KR20240028924A - 높은 중화 항체를 유도하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 불활화 백신 조성물 - Google Patents

높은 중화 항체를 유도하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 불활화 백신 조성물 Download PDF

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홍은진
신경렬
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강원대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 높은 중화 항체를 유도하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 이에 대한 불활화 백신 조성물에 대한 것으로, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대해 우수한 면역 유도능을 확인한 바, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 의한 질환을 예방하는데 유용하게 활용할 수 있다.

Description

높은 중화 항체를 유도하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 불활화 백신 조성물{Porcine Epidemic Diarrhea Virus Inducing Highly Neutralizing Antibodies, and Inactivated Vaccine Composition}
본 발명은 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine Epidemic Diarrhea Virus: PEDV)의 예방을 위한 백신 조성물에 관한 것이다.
돼지 유행성 설사병(Porcine epidemic diarrhea: PED)은 돼지의 주요 바이러스 설사병 중 하나로 모든 연령의 돼지를 감염시키고 급성 및 수양성 설사(acute, watery diarrhea)를 유발하며 특히 생후 1주 미만의 자돈에선 심각한 탈수를 유발하여 폐사를 초래한다. PED는 대규모 발생 시 자돈 폐사와 성장 지연 같은 직접적인 영향뿐만 아니라 모돈의 번식성적 저하 등 간접적 피해를 유발하기 때문에 국내 양돈산업을 위협하는 매우 큰 경제적 손실을 초래하는 질병이다.
PED의 원인체인 돼지 유행성 설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus: PEDV)는 Nidovirales 목, Coronaviridae 과, Alphacoronavirus 속에 속하는 단일 가닥의 positive-sense RNA genome을 가진 Enveloped virus이다. PEDV의 genome은 약 28kb이며 5′ untranslated region(5′ UTR), 7개의 open reading frame(ORF1a, ORF1b 및 ORF 2-6) 및 3’UTR로 구성된다. ORF1a 및 ORF1b는 replicase polyproteins pp1a과 pp1b를 암호화하고, 4개의 ORF는 spike(S), membrane(M), envelope(E), nucleocapsid(N)를 암호화하며, 남은 ORF는 accessory gene을 암호화한다. 이 중 S gene의 계통 발생 분석을 기반으로 PEDV는 유전적으로 genogroup1(G1; 고전적 또는 재조합 및 저병원성)과 genogroup2(G2; field epidemic 또는 pandemic 과 고병원성)의 두 그룹으로 나눌 수 있으며, 각각 1a와 1b, 2a와 2b의 하위 그룹으로 구성된다.
PED는 1971년 영국에서 처음 보고되었으며, 그 후 유럽과 아시아의 많은 양돈국에서 발생하였다. 국내에서 PED는 1992년 최초로 보고되었으며, 2000년 1월 충청북도 제천에서 발생한 PED를 공식적인 통계로 처리한 이후 매년 포유자돈의 폐사로 엄청난 경제적 손실을 초래하고 있다. PED는 포유자돈에서 발생하여 이유자돈까지 폭발적으로 발생하여 폐사를 일으키기 때문에 신생자돈의 면역이 매우 중요하다. 돼지는 태반을 통해 모돈의 면역이 이행되지 않기 때문에 모돈에 백신을 접종하여 충분한 면역을 유도하여 충분한 초유 급여를 통해 출생한 신생자돈에게 모체이행항체를 전달해야 된다. 이처럼 PED 백신은 필수 접종 백신이나 농장에서는 PED 백신을 접종했음에도 농장에서의 PED 피해가 끊어지지 않고 지속적으로 발생하여 이른바 ‘물백신’으로 인식되는 등 PED 백신에 대한 불신이 높은 실정이다. 과거에는 PED 발병 시 인공감염 등의 조치로 어느 정도 발병을 종료시킬 수 있었지만, 현재에는 발병 종료 이후 수개월이 지나면 다시 저산차(특히 초산 모돈)의 포유자돈에서 증상이 다시 나타나는 경우를 많이 관찰할 수 있어 농장의 PEDV의 순환이 더욱 심화되고 있다. 반면 현재까지 PED를 완전하게 방어하는 백신도, 치료제도 없는 상황이다. 현재 PEDV 백신의 효과가 미미한 이유는 백신의 주요 S glycoprotein과 field epizootic strain 간의 항원성, 유전적 및 계통 발생적 차이 및 면역증강제의 조성의 차이 때문일 수 있다.
