JP2020506915A - ブタコロナウイルスワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、37 C.F.R.1.821〜1.825に従う配列表を含有する。本出願に付属の配列表は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。10−0176−WO−SEQと名付けられる配列表であって、480kbのサイズであり、2017年1月23日に作成され、EFS−Webを介して、本出願と共に電子的に提出される配列表は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
本発明は、ブタを、ブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)およびブタデルタコロナウイルス(PDCoV)により引き起こされる疾患から防御する免疫原性組成物と、PEDV抗原およびPDCoV抗原の両方をもたらす組合せワクチンとに関する。併せて存在することが多い、高頻度の腸疾患は、10日齢未満の仔ブタにおける死亡率が高い(最大で、100%)ために、米国養豚業にとって、大きな経済的懸念をもたらす。
ブタ流行性下痢ウイルスとは、ブタにおいて、急性下痢、嘔吐、および脱水を引き起こす、エンベロープ型、プラス鎖の、一本鎖RNAウイルスである。ブタ流行性下痢ウイルスは、当初、欧州において同定されたが、韓国、中国、日本、フィリピン、およびタイを含む、多くのアジア諸国において、ますます問題となった。2013年4月、PEDVは、米国中西部のブタにおいて新たに勃興し、瞬く間に、全国に拡大した。2013年10月までに、PEDVは、18州のブタの群れにおいて検出された。PEDV感染の経済的影響は、既に、かなりのものとなっている。PEDVの北米分離株は、同定されているが(Huang et al. 2013; Stevenson et al. 2013)、米国では、完全に認可されたワクチンは、市販されていない。したがって、ブタを、PEDVと関連する疾患に対して防御することが可能なワクチンを開発することが必要とされ続けている。経粘膜経路(経口経路または鼻腔内経路)を介して、および非経口法(例えば、筋内法、皮下法、または静脈内法)を介して投与されうる、新興北米PEDV株に対して有効なワクチンを開発することが有利であろう。
PEDVは、Coronavirinae亜科、Alphacoronavirus属のメンバーであり(Bridgen et al. 1993)、1971年に、英国で、最初に同定され、ベルギー、中国、ハンガリー、イタリア、日本、韓国、およびタイなど、他の諸国でも同定された(Oldham J. 1972; Pensaert and De Bouck P. 1978; Chen et al. 2008; Nagy et al. 1996; Martelli et al. 2008; Takahashi et al. 1983; Chae et al. 2000;およびPuranaveja et al. 2009)。このファミリーの他のメンバーは、ブタ呼吸器コロナウイルス(PRCV)、ブタ血球凝集性脳脊髄炎コロナウイルス(PHE)、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)を含む。PEDVウイルスと、TGEVウイルスとは、類縁であり、臨床徴候も、極めて類似するが、免疫的な交差防御は存在しない。
PEDV Mタンパク質は、ウイルスのアセンブリー過程において重要な役割を果たす、最も存在量が多いエンベロープ構成要素であり、また、ウイルスを中和する抗体も誘導する。同様に、ヌクレオカプシドの構造基盤をもたらすビリオンRNAに結合するPEDV Nタンパク質もまた、細胞媒介性免疫の誘導に重要でありうる(Saif, L. 1993)。
それらのゲノム配列、送達方式、および有効性が異なる、いくつかのPEDVワクチンが開発されている。PEDVの流行が甚大であったアジア諸国では、欧州CV777株の細胞培養適応物が使用されている。これらは、1990年代以来、使用されている。
「〜を免疫化すること」という用語は、免疫化される対象への、免疫原性組成物の投与による能動的免疫化であって、これにより、このような免疫原性組成物に含まれる抗原に対する免疫応答を引き起こす能動的免疫化に関する。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、免疫原性組成物は、組換え抗原または不活化させた全ブタデルタコロナウイルスPDCoV抗原である。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、抗原は、不活化させた全PDCoV抗原である。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、PDCoV抗原は、化学的に不活化されている。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、PDCoVは、バイナリーエチレンイミンによる処置により化学的に不活化されている。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、アジュバントは、EMULSIGEN(登録商標)水中油エマルジョンベースのアジュバントである。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、PDCoV抗原は、組換え抗原である。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、組換え抗原は、a)ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)スパイクタンパク質の抗原をコードする単離核酸であって、組換えスパイクポリペプチドが、配列番号4、8、12、18、または28と、少なくとも90%の相同性を有する単離核酸;b)a)の単離核酸を含む組換えベクター;c)a)の核酸によりコードされる組換えPDCoVスパイクタンパク質;およびd)これらの任意の組合せ
からなる群から選択される、1または複数の免疫原性構成要素を含む。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、水中油エマルジョンは、EMULSIGEN(登録商標)水中油エマルジョンベースのアジュバントである。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、免疫原性組成物は、1または複数のさらなる抗原をさらに含む。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、抗原は、不活化させた全ブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)である。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、抗原は、組換えPEDV抗原である。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、組換え抗原は、ブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)の構造タンパク質M、E、またはNからなる群から選択される、1または複数の免疫原性構成要素を含む。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、免疫原性構成要素は、組換えベクターである。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、免疫原性構成要素は、組換えブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)スパイクタンパク質である。
本発明は、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)と関連する疾患の臨床症状を軽減するための方法であって、ブタへと、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された免疫原性組成物を投与するステップを含む方法にさらに関する。
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、ブタへと、不活化させた全PDCoV抗原を含む免疫原性組成物を投与するステップを含む。
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、ブタへと、組換え抗原としてのPDCoV抗原を含む免疫原性組成物を投与するステップを含む。
からなる群から選択される、1または複数の免疫原性構成要素を含む。
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、このような、投与された免疫原性組成物は、a)ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)スパイクタンパク質の抗原をコードする単離核酸であって、組換えスパイクポリペプチドが、配列番号4、8、12、18、または28と、少なくとも90%の相同性を有する単離核酸;b)a)の単離核酸を含む組換えベクター;c)a)の核酸によりコードされる、組換えブタデルタコロナウイルス(PDCoV)スパイクタンパク質;およびd)これらの任意の組合せからなる群から選択される、1または複数の免疫原性構成要素を含む組換え抗原を含む。
