CN107137705B - 猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用BHK细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法，其包括以下步骤：将BHK21细胞复苏后接入转瓶中培养至细胞长成片后，接入猪伪狂犬gE基因缺失病毒，继续培养，待细胞病变CPE达90％以上，收获细胞毒液，将收获的病毒液进行浓缩、灭活、除菌，制成成品，即得。采用本发明提供的疫苗生产方法收获的猪伪狂犬gE基因缺失病毒液的病毒含量高，达≥107.2TCID50/mL，且具有较强的免疫原性，不需要添加免疫增强剂即可达到好的免疫效果，经免疫后可促进体内分泌中和抗体，免疫保护率达到100％，完全达到疫苗效力评价标准。

Description

猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的生产方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种用BHK细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法。
背景技术
猪伪狂犬病病毒(PRV)属于疱疹病毒科a疱疹病毒亚科水泡病毒属猪疱疹病毒I型，猪是该病毒的唯一自然宿主，引起猪的伪狂犬病。该病在猪群多呈暴发流行，主要危害母猪群，引起母猪流产或垂直传播给仔猪，造成初生仔猪大量死亡，给我国乃至全球的养猪业带来了巨大的经济损失。
目前尚无治疗猪伪狂犬病的有效药物，因此疫苗接种成为控制该病发生和流行的主要措施。目前在市场上广泛使用是自然缺失弱毒疫苗。自然缺失弱毒疫苗是通过非猪源细胞或鸡胚的连续传代，或在某些诱变剂的存在下，用低于或高于通常的培养温度在细胞培养物上连续传代获得，其基因组的内部存在着多处的点突变以及一些基因的缺失，它是一种自然的基因缺失疫苗。其中，世界上使用最广泛的疫苗主要是PRV Bartha-K61株疫苗，然而近几年我国猪伪狂犬疫病流行现状表明使用的PRV Bartha-K61株疫苗免疫猪产生的中和抗体不能有效中和新分离的病毒PRV HeN1株，该疫苗不能完全保护新流行PRV的攻击。
伪狂犬病基因缺失疫苗是利用基因工程技术在PRV基因组中插入或缺失一段序列，致使PRV的某些基因(特别是一些毒力基因)不能表达，从而使PRV的毒力减弱，同时又保持其较强的免疫原性。伪狂犬病糖蛋白基因gE是造成伪狂犬病毒潜伏和免疫逃避的主要因素，是伪狂犬病毒的主要毒力相关基因。糖蛋白gE是至今发现的所有PRV毒株(某些疫苗株除外)均能表达的蛋白，具有群特异性，在PRV的鉴别诊断中具有重要的意义。因此，通过接种伪狂犬病毒gE基因缺失灭活疫苗来预防和控制狂犬病，已成为国际上普遍接受和流行的方法。
目前对猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗的研究主要是针对如何构建和筛选伪狂犬病病毒基因缺失的毒株，而对相应毒株的培养条件并没有进行深入的研究，大部分是采用常规的培养条件，如公开号为CN 1244692 C的中国专利申请“一种伪狂犬病TK-/gE-/gI-基因缺失标志活疫苗及制备方法”，将构建的基因缺失伪狂犬病病毒株采用原代鸡胚成纤维细胞进行转瓶培养，所用的细胞维持液为含有2％新生牛血清的DMEM溶液，制得的病毒液中病毒滴度仅为106.3TCID50/mL，且病毒液的收获所需的时间长。同时由于其细胞维持液含有新生牛血清，会造成血清残留，引发过敏，给疫苗的使用带来一定的安全隐患。因此，亟待对目前的猪伪狂犬病毒gE基因缺失灭活疫苗的生产和收获方法进行改进。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种用BHK细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法。
本发明提供的技术方案为如下：
一种用BHK细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法，其包括以下步骤：
(1)将种子细胞BHK21进行复苏，然后接入转瓶中，加入细胞生长液，置于转瓶机上培养，培养条件为：转速15～20r/min、pH值7.2～7.4、温度36.5～37.5℃；
(2)待步骤(1)中转瓶培养的BHK21细胞长成片后接入猪伪狂犬gE基因缺失病毒，接入毒种的感染复数为0.01，在转速为15～20r/min，pH值为7.2～7.4、温度为35.5～36.5℃的培养条件下培养12h，使病毒与细胞充分接触吸附，然后将转速设为5～10r/min，连续培养 4～6天，待细胞病变CPE达90％以上，收获细胞毒液；
(3)将收获的病毒液进行浓缩、灭活、除菌，制成成品，即得。
