CN108220248A - 猪轮状病毒毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种猪轮状病毒毒株HN03株，该株具有良好的免疫原性，其灭活抗原和亚单位抗原制备的疫苗组合物能对猪产生良好的保护作用，本发明的制备含有猪轮状病毒灭活抗原的疫苗组合物的方法，能培养产生高滴毒的病毒，抗原含量高，从而保证疫苗的免疫效力。

Description

猪轮状病毒毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪轮状病毒毒株及其疫苗组合物、制备方法和应用。
背景技术
轮状病毒(Rotavirus，RV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)，轮状病毒属(Rotavirus)成员，是引起婴幼儿和多种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原体。仔猪、犊牛、绵羊、山羊、幼驹、鸡、火鸡及其他禽类均可感染轮状病毒。
猪轮状病毒(Porcine Rotavirus，PRoV)主要引起仔猪的腹泻，并伴有厌食、呕吐、脱水等临床症状。该病主要通过粪便传播，可感染各种年龄、性别的猪，3～5周的仔猪感染率较高，仔猪感染猪轮状病毒后，在粪便中排毒的持续时间约1～14天，且常与猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒等肠道病毒混合感染，并且易继发其他细菌性感染。该病在世界范围内广泛流行，导致仔猪生长缓慢或死亡率升高，给养猪业造成了巨大的经济损失。
目前对于猪轮状病毒病没有有效的药物，常规治疗方法不佳，疫苗是预防和控制该病的主要措施。然而，猪轮状病毒的分离比较困难，且分离的病毒株病毒滴度较低，不利于后期的培养增殖，造成制备的疫苗组合物免疫效力不高，无法有效对猪轮状病毒病进行有效防控。因此，亟需分离出免疫原性良好的国内流行的猪轮状病毒野毒株，将其制备成高效的灭活疫苗对预防和/治疗猪轮状病毒疫情，具有深远的现实意义。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供一种猪轮状病毒毒株、及其制备的灭活疫苗及其制备方法以及应用，该疫苗能够有效预防猪轮状病毒的感染。
本发明涉及一种从感染的组织和样本中分离猪轮状病毒毒株的方法，本发明的分离方法能从含病毒滴度低的组织和样本中有效分离猪轮状病毒，对同一样本或组织分离病毒时，使用本发明的分离方法分离的毒株滴度普遍更高。
本发明涉及一种猪轮状病毒毒株，该毒株具有强毒性和良好的免疫原性。
本发明还涉及一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的所述猪轮状病毒毒株抗原和/或兽医学上可接受的载体；其中，所述猪轮状病毒抗原包括灭活的全病毒抗原或亚单位抗原。所述疫苗组合物由强毒株制备，具有良好的免疫原性，能对猪提供完全的保护。
本发明还涉及所述疫苗组合物的制备方法，本发明的疫苗组合物的制备方法所培养的病毒滴度高，能提供更高含量的抗原成分。
本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪轮状病毒相关疾病中的应用。
本发明的猪轮状病毒毒株为流行的猪轮状病毒野毒株，用该毒株制备成疫苗组合物可预防和/或治疗猪轮状病毒疫情蔓延，并且含该毒株的疫苗组合物免疫动物后能使动物机体快速产生抗体，对当前流行的猪轮状病毒单独或混合感染有良好的预防和控制效果，生物安全性好。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明涉及一种猪轮状病毒的分离方法，所述分离方法包括：步骤(1)获取表现典型猪轮状病毒感染症状的猪的小肠内容物或粪便；步骤(2)使用胰酶处理所述小肠内容物或粪便；步骤(3)将所述胰酶处理所述小肠内容物或粪便稀释，接种于培养好的单层传代细胞，添加细胞维持液，培养病毒。
术语“猪轮状病毒”(Porcine Rotavirus，PRoV)属呼肠孤病毒科、轮状病毒属成员，由11个双股RNA片段组成，所引发的临床症状包括腹泻，并伴有厌食、呕吐、脱水等。病理变化以小肠肠壁透明菲薄、水样内容物、小肠绒毛萎缩为特征。
术语“猪轮状病毒毒株(PRoV毒株)”在本发明中若无特殊说明即为猪轮状病毒野毒株(PRoV野毒株)、猪轮状病毒强毒株(PRoV强毒株)、野生型PRoV毒株，可互换使用。
作为本发明的一种实施方式，本发明的所述猪轮状病毒的分离方法中，所述步骤(2)中的胰酶含量为10μg/ml，处理条件为在37℃作用1小时，期间每20分钟混匀一次，所述步骤(3)中的传代细胞为MA104细胞、Marc145细胞、或Vero细胞，所述步骤(3)中的细胞维持液为含有0.5μg/ml胰酶的α-MEM培养液。
作为本发明的一种实施方式，本发明的所述猪轮状病毒的分离方法中，所述步骤(3)接种小肠内容物之前，使用PBS缓冲液洗涤对所述单层传代细胞的洗涤步骤；所述步骤(4)添加所述细胞维持液之前还包括使用PBS缓冲液对所述吸附了病毒的单层细胞的洗涤步骤；所述步骤(3)中吸附条件为接种病毒后，37℃孵育1小时，期间每20分钟混匀一次。
本发明涉及猪轮状病毒HN03株(Porcine Rotavirus，Strain HN03)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:V201653，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2016年10月24日。
本发明涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的猪轮状病毒HN03株抗原和药学上可以接受的载体。
术语“疫苗组合物”又称免疫原性组合物，是指一种含免疫原的制剂，包括如全细胞、灭活的或减毒的、活的病毒或细菌，或者多糖，或其组合，其被施用来刺激受体对存在于免疫原性组合物中一种或多种抗原的体液和细胞免疫反应。免疫接种是施用疫苗组合物并在宿主中刺激对抗原的免疫或免疫原性反应的过程，优选宿主为动物诸如猪。