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章において記載された通りであり、このようなブタへと、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された免疫原性組成物を投与するステップを含む。
本発明は、ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、a)免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器;およびb)上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された免疫原性組成物を含むキットにさらに関する。
本発明は、ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)およびブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、a)免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器;およびb)上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された免疫原性組成物であって、具体的には、さらなる抗原が、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された、任意の組換えPEDV抗原である免疫原性組成物を含むキットにさらに関する。
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)は、配列番号1、5、もしくは9、および/または配列番号1、5、もしくは9のRNA同等物という、さらなる特色を含む。
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、ブタ精巣細胞は、AI−ST細胞である。
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、水中油エマルジョンベースのアジュバントであるEMULSIGEN(登録商標)を、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)抗原へと添加するステップという、さらなる特色をさらに含む。
本発明は、前出の文のうちのいずれかにおいて記載された、組換えブタデルタコロナウイルス(PDCoV)抗原を含む免疫原性組成物を作製する方法であって、a)ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)の抗原を、宿主細胞内で発現させるステップ、b)ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)細胞の抗原を採取するステップ;およびc)水中油エマルジョンベースのアジュバントを、ステップb)のブタデルタコロナウイルス(PDCoV)抗原へと添加するステップを含む方法にさらに関する。
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)の抗原を、組換えバキュロウイルスベクターにより発現させる。
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)の抗原を、昆虫細胞内で発現させる。
本発明は、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)と関連する疾患の症状を軽減させるための使用のための、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載されたPDCoVを含む免疫原性組成物にさらに関する。
本発明は、PDCoVと、少なくとも1つのさらなる抗原とを含む免疫原性組成物であって、少なくとも1つのさらなる抗原が、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)および/またはブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)と関連する疾患の症状を軽減させるための使用のための、ブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)の抗原である免疫原性組成物にさらに関する。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、PDCoVの、1または複数の抗原をさらに含み、この場合、PDCoVは、北米由来である。
より一般的には、当業者に公知の、様々な化学的不活化剤を利用して、ウイルスを不活化させることができる。エチレンイミン、ならびにバイナリーエチレンイミン(BEI)およびアセチルエチレンイミンなど、類縁の誘導体は、PEDウイルスの不活化における使用に適する化学的不活化剤の例である。他の化学的不活化剤、例えば、ベータ−プロピオラクトン、アルデヒド(ホルムアルデヒドなど)、および/または界面活性剤(例えば、Tween(登録商標)界面活性剤、Triton(登録商標)X、またはアルキルトリメチルアンモニウム塩)もまた、ウイルスを不活化させるのに使用することができる。不活化は、当業者に公知の標準的な方法を使用して実施することができる。試料は、定期的な時間間隔で採取し、残存する生ウイルスについてアッセイすることができる。適切な細胞系における細胞変性効果のモニタリング、および/または適切な特異的モノクローナル抗体もしくは特異的ポリクローナル抗体による蛍光染色を使用して、残存する生ウイルスの存在を検出することができる。
本発明の組成物および方法は、本発明を例示し、当業者に、どのようにしてこれを作り、使用するのかを教示する一助となるように提示される、以下の例により例示することができる。これらの例は、いかなる形であれ、本発明の範囲を狭めるか、または他の形で限定することを意図するものではない。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、出願時に本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。用語の意味および範囲は、明確なはずであるが、万一、なんらかの潜在的な曖昧さが生じた場合、本明細書で提示される定義が、任意の辞書または外部の定義に対して優先される。さらに、文脈により、そうでないことが要求されない限りにおいて、単数形の用語は、複数形を含み、複数形の用語は、単数形を含むものとする。本明細書では、そうでないことが言明されない限りにおいて、「または」の使用は、「および/または」を意味する。さらに、「〜を含むこと」という用語のほか、「〜を含む」および「含まれた」など、他の形態の使用は、限定的ではない。本明細書で参照される、全ての特許および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
「長期持続性防御」とは、少なくとも3週間であるが、より好ましくは、少なくとも3カ月間、さらにより好ましくは、少なくとも6カ月間にわたり存続する「有効性の改善」を指すものとする。家畜の場合、長期持続性防御は、動物が食肉用に市販される、平均年齢まで存続することが最も好ましい。
本明細書で使用される免疫原性組成物はまた、本明細書で記載されるPDCoVスパイクポリペプチドおよび/またはPEDVスパイクポリペプチドのいずれかを含む組成物も指す。さらなる実施形態に従い、このような免疫原性組成物は、前記PDCoVスパイクタンパク質および/またはPEDVスパイクタンパク質を発現させるウイルスベクター、好ましくは、組換えバキュロウイルスの少なくとも一部をさらに含む。さらに、免疫原性組成物は、i)好ましくは、上記で記載した濃度の、上記で記載したPDCoVタンパク質またはPEDVタンパク質のいずれか、ii)前記PDCoVスパイクタンパク質および/またはPEDVスパイクタンパク質を発現させるウイルスベクター、好ましくは、組換えバキュロウイルスの少なくとも一部、ならびにiii)細胞培養物上清の一部を含みうる。
アジュバントは、投与1回当たり約100μg〜約10mgの量、好ましくは、投与1回当たり約100μg〜約10mgの量、より好ましくは、投与1回当たり約500μg〜約5mgの量、なおより好ましくは、投与1回当たり約750μg〜約2.5mgの量で添加することができ、最も好ましくは、投与1回当たり約1mgの量で添加しうることが予測される。代替的に、アジュバントは、最終生成物の容量で、約0.01%〜50%の濃度、好ましくは、約2%〜30%の濃度、より好ましくは、約5%〜25%の濃度、さらにより好ましくは、約7%〜22%の濃度であることが可能であり、最も好ましくは、10%〜20%の濃度でありうる。
「単離された」とは、「人為により」、その天然の状態から変更されたことを意味する、すなわち、「単離される」ことが、天然において生じる場合、「単離された」ものは、その元の環境から変化しているか、もしくは取り出されているか、またはこれらの両方である。例えば、この用語が、本明細書で利用される通り、生存する生物において、天然で存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いないが、その天然状態の共存材料から分離された、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いる。
