CN109568573A - 疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制备疫苗组合物的方法,其中,该方法包括:(1)制备含有猪伪狂犬病毒的液体;(2)通过向该步骤(1)的液体中加入非离子表面活性剂或者含有非离子表面活性剂的溶液,增溶存在于猪伪狂犬病毒液体中的囊膜蛋白;(3)除去该步骤(2)中的非离子表面活性剂得到纯化猪伪狂犬病毒抗原;以及(4)使用该步骤(3)中制备的抗原制备疫苗组合物。本发明还提供了该制备方法制备的含猪伪狂犬抗原的疫苗组合物,该疫苗组合物去除免疫抑制成分,同时最大限度的保留了免疫活性成分,对猪的肺病变有较好的保护效果;当与猪繁殖与呼吸综合征活病毒抗原共同作用时,对其没有抑制作用,表明可与多种其他抗原成分共用。
Description
本申请为专利申请201410763549.6的分案申请,原案发明名称为“疫苗组合物及其制备方法和应用”,原案申请日为2014年12月12日。
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域,具体涉及含猪伪狂犬病毒抗原的疫苗组合物及其制备方法。
背景技术
伪狂犬病,又称Aujeszky氏病,是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒Ⅰ型(Suid herpesvirus 1strain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国广泛存在,危害严重,是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻痹,死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜伏感染特性,在外周神经系统可以长期潜伏感染,当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒,被潜伏感染的宿主就会发病。
最近的研究报道称猪伪狂犬病发生了新的特点,突出表现为任何年龄的猪都会感染,可在猪群水平传播,潜伏期短(1~2天),发病率在10%~100%之间,发病猪死亡率在10%~100%之间(仔猪死亡率可高达100%),感染后可引起猪只高热(40~42℃,持续3日以上),呼吸困难,腹泻,喘,咳嗽,打喷嚏,后肢麻痹,犬坐,突然倒地,抽搐,侧卧不起,角弓反张,泳状划水,最后衰竭而死,并可引起种公猪精液质量下降,怀孕母猪流产(高达35%),早产,死胎,弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状。现有技术的疫苗免疫猪只后不能完全抵抗野毒攻击,依然会出现高热,精神沉郁,食欲下降或废绝等症状,感染率超过80%,发病率超过30%,死亡率在10%~20%之间。(参见彭金美等,猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析,中国预防兽医学报,2013,35(1):1-4;童武等,免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定,中国动物传染病学报,2013,21(3):1-7;Yu et al.,Pathogenic Pseudorabies Virus,China,2012,Emerging infectious Diseases,2014,20(1):102-104;An et al.,Pseudorabies virus variant in Bartha-K61-vaccinatedpigs,China,Emerging infectious Diseases,2013.19(11):1749-1755),现有技术还没有疫苗能够解决针对猪伪狂犬变异株引起的伪狂犬病。
中国专利申请CN103923884A公开了一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用公开了缺失gE基因的猪伪狂犬HN1201株(CCTCC NO.V201311),其攻毒能提供100%保护,但攻毒后还有2-3天的一过性发热。
目前商品化的猪伪狂犬灭活疫苗还存在有偶发性过敏情况(刘玉新等,仔猪伪狂犬病免疫过敏反应的诊治,河南畜牧兽医,2002(23)2)
目前存在的技术问题是需要更有效、更安全、更纯净的猪伪狂犬病疫苗,尤其需要的是针对伪狂犬变异株的标记纯化灭活疫苗。
