JP3043353B2 - ワクチン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ウシウイルス性下痢ウイルス（bovine virus diarr
hoa virus、以後、“BVDV"と略す）は、英国、それ以
外の西ヨーロッパ、北アメリカ、オーストラリア、およ
び、アフリカにおいて、ウシに極めて一般的なものであ
る。このウイルスに感染すると、最初に感染した年令に
より大きく影響されて、種々の病状や症候群が発生する
が、このウイルスは、これに感染したことがない若いコ
ウシに対して、過渡感染を引き起こすものである。これ
は、白血球減少症、および、免疫抑制の相関期間と関連
するものであり、このウイルスに感染すると、他の微生
物に感染しやすくなるものである。BVDVは、若い家畜ウ
シにとっては、多分、RSウイルス（RSV:respiratory s
yncitial virus）に次ぐ、呼吸疾患の突発性に関連し
た、最も重要なウイルスであるが、BVDVは免疫抑制作用
を有するため、他の、コウシ感染、たとえば腸炎の場合
にも、BVDVがその原因である可能性がある。このウイル
スはまた、米国およびカナダにおいて、“過密状態にお
かれているコウシ（feedlot calves）”の、病気の主
因であるとも考えられている。コウシは回復するにつれ
て、再感染に対する免疫性を示すが、この免疫性は、完
全もしくは永久的なものではない。

妊娠しているウシが感染すると、問題は、より重大で
ある。すなわち、流産してしまったり、または、出産さ
れる胎児が奇形である可能性がある。この奇形は、免疫
適格が発達する時期に、ウイルスに感染することによる
ものであり、不完全な免疫反応の結果といえる。非細胞
変性性ウイルスに、免疫適格が発達する前に胎児が感染
すると、妊娠期間に胎児にウイルス血症が残存し、ま
た、永続的にウイルス血症を有するコウシが出産され
る。このウシは、特別に、生涯、BVDVに対して免疫耐性
を有するが、このようなコウシは、後に、粘膜の疾患、
すなわち、BVDVの細胞変性を有する変形株の重感染によ
り、死に至るものである。

英国における、通常のコウシの約0.4％が、ウイルス
血症であると見積られ、その主な感染源は、農場であ
る。

伝統的には、ウイルス性ワクチンは、以下の２つのグ
ループにわけられるものである。すなわち、病原性を低
減するような方法で、処理もしくは増殖させた（毒性を
弱められた）生ウイルスを含有する生ワクチンと、死ん
だ（不活性化）ウイルス粒子を含有するワクチンとであ
る。BVDVに関していえば、ウイルス自体、細胞変性性も
しくは非細胞変性性かもしれない。したがって、原則と
して、BVDVワクチンは、４つの主なグループに分けるこ
とができるが、入手可能なワクチンの大半は、細胞変性
ウイルスに基づくものである。さらに、生ワクチンは許
容されるものではないと考えられており、これは、細胞
変性性の生ワクチン菌株は、永続的なウイルス血症動物
を、粘膜疾患により致死させてしまう可能性があり、ま
た、非細胞変性性の生ウイルスワクチンは、妊娠したウ
シの胎児に感染し、上記のような疾患を引き起こす可能
性があるからである。

気道を経由した感染は、農場でのウイルス伝染におけ
る最も重要なルートであり、このルートによる蔓延を防
ぐことが、BVDVによる疾患を制御するのに、最も有益な
効果を示すものと期待される。

不活性化されたBVDVを用いてワクチン注射を行なう
と、呼吸性感染が防止され、ある実験においては、５頭
の、ワクチン注射したコウシのすべてが、呼吸性感染に
対して抵抗力を示したが、他の５頭の、ワクチン注射を
しなかったコウシは、すべて感染した。

不活性な（殺、killed）BVDV抗原は、抗体の高タイタ
ー価の産生を誘発し、その量は、ワクチン注射前には、
50単位より少なかったのが、ワクチン注射後には、２、
000ー10,000単位以上となった。