이러한 문제를 해결하기 위해선 고병원성을 나타내거나 최근 현장에서 만연한 유행 균주를 이용하여 높은 면역원성(중화항체) 유도능을 통한 우수한 방어효과를 지닌 백신의 개발이 필요하다.
종래에 선행기술로서 대한민국 공개특허 제10-2021-0120898호에는 스파이크 단백질을 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 분리주 및 이의 배양물 또는 이의 바이러스 유사입자를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 조성물을 개시하고 있고, 대한민국 공개특허 제10-2014-0020881호에는 돼지유행성설사병바이러스 약독화주 및 이를 포함하는 돼지유행성 설사병 백신 조성물을 개시하고 있다. 그러나, 돼지유행성설사병바이러스에 대한 백신의 개발에도 불구하고 방어력이 좋은 백신의 개발 및 상용화되어 있지 않다.
이에 본 발명자들은 고병원성의 최근 유행형 PEDV G2b 바이러스를 분리하였고, 이를 불활화시킨 백신 조성물의 높은 면역원성(중화항체) 유도능을 확인하여 PED를 효과적으로 예방할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 백신은 모돈에 접종한 후 모돈에서 생성된 면역성분이 함유된 초유를 자돈이 섭취함으로 모체이행항체의 전달을 통해 자돈이 충분한 수동면역을 획득하는 것이다. 이를 위해서는 백신을 접종한 모돈에서 가능한 최대의 높은 면역을 유도하는 백신이 절대적으로 필요하다. 이를 위해서 높은 중화항체를 형성하는 PEDV의 선발, 다양한 PEDV 유전형에 대한 높은 교차방어능이 있는 PEDV의 선발 및 초유를 통한 모돈에서 자돈으로의 높은 수준의 모체항체의 이행이 중요하다.
본 연구의 주된 목적은 최근 유행한 고병원성의 PEDV G2b 분리주와 다양한 Adjuvant 후보군을 이용하여 가장 효과적으로 면역능을 향상시킬 수 있는 백신 조성을 결정하기 위하여 모돈에서 백신후보군에 의한 면역 유도능을 평가하고자 한다.
본 발명의 목적은 높은 중화 항체를 유도하는 신규 돼지 유행성 설사병 바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 돼지 유행성 설사병 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돼지 유행성 설사병 예방 또는 치료용 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 돼지에서 돼지 유행성 설사병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 높은 중화 항체를 유도하는 신규 돼지 유행성 설사병 바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명은 돼지 유행성 설사병 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 돼지 유행성 설사병 예방 또는 치료용 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 돼지에서 돼지 유행성 설사병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 높은 중화 항체를 유도하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 이에 대한 불활화 백신 조성물에 대한 것으로, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대해 우수한 면역 유도능을 확인한 바, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 의한 질환을 예방하는데 유용하게 활용할 수 있다.
도1은 RT-PCR을 통해 확인된 PEDV 양성 샘플을 나타내는 도면이다(M, DNA standard 3 kb plus; -, Vero cell control; 1, SM98; 2, HID9047; 3, HID9048; 4, HID9049).
도 2는 PEDV HID9047, HID9048, HID9049 strain을 접종한 Vero 세포의 세포변성 효과(cytopathic effect, CPE)를 보여주는 도면이다.