发明内容
为了解决现有技术的不足,本发明要解决的第一个问题是提供一种纯化的猪伪狂犬病毒抗原的方法,使用该方法可以制备更有效、更安全、更纯净的猪伪狂犬病疫苗组合物。
本发明的第一方面在于提供一种制备疫苗组合物的方法,其中,所述方法包括:(1)制备含有猪伪狂犬病毒的液体;(2)通过向所述步骤(1)的液体中加入非离子表面活性剂或者含有非离子表面活性剂的溶液,增溶存在于猪伪狂犬病毒液体中的囊膜蛋白;(3)除去所述步骤(2)中的非离子表面活性剂得到纯化猪伪狂犬病毒抗原;以及(4)使用所述步骤(3)中制备的抗原制备疫苗组合物。
作为一种可选择方式,上述“提供含有猪伪狂犬病毒的液体”是指通过将伪狂犬病毒接种于易感的动物细胞进行增殖所获得的液体培养物。
作为本发明的一种实施方式,所述步骤(1)中含有猪伪狂犬病毒的液体为使用细胞培养收获的猪伪狂犬病毒培养液;所述细胞包括ST细胞系、PK-15细胞系、非洲绿猴肾细胞Marc-145细胞系、牛肾细胞MDBK细胞系、牛睾丸传代细胞BT细胞系、Vero细胞系、BHK-21细胞系、猪肾传代细胞系IBRS-2、兔肾传代细胞系RK,或者鸡胚成纤维细胞和猪肾细胞的原代细胞。
使用上述传代细胞和原代细胞用于制备猪伪狂犬病毒的方法可以采用本技术领域的常规方法进行。
作为本发明的一种实施方式,所述制备含有猪伪狂犬病毒的液体使用细胞悬浮培养方法制备猪伪狂犬病毒。
作为本发明的一种实施方式,所述制备含有猪伪狂犬病毒的液体使用微载体作为细胞载体以制备猪伪狂犬病毒。
任何可以具有免疫活性的猪伪狂犬病毒均可以用于本发明,优选地,所述的伪狂犬病毒为伪狂犬变异株。
术语“猪伪狂犬变异株”也称为高致病性猪伪狂犬毒株,是指:表现为任何年龄的猪都会感染,可在猪群水平传播,潜伏期短(1~2天),发病率在10%~100%之间,发病猪死亡率在10%~100%之间(仔猪死亡率可高达100%),感染后可引起猪只高热(40~42℃,持续3日以上),呼吸困难,腹泻,喘,咳嗽,打喷嚏,后肢麻痹,犬坐,突然倒地,抽搐,侧卧不起,角弓反张,泳状划水,最后衰竭而死,并可引起种公猪精液质量下降,怀孕母猪流产(高达35%),早产,死胎,弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状。
作为本发明的一种实施方式,含有猪伪狂犬病毒的液体为使用传代细胞培养收获的猪伪狂犬病毒变异株的培养液,所述猪伪狂犬病毒变异株为猪伪狂犬病毒HN1201株以及猪伪狂犬HN1201株的gE基因缺失株、JS-2012株、猪伪狂犬HeN1、NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株、猪伪狂犬病毒HN1202株、PRV TJ strain、猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01。
猪伪狂犬病毒HN1201株(Pseudorabies virus,strain HN1201)保藏号为CCTCCNO.V 201311;保藏于中国典型培养物保藏中心;保藏地址为中国武汉·武汉大学,保藏日期为2013年5月20日。JS-2012株公开信息为:童武,张青占,郑浩等,免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定[J].中国动物传染病学报2013,21(3):1-7)。猪伪狂犬HeN1株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其菌种保藏编号为CGMCCNO.6656,公开于专利申请CN102994458A。NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株公开信息为:Xiuling Yu,Zhi Zhou,Dongmei Hu,et al.Pathogenic PseudorabiesVirus,China,2012EmergingInfectious Diseases,www.cdc.gov/eid ol.20,No.1,January 2014。猪伪狂犬病毒HN1202株(Pseudorabies virus,strain HN1202)保藏号为CCTCC NO.V 201335;保藏于中国典型培养物保藏中心;保藏地址为中国武汉·武汉大学,保藏日期为2013年8月26日。