本明細書における「有効用量」とは、抗原が投与される動物において、臨床症状の軽減をもたらす免疫応答を誘発するか、またはこれを誘発することが可能な抗原の量を意味するがこれらに限定されない。
有効用量:
本明細書で記載される化合物は、PDCoVおよび/またはPEDVに関連する疾患を防止するように、対象へと、治療有効用量で投与することができる。投与量は、ワクチンを施される宿主のほか、宿主のサイズ、体重、および年齢などの因子に依存するであろう。
組成物の免疫原性は、組成物による免疫化の後における、被験対象の免疫応答を、当技術分野で公知である、任意のイムノアッセイの使用を介してモニタリングすることにより決定することができる。体液性(抗体)応答および/または細胞媒介性免疫の発生は、免疫応答の指示として理解することができる。被験対象は、ブタ、マウス、ハムスター、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、家禽類(例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、およびシチメンチョウ)、およびヒトなどの動物を含みうる。
加えて、治療剤は、動物モデルまたはヒト対象において、抗体が指向する分子のレベルを、治療の前、治療時、または治療後の、適切な時間間隔で測定することにより評価することもできる。分子の量の、任意の変化または変化の非存在を同定し、処置の、対象に対する効果と相関させることができる。分子のレベルは、当技術分野で公知の任意の方法により決定することができる。
本発明の方法および組成物を使用する、動物への、PDCoVおよび/またはPEDVによるワクチン接種の後で、当技術分野で公知の結合アッセイを使用して、結果として得られる抗体と、特定の分子との間の結合について評価することができる。これらのアッセイはまた、特定の抗原に対して、より高度なアフィニティーまたは特異性を呈する抗体を選択するのにも実施することができる。
好ましい投与経路は、鼻腔内経路、経口経路、皮内経路、および筋内経路を含むがこれらに限定されない。当業者は、本発明の組成物がまた、1、2回、またはこれを超える回数の投与によっても投与しうるほか、他の投与経路によっても投与しうることを認識するであろう。例えば、このような他の経路は、皮下経路、皮内経路、静脈内経路、血管内経路、動脈内経路、腹腔内経路、髄腔内経路、気管内経路、皮内経路、心内経路、小葉内経路、髄内経路、肺内経路、および膣内経路を含む。所望の処置の持続期間および有効性に応じて、本発明に従う組成物は、1回または何回かにわたり投与することができ、また、間欠的に投与することもでき、例えば、何日間、何週間、または何カ月間かにわたり毎日投与することもでき、異なる投与量で投与することもできる。
PEDV株の単離および作製
死滅させたウイルスである、ブタ流行性下痢ウイルスワクチンを作製するために、PEDV(分離株)のマスター種培養物を、まず作製した。このマスター種から、PEDVの培養物を増殖させ、次いで、不活化させた。次いで、ブタ流行性下痢ウイルスワクチンを作製するために、不活化させたウイルス培養物を、アジュバントと混合した。以下の方法を使用して、ブタ流行性下痢ウイルスワクチンを作製した。
極度の下痢を呈する動物または動物に由来する組織は、2013年に得られた。粘膜剥離物に由来するホモジネートを、0.2μmのシリンジフィルターを通して濾過されたこれらの動物から作出し、濾過物を使用して、アフリカグリーンモンキー腎臓細胞(VERO)に接種した。改変MEM、ブタトリプシン、リン酸トリプトース培養液、酵母抽出物、およびHEPES緩衝液を含有するPEDV維持培地の存在下で、ウイルスを増殖させた。ウイルスの増殖は、特徴的な合胞体の形成および細胞単層の融合について点検することにより、査定し、視覚化した。Illumina社製のMISEQ(登録商標)シーケンサー技術を使用して、CPE陽性材料をシーケンシングにかけた。
PEDVマスター種ウイルス培養物(「PEDV MSV」)を作製するために、ブタ流行性下痢ウイルス株(分離株)(PEDV分離株)を、BI VERO細胞内で単離し、BI VERO細胞内で、のべ19代にわたり継代培養し、次いで、ウイルスを、2013 EU VERO細胞内で、第30継代まで増殖させた。第30継代のウイルスを希釈し、PEDV KV−1251−125−10−OKと命名されるマスター種ウイルスとして登録した。
ブタデルタコロナウイルス株の単離および作製
ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)は、National Veterinary Service laboratory(NVSL)、Ames、IAから購入した。このウイルスは、NVSLにおいて、2014年のイリノイ州由来のブタ腸試料から単離された。ウイルスは、5μg/mLのTPCKトリプシンの存在下にある無血清培地中のブタ精巣(ST)細胞上で単離された。元のウイルスを、NVSLにおいて、2ラウンドにわたるプラーク精製にかけ、第10継代のウイルスを、出発材料として用いた。
PEDV分離株およびPDCoV分離株のゲノム配列解析
試料の調製および解析:
ウイルスを抽出する前に、組織培養物上清を、DNアーゼおよびRNアーゼのカクテルで前処理して、残存する宿主細胞のゲノム核酸を除去した。次いで、RNEASY(登録商標)ウイルスRNA抽出キット(Qiagen;型番52906)を使用して、ウイルスゲノムRNAを、ヌクレアーゼで処理された試料から抽出した。抽出後、試料を、DNアーゼで、再度処理して、ウイルスゲノムRNAについて、さらにエンリッチした。その後、ランダムプライミング式逆転写およびKlenow断片処理により、ウイルスゲノムRNAを、二本鎖cDNA(ds cDNA)へと転換した。次いで、ds cDNA産物を、NEXTERA(登録商標)XTライブラリー調製キット(型番FC−131−1024)を使用する、Illumina MISEQ(登録商標)シーケンサーベースのシーケンシングのためのライブラリーを作出するのに使用した。各試料を、5’末端および3’末端の両方において、固有のタグでバーコード処理して、バイオインフォマティクスによるミスビニングの可能性を最小化した。このライブラリーを、500サイクルのキット(型番MS−102−2003)を使用する、MISEQ(登録商標)シーケンサーにかけ、NextGene(version 2.3.4)およびSequencherソフトウェア(version 5.1)の組合せを使用して、データを解析した。高品質配列を、25を超えるQスコア中央値を含有する配列として選択し、3’末端における、3つ以下の非判定塩基、またはQスコアの測定値が16未満である、3つ以下の連続塩基をカットオフとしてトリミングした。次いで、35bpの連なりにわたる、85%またはこれを超えるマッチの判定基準を使用して、配列を、デノボでアセンブルして、各分離株について、推定全ゲノムを作出した。次いで、各々についての、推定完全ゲノム配列を、一塩基多型(SNP)または可変的な小規模の挿入/欠失について検証する、鋳型ベースのアライメントにより検証した。
次に、免疫原性スパイクタンパク質の配列を、PEDVスパイクタンパク質の、大規模なGenBankリポジトリーに対する、タンパク質の同一性/類似性について検討した。ここでもまた、提供された、最も近縁のGenBank分離株は、University of Minnesota Veterinary diagnostic laboratory(GenBank受託番号:AGO58924)により寄託された、North American Colorado 2013株に由来し、99.5%を超える同一性(1386中1380の同一なアミノ酸)(配列番号X)を呈した。6カ所のアミノ酸変化のうち、1カ所は、23,101位における多型に起因し、838位において、多数で、CGA(Arg)をコードするか、または少数で、CAA(Gln)をコードするであろう。North American Colorado 2013株は、この位置において、Glnを含有する。
全PEDV分離株および全PDCoV分離株の不活化
PEDVウイルスの各ロットまたはプールを、VERO細胞内の継代による不活化について調べる。24時間にわたる細胞培養物75cm2に、不活化PEDV液2.0mLを接種し、36±3℃で、48時間にわたり維持する。VERO細胞のフラスコ1つは、接種せずにおく。陽性ウイルス対照のために、VERO細胞の培養物に、陽性対照PEDVを接種する。インキュベーション時間の終了時に、細胞単層を、PEDVに典型的なCPEについて検討する。材料を、3回にわたり、凍結および融解させ、次いで、各材料2mlずつを、1日齢のVERO細胞へと接種した。培養物は、37±2℃で、48時間にわたり維持するものとする。第2継代の後、第3継代を実施する。インキュベーションおよび継代の後、免疫蛍光染色の欠如により決定される、BEIで処理されたウイルス液中の、ウイルス感染細胞の非存在は、十分な不活化試験を構成する。陽性対照ウイルスを接種された対照細胞は、PEDVに典型的なCPEを示すものとし、接種されていないフラスコは、PEDV CPEの証拠を示さないものとする。