도 3은 PEDV HID9047, HID9048, HID9049 strain을 접종한 Vero 세포를 면역형광염색(Immunofluorescence assay, IFA)한 후 형광현미경 하에서 관찰한 결과를 보여주는 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 PEDV HID9047, HID9048, HID9049 strain과, 종래 PEDV strain 또는 분리주들의 스파이크 유전자에 대한 상동성 분석 결과를 계통수(phylogenetic tree)로 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 불활성화된 PEDV HID9047, HID9048, HID9049 strain과 Adjuvant(IMS 1313 또는 IMS Gel)를 혼합한 백신 조성물을 돼지의 이근부에 2회 접종한 후, 모돈에서 확보한 초유 내 PEDV SM98, HID9047, HID9048 및 HID9049 strain에 대한 중화항체가를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명에 따른 불활성화된 PEDV HID9047, HID9048, HID9049 strain과 Adjuvant(IMS1313 또는 IMS Gel)를 혼합한 백신 조성물을 돼지의 이근부에 2회 접종한 후, 모돈에서 확보한 혈청 내 SM98, HID9047, HID9048 및 HID9049 strain에 대한 중화항체가를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명에 따른 불활성화된 PEDV HID9047(항원 농도별)과 Adjuvant(ISA206)를 혼합한 백신 조성물을 기니픽에 2회 근육 접종한 후, 기니픽에서 확보한 혈청 내 PEDV HID9047 strain 특이적 IgG 항체가를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명에 따른 불활성화된 PEDV HID9047(항원 농도별)과 Adjuvant(ISA206)를 혼합한 백신 조성물을 기니픽에 2회 근육 접종한 후, 기니픽에서 확보한 혈청 내 PEDV HID9047 strain에 대한 중화항체가를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명에 따른 불활성화된 PEDV HID9047(항원 농도별)과 Adjuvant(ISA206)를 혼합한 백신 조성물 또는 시판백신군(PED-X) 또는 음성대조군을 모돈 이근부에 2회 접종한 후, 모돈에서 확보한 초유 내 PEDV HID9047 strain에 대한 중화항체가를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명에 따른 불활성화된 PEDV HID9047(항원 농도별)과 Adjuvant(ISA206)를 혼합한 백신 조성물 또는 시판백신군(PED-X) 또는 음성대조군을 모돈 이근부에 2회 접종한 후, 모돈에서 확보한 혈청 내 PEDV HID9047 strain에 대한 중화항체가를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 높은 중화 항체를 유도하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 분리주를 제공한다.
돼지 유행성설사병 바이러스(PEDV)(porcine epidemic diarrhea virus)는 코로나비리대 과(Coronaviridae family)의 일원으로서, 막(envelop)이 있는 단일가닥 RNA 바이러스이며, 돼지에 있어서 심한 장관 설사병(diarrhea)을 야기하는 것으로 알려져있다.
본 발명의 실시예에서 돼지 유행성 설사병으로 인해 폐사한 돼지의 분변 및 소장에서 돼지 유행성 설사병 바이러스를 분리하여 HID9047, HID9048 및 HID9049로 명명하고, 생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 15250BP, 수탁번호 KCTC 15248BP 또는 수탁번호 KCTC 15249BP를 부여받았다.
돼지 유행성 설사병 바이러스는 S 유전자의 계통유전학적 분석에 기초할 때, 2개의 유전형, 즉 유전자군 I (G1; classical strains, 저병원성) 유전자군 II (G2; 2010년 이후 글로벌 유행성 균주, 고병원성)로 지정되며, 이들은 유전적으로 상이하고 항원성도 상이하다. 각 유전자군은 2개의 서브그룹, 즉 1a와 1b, 및 2a와 2b로 구분될 수 있다. 본 발명의 실시예에서 본 발명의 바이러스 분리주는 유전자군 G2b 군에 속하는 것으로 밝혀졌다.
또한 본 발명은 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 분리주를 포함하는 돼지 유행성 설사병 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어, “백신”은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동면역이 면역에 관계하는 항체의 생성 기간이 길고지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
상기 백신 조성물은 돼지 유행성 설사병 바이러스 분리주를 불활화시킨 불활화 백신일 수 있다.
불활화 백신은 죽은 바이러스 또는 이의 활성 성분을 포함하는 조성물을 의미하는 것으로, 상기 조성물을 포함하는 백신은 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 바이러스가 높은 역가로 증식되면, 바이러스를 수득한 후 이들을 포르말린, 베타프로프리오락톤 (BPL), 이성분 에틸렌이민 (Binary ethylenimine, BEI) 또는 감마선으로 처리하거나, 당업자에게 공지된 기타 방법에 의해 비활성화시킨다. 바람직하게 상기 불활화는 이성분 에틸렌이민 (BEI)에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 백신은 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용 가능한" 이란 생리학적으로 허용되고 돼지에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 당 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액, 또는 비-수용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 또한 백신에 추가될 있는 조성물로는 안정제, 불활화제, 항생제, 보존제 등이 사용될 수 있다. 백신의 투여 경로에 따라 백신 항원은 증류수, 완충용액 등과도 혼합하여 사용될 수 있다.