术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。
术语“猪轮状病毒抗原”是指至少含有一种猪轮状病毒抗原形式的任何组合物，所述猪轮状病毒抗原可诱导、刺激或能抵抗猪轮状病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、减毒的或亚单位的抗原。其中，灭活的抗原可通过各种方法包括化学处理、物理处理(如声处理、照射、热)或任何其它足以阻止生物体复制或生长的常用方法来实现灭活而维持其免疫原性，优选将病原体在收集后灭活且任选地接受澄清净化，通过化学处理使用例如福尔马林或甲醛、β-丙内酯、乙烯亚胺、二元乙烯亚胺BEI、硫柳汞等；灭活的方法是本领域技术人员公知的，如通过β-丙内酯(Plana-Duran等，Vet.Microbiol.,1997,55:361-370)或通过BEI处理(US5587164)。
术语“药学上可以接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除猪轮状病毒抗原之外的其他所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(CambridgeBiotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica PharmaceuticalsIncorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccinedesign,the Subunit and adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BFGoodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。
本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的所述的猪轮状病毒毒株或其培养物灭活抗原和药学上可以接受的载体。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述猪轮状病毒HN03株抗原为猪轮状病毒HN03株或其培养物的灭活抗原；或所述猪轮状病毒HN03株抗原为猪轮状病毒HN03株或其培养物的亚单位抗原VP7蛋白。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述的猪轮状病毒毒株培养物为培养1～38代的培养物。
作为本发明的一种更优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述的猪轮状病毒毒株培养物为培养3～26代的培养物。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；
优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；
优选地，乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其特别是L121))；
优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波普974P、934P和971P；
优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA；
优选地，所述佐剂为206佐剂；
所述佐剂的浓度范围是从5％到50％V/V，优选50％V/V。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述猪轮状病毒HN03株或其培养物的灭活抗原含量为灭活前≥105.0TCID50/ml。
作为本发明的一种更优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述所述猪轮状病毒HN03株或其培养物的灭活抗原含量为灭活前105.0-107.0TCID50/ml。
作为本发明的一种最优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述所述猪轮状病毒HN03株或其培养物的灭活抗原含量为灭活前106.0TCID50/ml。
作为本发明的一种实施方式，所述灭活的全病毒抗原是通过将所述猪轮状病毒毒株在细胞上增殖而获得的全病毒培养液，并经灭活剂灭活所得。作为本发明的一种实施方式，所述灭活剂包括但不限于β-丙内酯BPL、二乙烯亚胺BEI、福尔马林、甲醛、N-乙酰乙烯亚胺AEI、盐酸聚六亚甲基胍PHMG。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述猪轮状病毒HN03株或其培养物的亚单位抗原VP7蛋白含量为25-150μg/ml。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述猪轮状病毒HN03株或其培养物的亚单位抗原VP7蛋白含量为50μg/ml。
本发明的所述猪轮状病毒HN03株或其培养物的亚单位抗原VP7蛋白可以通过本领域的常规方法制备，例如通过原核表达体系表达制备、真核表达体系表达制备、或通过化学合成制备。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述疫苗组合物还包括免疫量的猪流行性腹泻病毒病毒抗原。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述猪流行性腹泻病毒病毒抗原为HN1303株或其培养物的灭活抗原。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述猪流行性腹泻病毒病毒抗原含量为灭活前107.0-108.0TCID50/ml。