PDCoVスパイク抗原をコードし、発現させる、組換えバキュロウイルスの構築
PDCoV S1−IgG2a Fcバキュロウイルスの調製
ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)スパイクのS1領域(アミノ酸1〜673)は、プライマーである、P2967167A(配列番号13)およびP2967167B(配列番号14)を使用するPCRにより、プラスミドDNAから増幅した。短いGGSリンカーおよびヒンジ領域を含む、ブタIgG2aのFc領域は、プライマーである、P2967167C(配列番号15)およびP2968014E(配列番号16)を使用して、プラスミドDNAから増幅した。2つの断片を、プライマーである、P2967167A(配列番号13)およびP2968014E(配列番号16)を使用する、オーバーラップエクステンションPCRにより融合させて、開始コドンのすぐ5’側の、Kozakコンセンサス配列を含有する、PDCoV S1−IgG2a Fcのコード配列(配列番号17)を作出した。図3Aにおける概略図を参照されたい。最終的なコード配列は、BamHI制限部位と、NotI制限部位とで挟んで、バキュロウイルス導入プラスミドであるpVL1393へのクローニングを容易とした。完了したら、プラスミドであるpVL1393−PDCoV S1−IgG2a Fcを、直鎖化されたBaculoGoldバキュロウイルスDNAと共に使用して、組換えバキュロウイルスを作製するように、Sf9昆虫細胞にトランスフェクトする。
ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)に由来するPDCoVスパイク遺伝子を、プラスミドDNAに由来する、2つの重複断片(N末端およびC末端)内にクローニングした。N末端断片は、プライマーである、P2967002C(配列番号23)およびP2967002D(配列番号24)を使用して増幅する一方、C末端断片は、プライマーである、P2967002E(配列番号25)およびP2967002F(配列番号26)を使用して増幅した。N末端およびC末端の断片は、天然のシグナル配列およびC末端のテールを除去するように増幅した。N末端断片を、プライマーである、P290194A(配列番号19)およびP2967002D(配列番号20)を使用する、オーバーラップエクステンションPCR(OE−PCR)により、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)gp64シグナル配列(O2967002A)(配列番号21)と融合させた。C末端断片を、プライマーである、P290194B(配列番号20)およびP2967002E(配列番号25)を使用するOE−PCRにより、AcNPV gp64C末端テールのコード配列(O2967002B)(配列番号22)と融合させた。結果として得られる2つの断片を、プライマーである、P290194A(配列番号19)およびP290194B(配列番号20)を使用するOE−PCRにより融合させて、開始コドンのすぐ5’側の、Kozakコンセンサス配列を含有する、PDCoVスパイクBaculoDisplay(PDCoVS BD)のコード配列(配列番号27)を作出した。図3Bにおける概略図を参照されたい。最終的なコード配列は、BamHI制限部位と、NotI制限部位とで挟んで、バキュロウイルス導入プラスミドであるpVL1393へのクローニングを容易とした。完了したら、プラスミドである、pVL1393−PDCoVS BDを、直鎖化されたBaculoGoldバキュロウイルスDNAと共に使用して、組換えバキュロウイルスを作製するように、Sf9昆虫細胞にトランスフェクトする。
PEDVスパイク抗原を含む医薬組成物(ワクチン)の調製:
5mMのBEIを使用して、不活化PEDV材料のために、PEDVウイルス採取物を、最小で24時間にわたり不活化させ、清澄化し、0.45μmで濾過した。
中和の後、多様なアジュバントを添加し、以下のワクチン/医薬組成物を作出した。
PDCoVスパイク抗原を含む医薬組成物(ワクチン)の調製:
PDCoV抗原(BacluloS−BD−PDCoVおよびBaculoS−FC−PDCoV)のバッチを、3Lのスピナー内で増殖させた。感染させるために、SF+細胞に、ウイルスを、約1.0〜2.1の間のMOIで接種した。フラスコを、100rpmに設定して、攪拌しながら、27℃でインキュベートした。採取は、感染の5日後に開始した。採取時に、細胞の生存率は、24%〜26%の間であり、1mL当たりの生存細胞は、0.31×106〜0.36×106個の間であった。採取液は、10,000×gで10分間にわたる遠心分離により清澄化し、0.2μmで濾過した。清澄化した採取液を、EMULSIGEN(登録商標)Dと組み合わせて、12.5%の製剤を達成する。
ブタへの、不活化PDCoVワクチンおよびバキュロウイルススパイクワクチンの接種、ならびに血清学的応答の評価
研究の目的は、従来の仔ブタにおける、PDCoVワクチンプロトタイプによる血清学的応答について査定することであった。PDCoVのスパイクタンパク質を、多様なバックボーン内で発現させる、いくつかのプロトタイプワクチンを作出した。加えて、全細胞不活化ウイルス調製物も作出した。
間接的免疫蛍光アッセイ(IFA)
1倍濃度のリン酸緩衝生理食塩液(PBS;Gibco;型番10010−023)中で、各試料の、1:40〜1:320にわたる、2倍の希釈系列を作った。各希釈試料100μlずつを、PDCoV感染プレートへと添加し、37℃で、1時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、血清を除去し、単層を、1倍濃度のPBSにより、2回にわたり洗浄した。次いで、希釈率を1:100とするFITCコンジュゲートヤギ抗ブタIgG抗体、ウェル1つ当たり10μlずつを使用して、細胞を染色した。力価は、非感染対照ウェルと比較して、PDCoVの染色を示す、最大血清希釈率として報告した。
単回の(signal)ワクチン接種の後、BaculoS−BDプロトタイプをワクチン接種された動物のうちの20〜73%が応答した。35日目までに、全細胞プロトタイプまたはBaculoS−FCプロトタイプをワクチン接種された、全ての動物が、検出可能な応答を示した。BaculoS−BDプロトタイプをワクチン接種された動物のうちの50%だけが、35日目までに、検出可能な応答を示した。
PDCoV IgG ELISA
精製されたPDCoV−S1−IgG2aFc抗原(BIVI;型番3091−141;0.2mg/mL)を、炭酸緩衝液(BIVI;型番3144−180)中、1:6666.67に希釈した。ELISAプレート(高結合96ウェルプレート;Greiner;型番655061)を、ウェル1つ当たり100μlの希釈抗原でコーティングし、4℃で、一晩にわたりインキュベートした。プレートを、自動式プレート洗浄機を使用して、ウェル1つ当たり300μlのTBST(0.05%のTween 20)で、5回にわたり洗浄した。洗浄ステップの後、150μlのブロッキング溶液(カゼインブロッカー;Thermo;型番37532)を、ウェルごとに添加し、プレートを、15〜30℃で、1時間にわたりインキュベートした。初期血清希釈液を、カゼインブロッカー中、希釈率を1:200として調製した(陰性対照および被験試料)。インキュベーションの後、カゼインブロッカーを、プレートから除去し、被験試料の2倍の系列希釈液を、1:200〜12800にわたって作った(カゼインブロッカー中で作った)。陰性対照の2倍の系列希釈液は、1:200〜1:204800にわたって作った。希釈液は、プレート上において、最終容量を、ウェル1つ当たり100μlとして調製した。プレートを、振盪(100rpm)しながら、37℃で、1時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後、プレートを、既に記載した通りに洗浄した。希釈率を1:2000(カゼインブロッカー中)とする、HRPコンジュゲートヤギ抗ブタIgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch;型番114−035−003)を調製し、100μlを、各ウェルへと添加した。プレートを、100rpmで振盪しながら、37℃で、1時間にわたりインキュベートし、次いで、既に記載した通りに洗浄した。検出のために、ウェル1つ当たり100μlの、調製されたTMB基質(KPL;型番50−76−00)を、ウェルごとに添加した。プレートを、15〜30℃で、10分間にわたりインキュベートした。反応を、1NのHCl、ウェル1つ当たり100μlで停止させ、自動式プレートリーダーにより、450nmで、速やかに読み取った。
−8日目、21日目、および35日目における血清学的応答を、群ごとに提示する。日数および群ごとの検出の最小2乗平均および頻度を、表5(図5も参照されたい)に提示する。いかなる動物も、ワクチン接種の前に、検出可能な血清学的応答を示さなかった。
PEDVバキュロウイルスワクチンの有効性
以下の研究では、死滅させたブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)ワクチン、またはバキュロウイルス構築物によるワクチン2mLずつ、2回にわたる投与(does)によるワクチン接種に対する血清学的応答であって、3週齢時における、ワクチンの、ブタへの投与の後で測定される応答について査定した。主要転帰は、処置されたブタの、ワクチン接種後において回収された血清試料についての、蛍光フォーカス中和(FFN)による血清学的試験結果であった。