상기 백신 조성물은 보조제(adjuvant)를 추가적으로 포함할 수 있다. 보조제란 일반적으로 항원에 대한 체액 및/또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 지칭한다. 백신 조성물은 다양한 보조제와 면역반응 촉진 첨가물의 조합에 의해 최적의 면역반응 유도를 위한 조성으로 사용될 수 있다.
상기 보조제는 수산화 알루미늄, GEL 01, GEL 02, IMS 1313, ISA 15A (VG), ISA 28R (VG), ISA 35 (VG), ISA 201 (VG), ISA 206 (VG), ISA 660 (VG), 기름속 수형 에멀젼(물-in-oil emulsion), 불완전 프로인트항원보조제(불완전한 Freund’s adjuvant), 백반(alum), 알루미늄 하이드록사이드(aluminum hydroxide), Toll-like 수용체 작용제(Toll-like receptor agonist), 면역자극성 올리고뉴클레오티드(Immunostimulatory oligonucleotide) 및 생물학적 보조제(biological adjuvant)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명 백신 조성물의 투여량은 투여대상의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 바람직하게는 1회당 106 TCID50/dose 이상을 3주 간격으로 2회 투여할 수 있다.
상기 백신 조성물은 경구, 근육, 피하, 피내, 복강, 정맥, 진피, 안구, 뇌내 등의 투여경로를 통해 투여될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 근육 투여경로를 통해 투여될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 백신 조성물을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는 돼지에서 돼지 유행성 설사병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 돼지 유행성 설사병바이러스 등에 관한 내용은 전술한 바와 같다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 바이러스의 분리, 배양 및 확인
본 연구에 사용된 PEDV strain 중 HID9047 및 HID9048은 2016년 베트남 하남(Ha Nam) 및 타이빈성(Thai Binh provinces)에서, HID9049는 2017년 베트남 흥옌성(Hung Yen province)에서 급성 수양성 설사를 동반하다 폐사한 포유 자돈 및 이유 자돈의 분변 및 소장에서 수득하였다.
Vero 세포주에서 PEDV 분리 및 증식은 Vero 세포주를 T-25 flask에 90% confluency가 되도록 배양한 다음 PBS로 3회 세척하여 GM내 FBS성분을 모두 제거하였다. MD1 700 μl에 PEDV 200 μl를 혼합하고 trypsin 5 μl를 첨가한 후 Vero 세포주에 접종하였고, 37℃ 5% CO2 배양기에서 1시간 동안 흡착시켰다. 흡착 1시간 후 MD6 4.5 ml을 첨가하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하면서 CPE 발생 유무를 현미경으로 매일 관찰하였다. CPE가 80%이상 발생하였을 때 얼렸다 녹이기를 3회 반복한 다음 4℃에서 211 xg로 10분간 원심분리하여 상층액을 수득하였으며 -70℃에 동결 보존하면서 다음 계대 배양에 이용하였다.
계대 배양 중 일부 배양 샘플을 채취하여 RNA/DNA extraction kit (Intron, Korea)를 이용하여 RNA를 분리한 다음, 상기 분리한 RNA를 AMPIGENE® cDNA Synthesis kit(ENZ-KIT 106-0200)를 이용하여 cDNA를 합성(RT, Reverse Transcription)하였다. 합성된 cDNA를 PEDV에 특정하게 반응하는 두 종류의 프라이머 즉 PEDV-N-F (5′-CGG TTC TCA CAG ATA GTG A-3′)와 PED-N-R (5′-CTC CTC CAC TCT GGG ATG T-3′) 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. 그 결과 도 1에 나타난 바와 같이 PEDV 특이 밴드인 약 900bp의 DNA를 검출하였다. PEDV-PCR 양성 샘플을 Vero 세포에서 배양하였으며, 명확한 CPE를 나타낸 3개의 PEDV 분리주를 HID9047, HID9048 및 HID9049로 명명하였다(도 2).
바이러스의 적정은 Reed-Muench법을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, Vero 세포를 분석 1일 전 96 well plate(Corning, USA)에 1x105 cells/well으로 seeding 후 37°C에서 배양하였다. 바이러스 증식용 배지에 역가를 측정하고자 하는 PEDV 샘플을 10진 희석하여 200 μl을 각 well에 접종하였다. 상기 접종 후 접종액을 완전히 제거하고 새로운 바이러스 증식용 배지를 각 well에 200 μl씩 첨가한 후 7일 동안 매일 현미경으로 CPE를 관찰하여 최대 바이러스 희석 배수의 역수를 TCID50(50% Tissue Culture Infective Dose)로 표시하였다. HID9047, HID9048 및 HID9049의 바이러스 역가는 계대 10대 바이러스주에서 각각 107.5, 108.2 및 108.5 TCID50/ml이였다.