作为本发明的一种更优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述猪流行性腹泻病毒病毒抗原含量为灭活前107.0TCID50/ml。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物包括含量为灭活前105.0-107.0TCID50/ml的猪轮状病毒HN03株或其培养物的灭活抗原、含量为灭活前107.0-108.0TCID50/ml的猪流行性腹泻病毒HN1303株或其培养物的灭活抗原，以及50％V/V 206佐剂。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物包括含量为灭活前106.0TCID50/ml的猪轮状病毒HN03株或其培养物的灭活抗原、含量为灭活前107.0TCID50/ml的猪流行性腹泻病毒HN1303株灭活抗原，以及50％V/V 206佐剂。
本发明的疫苗组合物中，其他抗原成分对灭活的猪轮状病毒灭活抗原产生了协同作用，使得免疫的猪只在更短时间内达到了足以抵抗强毒攻毒的中和抗体效价。
本发明还涉及一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：步骤(1)培养单层传代细胞；步骤(2)将所述猪轮状病毒HN03株接种于所述培养好的单层传代细胞，吸附病毒；步骤(3)在所述吸附了病毒的单层传代细胞中添加细胞维持液，培养细胞，所述细胞维持液含有胰酶，不含血清；步骤(4)当细胞CPE达到80％以上，收获病毒液；以及步骤(5)灭活收获的病毒，添加佐剂，混匀。
作为本发明的一种实施方式，本发明制备所述疫苗组合物的方法中，所述步骤(1)中的传代细胞为MA104细胞、Marc145细胞、或Vero细胞；所述步骤(3)中的细胞维持液为含有0.5μg/ml胰酶的α-MEM培养液。
作为本发明的一种实施方式，本发明制备所述疫苗组合物的方法中，所述步骤(2)接种猪轮状病毒HN03株病毒之前还包括使用PBS缓冲液对所述单层细胞的洗涤步骤；所述步骤(3)添加所述细胞维持液之前还包括使用PBS缓冲液对所述吸附了病毒的单层细胞的洗涤步骤；所述步骤(2)中吸附条件为接种病毒后，37℃孵育1小时，期间每20分钟混匀一次。
术语“预防和/或治疗”在涉及猪轮状病毒感染时是指抑制猪轮状病毒的复制、抑制猪轮状病毒的传播或防止猪轮状病毒在其宿主体内定居，以及减轻猪轮状病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
本发明还涉及所述的疫苗组合物在制备预防猪轮状病毒感染相关疾病的药物中的应用。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1猪轮状病毒HN03株的分离
1、样品筛选和处理
从各地发病的2-3日龄仔猪中收集粪便、小肠内容物，经试纸条检测均为猪轮状病毒阳性。将该粪便、小肠内容物用PBS(0.02mol/L，pH值7.4)4倍稀释后，8000rpm离心10分钟，取上清用0.22μm滤器过滤后，分装保存，分别命名为样1、样2、样3、样4、样5、样6、样7和样8。
2、猪轮状病毒的分离
2.1本发明分离方法分离：在MA104细胞上进行分离。将MA104细胞传代后(细胞培养液为α-MEM+5％FBS)，按120-150万细胞接种25T细胞瓶。待细胞长成单层后，将处理后的小肠内容物用10μg/ml的胰酶在37℃作用1小时，期间每20分钟混匀一次；取长成单层的MA104细胞，弃去细胞培养液，用37℃预热的PBS(0.02mol/L，pH值7.4)洗2次，按2倍稀释接毒，37℃孵育1小时，期间每20分钟混匀一次；然后弃去病毒液，用37℃预热的PBS(0.02mol/L，pH值7.4)洗1次，补加5ml细胞维持液(α-MEM+0.5μg/ml胰酶)，在37℃5％CO2条件下培养3-5天收获病毒液。
2.2常规分离方法分离：在MA104细胞上进行分离。将MA104细胞传代后(细胞培养液为α-MEM+5％FBS)，按120-150万细胞接种25T细胞瓶。待细胞长成单层后，弃去细胞培养液，用37℃预热的PBS(0.02mol/L，pH值7.4)洗2次，按2倍稀释接毒，37℃孵育1小时，期间每20分钟混匀一次；然后弃去病毒液，用37℃预热的PBS(0.02mol/L，pH值7.4)洗1次，补加5ml细胞维持液(α-MEM+1％FBS)，在37℃5％CO2条件下培养3-5天收获病毒液。
将样1、样2、样3、样4、样5、样6、样7和样8分别按照2.1本发明分离方法和2.2常规分离方法进行病毒分离，收获的病毒液分别命名为样1-1、样2-1、样3-1、样4-1、样5-1、样6-1、样7-1、样8-1和样1-2、样2-2、样3-2、样4-2、样5-2、样6-2、样7-2、样8-2并进行毒价测定。结果见表1。
表1不同分离方法分离病毒的毒价测定结果
结果显示，在鉴定为阳性的样品采用本发明分离方法进行病毒分离，均能分离到病毒，而采用常规方法进行分离，却有5/8显示测不到毒价(未见细胞病变)；同时，在3/8能测定到毒价的样品中，本发明分离方法分离到的病毒滴度明显高于常规方法。
将分离到的样3-1命名为猪轮状病毒HN03株(Porcine Rotavirus，strain HN03)，将猪轮状病毒HN03株进行保藏。
实施例2猪轮状病毒HN03株的鉴定
1猪轮状病毒HN03株的检测
针对VP7基因设计一对引物，可以用RT-PCR方法通用性地进行检测，所用引物序列如下：
F：5’-CCCCGGTATTGAATATACCACAGT-3’
R：5’-TTTCTGTTGGCCACCCTTTAGT-3’