本研究では、ブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)2aに由来するスパイク遺伝子を、プラスミドDNAに由来する、2つの重複断片(N末端およびC末端)内にクローニングした。N末端断片は、プライマーである、P1360110A(配列番号37)およびPEDV−S2−R(配列番号38)を使用して増幅する一方、C末端断片は、プライマーである、PEDV−S1−F(配列番号39)およびP1360110B(配列番号40)を使用して増幅した。N末端およびC末端の断片は、天然のシグナル配列およびC末端のテールを除去するように増幅した。N末端断片を、プライマーである、P290194A(配列番号45)およびPEDV−S2−R(配列番号38)を使用するオーバーラップエクステンションPCR(OE−PCR)により、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)gp64シグナル配列(O1360110C)(配列番号41)と融合させた。C末端断片を、プライマーである、P290194B(配列番号43)およびPEDV−S1−F(配列番号44)を使用するOE−PCRにより、AcNPV gp64のC末端テールのコード配列(O1360110D)(配列番号42)と融合させた。結果として得られる2つの断片を、プライマーである、P290194A(配列番号45)およびP290194B(配列番号43)を使用するOE−PCRにより融合させて、開始コドンのすぐ5’側の、Kozakコンセンサス配列を含有する、PEDVスパイクBaculoDisplay(PEDVS BD)(配列番号46)のコード配列を作出した。最終的なコード配列は、BamHI制限部位と、NotI制限部位とで挟んで、バキュロウイルス導入プラスミドであるpVL1393へのクローニングを容易とした。完了したら、プラスミドである、pVL1393−PEDVS BDを、直鎖化されたBaculoGoldバキュロウイルスDNAと共に使用して、組換えバキュロウイルスを作製するように、Sf9昆虫細胞にトランスフェクトする。図6A:PEDV 2a BD BaculoDisplayバキュロウイルスについての概略図を参照されたい。
*PEDVスパイクシグナル配列およびC末端テールを、バキュロウイルスのgp64同等物で置きかえた。組換えPEDVスパイクディスプレイバキュロウイルスを、昆虫細胞内で作製した。感染させた培養物を採取し、遠心分離および0.2μmにおける濾過により清澄化させた。清澄化させた採取材料を、5mMのBEIにより、37℃で、72時間にわたり不活化させ、次いで、遠心分離および0.2μmにおける濾過により清澄化させた。
ワクチン接種後(28日目および35日目)におけるセロコンバージョンは、20%のEMULSIGEN(登録商標)BCLでアジュバント処理されたPEDvワクチンをワクチン接種されたブタのうちの20%(T02;表7)、およびトリプシンで増殖させたPEDVスパイク−バキュロウイルスをワクチン接種されたブタのうちの60%(T05;表7)において生じた。全ての処置群について、≧1:20である血清陽性ブタの幾何平均力価を、下記の表7に提示する。全てのブタの、処置群ごとの力価の頻度分布を、表8に提示する。
セロコンバージョンは、BEIで不活化させ、20%のEMULSIGEN(登録商標)BCLでアジュバント処理した、1ml当たり6.93 log10 TCID50のPEDVにより製剤化された被験ワクチンの、2回にわたる投与の後の、T02のブタのうちの20%において生じた。セロコンバージョンは、PEDVスパイク糖タンパク質により製剤化された、被験組換えトリプシン増殖型バキュロウイルスワクチンの、2回にわたる投与の後の、T05のブタのうちの60%において生じた。
PEDV 2a BDバキュロウイルスワクチンの有効性
本研究の主要目的は、従来の雌ブタモデルにおいて、プロトタイプのPEDVバキュロウイルスワクチンの有効性を査定することであった。36匹の雌ブタを、5つの群へと無作為化した。分娩の5週間前および2週間前の雌ブタの筋内に、被験PEDVワクチン、プラセボ、市販の陽性対照によりワクチン接種するか、またはワクチン接種せずにおいた(厳密な対照)。使用された群およびワクチンについての簡単な記載を、下記の表9に列挙する。妊娠期間、分娩期間、および抗原投与期間を通して、血清試料および糞便試料を、雌ブタおよびブタから回収して、抗PEDV抗体およびPEDV RNAの存在をモニタリングした。臨床徴候を、毎日1回記録した。
ブタの死亡率:
毒性PEDV分離株による抗原投与後におけるブタの死亡率が、ワクチンの有効性について評価するのに使用される主要転帰パラメータであった。抗原投与期間中の、群ごとの死亡率の概要を、下記の表10に提示する。群および日数ごとの生存率を、図7に提示する(「群および日数ごとの、生存するブタの百分率」)。0日目に、適切なサイズの、滅菌注射針およびシリンジを使用して、用量2mLのワクチンを、健常な雌ブタの右側頸部の筋組織に投与した。21日目に、注射を頸部の左側に施すことを例外として、工程は同一であった。
総じて、全ての群は、感染から48時間以内のブタの大部分において臨床徴候が存在する同様の傾向を有した。臨床徴候は、抗原投与後6日目までを通して、全ての群内の、50%を超えるブタにおいて存在した。抗原投与後7日目〜抗原投与後11日目において、臨床徴候は、消失した。抗原投与後13日目までに、ブタのうちのいずれにおいても、臨床徴候は観察されなかった。
生物統計学:全てのデータは、解析のために、SAS(登録商標)version 9.4へとインポートした。処置群ごとに、頻度分布を含む、データの一覧および統計の概要を作成した。同腹仔効果および飼育場効果を、適切な効果として組み込む解析を行った。抗原投与後における、群ごとのブタの死亡率および同腹仔ごとのブタの死亡率を列挙し、記述統計学の平均値、中央値、最小値、および最大値を、群ごとの概要のために使用した。群ごとの死亡率および同腹仔ごとの死亡率は、ピアソンのカイ2乗を伴う一般線形モデルを、過分散(over dispersion)として使用して解析した。次いで、各処置群についての、プラセボ群と比較した、モデルベースの予防分画および95%信頼区間を推定した。過分散としてのピアソンのカイ2乗を伴う一般線形モデルを、固定効果としての年齢、処置スコア、およびパリティーを加えた死亡率データへと、再度当てはめて、これらの因子が、何らかの効果を、死亡率に対して及ぼしたのかどうかを検討した。研究の無作為化データを一覧した。ブタについての糞便スコアを、頻度分布を使用して、群および日数ごとに一覧し、まとめた。まとめは、抗原投与の前および抗原投与時に、個別に行った。雌ブタについての臨床徴候のスコア(糞便、嘔吐、注射部位における病変、乳汁分泌欠如、および処置スコア)を、頻度分布を使用して、群および日数ごとに、分娩の前および後について、個別に一覧し、まとめた。ブタの体重データを記述統計学の中央値、最小値、および最大値を使用して、同腹仔ごとに、群および日数ごとに一覧し、まとめた。1日当たりの平均体重増加量(ADWG)は、モデルを、固定効果としての群および分娩時の体重;ランダム効果としての同腹仔および飼育室と組み合わせることにより解析した。最小2乗平均および群間におけるそれらの対比を推定し、対応する標準誤差および95%信頼区間を推定した。ブタについての剖検データであって、盲腸病変、結腸病変、小腸病変、および肺病変の、臓器および内容物についての病理学データ、ならびに胃についての記録を含むデータを、死亡率により分けられた群ごとに、各変数についてのカウントを使用して、一覧し、まとめた。任意の病変が存在するのかどうかもまた、群ごとのカウントおよび百分率を使用してまとめた。雌ブタについてのPEDウイルス血清抗体力価(FFN)、ブタおよび雌ブタの個々についての、血清IgAによる全細胞ELISA、雌ブタについての、IgAおよびIgGによるbaculos ELISA、雌ブタおよびブタについての、IgAおよびIgGによるIDEXX ELISAならびにPCRを含む検査室データを、まず一覧した。次に、幾何平均値(FFN)(FFNについては、標準偏差は与えられなかったが)、または平均値(ELISA、PCR)を使用して、記述統計学の平均値、最小値、最大値、および標準誤差を、群および日数ごとに計算した。次に、ランダム効果としての同腹仔および飼育室と組み合わせたモデルを使用して、群および日数ごとの、最小2乗平均、標準誤差、および95%信頼区間を推定した。対をなす群間の最小2乗平均および対応する95%信頼区間の対比を推定した。
PEDV2bバキュロウイルスワクチンの調製
ブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)2bに由来するスパイク遺伝子は、2つの重複断片(N末端およびC末端)内で調製した。N末端断片は、プライマーである、P290194A(配列番号48)およびP3183131B(配列番号49)を使用して、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)gp64シグナル配列の、PEDV 2bスパイクのアミノ酸22〜400との融合体を含有する合成DNAから増幅した。C末端断片は、プライマーである、P3183131A(配列番号50)およびP290194B(配列番号51)を使用して、AcNPV gp64のC末端テールのコード配列を既に含有する、pVL1393−PEDVS BDプラスミドDNAから増幅した。結果として得られる2つの断片を、プライマーである、P290194A(配列番号48)およびP290194B(配列番号51)を使用するOE−PCRにより融合させて、開始コドンのすぐ5’側の、Kozakコンセンサス配列を含有する、PEDV 2bスパイクBaculoDisplay(PEDVS 2b BD)(配列番号52)のコード配列を作出した。最終的なコード配列は、BamHI制限部位と、NotI制限部位とで挟んで、バキュロウイルス導入プラスミドであるpVL1393へのクローニングを容易とした。完了したら、プラスミドである、pVL1393−PEDVS 2b BDを、直鎖化されたBaculoGoldバキュロウイルスDNAと共に使用して、組換えバキュロウイルスを作製するように、Sf9昆虫細胞にトランスフェクトする。図6B:PEDV 2b BD BaculoDisplayバキュロウイルスタンパク質マップについての概略図を参照されたい。
PEDVおよびPDCoVの有効性研究
下記の研究をデザインして、死滅させたPEDVワクチンおよび/または死滅させたPDCoVワクチンまたは他のプロトタイプワクチンの、ブタにおける有効性について評価した。主要転帰パラメータは、ブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)および/またはPDCoVによる抗原投与後における、仔ブタの死亡率である。副次的転帰パラメータは、雌親ブタについての血清学であった。測定される他のパラメータは、ワクチン接種後の雌ブタにおける臨床徴候(ISLを含む);ワクチン接種後の雌ブタにおけるウイルスの排出(qRT−PCRを介する);仔ブタにおける臨床徴候;ならびに仔ブタにおけるPEDVおよび/またはPDCoVについての血清学を含んだ。
分娩の4および2週間前(0日目および14日目)において、妊娠中の各雌親に、3つの経路(筋内、鼻腔内、および経口)により、2mLの、以下の処置:T01(陰性対照、NC)リン酸緩衝生理食塩液;T02(BEI−VH)20%のEMULSIGEN(登録商標)BCLによるアジュバント処理;T03(厳密な対照;SC)非ワクチン接種/非抗原投与対照として用いられたのうちの1つを投与した。4匹の動物を有したT06を除き、群1つ当たり8匹ずつの動物を使用した。35日目または36日目に、ブタに、1ml当たり2.0 log10 TCID50のPEDVウイルス採取物1mLを、経口により抗原投与した。雌親およびブタにおける臨床徴候(嘔吐および下痢)を、抗原投与期に、毎日観察した。血清を、雌親から、分娩の4および2週間前(0日目および14日目)、仔ブタへの抗原投与の前日(34日目または35日目)および試験終了日(57日目)において回収した。
ブタの死亡率:毒性PEDV分離株による抗原投与後におけるブタの死亡率が、ワクチンの有効性について評価するのに使用される主要転帰パラメータであった。抗原投与期間中の、群ごとの死亡率の概要を、下記に列挙する。死亡率が55%であり、T01(NC)において、全ての同腹仔が罹患したので、抗原投与は、十分に毒性であると考えられた。T01(NC)と比較して、T02(BEI−VH)は、0.20(−0.550,0.586)のPF(95%CI)により、ブタ死亡率数値の低減を裏付けた。95%CI(−0.550,0.586)が、ゼロを含んだので、低減は、統計学的に有意ではなかった(表13を参照されたい)。
剖検時に、腸試料または腸内容物を採取し、PEDV抗原を検出するように、qRT−PCRにより調べた。死亡率がピーク時の動物に由来する被験試料のうちの55.5%から、PEDVが検出された。
**NC= NC=計算なし。研究デザインに基づき、T02(BEI-VH)に可能な信頼区間
蛍光フォーカス中和(FFN)アッセイ:FFNアッセイを使用して、ワクチン接種および抗原投与の後の雌親における、ウイルス中和応答について評価した。群ごとに列挙される幾何平均力価を、血液を雌ブタから回収した日について、下記に提示する。
2回にわたるワクチンの投与後、T02(BEI−VH)における雌ブタ8例中2例(25%)が、検出可能なレベルの中和抗体を有した。検出可能なレベルの中和抗体は、他の群のいずれにおいても観察されなかった。
PEDVへの外側曝露の後、曝露された処置群内の全ての雌ブタは、検出可能なレベルの中和抗体を有した。T03(SC)群内の動物は、試験を通して、血清中陰性を維持した。57日目(曝露の約21日後)における幾何平均力価は、ワクチン接種が、T01(NC)と比較して、高値の力価を結果としてもたらすことを指し示した。T02(BEI−VH)群における雌ブタは、T01(NC)における雌ブタについての、200のGMTと比較して約3倍の力価である、613のGMTを有した(p=0.005)。T02(BEI−VH)群における複数の試料が、最大の被験希釈率(1:640)において、検出可能な中和抗体を有したので、これらの結果は、群間差の保守的な推定値を表す可能性が高い。
**T01(NC)およびT02(BEI-VH)についての、57日目のGMTは、逆変換された最小2乗平均である。
S1ベースのELISAを使用して、ワクチン接種および抗原投与の後における、PEDVスパイクタンパク質に対する、雌親の応答について評価した。初乳、乳汁、および血清についてのアッセイ結果を、試料を回収した日について、群ごとに列挙する。
T02(BEI−VH)と、T04(NC)との間では、初乳中および乳汁中の抗PEDV IgAの幾何平均力価における有意差が観察されなかった。
剖検時に、血清を、ブタから回収して、中和抗体の存在について査定した。下記の表16は、陽性ブタの幾何平均値FFN力価を、群ごとに提示する。表16はまた、被験動物数に対する、GMTが20以上のブタの数として表される検出頻度も含む。試験は、入手可能な全ての試料に対して実施した。多数のブタに由来する試料は、死亡と剖検との時差のために、得ることが不可能であった。
群ごとの全体のブタ力価を検討すると、T02(BEI−VH)について、死亡率の推定値は、群全体のFFN百分率と逆相関した。
ブタの糞便スコア:群ごとの、ブタにおける異常な糞便の観察期間、および死亡状態(死亡:死亡した/死亡していない)ごとの、ブタにおける異常な糞便の観察期間についての記述統計学を、下記に列挙する。総じて、死亡状態が同じブタにおける、異常な糞便スコアの持続期間中央値は、群間で同様であった。死亡するか、または安楽死させた動物では、異常な糞便スコアの持続期間中央値が、数値上短くなった。この傾向は、T01(NC)のブタにおいて、最も明白であったが、これらの動物の大部分が、抗原投与後の1週目以内に死亡したという事実による副次的なものである可能性が高い。
T02(BEI−VH)群では、T01(NC)群と比較して、ブタの死亡率の20%の低減が観察された。本研究では、3つの投与経路を試みた。3つの経路を使用したが、IM以外の経路が、アジュバントおよびワクチンによる製剤に基づくT02(BEI−VH)の有効性に寄与したとは予測されない。総じて、不活化前力価を、最小の、1ml当たり6.04 log TCID50とする、20%のEMULSIGEN(登録商標)−BCLワクチンでアジュバント処理された不活化PEDVは、仔ブタおよび雌ブタにおいて、良好な免疫応答を誘導すると考えられる。好ましいワクチン接種スケジュールは、2週間間隔で、2mlずつ、3回にわたる投与である、3週齢またはこれを超える仔ブタのためのIM投与経路である。T02(BEI−VH)では、ワクチン接種後の雌ブタにおける臨床徴候が観察されず、他の処置群でも、限定的であった。ワクチン接種の使用は、生産ブタの百分率に影響を及ぼさないと考えられた(データは示さない)。
本研究の目的は、プロトタイプのPDCoVワクチンの、宿主動物における有効性を決定することであった。PDCoVの抗原投与材料およびPDCoVについての疾患モデルを開発するための、下記の予備研究に基づくと、ワクチン接種されなかった仔ブタは、抗原投与から1週間以内に、体重の減少および下痢を呈したが、回復した。死亡は、観察されなかった。
NVSL PDCoV群および陰性対照群における動物は、抗原投与後に、体重が増加した。これと比較して、2つの抗原投与用分離株であるBIPDCoV−5.0327(群3)およびBIPDCoV 2.0307(群4)により抗原投与された動物は、同じ期間内に、対照群と比較して、それほど頑健な体重の増加を呈さなかった。
表21:PDCoVについての研究デザイン(ワクチン群、用量、および経路)
免疫化された雌ブタに由来する仔ブタは、分娩時に、試験へと登録する。仔ブタには、経口経路を使用して、約5〜7日齢において、1.0mLの抗原投与材料を接種する。
Claims (52)
- ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)の1または複数の抗原と、アジュバントとを含む免疫原性組成物であって、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)が、
a)配列番号1、5、もしくは9によりコードされ、かつ/または配列番号1、5、もしくは9の配列を含み、かつ/または配列番号1、5、もしくは9のRNA同等物を含むPDCoV;