Vero 세포에서 PEDV의 성장을 확인하기 위하여 monoclonal mouse anti-PEDV(Median Diagnostics, Korea)와 fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated goat anti-mouse immunoglobulin G (IgG) (MP Biomedicals, USA)를 사용하여 IFA를 수행하였다. 구체적으로, Vero 세포를 분석 24시간 전에 PEDV로 감염시킨 후 대조군 및 감염된 세포를 4% paraformaldehyde로 고정하고 0.1% Triton X-100로 permeabilized 시켰다. 이후 세포를 5% bovine serum albumin으로 blocking한 후 1/1000 monoclonal mouse anti-PEDV 및 1/1000 FITC-conjugated goat anti-mouse IgG로 염색하여 형광현미경을 사용하여 관찰하였다. 시험 결과 바이러스에 감염된 Vero 세포의 세포질에서는 특정 형광 신호가 관찰되었으나 감염되지 않은 세포에서는 관찰되지 않았다(도 3).
실시예 2. PEDV 분리주의 유전자 염기서열 및 계통 분석
PEDV는 S gene의 계통 발생 분석을 기반으로 유전적으로 genogroup1과 genogroup2의 두 그룹으로 나눌 수 있으며, 각각 1a와 1b, 2a와 2b의 하위 그룹으로 구성된다. 본 연구에서 분리된 3개의 PEDV 분리주의 Spike protein 유전자의 전체 염기서열을 이용하여 국내 외 분리주와 phylogenetic tree를 분석한 결과, 3개의 바이러스주 모두 genogroup 2b(G2b) 계열에 속하는 것으로 밝혀졌다(도 4).
실시예 3. 시험 백신의 제조
불활화 백신을 제조하기 위해 역가가 확인된 바이러스 배양액을 5N NaOH를 이용하여 pH7.8±0.2로 조정한 다음 1시간 정도 정치하였다. 바이러스 배양액에 2-Bromoethylamine hydrobromide(BEA)의 최종 농도가 2 mM이 되도록 첨가하여 (37℃, 16시간) 이성분 에틸렌이민(BEI)를 형성시킴으로써 바이러스를 불활화시켰다. 불활화 바이러스를 중화하기 위하여 20% Sodium thiosulfate를 불활화된 바이러스 배양액에 10% 첨가하여 37℃에서 24시간 동안 배양하여 중화하였고 Amicon tube를 이용하여 불활화제(BEI)를 제거하였다. 바이러스 불활화를 확인하기 위하여 불활화된 바이러스를 바이러스 배양 방법과 동일한 방법으로 Vero 세포주에 접종하였고, 37℃ 5% CO2 배양기에서 7일간 배양하면서 PEDV에 의한 CPE 발생 유무를 관찰하여 바이러스가 불활화 되었는지 확인하였다. 불활화 확인이 끝난 후 바이러스 용액을 어쥬번트 IMS Gel은 9:1, IMS 1313과 ISA206은 5:5의 비율로 혼합하여 시험 백신을 제조하였다.
실시예4. 시험 백신의 면역원성
본 발명에서 분리한 3개의 PEDV 분리주로부터 제작한 시험 백신의 면역원성을 조사하기 위하여 표 1과 같이 시험을 진행하였다.
모돈 백신 접종 시험 구성
그룹 군명 군 설명 접종용량
(1 dose)
항원 항원함량
(1 dose) 		Adjuvant
1 시험약-1 불활화 HID9047 항원 1x107 TCID50 IMS1313 2 mL
2 시험약-2 불활화 HID9047 항원 1x107 TCID50 IMS Gel 2 mL
3 시험약-3 불활화 HID9048 항원 1x107 TCID50 IMS1313 2 mL
4 시험약-4 불활화 HID9048 항원 1x107 TCID50 IMS Gel 2 mL
5 시험약-5 불활화 HID9049 항원 1x107 TCID50 IMS1313 2 mL
6 시험약-6 불활화 HID9049 항원 1x107 TCID50 IMS Gel 2 mL
7 음성대조군 PBS 2 mL
구체적으로, 상기 준비된 백신을 분만 4주 전 모돈에 2주 간격으로 상기 백신 조성물을 2 ml의 부피로 각각의 돼지 이근부에 총 2회 근육접종하고 최종 접종 2주 후 채혈 및 초유를 수득하였다.