根据核酸提取试剂盒(Geneaid公司)说明书，从猪轮状病毒HN03株病毒液中提取RNA，进行反转录，按照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(TransGen公司)说明书进行，反应体系为(20μl)：2×ES Reaction Buffer 10μl，ES RT/RI Enzyme Mix1μl，随机引物1μl，RNase-free water 4μl，RNA模板4μl。反应条件为：25℃10分钟，42℃30分钟，85℃5分钟。以cDNA为模板进行PCR，体系如下(25μl)：2×EasyTaq PCR SuperMix(TransGen公司)12.5μl，上游引物(F，10μM)0.5μl，下游引物(R，10μM)0.5μl，ddH2O 9.5μl，cDNA模板2μl。PCR反应程序如下：95℃5分钟，94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒，30个循环，72℃10分钟。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像仪观察电泳结果。
结果显示：所分离毒株HN03株RT-PCR鉴定为阳性，证实了所分离毒株HN03株确实为猪轮状病毒。同时对该毒株病毒液进行无菌检验、纯净性检验和外源病毒检验，结果均合格，无细菌、霉菌和支原体生长，外源病毒PEDV、TGEV、PRRSV、PCV2、PRV、CSFV、BVDV、PPV均为阴性。
2猪轮状病毒HN03株间接免疫荧光方法鉴定
抗原板的制备
将MA104细胞传代后，按照2×104个细胞/孔接种96孔板，每孔100μl，置于37℃5％CO2培养箱培养48小时。
待细胞长成单层后，弃去细胞孔中的液体，用无菌PBS(0.02mol/L，pH值7.4)洗1次，留一列作为健康细胞对照，加入细胞维持液(α-MEM+0.5μg/ml胰酶)，剩余孔用微量移液器加入稀释至300TCID50/0.1ml的猪轮状病毒HN03株病毒液，每孔100μl，置于37℃5％CO2培养箱培养18～22小时。
取培养好的96孔板，弃去细胞维持液，用预热的PBS(0.02mol/L，pH值7.4)洗2次，300μl/孔，每次5分钟。弃去PBS(0.02mol/L，pH值7.4)，用预冷的80％丙酮固定，每孔50μl，置于2～8℃30分钟。弃去丙酮，用PBS(0.02mol/L，pH值7.4)洗3次，300μl/孔，每次5分钟。弃去PBS(0.02mol/L，pH值7.4)后将抗原板甩干净，做好标记，置于-20℃保存备用。
IFA检测
抗原板预处理从-20℃取出制备好的猪轮状病毒抗原板，平衡至室温后，用37℃预热的PBS(0.02mol/L，pH值7.4)润洗一次，50μl/孔。
孵育一抗将商品化猪轮状病毒单抗(韩国金诺公司)作400倍稀释，加入4孔，作为阳性对照，健康细胞孔加入PBS(0.02mol/L，pH值7.4)。用PBS(0.02mol/L，pH值7.4)将猪轮状病毒阳性血清样品10稀释后，再进行2倍倍比稀释，将稀释好的样品加入到96孔板中，50μl/孔，置于37℃孵育1小时。
孵育二抗弃去孔中液体，用PBS(0.02mol/L，pH值7.4)洗3次，300μl/孔，每次5分钟；加入400倍稀释的FITC标记的兔抗鼠二抗(Sigma公司)，50μl/孔，置于37℃孵育1小时。
观察荧光弃去孔中液体，用PBS(0.02mol/L，pH值7.4)洗3次，300μl/孔，每次5分钟，每孔加入50μl PBS(0.02mol/L，pH值7.4)，在荧光显微镜下进行观察。
结果显示：健康细胞对照孔无可见荧光，阳性对照孔可见病变区细胞的细胞质中发出绿色荧光，表明特异性良好。
实施例3猪轮状病毒HN03株的致病性试验
怀孕母猪采血进行猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV2)抗原检测，猪轮状病毒(PRoV)IFA抗体检测，采集肛拭子用于猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRoV)抗原检测，选取PRoV抗原抗体阴性、PRRSV、PCV2、PEDV、TGEV抗原阴性的母猪所产仔猪用于本试验，仔猪不吃初乳。选用3日龄未吃初乳的仔猪10只，随机分为2组，每组5只。第一组口服接种HN03株病毒液2ml(病毒含量为107.5TCID50/ml)；第二组为空白对照组，口服接种α-MEM培养液2ml。每天观察临床症状，并采集肛拭子。临床症状：第二组空白对照组猪只精神饮食正常，粪便正常，未见腹泻。第一组攻毒组5头猪只全部发病，出现呕吐、水样腹泻的临床症状，猪只精神食欲下降，消瘦。结果见表2。
表2猪轮状病毒HN03株的致病性试验结果
组别 动物数量 接种剂量 发病数
1 5 2ml/只 5/5
2 5 2ml培养液/只 0/5
攻毒组猪只出现临床症状后，进行剖检以观察其脏器组织的病理变化。取发病猪只的小肠内容物，提取病毒RNA，进行RT-PCR检测。并按照实施例1中的方法分离病毒，接种MA104细胞，观察细胞病变。
剖检病变：空白对照组猪只剖检小肠无异常，其他脏器无异常；攻毒组猪只小肠肠壁菲薄透明，充满黄色内容物。
对从被剖检猪只中收集的小肠内容物进行RT-PCR分析，结果显示为PRoV阳性，猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阴性。同时将该小肠内容物按实施例1的方法接种MA104细胞，出现相同的细胞病变。这表明本试验中引起仔猪腹泻的确实为猪轮状病毒。本发明所述的分离株HN03株为猪轮状病毒强毒株。
实施例4猪轮状病毒HN03株病毒培养
4.1本发明扩增培养方法培养
取长成良好单层的MA104细胞，弃去细胞培养液，用37℃预热的PBS(0.02mol/L，pH值7.4)洗2次，按1000倍稀释接毒，37℃孵育1小时，期间每20分钟混匀一次；然后弃去病毒液，用37℃预热的PBS(0.02mol/L，pH值7.4)洗1次，补加细胞维持液(α-MEM+0.5μg/ml胰酶)，在37℃5％CO2条件下培养20-48小时，当CPE达到80％以上时，收获病毒液，经过2-3次冻融后，置于-20℃保存。
4.2常规扩增培养方法培养