PRV TJ(PRV TJ)株,公开于ChinaChun-Hua Wang Jin Yuan1,Hua-Yang Qin1,et al,A novel gE-deleted pseudorabies virus(PRV)provides rapid andcompleteprotection from lethal challenge with the PRV variantemerging in Bartha-K61-vaccinated swine population in China Vaccine 32(2014)3379–3385。猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01,其保藏号为CGMCCNo.8170公开于CN103627678A。
猪伪狂犬变异株的基因缺失株包括但不限于中国专利申请CN103923884A公开的缺失gE基因的猪伪狂犬HN1201株,中国专利申请CN103756977A公开了猪伪狂犬病gE和gI基因缺失病毒株PRV-ZJ011G株(保藏号为CGMCCNo.7957),中国专利申请CN102994458A公开了猪伪狂犬病gE缺失株,保藏号为CGMCC NO.6657。
使用上述传代细胞和原代细胞用于制备猪伪狂犬病毒变异株的方法可以采用本技术领域的常规方法进行。
作为本发明的一种实施方式,所述制备含有猪伪狂犬病毒变异株的液体使用细胞悬浮培养方法制备猪伪狂犬病毒。
作为本发明的一种实施方式,所述制备含有猪伪狂犬病毒变异株的液体使用微载体作为细胞载体以制备猪伪狂犬病毒。
所述“易感的动物细胞”可以是传代细胞系,也可以是原代细胞。适合于猪伪狂犬病毒的易感细胞包括但不限于,ST细胞系(ATCC编号:CRL-1746)、PK-15细胞系(ATCC编号:CCL-33)、非洲绿猴肾细胞Marc-145细胞系(ATCC编号:CRL-12219)、牛肾细胞MDBK细胞系(ATCC编号:CCL-22)、牛睾丸传代细胞BT细胞系(ATCC编号:CRL-1390)、Vero细胞系(ATCC编号:CCL-81)、BHK-21细胞系(ATCC编号:CCL-10)、猪肾传代细胞系(如:IBRS-2,见例如,DECASTRO,M.P.1964.Behavior of foot and mouth disease virus in cell culture:susceptibility of the IB-RS-2swine cell line.Arquivos Instituto Biologica 31:63-78)、兔肾传代细胞系(RK,如:ATCC编号:CCL-106)等传代细胞系,或者鸡胚成纤维细胞和猪肾细胞等原代细胞。原代细胞可以通过本领域公知的方法,用动物体内的组织进行分离和制备。优选地,所述的适合的动物细胞为BHK-21细胞系。
作为本发明的一种实施方式所述的“提供含有猪伪狂犬病毒的液体”为采用BHK21细胞悬浮培养方法来增殖伪狂犬病毒。
作为本发明的另外一种实施方式所述的“提供含有猪伪狂犬病毒的液体”为采用PK15细胞悬浮培养方法来增殖伪狂犬病毒。
作为本发明的一种实施方式,本发明所述制备方法中所述步骤(1)之后步骤(2)之前还可以包括澄清、浓缩所述含有猪伪狂犬病毒的液体的步骤;例如通过膜过滤进行将病毒液浓缩为原体积的1/2至1/5。
作为本发明的一种实施方式,所述步骤(1)之后还包括灭活病毒的步骤。
病毒灭活对于本发明的制备方法是必须的,可以通过化学或者物理的方法实现灭活,例如,物理方法的加热,化学方法的加入甲醛、二乙烯亚胺(BEI)或β丙内酯一个优选实施方式所用的灭活剂为甲醛。
病毒灭活步骤可以选择步骤(1)灭活,也可以选择在步骤(3)中除去的非离子表面活性剂后灭活。
作为本发明的一种实施方式,所述步骤(2)中非离子表面活性剂包括烷基葡糖苷、Brij 35、Brij 58、Genapol、TritonX-100、Triton X-114、吐温20、吐温80、Nonidet P40、脱氧胆酸钠。
作为本发明的一种优选实施方式,所述步骤(2)中非离子表面活性剂为Triton X-114、Nonidet P40。
作为本发明的一种实施方式,所述步骤(2)中非离子表面活性剂加入的量为与所述灭活的猪伪狂犬病毒的液体体积比0.1%-5%。
作为本发明的一种优选实施方式,非离子表面活性剂加入的量为与所述灭活的猪伪狂犬病毒的液体体积比0.5%~2.5%。