其中，上述的将种子细胞BHK21进行复苏具体为：将BHK21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5％CO2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％EDTA胰蛋白酶消化液，37℃消化6～8min，使用含10％新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为2～4×105个/mL的细胞悬液。
进一步地，所述的细胞生长液为含有4～8mmol/L谷氨酰胺、0.4～1.2mg/L二亚油酰磷脂酰胆碱、2～6％(m/v)D-氨基葡萄糖、2～4％(m/v)生长促进剂、1.0～1.2％(v/v)双抗的DMEM培养液。
优选地，所述的细胞生长液为含有8mmol/L谷氨酰胺、0.6mg/L二亚油酰磷脂酰胆碱、4％ (m/v)D-氨基葡萄糖、4％(m/v)生长促进剂、1.0％(v/v)双抗的DMEM培养液。
进一步地，所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.05～0.2的质量比组成。
优选地，所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成。
具体地，上述的硫酸角质素寡聚糖为硫酸角质素低聚糖混合物，即为硫酸角质素二糖、硫酸角质素三糖、硫酸角质素四糖、硫酸角质素五糖的混合物，其制备方法参考公开号为 CN 1174557A的中国专利“硫酸角质素寡聚糖级分及含该级分的药剂”，具体为：取硫酸角质素50g，溶解在300ml的0.1M醋酸缓冲液(pH6.0)中，加入25U内-β-N-乙酰基葡萄糖胺酶型硫酸降解酶，在37℃下降解24h。反应结束后，加入2倍体积的乙醇，搅拌，在室温下放置1夜，在4000rpm下离心15min，取上清(上清A)。往沉淀中加入300ml蒸馏水，进行溶解，加入3倍量的乙醇，搅拌，在室温下放置1夜，4000rpm下离心15min，取上清(上清B)。将上清A和上清B混合，减压浓缩，使用Bio-Gel-P-2柱(3.6╳134cm)，以蒸馏水作为溶剂，进行凝胶过滤，将滤液冷冻干燥即得。优选地，本发明人根据上述公开的方法进行改进，以调整硫酸角质素寡聚糖中硫酸角质素二糖、硫酸角质素三糖、硫酸角质素四糖、硫酸角质素五糖的比例。经试验，本发明人发现硫酸角质素寡聚糖中硫酸角质素二糖的含量越高，更有利于BHK21细胞在无血清细胞生长液中生长，促进病毒繁殖。
进一步地，所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素溶液。
在本发明用于制备疫苗的病毒液中病毒的滴度≥108.0TCID50/mL，所收获的病毒液在制成成品疫苗前需经过浓缩、灭活、除菌处理，具体地，所述的浓缩步骤为：将病毒液通过50K中空纤维柱进行浓缩；
灭活步骤为：采用福尔马林灭活，所述福尔马林在病毒浓缩液的终浓度为0.1％；
除菌步骤为：将灭活后的浓缩液使用过滤精度为0.45μm的筒式滤芯精滤，再用过滤精度为0.20μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，即得。
此外，本发明还请求保护根据所述的灭活疫苗生产方法制得的猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗。
在本发明用BHK21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒液的过程中，使用的细胞生长液中添加由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以一定质量比组成的生长促进剂，可使 BHK21细胞在无血清的环境下保持较佳的生长状态，使BHK21细胞能够迅速适应由含高浓度新生牛血清(10％)的DMEM培养基过渡到不含血清的细胞生长液培养环境，在较短时间内于转瓶内壁上长成单层细胞。所述的活性矿物酵母多肽(ACB Bio-Chelate5)是矿物元素与酵母多肽形成的络合物，具体为酵母多肽络合的锌、铜、镁、铁和硅，购自美国艾缇科技公司(Active Concepts)，为BHK21细胞和病毒的生长繁殖提供了必不可少的营养元素，促进细胞和病毒的繁殖。在本发明所述的生长促进剂中，硫酸角质素寡聚糖以低聚糖的形式存在，具体为：以硫酸角质素二糖、硫酸角质素三糖、硫酸角质素四糖、硫酸角质素五糖混合物的形式添加至细胞生长液中，有利于细胞吸收，其具有一些生长因子的类似作用，可刺激细胞繁殖与分化，提高BHK21细胞贴壁培养密度。