모돈 접종 실험을 통해 얻어진 초유 및 혈청을 이용하여 중화항체가 측정 시험 결과, 초유 내 중화항체가는 그룹 2(불활화 HID9047+IMS Gel)에서 HID9047 strain에 대한 중화항체가가 약 341로 가장 높게 측정되었으며, 혈중 중화항체가는 그룹 5(불활화 HID9049+IMS1313)에서 약 298로 가장 높게 측정되었다(도 5, 6). 그러나 PEDV 백신 전달 기전은 모돈에 백신을 접종하여 초유를 통해 자돈에 항체를 전달하는 방식이기 때문에 초유 내에서 가장 높은 중화항체가를 나타낸 그룹 2(불활화 HID9047+IMS Gel)의 HID9047을 백신 바이러스주로 선정하였다.
실시예 5. 실험동물(기니픽)에서 백신의 항원량 결정 시험
가장 뛰어난 면역능을 나타내면서 경제적으로도 이점이 되는 PEDV 항원량을 결정하기 위한 실험에 앞서, 백신의 효능을 가장 효율적으로 향상시킬 수 있는 Adjuvant를 선정하기 위하여 관련논문을 바탕으로 Seppic사의 ISA206을 추가하여 Adjuvant 선정시험을 진행하였고, 시험결과 IMS Gel보다 ISA 206 혼합군에서 더 높은 중화항체가가 유도되는 것을 확인할 수 있었다(data 생략).
따라서 앞선 실험에서 결정된 불활화 HID9047 항원과 ISA 206 조합으로 항원량 결정시험을 진행하였으며, 시험은 '동물용의약품 국가출하승인검정 기준(1-2-04-14 돼지 유행성 설사 바이러스 불활화백신 검정기준)'에서 명시하는 것처럼 돼지의 바이러스성 질병 백신의 검정시험법을 참고하여 실험 동물인 기니픽에서 시험을 수행하였다.
항원량을 결정하기 위해 1x105, 1x106, 2x106, 1x107 TCID50/dose의 네 가지 조건에서 실험을 수행하였다. 7주령 암컷 기니픽에 3주 간격으로 백신후보군(표 2)을 2회 근육 접종하였으며, 접종 후(0주, 3주) 0, 3, 5주에 채혈하여 혈청 내 PEDV 특이적 IgG 및 중화항체가를 측정하였다.
기니픽에서의 항원량 결정 시험 구성
그룹 군명 군설명 접종용량
(1/2 dose)
항원 항원함량
(1 dose) 		Adjuvant
1 시험약-1 불활화
HID9047
항원		 1x105 TCID50 ISA206 1 mL
2 시험약-2 1x106 TCID50 1 mL
3 시험약-3 2x106 TCID50 1 mL
4 시험약-4 1x107 TCID50 1 mL
5 음성대조군 PBS 1 mL
Indirect ELISA 방법을 통해 혈청 내 항원 특이적 IgG를 측정한 결과(도 7), 백신 접종 3주 후부터 항원량이 증가될수록 항체역가가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 특히 그룹 4(1x107 TCID50/dose)는 3 WPV(weeks post vaccination)부터 시험 종료 시(5 WPV)까지 음성대조군(p<0.001) 및 그룹 1(1x105 TCID50/dose)(p<0.001)과의 유의적인 차이를 나타냈으며, 그룹 3(2x106 TCID50/dose)도 5 WPV에서 음성대조군(p<0.001) 및 그룹 1(1x105 TCID50/dose)(p<0.001)과의 유의적인 차이를 나타냈다.
중화항체가 측정 결과(도 8), IgG 측정 결과와 유사하게 백신 접종 횟수가 증가될수록 HID9047에 대한 중화항체가가 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며, 특히 그룹 4(1x107 TCID50/dose)에서 음성대조군(p<0.001) 및 다른 접종군(p<0.001)과 유의적인 차이로 높게 나타남을 확인하였다.