上述步骤(b)所述非离子表面活性剂非离子表面活性剂的加入量有严格限制,量多会造成有效蛋白的损失,加入量太小则无法去除杂质蛋白。非离子表面活性剂量为灭活的猪伪狂犬病毒的液体与非离子表面活性剂体积比为0.1%-5%,优选的范围为0.1%-0.2%、0.2%-0.3%、0.3%-0.4%、0.4%-0.5%、0.5%-0.6%、0.6%-0.7%、0.7%-0.8%、0.8%-0.9%、0.9-1.0%、0.8%-0.9%、0.9%-1.0%、1.0%-1.1%、1.1%-1.2%、1.2%-1.3%、1.3%-1.4%、1.4%-1.5%、1.5%-1.6%、1.6%-1.7%、1.7%-1.8%、1.8%-1.9%、1.9%-2.0%、2.0%-2.5%、2.5%-3.0%、3.0%-3.5%、3.5%-4.0%、4.0%-4.5%或4.5%-5.0%。最优选为0.5%、1%、2.5%。
作为本发明的一种实施方式,所述步骤(2)中增溶处理为在非离子表面活性剂与水不互溶的温度下混匀、溶解处理30分钟以上。
作为本发明的一种优选实施方式,所述步骤(2)中增溶处理为在0℃-5℃混匀、溶解处理60分钟。
作为本发明的一种实施方式,所述步骤(3)除去非离子表面活性剂的步骤为在10-30℃或37℃+0.5℃离心,所述离心的离心力大于100,000g。
作为本发明的一种实施方式,所述步骤(3)还包括除去病毒粒子的步骤。
作为本发明的一种实施方式,所述步骤(3)中除去非离子表面活性剂和病毒粒子可以同时进行,也可以分步进行。
作为本发明的一种优选实施方式,所述步骤(3)中除去非离子表面活性剂和病毒粒子的步骤中,所述离心的离心力大于200,000g,离心2小时以上,以同时除去病毒粒子。
本发明的第二方面为提供一种上述方法制备的所述的疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物中含有所述纯化的猪伪狂犬病毒抗原5μg/头份-500μg/头份以及药学上可以接受的载体,优选地含有抗原10μg/头份-100μg/头份,最优选为25μg/头份。
本发明疫苗可以按照公知常识加入药学上可以接受的载体,例如稳定剂、稀释剂、防腐剂,和缓释剂,稀释包括水、右旋糖酐、乙醇等诸如此类,等渗剂包括氯化钠、甘露醇、乳糖等诸如此类。稳定剂包括白蛋白,防腐剂包括硫柳汞、抗生素等诸如此类。
作为本发明的一种实施方式,疫苗组合物还包括佐剂,所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、含皂苷的免疫刺激性组合物、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。
作为本发明的一种实施方式所述佐剂为“免疫刺激性复合物”。
作为本发明的一种实施方式,所述含皂苷的免疫刺激性组合物为皂苷与固醇及磷脂的组合物,其中皂苷对固醇及磷脂的比例为1∶100(w/w)至5∶1(w/w)。
作为本发明的一种优选实施方式,所述含皂苷的免疫刺激性组合物为皂苷与固醇及磷脂的组合物,其中皂苷对固醇及磷脂的比例为1∶2(w/w)至1∶5(w/w)。
作为本发明的一种实施方式,所述含皂苷的免疫刺激性组合物中皂苷的量为0.05mg/头份至0.2mg/头份。
作为本发明的一种优选实施方式,所述含皂苷的免疫刺激性组合物中皂苷的量为0.1mg/头份。
作为本发明的一种优选实施方式,在上述四种实施方式中,所述含皂苷的免疫刺激性组合物为Quil A与胆固醇及卵磷脂的组合物。
作为本发明的一种实施方式,所述佐剂分别为含皂苷的免疫刺激性组合物和卡波姆、Quil A与铝胶的组合物。
作为本发明的一种优选实施方式,含皂苷的免疫刺激性组合物和卡波姆的佐剂组合物中,含皂苷的免疫刺激性组合物为皂苷Quil A与胆固醇及卵磷脂的组合物,含量为Quil A 0.1mg/头份,胆固醇0.2mg/头份,卵磷脂0.2mg/头份,卡波姆含量为2mg/头份。
作为本发明的一种优选实施方式,Quil A与铝胶的组合物中,Quil A含量为50-70μg/头份,铝胶含量为占疫苗组合物体积10-20%。
术语“免疫刺激性复合物”或ISCOM是指当Quil A与固醇及磷脂组合时形成的特殊形式。ISCOM可通过组合皂苷、固醇及磷脂来制备。例如:ISCOM可含有以重量计5%至10%的Quil A、1%至5%的胆固醇和磷脂,以及剩余部分的蛋白质。佐剂配制物中皂苷对固醇的比例典型地为1∶100(重量对重量)(w/w)至5∶1(w/w)。在一些实施方案中存在过量的固醇,其中皂苷对固醇的比例为至少1∶2(w/w),或1∶5(w/w)。在其他实施方案中,皂苷相对于固醇而言为过量,并使用的皂苷对固醇的比例为约5∶1(w/w)。ISCOM及ISCOMATRIX可自IsconovaAB(瑞典)购得。