取长成良好单层的MA104细胞，弃去细胞培养液，用37℃预热的PBS(0.02mol/L，pH值7.4)洗2次，按1000倍稀释接毒，37℃孵育1小时，期间每20分钟混匀一次；然后弃去病毒液，用37℃预热的PBS(0.02mol/L，pH值7.4)洗1次，补加细胞维持液(α-MEM+1％胎牛血清)，在37℃5％CO2条件下培养20-48小时，当CPE达到80％以上时，收获病毒液，经过2-3次冻融后，置于-20℃保存。
按照上述两种方法得到的病毒液进行毒价测定，本发明扩增培养方法得到的病毒液毒价为108.6TCID50/ml，而常规扩增培养方法得到的病毒液毒价为106.5TCID50/ml，说明使用本发明扩增培养方法获得的病毒液病毒滴度更高，适合制备疫苗。
实施例5猪轮状病毒HN03株灭活疫苗的制备
将实施例4本发明扩增培养方法得到的病毒液经3000rpm/min，离心10分钟，除去细胞碎片；再加入0.1％～0.2％的甲醛溶液37℃灭活24h，加入0.1～0.2％中和剂来中和甲醛的毒性。按照《中国兽药典》(中国兽药委员会，2010年版三部，中国农业出版社，2010)方法对灭活后的猪轮状病毒进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验，结果表明：猪轮状病毒HN03株灭活后，未受到细菌、霉菌的污染，也未受到支原体和外源病毒的感染，纯净性良好。
将上述灭活完全的猪轮状病毒抗原液与206佐剂(Seppic公司)按照1:1的比例混合，用IKA搅拌器以350rpm/min搅拌混匀5min制成乳剂，即得灭活疫苗1、2、3。具体配比见表3。
表3猪轮状病毒HN03株灭活疫苗配比
名称 灭活前病毒含量(TCID50/ml) 206佐剂含量(V/V％)
疫苗1 105.0 50
疫苗2 106.0 50
疫苗3 107.0 50
实施例6猪轮状病毒HN03株灭活苗的安全性试验
1妊娠母猪的安全性试验
选取产前4～6周PRoV抗原抗体均为阴性的妊娠母猪12头，随机分为4组，每组3头。第3组颈部肌肉注射实施例5制备的疫苗1(4ml/头)，第4组颈部肌肉注射实施例5制备的疫苗2(4ml/头)，第5组颈部肌肉注射实施例5制备的疫苗3(4ml/头)，第6组颈部肌肉注射同等量的无菌PBS作为对照组，观察免疫后母猪的精神、饮食、粪便状况。在产前2～4周再加强免疫1次，观察免疫后母猪的精神、饮食、粪便状况，直至母猪产仔。
结果(见表4)：免疫组3、4、5组的9头妊娠母猪与对照组6相比，精神、采食、体温、妊娠产仔均未见异常，注射部位及全身均未见不良反应，所有猪均健活。
表4灭活疫苗对妊娠母猪接种的安全性试验结果
2仔猪的安全性试验
选取3～5日龄PRoV抗原抗体均为阴性的仔猪20头，随机分为4组，每组5头。第1组颈部肌肉注射实施例5制备的疫苗1(2ml/头)，第2组颈部肌肉注射实施例5制备的疫苗2(2ml/头)，第3组颈部肌肉注射实施例5制备的疫苗3(2ml/头)，第4组颈部肌肉注射同等量的无菌PBS作为对照组，观察免疫后仔猪的精神、饮食、粪便状况，连续观察14日。
结果见表5：免疫组7、8、9组的15头仔猪与对照组10相比，精神、吃乳、诱饲、粪便均未见异常，注射部位及全身均未见不良反应，所有猪均健活。
表5灭活疫苗对仔猪接种的安全性试验结果
以上结果表明，本发明制备的灭活疫苗1、2、3用于免疫母猪和仔猪是安全的。
实施例7猪轮状病毒HN03株灭活苗的免疫原性试验
1主动免疫试验
选取产前4～6周PRoV抗原抗体均为阴性的妊娠母猪20头，随机分为4组，每组5头。第11组颈部肌肉注射实施例5制备的疫苗1(4ml/头)，第12组颈部肌肉注射实施例5制备的疫苗2(4ml/头)，第13组颈部肌肉注射实施例5制备的疫苗3(4ml/头)，第14组颈部肌肉注射同等量的无菌PBS作为对照组，观察免疫后母猪的精神、饮食、粪便状况。在产前2～4周再加强免疫1次，观察免疫后母猪的精神、饮食、粪便状况，直至母猪产仔。
母猪产仔后，第11组到第14组每头母猪所产3日龄仔猪各取5头，每组共25头，一共100头，均口服猪轮状病毒HN03株2ml/头(病毒含量为107.5TCID50/ml)，观察攻毒后仔猪的临床表现。
结果(见表6)：免疫母猪所产的仔猪，3日龄攻毒后，第11组25头免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，均健活；第12组25头免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，均健活；第13组25头免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，均健活；第14组，25头对照仔猪攻毒后，25/25表现典型的猪轮状病毒症状，呕吐，水样腹泻。疫苗1、疫苗2、疫苗3免疫妊娠母猪后，对所产的仔猪的保护率均为100％，表明灭活疫苗1、2、3具有良好的保护效果。
表6免疫母猪所产的仔猪攻毒保护率
2被动免疫试验
选取3～5日龄PRoV抗原抗体均为阴性的仔猪40头，随机分成4组，每组10头，第15组颈部肌肉注射实施例5制备的疫苗1(2ml/头)，第16组颈部肌肉注射实施例5制备的疫苗2(2ml/头)，第17组颈部肌肉注射实施例5制备的疫苗3(2ml/头)，第18组颈部肌肉注射同等量的无菌PBS作为对照组，观察免疫后仔猪的精神、饮食、粪便状况，连续观察14日。
于免疫后21日，均口服猪轮状病毒HN03株2ml/头(病毒含量为107.5TCID50/ml)，观察攻毒后仔猪的临床表现。
结果见表7：免后21日攻毒后，第15组、16组、17组10头免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，均健活；第18组，10头对照仔猪攻毒后，10/10表现典型的猪轮状病毒症状，呕吐，水样腹泻。疫苗1、疫苗2、疫苗3对仔猪的保护率均为100％，表明灭活疫苗1、2、3具有良好的保护效果。
表7免疫仔猪后的攻毒保护率
实施例8猪流行性腹泻病毒抗原的制备