b)その配列が、配列番号配列番号1と、少なくとも99%同一であり、かつ/または配列番号1、5、もしくは9のRNA同等物と、少なくとも99%同一であるPDCoV;
c)そのスパイクタンパク質が、配列番号3、7、11、17、または27の核酸配列によりコードされるPDCoV;
d)そのスパイクタンパク質が、配列番号3、7、11、17、または27と、少なくとも90%同一な核酸配列によりコードされるPDCoV;
e)配列番号2、6、または10によりコードされる、任意のPDCoV;あるいは
f)その配列が、配列番号2、6、または10と、少なくとも99%同一であるPDCoV
のいずれかのPDCoVである免疫原性組成物。 - アジュバントが、水中油エマルジョンである、請求項1に記載の免疫原性組成物。
- 組換え抗原または不活化させた全ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)抗原である、請求項1または2に記載の免疫原性組成物。
- 抗原が、不活化させた全PDCoV抗原である、請求項1から3のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- PDCoV抗原が、化学的に不活化されている、請求項4に記載の免疫原性組成物。
- PDCoV抗原が、エチレンイミン、バイナリーエチレンイミン、アセチルエチレンイミン、およびこれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む化学的不活化剤による処置により化学的に不活化されている、請求項5に記載の免疫原性組成物。
- PDCoVが、バイナリーエチレンイミンによる処置により化学的に不活化されている、請求項6に記載の免疫原性組成物。
- アジュバントが、EMULSIGEN(登録商標)水中油エマルジョンベースのアジュバントである、請求項1から7のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- 不活化させたブタデルタコロナウイルス(PDCoV)が、配列番号1、5、もしくは9を含み、かつ/または配列番号1、5、もしくは9のRNA同等物を含む、請求項4に記載の免疫原性組成物。
- PDCoV抗原が、組換え抗原である、請求項1から3のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- 組換え抗原が、
a)ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)スパイクタンパク質の抗原をコードする単離核酸であって、組換えスパイクポリペプチドが、配列番号4、8、12、18、または28と、少なくとも90%の相同性を有する単離核酸;
b)a)の単離核酸を含む組換えベクター;
c)a)の核酸によりコードされる組換えPDCoVスパイクタンパク質;および
d)これらの任意の組合せ
からなる群から選択される、1または複数の免疫原性構成要素を含む、請求項10に記載の免疫原性組成物。 - 薬学的に許容可能な担体および/または賦形剤を含む、請求項10または11に記載の免疫原性組成物。
- 水中油エマルジョンが、EMULSIGEN(登録商標)水中油エマルジョンベースのアジュバントである、請求項10から12のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- 免疫原性組成物が、1または複数のさらなる抗原をさらに含む、請求項1から13のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- さらなる抗原が、ブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)の抗原であり、ブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)が、
a)配列番号29によりコードされ、かつ/または配列番号29もしくは33の配列を含み、かつ/または配列番号29もしくは33のRNA同等物を含むPEDV;
b)その配列が、配列番号29もしくは33と、少なくとも99%同一であり、かつ/または配列番号29もしくは33のRNA同等物と、少なくとも99%同一であるPEDV;
c)そのスパイクタンパク質が、配列番号30、34、46、または52の核酸配列によりコードされるPEDV;
d)そのスパイクタンパク質が、配列番号30、34、46、または52と、少なくとも90%同一な核酸配列によりコードされるPEDV;
e)配列番号32または36によりコードされるPEDV;あるいは
f)配列番号32または36と、少なくとも99%同一な配列よりコードされるPEDV
のいずれかのPDCoVである、請求項14に記載の免疫原性組成物。 - さらなるPEDV抗原が、組換え抗原または不活化させた全ブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)である、請求項15に記載の免疫原性組成物。
- 抗原が、不活化させた全ブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)である、請求項16に記載の免疫原性組成物。
- 抗原が、組換えPEDV抗原である、請求項16に記載の免疫原性組成物。
- 組換え抗原が、
a)ブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)スパイクタンパク質の抗原をコードする単離核酸であって、抗原が、配列番号31、35、47、または52と、少なくとも90%の相同性を有する単離核酸;
b)a)の単離核酸を含む組換えベクター;
c)a)の核酸によりコードされる組換えPEDVスパイクタンパク質;および
d)これらの任意の組合せ
からなる群から選択される、1または複数の免疫原性構成要素を含む、請求項16または18に記載の免疫原性組成物。 - 組換え抗原が、ブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)の構造タンパク質M、E、またはNからなる群から選択される、1または複数の免疫原性構成要素を含む、請求項14、15、16、または18に記載の免疫原性組成物。
- 免疫原性構成要素が、単離核酸である、請求項19に記載の免疫原性組成物。
- 免疫原性構成要素が、組換えベクターである、請求項19に記載の免疫原性組成物。
- 免疫原性構成要素が、組換えブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)スパイクタンパク質である、請求項19に記載の免疫原性組成物。
- 免疫原性構成要素が、組合せである、請求項19に記載の免疫原性組成物。
- ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)と関連する疾患の臨床症状を軽減するための方法であって、ブタへと、請求項1から24のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
- ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)と関連する疾患の臨床症状を軽減するための方法であって、ブタへと、請求項4に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
- ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)と関連する疾患の臨床症状を軽減するための方法であって、ブタへと、請求項10に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
- このような免疫原性組成物が、
a)配列番号1、5、もしくは9によりコードされ、かつ/または配列番号1の配列を含み、かつ/または配列番号1、5、もしくは9のRNA同等物を含む免疫原性構成要素;
b)その配列が、配列番号1、5、もしくは9と、少なくとも99%同一であり、かつ/または配列番号1、5、もしくは9のRNA同等物と、少なくとも99%同一である免疫原性構成要素;
c)そのスパイクタンパク質が、配列番号3、7、11、17、または27の核酸配列によりコードされる免疫原性構成要素;
d)そのスパイクタンパク質が、配列番号3、7、11、17、または27と、少なくとも90%同一な核酸配列によりコードされる免疫原性構成要素;
e)配列番号2、6、または10によりコードされる免疫原性構成要素;および
f)その配列が、配列番号2、6、または10と、少なくとも99%同一である免疫原性構成要素
からなる群から選択される、1または複数の免疫原性構成要素を含む、請求項25に記載の方法。 - このような免疫原性組成物が、
a)配列番号1、5、または9の配列によりコードされるか、またはこれを含む免疫原性構成要素;
b)その配列が、配列番号1、5、または9と、少なくとも99%同一である免疫原性構成要素;
c)そのスパイクタンパク質が、配列番号3、7、11、17、または27の核酸配列によりコードされる免疫原性構成要素;および
d)そのスパイクタンパク質が、配列番号3、7、11、17、または27と、少なくとも90%同一な核酸配列によりコードされる免疫原性構成要素
からなる群から選択される、1または複数の免疫原性構成要素を含む、請求項26に記載の方法。 - このような組換え抗原が、