优选地,所述猪伪狂犬疫苗Quil A的量为0.05mg/头份-0.2mg/头份,优选0.1mg/头份。
作为本发明的一种实施方式,疫苗中含有纯化的猪伪狂犬病毒抗原,免疫刺激物和铝胶。
优选地,所述铝胶用量为所述铝胶为用量为10%-20%(v/v)。
作为本发明的一种实施方式,所述疫苗组合物进一步包括免疫量的其他抗原成分,所述抗原包括猪瘟抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪圆环病毒抗原、猪肺炎支原体抗原、猪流感病毒抗原、猪萎缩性鼻炎抗原中的一种或多种。
本发明所用术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物,尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联,这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer,商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462,其描述了这类丙烯酸聚合物,其与聚羟基化的化合物交联,所述化合物具有至少3个羟基,优选不超过8个,其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团,例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基,如甲基。这些产品以卡波普的名义出售,(BF Goodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P,最优选使用卡波普971P。
本发明所用术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto),这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液,经中和,优选中和至生理pH,以便产生佐剂溶液,能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。
本发明的另一方面为所述的疫苗组合物在预防和治疗猪伪狂犬病毒相关疾病中的应用。
本发明具有以下突出的优点:
(1)本发明制备的疫苗组合物除去引起过敏的蛋白、内毒素等,疫苗更安全。
(2)本发明的制备方法制备的组合物能对猪伪狂犬病毒变异株有更好的保护作用。
(3)本发明的疫苗组合物可以用来稀释猪瘟、猪繁殖与呼吸系统综合症等活疫苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明所用术语“预防和/或治疗”在涉及猪伪狂犬感染时是指抑制猪伪狂犬的复制、抑制猪伪狂犬的传播或防止猪伪狂犬在其宿主体内定居,以及减轻猪伪狂犬感染的疾病或病症的症状。若细菌荷载量减少、肺部感染减轻和/或摄食量和/或生长增加,那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
本发明所用术语“猪”是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物。
术语“抗原”是指可在动物中产生抗体或T细胞反应或者二者都有的化合物、组合物或免疫原性物质。
本文定义疫苗或免疫组合物是指包含至少一种抗原的物质的组合物,该抗原在对所能引起免疫反应。
本实施例中伪狂犬变异株的基因缺失株为中国申请CN103923884A公开缺失gE基因的猪伪狂犬HN1201株。其中猪伪狂犬HN1201株(Pseudorabies virus,strain HN1201),保藏号为CCTCC NO.V 201311;保藏于中国典型培养物保藏中心;保藏地址为湖北省武汉武汉大学,保藏日期为2013年5月20日
本发明中所用的pH7.2PBS液配方为:1000mL蒸馏水中加入NaCl 9g、Na2HPO4·12H2O 6g、NaH2PO4·2H2O 0.4g,本发明中所用到的化学试剂均为分析纯,购自国药集团。