将猪流行性腹泻病毒HN1303株((Porcine epidemic diarrhea virus，strainHN1303，保藏号为CCTCC NO.V201514；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉·武汉大学；保藏日期为2015年3月4日；公开于中国专利申请CN106148287A)在Vero细胞上扩增，收获病毒液，经2次冻融后，收毒，测定毒价。加入0.1％～0.2％的甲醛溶液37℃灭活24h，加入0.1～0.2％中和剂来中和甲醛的毒性。按照《中国兽药典》(中国兽药委员会，2010年版三部，中国农业出版社，2010)方法对灭活后的猪流行性腹泻病毒进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验，结果表明：猪流行性腹泻病毒HN1303株灭活后，未受到细菌、霉菌的污染，也未受到支原体和外源病毒的感染，纯净性良好。
实施例9含猪轮状病毒抗原的疫苗组合物的制备
将实施例4本发明扩增培养方法制备的猪轮状病毒HN03株抗原、实施例8制备的猪流行性腹泻病毒HN1303株抗原以及Seppic公司的206佐剂按照表8所示组分及含量进行配制。
表8含猪轮状病毒抗原的疫苗组合物含量配比
实施例10含猪轮状病毒抗原的疫苗组合物的应用
1含猪轮状病毒抗原的疫苗组合物的安全性试验
选取产前4～6周PRoV、PEDV抗原抗体均为阴性的妊娠母猪3头，颈部肌肉注射实施例9制备的疫苗4(4ml/头)，观察免疫后母猪的精神、饮食、粪便状况。在产前2～4周再加强免疫1次，观察免疫后母猪的精神、饮食、粪便状况，直至母猪产仔。结果：免疫接种妊娠母猪精神、采食、体温、妊娠产仔均未见异常，注射部位及全身均未见不良反应，所有猪均健活。
选取3～5日龄PRoV、PEDV抗原抗体均为阴性的仔猪5头，颈部肌肉注射实施例9制备的疫苗4(2ml/头)，观察免疫后仔猪的精神、饮食、粪便状况，连续观察14日。结果：免疫接种仔猪精神、吃乳、诱饲、粪便均未见异常，注射部位及全身均未见不良反应，所有猪均健活。表明：疫苗4的安全性试验均合格，本发明制备的灭活疫苗4用于免疫母猪和仔猪是安全的。
2含猪轮状病毒抗原的疫苗组合物的免疫原性试验
选取产前4～6周PRoV、PEDV抗原抗体均为阴性的妊娠母猪20头，随机分为4组，每组5头。第19组、第20组颈部肌肉注射实施例9制备的疫苗4(4ml/头)，第21组、第22组颈部肌肉注射同等量的无菌PBS作为对照组，观察免疫后母猪的精神、饮食、粪便状况。在产前2～4周再加强免疫1次，观察免疫后母猪的精神、饮食、粪便状况，直至母猪产仔。
母猪产仔后，第19组、第21组每头母猪所产3日龄仔猪各取5头，共50头，均口服猪轮状病毒HN03株2ml/头(病毒含量为107.5TCID50/ml)，观察攻毒后仔猪的临床表现。
结果见表9：免疫母猪所产的仔猪，3日龄攻毒后，第19组25头免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，均健活；第21组，25头对照仔猪攻毒后，25/25表现典型的猪轮状病毒症状，呕吐，水样腹泻。疫苗4免疫妊娠母猪后，对所产的仔猪的保护率均为100％，表明灭活疫苗4对猪轮状病毒感染具有良好的保护效果。
表9含猪轮状病毒抗原的疫苗组合物对PRoV攻击后动物试验结果
母猪产仔后，第20组、第22组每头母猪所产3日龄仔猪各取5头，共50头，均口服猪流行性腹泻病毒HN1303株2ml/头(病毒含量为105.5TCID50/ml)，观察攻毒后仔猪的临床表现。
结果见表10：免疫母猪所产的仔猪，3日龄攻毒后，第20组25头免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，均健活；第22组，25头对照仔猪攻毒后，25/25表现典型的猪流行性腹泻病毒症状，呕吐，水样腹泻。疫苗4免疫妊娠母猪后，对所产的仔猪的保护率均为100％，表明灭活疫苗4对猪流行性腹泻病毒感染具有良好的保护效果。
表10含猪轮状病毒抗原的疫苗组合物对PEDV攻击后动物试验结果
选取3～5日龄PRoV、PEDV抗原抗体均为阴性的仔猪40头，随机分成4组，每组10头，第23组、第24组颈部肌肉注射实施例9制备的疫苗4(2ml/头)，第25组、第26组颈部肌肉注射同等量的无菌PBS作为对照组，观察免疫后仔猪的精神、饮食、粪便状况，连续观察14日。
于免疫后21日，第23组、第25组口服猪轮状病毒HN03株2ml/头(病毒含量为107.5TCID50/ml)，观察攻毒后仔猪的临床表现。
结果见表11：免后21日攻毒后，第23组10头免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，均健活；第25组，10头对照仔猪攻毒后，10/10表现典型的猪轮状病毒症状，呕吐，水样腹泻。疫苗4对仔猪的保护率均为100％，表明灭活疫苗4对猪轮状病毒感染具有良好的保护效果。
表11含猪轮状病毒抗原的疫苗组合物对PRoV攻击后动物试验结果
于免疫后21日，第24组、第26组口服猪流行性腹泻病毒HN1303株2ml/头(病毒含量为107.5TCID50/ml)，观察攻毒后仔猪的临床表现。
结果见表12：免后21日攻毒后，第24组10头免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，均健活；第26组，10头对照仔猪攻毒后，10/10表现典型的猪流行性腹泻病毒症状，呕吐，水样腹泻。疫苗4对仔猪的保护率均为100％，表明灭活疫苗4对猪流行性腹泻病毒感染具有良好的保护效果。
表12含猪轮状病毒抗原的疫苗组合物对PEDV攻击后动物试验结果
综上所述：本发明制备的含猪轮状病毒抗原的疫苗组合物免疫后呕吐，水样腹泻等典型的猪轮状病毒病的典型的临床症状，对疫苗组合物中所含其他抗原没有免疫干扰，疫苗组合物中所含其他抗原还能对猪轮状病毒抗原发生协同增效作用。
实施例11猪轮状病毒HN03株VP7蛋白的制备
取猪轮状病毒HN03株病毒液，提取病毒RNA，设计特异性引物
VP7-F:5'CGGCGGAATTCATGTATGGTATTGAAT-3'(下划线为EcoRI酶切位点)