相关试验数据表明，采用转瓶培养BHK21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒液过程中，经复苏后制得的BHK21细胞悬液接入转瓶中进行扩大培养48～72h，即可在转瓶内壁上长成一片，BHK21细胞细胞生长迅速。同时，往细胞接入猪伪狂犬gE基因缺失病毒后继续培养，病毒繁殖迅速，培养4～5天，细胞病变CPE达90％以上，收获的病毒液中病毒含量高，达≥107.2TCID50/mL，表明BHK21细胞和猪伪狂犬gE基因缺失病毒在本发明提供的培养环境中，均保持较佳的生长活性，大大缩短了生产时间，节约成本，提高效益。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)采用本发明提供的疫苗生产方法收获的猪伪狂犬gE基因缺失病毒液的病毒含量高，达≥107.2TCID50/mL，经浓缩后制成成品疫苗，得到的疫苗效价高，稳定在108.0TCID50/mL 以上，且纯度高，质量稳定，不会存在血清残留引起过敏反应的问题，且具有较强的免疫原性，不需要添加免疫增强剂即可达到好的免疫效果，经免疫后可促进体内分泌中和抗体，免疫保护率达到100％，完全达到疫苗效力评价标准。
(2)本发明创造性地在细胞生长液中添加由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽组成的生长促进剂，大大提高了BHK21细胞的生长活性，使BHK21细胞能够迅速适应由含高浓度新生牛血清(10％)的DMEM培养基过渡到不含血清的细胞生长液培养环境，在较短时间内于转瓶内壁上长成单层细胞，同时促进病毒在细胞中繁殖，大大缩短生产时间，提高生产效率。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。
实施例1硫酸角质素寡聚糖制备及成分分析
A组的制备：
取硫酸角质素50g，溶解在300ml的0.1M醋酸缓冲液(pH6.0)中，加入25U混合酶，在37℃下降解24h。反应结束后，加入2倍体积的乙醇，搅拌，在室温下放置1夜，在4000rpm 下离心15min，取上清(上清A)。往沉淀中加入300ml蒸馏水，进行溶解，加入3倍量的乙醇，搅拌，在室温下放置1夜，4000rpm下离心15min，取上清(上清B)。将上清A和上清B混合，减压浓缩，使用Bio-Gel-P-2柱(3.6╳134cm)，以蒸馏水作为溶剂，进行凝胶过滤，将滤液冷冻干燥即得。
B-D组硫酸角质素寡聚糖的制备参考A组。
硫酸角质素寡聚糖的成分分析
将上述A-D组制得的硫酸角质素寡聚糖分别采用离子交换色谱进行分离，分别取得硫酸角质素二糖、硫酸角质素三糖、硫酸角质素四糖、硫酸角质素五糖级分，经冷冻干燥后，采用高效液相色谱进行分析，检测各成分的含量，结果见下表所示：
表1 50g硫酸角质素制得的寡聚糖中各低聚糖的含量
组成(含量％) 硫酸角质素二糖 硫酸角质素三糖 硫酸角质素四糖 硫酸角质素五糖
A 20.8 12.6 6.2 2.5
B 23.6 13.2 4.7 2.2
C 22.7 12.8 5.5 2.0
D 20.2 12.4 5.7 2.8
实施例2硫酸角质素寡聚糖对BHK-21细胞生长的影响
分别采用实施例1A-D组制得硫酸角质素寡聚糖对BHK21细胞进行培养，具体为：
(1)将BHK21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5％CO2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％EDTA胰蛋白酶消化液，37℃消化6min，使用含10％新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为2.26×105个/mL的细胞悬液；
(2)将步骤(1)得到细胞悬液接入转瓶中，加入细胞生长液，所述的细胞悬液与细胞生长液的体积比为1:10，所述的细胞生长液为含有4mmol/L谷氨酰胺、0.8mg/L二亚油酰磷脂酰胆碱、4％(m/v)D-氨基葡萄糖、2％(m/v)生长促进剂、1.0％(v/v)双抗的DMEM培养液，置于转瓶机上培养，培养条件为：转速15r/min、pH值7.35、温度36.5℃。其中，所述的生长促进剂为实施例1A(B或C或D)组制得的硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以 1:0.15的质量比组成。
(3)培养72h后，统计细胞的生长密度，结果见下表2。
表2不同组别的硫酸角质素寡聚糖对BHK-21细胞生长的影响
由上表2可知，硫酸角质素寡聚糖中硫酸角质素二糖的含量越高，更有利于BHK21细胞在无血清细胞生长液中生长，使细胞在转瓶中培养72h后的密度达到1.02╳107个/ml。
实施例3用BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒
(1)将BHK21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5％CO2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％EDTA胰蛋白酶消化液，37℃消化6min，使用含10％新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为3.24×105个/mL的细胞悬液；
(2)将步骤(1)得到细胞悬液接入转瓶中，加入细胞生长液，所述的细胞悬液与细胞生长液的体积比为1:10，所述的细胞生长液为含有6mmol/L谷氨酰胺、0.4mg/L二亚油酰磷脂酰胆碱、4％(m/v)D-氨基葡萄糖、3％(m/v)生长促进剂、1.0％(v/v)双抗的DMEM培养液，置于转瓶机上培养72h，培养条件为：转速15r/min、pH值7.35、温度36.5℃，其中，所述的生长促进剂为实施例1B组制得的硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成；
(3)待步骤(2)中转瓶培养的BHK21细胞长成片后接入猪伪狂犬gE基因缺失病毒，接入毒种的感染复数为0.01，在转速为15r/min，pH值为7.35、温度为36.5℃的培养条件下培养12h，使病毒与细胞充分接触吸附，然后将转速设为5r/min，连续培养4天，待细胞病变CPE达90％以上，收获细胞毒液。
实施例4用BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒
(1)将BHK21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5％CO2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％EDTA胰蛋白酶消化液，37℃消化6min，使用含10％新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为2.52×105个/mL的细胞悬液；
(2)将步骤(1)得到细胞悬液接入转瓶中，加入细胞生长液，所述的细胞悬液与细胞生长液的体积比为1:10，所述的细胞生长液为含有8mmol/L谷氨酰胺、0.6mg/L二亚油酰磷脂酰胆碱、4％(m/v)D-氨基葡萄糖、4％(m/v)生长促进剂、1.0％(v/v)双抗的DMEM培养液，置于转瓶机上培养72h，培养条件为：转速15r/min、pH值7.4、温度36.5℃，其中，所述的生长促进剂为实施例1B组制得的硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成；
(3)待步骤(2)中转瓶培养的BHK21细胞长成片后接入猪伪狂犬gE基因缺失病毒，接入毒种的感染复数为0.01，在转速为15r/min，pH值为7.4、温度为36.5℃的培养条件下培养12h，使病毒与细胞充分接触吸附，然后将转速设为5r/min，连续培养4天，待细胞病变CPE达90％以上，收获细胞毒液。
对比例1用BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒
对比例1用BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒的步骤与实施例4基本相同，区别在于，所述步骤(2)的细胞生长液不添加生长促进剂。
对比例2用BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒
对比例2用BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒的步骤与实施例4基本相同，区别在于，所述步骤(2)的细胞生长液中的生长促进剂仅含硫酸角质素寡聚糖。
对比例3用BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒
对比例3用BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒的步骤与实施例4基本相同，区别在于，所述步骤(2)的细胞生长液中的生长促进剂仅含活性矿物酵母多肽。
对比例4用BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒
对比例4用BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒的步骤与实施例4基本相同，区别在于，所述步骤(2)的细胞生长液中的生长促进剂由硫酸角质素和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成。