BHK-21细胞培养基为CellventoTM BHK-200无血清细胞培养基(默克,FC00408)。按照说明书配制BHK-21悬浮细胞用培养基,在容器中加入注射用水至总体积的90%,将一袋培养基(2.16g)全部倒入容器中,轻微搅拌溶解,按照2g/L的重量体积比加入碳酸氢钠,轻微搅拌后加注射用水至1L,用1mol/L的氢氧化钠或1mol/L的盐酸调pH值至7.2,用0.1μm滤膜正压过滤除菌。
Quil A储备溶液:将Quil A(Superfos)溶解在水中,制备50毫克/毫升的储备溶液。将胆固醇利用0.2微米滤器过滤。
胆固醇储备溶液:胆固醇储备溶液(溶解在乙醇中,制备18毫克/毫升的储备溶液。然后,利用0.2微米滤器过滤胆固醇储备溶液。
卡波姆溶液:将卡波姆溶解在去离子水中,制备0.75%的储备溶液。
铝胶佐剂:货号:VAC-ALU-250厂商:invivogen
为使本发明更加容易理解,下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法,若无特殊说明,均为常规方法;所述的生物材料,若无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例1猪伪狂犬抗原的制备
1.1用转瓶制备工艺制备猪伪狂犬抗原
猪伪狂犬病病毒gE缺失株接种于PK-15细胞培养物先形成种子批,然后按病毒培养液量的1%(V/V)接入形成单层的PK细胞培养物中,置37℃旋转培养,当病变达到80%时,收获含毒细胞培养液,经2次冻融后,收毒,测定毒价为108.7TCID50/ml。病毒液中加入10%(v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2%(V/V),37℃灭活18小时,每4小时搅拌1次,每次搅拌10min。
1.2用悬浮培养法制备猪伪狂犬抗原
复苏液氮中冻存的BHK-21传代细胞系于底面积为75cm2的方瓶中静止培养,BHK-21悬浮细胞用培养基添加量为20ml。培养3d后收集液体中漂浮的活细胞于100ml摇瓶中培养,在37℃,5%CO2,110rpm的摇床中培养待摇瓶中BHK-21细胞浓度达4×106个/ml左右时,加入新鲜培养基对摇瓶中细胞进行稀释,并转移到其他摇瓶中,使细胞终浓度为1×106个/ml,收集摇瓶中培养72h的悬浮BHK-21细胞,使细胞总数在3×1010个左右,将细胞转移至NBS510 40L生物反应器,然后添加新鲜培养基至30L,使细胞终浓度为1×106个/ml。生物反应器培养参数为pH 7.2,温度为37℃,溶氧(Do)为60%,搅拌速度为80rpm,细胞在生物反应器培养48h后按照M.O.I 0.5接种伪狂犬病毒,病毒接种后观察细胞病变,当CPE至80%以上时开始收获病毒液。对收获的病毒液进行病毒含量测定(半数组织感染量),病毒含量为1010.0TCID50/ml,毒液中加入10%(v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2%(V/V),37℃灭活18小时,每4小时搅拌1次,每次搅拌10min。
实施例2纯化猪伪狂犬病毒
2.1猪伪狂犬纯化抗原的制备:将实施例1.2制备的猪伪狂犬灭活的抗原物100ml加入体积比为1.0%(体积比)Triton X114混匀;放至于0℃-5℃混匀60分钟,放在到37℃+0.5℃离心分离出Triton X114和病毒粒子。上清液即为纯化的伪狂犬病毒抗原,纯化后猪伪狂犬病毒纯化抗原的抗原用牛血清白蛋白做标准曲线,在长280nm和260nm波长计算蛋白含量纯化后的蛋白含量为53μg/ml。
2.2猪伪狂犬纯化抗原的制备:将1.2制备的猪伪狂犬灭活的培养物100ml加入体积比为2.0%(体积比)NP-40混匀;放在0℃-5℃混匀60分钟,放在到37℃+0.5℃离心分离出NP-40和病毒粒子。取上清液,纯化后的抗原用牛血清白蛋白做标准曲线,在长280nm和260nm波长计算蛋白含量纯化后的蛋白含量为48μg/ml。
2.3按照2.2方法,加入体积比为0.5%(体积比)NP-40,蛋白含量纯化后的蛋白含量为54μg/ml。
2.4按照2.2方法,加入体积比为5.0%(体积比)NP-40含量纯化后的蛋白含量为40μg/ml。
2.4按照2.1方法加入体积比为0.5%(体积比)Triton X114含量纯化后的蛋白含量为51μg/ml。
实施例3猪伪狂犬病疫苗中的制备
疫苗1:用实施例1.1所制备的猪伪狂犬病毒灭活抗原与206佐剂(法国SEPPIC公司产品)按照体积比54:46混合,在30℃条件下120转/分钟搅拌15分钟。