VP7-R:5'CCGTCGACTCAGACTCTATAGTAAAAAGC-3'(下划线为Sal I酶切位点)
扩增VP7的ORF基因。取目的产物连接pMD-18T克隆载体，制备阳性重组质粒pMD18-T-VP7，重组质粒pMD18-T-VP7使用特异性引物进行扩增，将扩增产物连接表达载体pET32a(+)，经EcoR I和Sal I双酶切后，用T4连接酶进行连接。将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆。将构建的阳性表达质粒转入表达宿主菌BL21中，挑选单克隆，接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，用IPTG进行诱导表达，即得到猪轮状病毒VP7蛋白。
实施例12猪轮状病毒HN03株VP7蛋白的免疫原性试验
选择1头待产健康母猪，猪轮状病毒抗原、抗体阴性。产前4～6周接种VP7蛋白，在产前2～4周再加强免疫1次，50μg/头。待母猪产仔，选取10头状态良好的仔猪用于攻毒试验。其中各有5头母乳喂养；5头不吃母乳，人工饲养。仔猪3日龄时，用HN03毒株(107.5TCID50/ml，2ml/头)进行口服攻毒，仔猪分组及攻毒情况见表13。
表13猪轮状病毒VP7蛋白攻毒保护试验结果
组别 仔猪数 母猪接种疫苗 饲养方式 攻毒毒株 攻毒方式 保护率
26 5 VP7蛋白 母乳 HN03株 口服 4/5
27 5 VP7蛋白 人工 HN03株 口服 0/5
结果显示，猪轮状病毒VP7蛋白免疫仔猪4/5保护，有1头仔猪出现轻微腹泻；对照组则5/5发病，出现连续的腹泻。该结果说明本研究中表达的VP7蛋白有较好的免疫原性，能够产生较好的保护力。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 普莱柯生物工程股份有限公司
<120> 猪轮状病毒毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 981
<212> DNA
<213> 猪轮状病毒
<400> 1
atgtatggta ttgaatatac cacagttcta acctttctga tatcaatagt tttattgaac 60
tatatattaa aatcactaac tagtgcaatg gactttataa tttatagatt tcttttactt 120
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gattatatta atcagattgt gcaagttatg tccaaaagat cacgatcatt aaattcagca 960
gctttttact atagagtctg a 981
<210> 2
<211> 326
<212> PRT
<213> 猪轮状病毒
<400> 2
Met Tyr Gly Ile Glu Tyr Thr Thr Val Leu Thr Phe Leu Ile Ser Ile
1 5 10 15
Val Leu Leu Asn Tyr Ile Leu Lys Ser Leu Thr Ser Ala Met Asp Phe
20 25 30
Ile Ile Tyr Arg Phe Leu Leu Leu Ile Val Ile Ile Ser Pro Phe Val
35 40 45
Lys Thr Gln Asn Tyr Gly Ile Asn Leu Pro Ile Thr Gly Ser Met Asp
50 55 60
Thr Ala Tyr Ala Asn Ser Ser Gln Gln Glu Ala Phe Leu Thr Ser Thr
65 70 75 80
Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Thr Glu Ala Ser Thr Gln Ile Gly Asp Thr
85 90 95
Glu Trp Lys Asp Thr Leu Ser Gln Leu Phe Leu Thr Lys Gly Trp Pro
100 105 110
Thr Gly Ser Val Tyr Phe Lys Glu Tyr Thr Asp Ile Ala Ser Phe Ser
115 120 125
Ile Asp Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn Val Val Leu Met Lys His
130 135 140
Asp Ser Thr Leu Glu Leu Asp Met Ser Glu Leu Ala Asp Leu Ile Leu
145 150 155 160
Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile Thr Leu Tyr Tyr Tyr Gln
165 170 175
Gln Thr Asn Glu Ala Asn Lys Trp Ile Ser Met Gly Gln Ser Cys Thr
180 185 190
Ile Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Thr Leu Gly Ile Gly Cys Thr
195 200 205
Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Glu Val Ala Lys Asn Glu Lys Leu
210 215 220
Val Ile Thr Asp Val Val Asp Gly Val Asn His Lys Leu Asp Val Thr
225 230 235 240
Thr Asn Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Lys Lys Leu Gly Pro Arg Glu