本発明は、不活性な（殺、killed）非細胞変性のウイ
ルスからなるワクチンを提供するものであり、そのウイ
ルスは、MDBK細胞系（Madin Darby Bovine Kidney;M
adin ＆ Darby（1958）;ECACC社より入手可能（Salis
bury、Wiltshire、UK））のような、ウシの細胞から誘
導される細胞系において増殖するものであり、“キルＡ
（Quil Ａ）”がアジュバントとして加えられたもので
ある。MDBK細胞は、世界中の、多くの実験室より入手可
能なものである。本発明の実用において使用される、他
のウシ細胞系としては、EBL細胞、NM5細胞、LWC874細
胞、および、CTe細胞が挙げられる。

MDBK細胞系は、このましくは、147ー187の継代レベル
（passage level）において、より好ましくは147から1
57において、最も好ましくは147において、使用される
ものである。種ウイルスは、好ましくは、約10⁶TCD₅₀の
BVDV（非細胞変性性の菌株）を、コウシの精巣細胞の融
合培養に添加することにより調製されるものである。コ
ウシの精巣細胞は、ウイルス収率がこれらの細胞におい
てより高いため、種培養物を増殖するのに好ましく、一
方、抗原の収率はMDBK細胞においてより大きい。これら
の細胞は、イーグルの最少必須培地（Eagle's MEM）を
用いて回転瓶において増殖され、ウシの胎児の血清 7.
5％、炭酸水素ナトリウム 0.11％、および、ラクトア
ルブミンの加水分解産物 0.25％が添加されてもよいも
のである。ウイルスの添加後、培養は、50mlの培地；ウ
シの胎児の血清 ２％、炭酸水素ナトリウム 0.17％、
ラクトアルブミンの加水分解産物 0.25％、および、塩
化マグネシウム（MgCl2・6H2O）0.6％を含有する、イー
グルの基礎培地（Eagle's BME）に、維持されるもので
ある。培養は、約36℃において、５日間から９日間、好
ましくは７日間インキュベートされ、凍結／解凍の１サ
イクルにふされるものである。懸濁液は、約500gで４分
間から６分間、好ましくは５分間、遠心分離されて、沈
殿物が取り除かれ、少量の上澄み液が、約ー70℃に冷却
保存される。この保存された種ウイルスのタイターは、
コウシの精巣細胞の培養により、定量することができ
る。

ウイルス抗原は、約1mlの種ウイルス（BVDVを約10⁶TC
D₅₀含有する）を、MDBK細胞の培養に添加することによ
り、調製されるものである。これらの細胞は、イーグル
の最少必須培地、ウシの胎児の血清 10％、および、炭
酸水素ナトリウム 0.11％を用いて回転瓶において増殖
され、培養が約75％融合するとき、すなわち約４日後
に、使用可能なものである。ウイルスの添加後、培養
は、125mlの基礎培地（BME（vide supra））におい
て、維持することができる。７日後、培養が、約10⁸の
細胞および約10^8.5TCD₅₀のウイルスタイターを有した
ら、βープロピオラクトンを、499に対して１（500のう
ち１）の濃度で添加し、約36℃で、３時間、回転瓶で、
ウイルスを不活性にするものである。この抗原が完全に
不活性であるか否かは、コウシの精巣細胞の培養におい
て、サンプルの継代により、チェックされる。この抗原
は、ー20℃において、保存されるものである。

細胞培養が、種ウイルスおよびウイルス抗原の調製に
使用される以前に、これらに対する、外因性のBVDVの存
在がチェックされるものである。ウシの胎児の血清にお
いては、ウイルスおよびBVDV抗体がないことが、検査さ
れるものである。

ワクチンの１回の投与量は、50ulのストック（水中、
20mg/ml）とされた1mgの“キルＡ（Quil Ａ）”（スー
パーフォス、デンマーク（Superfos A/S、Denmark））
を、4mlのβープロピオラクトンー不活性化ウイルスに
添加することにより、調製されるものである。このワク
チンは、生後約３箇月で、母体から誘導もしくは感染に
より産生されたBVDV抗体を保有しないことが明らかなコ
ウシの後ろ肩に、皮下注射されるものである。

