 면역원성 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 항원이 재조합 PEDV 항원인, 면역원성 조성물.
  19. 제16항 또는 제18항에 있어서, 상기 재조합 항원이 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 면역원성 성분을 포함하는, 면역원성 조성물:
    a) 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 스파이크 단백질의 항원을 암호화하는 단리된 핵산으로서, 상기 항원이 서열 번호 31, 35, 47 또는 52와 적어도 90%의 상동성을 갖는, 단리된 핵산;
    b) a)의 단리된 핵산을 포함하는 재조합 벡터;
    c) a)의 단리된 핵산에 의해 암호화되는 재조합 PEDV 스파이크 단백질; 및
    d) 이들의 임의의 조합.
  20. 제14항 내지 제16항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 항원이 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)의 구조 단백질 M, E 또는 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 면역원성 성분을 포함하는, 면역원성 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 면역원성 성분이 단리된 핵산인, 면역원성 조성물.
  22. 제19항에 있어서, 면역원성 성분이 재조합 벡터인, 면역원성 조성물.
  23. 제19항에 있어서, 면역원성 성분이 재조합 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV) 스파이크 단백질인, 면역원성 조성물.
  24. 제19항에 있어서, 면역원성 성분이 조합인, 면역원성 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 돼지에게 투여하는 것을 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)와 관련된 질병의 임상 증상을 감소시키는 방법.
  26. 제4항의 면역원성 조성물을 돼지에게 투여하는 것을 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)와 관련된 질병의 임상 증상을 감소시키는 방법.
  27. 제10항의 면역원성 조성물을 돼지에게 투여하는 것을 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)와 관련된 질병의 임상 증상을 감소시키는 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 면역원성 성분을 포함하는, 방법:
    a) 서열 번호 1, 5 또는 9에 의해 암호화되고/되거나 서열 번호 1의 서열을 포함하고/하거나 서열 번호 1, 5 또는 9의 RNA 등가물을 포함하는 것;
    b) 서열이 서열 번호 1, 5 또는 9와 적어도 99% 동일하고/하거나 서열 번호 1, 5 또는 9의 RNA 등가물과 적어도 99% 동일한 것;
    c) 스파이크 단백질이 서열 번호 3, 7, 11, 17 또는 27의 핵산 서열에 의해 암호화되는 것;
    d) 스파이크 단백질이 서열 번호 3, 7, 11, 17 또는 27과 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되는 것;
    e) 서열 번호 2, 6 또는 10에 의해 암호화되는 것; 및
    f) 서열이 서열 번호 2, 6 또는 10과 적어도 99% 동일한 것.
  29. 제26항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 면역원성 성분을 포함하는, 방법:
    a) 서열 번호 1, 5 또는 9의 서열에 의해 암호화되거나 이들을 포함하는 것;
    b) 서열이 서열 번호 1, 5 또는 9와 적어도 99% 동일한 것;
    c) 스파이크 단백질이 서열 번호 3, 7, 11, 17 또는 27의 핵산 서열에 의해 암호화되는 것; 및
    d) 스파이크 단백질이 서열 번호 3, 7, 11, 17 또는 27과 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되는 것.
  30. 제27항에 있어서, 상기 재조합 항원이 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 면역원성 성분을 포함하는, 방법:
    a) 돼지 유행성 설사 바이러스, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 스파이크 단백질의 항원을 암호화하는 단리된 핵산으로서, 상기 재조합 스파이크 폴리펩타이드가 서열 번호 4, 8, 12, 18 또는 28과 적어도 90%의 상동성을 갖는, 단리된 핵산;
    b) a)의 단리된 핵산을 포함하는 재조합 벡터;
    c) a)의 단리된 핵산에 의해 암호화되는 재조합 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 스파이크 단백질; 및
    d) 이들의 임의의 조합.
  31. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 돼지에게 투여하는 것을 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 및 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)와 관련된 질병의 임상 증상을 감소시키는 방법.
  32. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 돼지에게 투여하는 것을 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 및 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)와 관련된 질병의 임상 증상을 감소시키는 방법.
  33. 제14항 내지 제16항 및 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 돼지에게 투여하는 것을 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 및 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)와 관련된 질병의 임상 징후를 감소시키는 방법.
  34. 하기를 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)와 관련된 질병에 대해 돼지에서 면역원성 반응을 유도하기 위한 키트:
    a) 면역원성 조성물을 돼지에게 투여할 수 있는 디스펜서; 및
    b) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물.