종합하면, 기니픽에서의 항원량 결정시험을 수행한 결과, 그룹 4(1x107 TCID50/dose)에서 체액성 면역반응(IgG 항체역가, 중화항체가)이 가장 높게 증가함을 확인하였으나, 그룹 3(2x106 TCID50/dose)에서도 유의성있게 체액성 면역반응이 증가되는 것을 관찰할 수 있었다.
실시예 6. 목적동물(돼지)에서 백신의 항원량 결정 시험
실험동물에서의 실험 결과를 바탕으로, 목적동물에서 백신의 유효성 및 경제적 이점을 나타내는 백신의 항원량을 결정하기 위해 목적동물인 모돈에서 시험을 수행하였다. 항원량은 기니픽에서 유효성을 나타낸 항원량(2x106 TCID50/dose)과 최대 항원량(108 TCID50/dose) 두 가지 농도로 시험을 진행하였으며, 양성대조군으로 (주)중앙백신연구소의 PED-X를 사용하였다(표 3).
모돈에서의 항원량 결정 시험 구성
그룹 군명 군설명 접종용량
(1 dose)
항원 항원함량
(1 dose) 		Adjuvant
1 시험약-1 불활화 HID9047 항원 2x106 TCID50 ISA206 2 mL
2 시험약-2 불활화 HID9047 항원 1x108 TCID50 ISA206 2 mL
3 시판백신군
(PED-X)		 불활화 ISU46065IA13주 항원 106.5 TCID50 CAWIO 2 mL
4 음성대조군 PBS 2 mL
상기 준비된 백신을 분만 5주 전 모돈에 3주 간격으로 상기 백신 조성물을 2 ml의 부피로 각각의 돼지 이근부에 총 2회 근육접종하고 최종 접종 2주 후 채혈 및 초유를 수득하였다.
모돈 접종 실험을 통해 얻어진 초유 및 혈청을 이용하여 중화항체가를 측정한 시험 결과, 초유 내 중화항체가는 그룹 1(불활화 HID9047 2x106 TCID50/dose)에서 HID9047 strain에 대한 중화항체가가 약 1706으로 가장 높게 측정되었으며(도 9), 혈중 중화항체가 역시 그룹 1(불활화 HID9047 2x106 TCID50/dose)에서 약 384로 가장 높게 측정되었다(도 10). 그룹 1의 초유 및 혈중 중화항체가는 음성대조군 대비 유의적으로 증가되었으며, 뿐만 아니라 양성대조군인 PED-X와도 유의적인 차이를 나타내어 개발백신이 기존 시판백신 대비 우수한 면역 유도능을 나타냄을 확인하였다.
한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC15248BP 20221215 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC15249BP 20221215 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC15250BP 20221215

Claims (8)

  1. 높은 중화 항체를 유도하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 분리주로서, 수탁번호 수탁번호 KCTC 15248BP, 수탁번호 KCTC 15249BP 수탁번호 KCTC 15250BP로 기탁된 것을 특징으로 하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바이러스 분리주는 유전자군 G2b 군에 속하는 것을 특징으로 하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스주.
  3. 제1항의 돼지 유행성 설사병 바이러스 분리주를 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지 유행성 설사병 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 백신은 불활화 백신인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 불활화는 이성분 에틸렌이민(Binary ethylenimine)에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 보조제(adjuvant)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 보조제는 수산화 알루미늄, GEL 01, GEL 02, IMS 1313, ISA 15A (VG), ISA 28R (VG), ISA 35 (VG), ISA 201 (VG), ISA 206 (VG), ISA 660 (VG), 기름속 수형 에멀젼(water-in-oil emulsion), 불완전 프로인트항원보조제(Incomplete Freund’s adjuvant), 백반(alum), 알루미늄 하이드록사이드(aluminum hydroxide), Toll-like 수용체 작용제(Toll-like receptor agonist), 면역자극성 올리고뉴클레오티드(Immunostimulatory oligonucleotide) 및 생물학적 보조제(biological adjuvant)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  8. 제3항의 백신 조성물을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지에서 돼지 유행성 설사병을 예방 또는 치료하는 방법.
KR1020230098328A 2022-08-25 2023-07-27 높은 중화 항체를 유도하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 불활화 백신 조성물 KR20240028924A (ko)

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