ワクチン注射されたコウシは、抗体反応（表１）を示
し、これはエリザ（ELISA（Howard、Clarke ＆ Brown
lie、1985））によって調べられ、最初のワクチン注射
から６週間後に検知された。これらのワクチン注射され
たコウシ、および、ワクチン注射されていないもの（比
較例）は、気道に対して向性を有すること、および、鼻
咽喉へ一定の速度で分散することから選択されたBVDVの
菌株（11249nc）を用いて、感染試験された。コウシ
は、第８週目で、鼻腔に感染させた。ウイルスの分散
は、感染試験から約10日間、鼻咽喉への感染を綿棒を用
いて（同時に血液検査も行なった）調べられ、サンプル
は、コウシの精巣細胞の培養に付された。BVDVは、表２
および表３に示すように、ワクチン注射されていないも
の（比較例）から検出されたが、ワクチン注射されたコ
ウシからは、検出されなかった。個々における感染試験
時の抗体レベルと感染しやすさとの関係が、表３に示さ
れている。ワクチン注射されていないもの（比較例）の
いずれも、感染試験時においては、検出されるほどの抗
体を有していなかったが、すべてのものが感染し、抗体
ができたものである（漿液が変化した）（表１参照）。

BVDV抗原は、多価ワクチンを得るために他の微生物
（好ましくは不活性化された微生物）と共に含有されて
もよい。これらの微生物には、RSウイルス、パラインフ
ルエンザ ３ ウイルス、および、マイコプラズマ ボ
ビス（Mycoplasma bovis）が含有されるものである。

ウイルス全体を使用する替わりに、ウイルスから抗原
を分け、これを、“キルＡ（Quil Ａ）”、および、任
意には、適当なキャリアなどとともに、使用することが
有益である。これは、公知の方法で施行可能なものであ
る。

MDBK（MadinーDarby Bovine Kidney）細胞系は、AT
CC CCL 22として、アメリカン タイプ カルチャ
ー、コレクション、米国、マリーランド、ロックビル
（the American Type Culature Collection、Rockv
ille、Maryland、USA）より、約25年間、入手可能であ
る。1982年以来、この細胞系は、BDVーフリーである。
同細胞系は、また、ヨーロピアン コレクション オブ
アニマル セル カルチャーズ、英国、ウイルトシャ
イアー、サリスバリー、ポートン ダウン（the Europ
ean Collection of Animal Cell Cultures、Porto
nDown、Salisbury、Wiltshire、UK、以後、これをECACC
と略す）から、受託番号ECACC85102401号として、入手
可能であるが、このMDBK細胞系は、他の種から誘導され
たものである。そのサンプルは、ブタペスト条約に基づ
き、1989年８月２日に、受託番号89080201号として、EC
ACCに寄託されているものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クラーク，マイケル シリル イギリス国 ＲＧ16 ０ＮＮ バークシ ャー エヌアール ニューベリー コン プトン （番地なし） インスティチュ ート フォア アニマル ヘルス内 (72)発明者 ブラウンリー，ジョン イギリス国 ＲＧ16 ０ＮＮ バークシ ャー エヌアール ニューベリー コン プトン （番地なし） インスティチュ ート フォア アニマル ヘルス リミ テッド内 (56)参考文献 特開 昭57−131726（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−31058（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−105622（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−84029（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−255436（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−2933（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−89631（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 39/00 - 39/44 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）非細胞変性性のウシウイルス性下痢
   ウイルス（bovine virus diarrhoa virus:BVDV）
   を、ウシの細胞から誘導された細胞系で増殖させる過程
   と、（ｂ）過程（ａ）で得られたウイルスを不活性化す
   る過程と、（ｃ）過程（ｂ）で得られたウイルス由来物
   質とキルＡ（Quil A）とを混合する過程とを含む、ワク
   チン調製方法。
2. 【請求項２】前記細胞系が、MDBK、EBL、NM5、LWC874、
   もしくは、CTe細胞からなる、特許請求の範囲第１項に
   記載のワクチン調製方法。
3. 【請求項３】前記細胞系が、MDBK細胞からなる、特許請
   求の範囲第２項に記載のワクチン調製方法。
4. 【請求項４】初期過程において、前記細胞系が、コウシ
   の精巣細胞において増殖されたBVDVにより接種されるも
   のである、特許請求の範囲第１項ないし第３項に記載の
   ワクチン調製方法。
5. 【請求項５】前記ウイルス由来物質が、ウイルス全体か
   らなる、特許請求の範囲第１項ないし第４項に記載のワ
   クチン調製方法。
6. 【請求項６】不活性化された、非細胞変性性のウシウイ
   ルス性下痢ウイルス（BVDV）と、そのアジュバントとし
   てキルＡ（Quil A）とを含む、BVDV感染に効果的なワク
   チン。