  35. 하기를 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)와 관련된 질병에 대해 돼지에서 면역원성 반응을 유도하기 위한 키트:
    a) 면역원성 조성물을 돼지에게 투여할 수 있는 디스펜서; 및
    b) 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물.
  36. 하기를 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)와 관련된 질병에 대해 돼지에서 면역원성 반응을 유도하기 위한 키트:
    a) 면역원성 조성물을 돼지에게 투여할 수 있는 디스펜서; 및
    b) 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물.
  37. 하기를 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 및 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)와 관련된 질병에 대해 돼지에서 면역원성 반응을 유도하기 위한 키트:
    a) 면역원성 조성물을 돼지에게 투여할 수 있는 디스펜서; 및
    b) 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물.
  38. 하기를 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 및 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)와 관련된 질병에 대해 돼지에서 면역원성 반응을 유도하기 위한 키트:
    a) 면역원성 조성물을 돼지에게 투여할 수 있는 디스펜서; 및
    b) 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물.
  39. 하기를 포함하는, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 및 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)와 관련된 질병에 대해 돼지에서 면역원성 반응을 유도하기 위한 키트:
    a) 면역원성 조성물을 돼지에게 투여할 수 있는 디스펜서; 및
    b) 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물.
  40. 하기 단계를 포함하는, 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 면역원성 조성물의 제조 방법:
    a) 돼지 정소 세포에 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)를 접종하는 단계;
    b) 상기 접종된 돼지 정소 세포를 인큐베이션 처리하는 단계;
    c) 상기 인큐베이션 처리된 세포로부터 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)를 수확하는 단계; 및
    d) 상기 수확된 세포를 화학적 불활성화제, 바람직하게는 에틸렌이민, 바이너리 에틸렌이민, 아세틸에틸렌이민 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물로 처리하여 불활성화된 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 항원을 형성시키는 단계.
  41. 제40항에 있어서, 상기 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)가,
    a) 서열 번호 1, 5 또는 9의 서열에 의해 암호화되거나 이를 포함하는 서열;
    b) 서열 번호 1, 5 또는 9와 적어도 99% 동일한 서열;
    c) 서열 번호 3, 7, 11, 17 또는 27의 핵산 서열에 의해 암호화되는 스파이크 단백질;
    d) 서열 번호 3, 7, 11, 17 또는 27과 적어도 90% 동일한 핵산 서열에 의해 암호화되는 스파이크 단백질
    을 포함하는, 제조 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)가 서열 번호 1, 5 또는 9를 포함하고/하거나 서열 번호 1, 5 또는 9의 RNA 등가물을 포함하는, 제조 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 돼지 정소 세포가 AI-ST 세포인, 제조 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 화학적 불활성화제가 바이너리 에틸렌이민을 포함하는, 제조 방법.
  45. 제40항에 있어서, 수중유형 에멀젼계 아쥬반트 EMULSIGEN®을 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 항원에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 제조 방법.
  46. 하기 단계를 포함하는, 제10항 내지 제24항 중 어느 한 항의 재조합 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 항원을 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법:
    a) 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)의 항원을 숙주 세포에서 발현시키는 단계;
    b) 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 세포의 항원을 수확하는 단계; 및
    c) 단계 b)의 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 항원에 수중유형 에멀젼계 아쥬반트를 첨가하는 단계.
  47. 제46항에 있어서, 상기 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 항원이,
    a) 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 스파이크 단백질의 항원을 암호화하는 단리된 핵산으로서, 상기 재조합 스파이크 폴리펩타이드가 서열 번호 4, 8, 12, 18 또는 28과 적어도 90%의 상동성을 갖는, 단리된 핵산;
    b) a)의 단리된 핵산을 포함하는 재조합 벡터;
    c) a)의 단리된 핵산에 의해 암호화되는 재조합 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 스파이크 단백질; 및
    d) 이들의 임의의 조합.
  48. 제46항에 있어서, 상기 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)의 항원이 재조합 바큘로바이러스 벡터에 의해 발현되는, 제조 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)의 항원이 곤충 세포에서 발현되는, 제조 방법.
  50. 제46항에 있어서, 상기 수중유형 에멀젼계 아쥬반트가 EMULSIGEN® 수중유형 에멀젼계 아쥬반트인, 제조 방법.
  51. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV)와 관련된 질병의 증상의 감소에 사용하기 위한, 면역원성 조성물.
  52. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 돼지 델타코로나바이러스 (PDCoV) 및/또는 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV)와 관련된 질병의 증상의 감소에 사용하기 위한, 면역원성 조성물.
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