疫苗2:用实施例2.1所制备的纯化猪伪狂犬病毒抗原用pH为7.2的PBS稀释到最终疫苗中蛋白浓度为10μg/头份与206佐剂(法国SEPPIC公司产品)按照体积比54:46混合,在30℃条件下120转/分钟搅拌15分钟。
疫苗3:用实施例2.1所制备的纯化猪伪狂犬病毒抗原用P pH为7.2的PBS稀释到最终疫苗中蛋白浓度为10μg/头份加入Quil A溶液使Quil A的终浓度为0.1mg/头份,加入胆固醇溶液使胆固醇的终浓度为0.2mg/头份,卵磷脂0.2mg/头份,加入卡波姆溶液使卡波姆的终浓度为卡波姆2mg/头份,用pH为7.2的磷酸盐缓冲液补充体积。
疫苗4:用实施例2.3所制备的纯化猪伪狂犬病毒抗原用pH为7.2的PBS稀释到最终疫苗中蛋白浓度为25μg/头份加入Quil A溶液使Quil A的终浓度为0.1mg/头份(请确认),加入胆固醇溶液使胆固醇的终浓度为0.2mg/头份,卵磷脂0.2mg/头份,加入卡波姆溶液使卡波姆的终浓度为卡波姆2mg/头份,用pH为7.2的磷酸盐缓冲液补充体积。
疫苗5:用实施例2.3所制备的纯化猪伪狂犬病毒抗原、Quil A溶液使Quil A的终浓度为70μg/头份,加入铝胶佐剂10%(v/v)。
疫苗6:用实施例2.4所制备的纯化猪伪狂犬病毒抗原、Quil A溶液使Quil A的终浓度为50μg/头份,加入铝胶佐剂20%(v/v)。
实施例4、猪伪狂犬病病毒基因免疫原性实验
将9日龄的PRV抗原抗体阴性仔猪30头随机分成6组,5头/组,按照表1接种实施例3制备的疫苗,对照组接种DMEM培养基1ml/头。免疫28日后攻毒,攻毒剂量为HN1201株猪伪狂犬病病毒1×107.0TCID50/头,攻毒后每日测定仔猪体温,观察临床症状和死亡情况(结果见表2),攻毒前分别对试验组和对照组仔猪采血。
表1免疫原性试验动物分组
组别 | 注射疫苗 | 免疫剂量 |
I组 | 实施例3制备的疫苗1 | 肌注接种2ml/头 |
II组 | 实施例3制备的疫苗2 | 肌注接种1ml/头 |
III组 | 实施例3制备的疫苗3 | 肌注接种1ml/头 |
IV组 | 实施例3制备的疫苗4 | 肌注接种1ml/头 |
V组 | 实施例3制备的疫苗5 | 肌注接种1ml/头 |
VI组 | 实施例3制备的疫苗6 | 肌注接种1ml/头 |
空白对照组 | DMEM培养基 | 肌注接种2ml/头 |
免疫28日后攻毒,攻毒途径为滴鼻,攻毒剂量为猪伪狂犬病毒HN1201株1×107.0TCID50/头,1ml/头,观察攻毒后每日测定仔猪体温并观察临床症状和死亡情况免疫14后称重结果见表2。
表2猪伪狂犬活疫苗免疫仔猪后的攻毒情况及临床情况
试验结果显示:纯化疫苗表现出更好的效果,突出表现为攻毒后变现在仔猪发热时间变短,注射疫苗后没有一过性高热出现,并且增重方面也有更优的效果,且使用加入Quil A的佐剂显示出更优的预防效果。
实施例5疫苗相容性检验
取猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)(普莱柯生物工程股份有限公司,批号1407053A),用实施例3制备的疫苗1~5和参考稀释液(无菌注射用水),按照使用说明,灭活疫苗部分1头份/瓶(2ml)复原。20±3℃放置2h,依照猪繁殖与呼吸综合征活疫苗滴定方法检验。通过与参考稀释液的比较,评估待检稀释液对病毒活性组分的影响,病毒组分的滴定结果如表3,差值均不超过0.7log10(欧洲兽用疫苗标准)。本发明的疫苗可以用作冻干的活病毒抗原的稀释剂。而疫苗1由于是油佐剂疫苗无法进行抗原的稀释。
表3疫苗相容性检验结果
以上所述仅是本发明的优选实施例而已,并非对本发明做任何形式上的限制,虽然本发明已以优选实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案的范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (11)
1.一种制备疫苗组合物的方法,其中,所述方法包括:(1)制备含有猪伪狂犬病毒的液体;
(2)通过向所述步骤(1)的液体中加入非离子表面活性剂或者含有非离子表面活性剂的溶液,增溶存在于猪伪狂犬病毒液体中的囊膜蛋白;
(3)除去所述步骤(2)中的非离子表面活性剂得到纯化猪伪狂犬病毒抗原;