a)ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)スパイクタンパク質の抗原をコードする単離核酸であって、組換えスパイクポリペプチドが、配列番号4、8、12、18、または28と、少なくとも90%の相同性を有する単離核酸;
b)a)の単離核酸を含む組換えベクター;
c)a)の核酸によりコードされる、組換えブタデルタコロナウイルス(PDCoV)スパイクタンパク質;および
d)これらの任意の組合せ
からなる群から選択される、1または複数の免疫原性構成要素を含む、請求項27に記載の方法。 - ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)およびブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)と関連する疾患の臨床症状を軽減するための方法であって、ブタへと、請求項15から24のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
- ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)およびブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)と関連する疾患の臨床症状を軽減する方法であって、このようなブタへと、請求項14から17のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
- ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)およびブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)と関連する疾患の臨床徴候を軽減するための方法であって、このようなブタへと、請求項14、15、16、または18から24のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
- ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、
a)免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器;および
b)請求項1から14のいずれか1項に記載の免疫原性組成物
を含むキット。 - ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、
a)免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器;および
b)請求項4から9のいずれか1項に記載の免疫原性組成物
を含むキット。 - ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、
a)免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器;および
b)請求項10から14のいずれか1項に記載の免疫原性組成物
を含むキット。 - ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)およびブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、
a)免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器;および
b)請求項15から24のいずれか1項に記載の免疫原性組成物
を含むキット。 - ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)およびブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、
a)免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器;および
b)請求項15から17のいずれか1項に記載の免疫原性組成物
を含むキット。 - ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)およびブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、
a)免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器;および
b)請求項18から24のいずれか1項に記載の免疫原性組成物
を含むキット。 - 請求項4から9のいずれか1項に記載のブタデルタコロナウイルス(PDCoV)による免疫原性組成物を作製する方法であって、
a)ブタ精巣細胞に、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)を接種するステップ;
b)接種されたブタ精巣細胞をインキュベートするステップ;
c)ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)を、インキュベートされた細胞から採取するステップ;および
d)採取された細胞を、化学的不活化剤、好ましくは、エチレンイミン、バイナリーエチレンイミン、アセチルエチレンイミン、またはこれらの混合物からなる群から選択される化合物により処置して、不活化させたブタデルタコロナウイルス(PDCoV)抗原を形成するステップ
を含む方法。 - ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)が、
a)配列番号1、5、または9の配列によりコードされるか、またはこれらを含む配列;
b)配列番号1、5、または9と、少なくとも99%同一な配列;
c)配列番号3、7、11、17、または27の核酸配列によりコードされるスパイクタンパク質;
d)配列番号3、7、11、17、または27と、少なくとも90%同一な核酸配列によりコードされるスパイクタンパク質
を含む、請求項40に記載の方法。 - ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)が、配列番号1、5、もしくは9、および/または配列番号1、5、もしくは9のRNA同等物を含む、請求項41に記載の方法。
- ブタ精巣細胞が、AI−ST細胞である、請求項40に記載の方法。
- 化学的不活化剤が、バイナリーエチレンイミンを含む、請求項43に記載の方法。
- 水中油エマルジョンベースのアジュバントであるEMULSIGEN(登録商標)を、ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)抗原へと添加するステップをさらに含む、請求項40に記載の方法。
- 請求項10から24のいずれか1項に記載の、組換えブタデルタコロナウイルス(PDCoV)抗原を含む免疫原性組成物を作製する方法であって、
a)ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)の抗原を、宿主細胞内で発現させるステップ;
b)ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)細胞の抗原を採取するステップ;および
c)水中油エマルジョンベースのアジュバントを、ステップb)のブタデルタコロナウイルス(PDCoV)抗原へと添加するステップ
を含む方法。 - ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)抗原が、
a)ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)スパイクタンパク質の抗原をコードする単離核酸であって、組換えスパイクポリペプチドが、配列番号4、8、12、18、または28と、少なくとも90%の相同性を有する単離核酸;
b)a)の単離核酸を含む組換えベクター;
c)a)の核酸によりコードされる、組換えブタデルタコロナウイルス(PDCoV)スパイクタンパク質;および
d)これらの任意の組合せ
を含む、請求項46に記載の方法。 - ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)の抗原を、組換えバキュロウイルスベクターにより発現させる、請求項46に記載の方法。
- ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)の抗原を、昆虫細胞内で発現させる、請求項48に記載の方法。
- 水中油ベースのアジュバントが、EMULSIGEN(登録商標)水中油エマルジョンベースのアジュバントである、請求項46に記載の方法。
- ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)と関連する疾患の症状を軽減させるための使用のための、請求項1から14のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)および/またはブタ流行性下痢ウイルス(PEDV)と関連する疾患の症状を軽減させるための使用のための、請求項15から24のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
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