245 250 255
Asn Val Ala Ile Ile Gln Val Gly Gly Ser Glu Val Leu Asp Ile Thr
260 265 270
Ala Asp Pro Thr Thr Ala Pro Gln Thr Glu Arg Met Met Arg Val Asn
275 280 285
Trp Lys Lys Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr Val Val Asp Tyr Ile Asn
290 295 300
Gln Ile Val Gln Val Met Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu Asn Ser Ala
305 310 315 320
Ala Phe Tyr Tyr Arg Val
325

Claims (11)

1.猪轮状病毒HN03株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:V201653，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2016年10月24日。
2.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的猪轮状病毒HN03株抗原和药学上可以接受的载体。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述猪轮状病毒HN03株抗原为猪轮状病毒HN03株或其培养物的灭活抗原；或所述猪轮状病毒HN03株抗原为猪轮状病毒HN03株或其培养物的亚单位抗原VP7蛋白；优选地，所述的猪轮状病毒毒株培养物为培养1～38代的培养物；更优选地，所述的猪轮状病毒毒株培养物为培养3～26代的培养物。
4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；
优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；
优选地，乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其特别是L121))；
优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波普974P、934P和971P；
优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA；
优选地，所述佐剂为206佐剂；
所述佐剂的浓度范围是从5％到50％V/V，优选50％V/V。
5.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述猪轮状病毒HN03株或其培养物的灭活抗原含量为灭活前≥105.0TCID50/ml；优选地，所述猪轮状病毒HN03株或其培养物的灭活抗原含量为灭活前105.0-107.0TCID50/ml；更优选地，所述所述猪轮状病毒HN03株或其培养物的灭活抗原含量为灭活前106.0TCID50/ml。
6.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述猪轮状病毒HN03株或其培养物的亚单位抗原VP7蛋白含量为25-150μg/ml；优选地，所述猪轮状病毒HN03株或其培养物的亚单位抗原VP7蛋白含量为50μg/ml。
7.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包括免疫量的猪流行性腹泻病毒病毒抗原；优选地，所述猪流行性腹泻病毒病毒抗原为HN1303株或其培养物的灭活抗原。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中，所述猪流行性腹泻病毒病毒抗原含量为灭活前107.0-108.0TCID50/ml；优选地，所述猪流行性腹泻病毒病毒抗原含量为灭活前107.0TCID50/ml；优选地，所述的疫苗组合物包括含量为灭活前105.0-107.0TCID50/ml的猪轮状病毒HN03株或其培养物的灭活抗原、含量为灭活前107.0-108.0TCID50/ml的猪流行性腹泻病毒HN1303株或其培养物的灭活抗原，以及50％V/V 206佐剂；优选地，所述的疫苗组合物包括含量为灭活前106.0TCID50/ml的猪轮状病毒HN03株灭活抗原、含量为灭活前107.0TCID50/ml的猪流行性腹泻病毒HN1303株灭活抗原，以及50％V/V 206佐剂。
9.一种制备权利要求2所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：
步骤(1)培养单层传代细胞；
步骤(2)将所述猪轮状病毒HN03株接种于所述培养好的单层传代细胞，吸附病毒；
步骤(3)在所述吸附了病毒的单层传代细胞中添加细胞维持液，培养细胞，所述细胞维持液含有胰酶，不含血清；
步骤(4)当细胞CPE达到80％以上，收获病毒液；以及
步骤(5)灭活收获的病毒，添加佐剂，混匀。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述步骤(1)中的传代细胞为MA104细胞、Marc145细胞、或Vero细胞；所述步骤(3)中的细胞维持液为含有0.5μg/ml胰酶的α-MEM培养液；以及
所述步骤(2)接种猪轮状病毒HN03株病毒之前还包括使用PBS缓冲液对所述单层细胞的洗涤步骤；所述步骤(3)添加所述细胞维持液之前还包括使用PBS缓冲液对所述吸附了病毒的单层细胞的洗涤步骤；所述步骤(2)中吸附条件为接种病毒后，37℃孵育1小时，期间每20分钟混匀一次。
11.根据权利要求2～8所述疫苗组合物在制备预防猪轮状病毒感染相关疾病的药物中的应用。
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