(4)使用所述步骤(3)中制备的抗原制备疫苗组合物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述步骤(1)中制备含有猪伪狂犬病毒的液体为使用细胞培养收获的猪伪狂犬病毒培养液;所述细胞包括ST细胞系、PK-15细胞系、非洲绿猴肾细胞Marc-145细胞系、牛肾细胞MDBK细胞系、牛睾丸传代细胞BT细胞系、Vero细胞系、BHK-21细胞系、猪肾传代细胞系IBRS-2、兔肾传代细胞系RK,或者鸡胚成纤维细胞和猪肾细胞的原代细胞;
所述含有猪伪狂犬病毒的液体包括使用传代细胞培养收获的猪伪狂犬病毒变异株的培养液,所述猪伪狂犬病毒变异株包括猪伪狂犬病毒HN1201株及猪伪狂犬HN1201株的gE基因缺失株、JS-2012株、猪伪狂犬HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株、猪伪狂犬病毒HN1202株、PRV TJ株、猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01株及其gE和gI基因缺失病毒株PRV-ZJ011G株以及
所述步骤(1)制备含有猪伪狂犬病毒的液体使用悬浮细胞制备猪伪狂犬病毒。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述步骤(1)之后还包括灭活病毒的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,所述步骤(2)中非离子表面活性剂包括烷基葡糖苷、Brij 35、Brij 58、Genapol、TritonX-100、Triton X-114、吐温20、吐温80、NonidetP40、脱氧胆酸钠;优选Triton X114、Nonidet P40。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述步骤(2)中非离子表面活性剂加入的量为与所述灭活的猪伪狂犬病毒的液体体积比0.1%-5%,优选地,非离子表面活性剂加入的量为与所述灭活的猪伪狂犬病毒的液体体积比0.5%~2.5%。
6.根据权利要求1所述的方法,所述步骤(3)还包括除去病毒粒子的步骤。
7.根据权利要求1~6任一项所述的疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物中含有所述纯化的猪伪狂犬病毒抗原5μg/头份-500μg/头份以及药学上可以接受的载体,优选地含有抗原10μg/头份-100μg/头份,最优选为25μg/头份。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物,其中,疫苗组合物还包括佐剂,所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、含皂苷的免疫刺激性组合物、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Blockco-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。
9.根据权利要求8所述的疫苗组合物,其中,所述含皂苷的免疫刺激性组合物为皂苷与固醇及磷脂的组合物,其中皂苷对固醇及磷脂的比例为1∶100(w/w)至5∶1(w/w),优选为1∶2(w/w)至1∶5(w/w);以及
皂苷的量为0.05mg/头份-0.2mg/头份,优选0.1mg/头份;
优选地,所述含皂苷的免疫刺激性组合物为Quil A与胆固醇及卵磷脂的组合物。
10.根据权利要求9所述的疫苗组合物,其中,所述佐剂分别为含皂苷的免疫刺激性组合物和卡波姆、Quil A与铝胶的组合物;优选地,含皂苷的免疫刺激性组合物和卡波姆的佐剂组合物中,含皂苷的免疫刺激性组合物为皂苷Quil A与胆固醇及卵磷脂的组合物,含量为Quil A 0.1mg/头份,胆固醇0.2mg/头份,卵磷脂0.2mg/头份,卡波姆含量为2mg/头份;优选地,Quil A与铝胶的组合物中,Quil A含量为50-70μg/头份,铝胶含量为占疫苗组合物体积10-20%。
11.根据权利要求7所述的疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物进一步包括免疫量的其他抗原成分,所述抗原包括猪瘟抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪圆环病毒抗原、猪肺炎支原体抗原、猪流感病毒抗原、猪萎缩性鼻炎抗原中的一种或多种。
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