实施例5病毒含量测定
分别对实施例3-4、对比例1-4收获的病毒液进行病毒含量测定，具体为：将病毒液用 DMEM培养液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞孔；每孔0.1mL，37℃吸附30min后，补加细胞维持液0.3mL，于37℃、5％CO2培养120小时，观察细胞病变(CPE)，计算TCID50，结果见表3。
表3病毒滴度检测结果
组别 病毒含量(TCID50/mL)
实施例3 107.2
实施例4 107.4
对比例1 105.2
对比例2 105.6
对比例3 106.0
对比例4 106.1
由上表3可知，本发明实施例3-4用BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒的滴度较高，均≥107.2TCID50/mL，明显优于对比例1-4收获的猪伪狂犬gE基因缺失病毒滴度，表明以硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽组成的生长促进剂有利于BHK-21细胞的生长，促进病毒在细胞繁殖。
实施例6猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的制备
(1)病毒液浓缩
分别将实施例3-4、对比例1-4收获的病毒液通过50K的中空纤维柱超滤浓缩10倍，即得病毒浓缩液；
(2)病毒液灭活
将病毒浓缩液导入灭活罐内，加入福尔马林溶液，充分混合，福尔马林溶液的终浓度为 0.1％(v/v)，37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时)后取出，置6℃保存，应不超过1个月；
(3)病毒液灭活检验：取灭活检验的样品，用DMEM营养液以10-1、10-2、10-3三个比例稀释待检样品，同时设立同样稀释比例的灭活前病毒样品用于阳性对照，分别接种于 48孔LMH细胞单层细胞，每组重复接种5孔，每孔0.4mL 37℃、5％CO2培养96小时。灭活样品各组稀释度孔中均没有出现细胞病变，阳性对照组各稀释度孔中细胞病变均明显，达 80％以上，判定为灭活检验合格；
(4)病毒液除菌
将灭活检验合格的浓缩液使用过滤精度为0.45μm的筒式滤芯精滤，再用过滤精度为 0.20μm的筒式滤芯过滤除菌，即得疫苗抗原；
(5)疫苗成品制备
①油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司盘-80 4份，先将白油缓慢加温，加入司盘-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用；
②水相制备：取步骤(4)制得的 疫苗抗原96份加入灭菌后的吐温-80 4份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；
③乳化：将水相加入到油相中，利用IKA乳化剂进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即可；
④分装：将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。
实施例7灭活疫苗成品检验
(1)性状
①外观：为乳白色乳剂。
②剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均不扩散。
③稳定性：吸取疫苗10毫升加入离心管中，以3000rpm离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5mL。
④粘度：用出口内径为1.2mm的1.0mL吸管，吸取25℃左右1.0mL，令其垂直自然流出，记录流出0.4mL所需的时间，应不超过8秒。
(2)无菌检验：取成品接种硫乙醇酸盐培养基小管和酪胨琼脂各两支，每支0.2mL，一支置37℃培养，一支置25℃培养，观察3～5日，应纯粹，无菌生长。
(3)安全检验：用21日龄健康仔猪10头，每头颈部注射疫苗2mL，观察14日，结果试验仔猪均健活，无任何局部和全身不良反应。
(4)甲醛含量测定：
①对照品溶液的制备：取已标定的甲醛溶液适量，配成每1.0mL含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5.0mL置50mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。
②被测样本的制备：用5.0mL刻度吸管量取被检品5.0mL，置50mL量瓶中，用20％吐温-80乙醇溶液10mL，分次洗涤吸管，洗液并入50mL量瓶中，摇匀，加水稀释至刻度，强烈振摇，静止分层，下层液如果不澄清，滤过，弃去初滤液，取澄清续滤液，即得。
③测定法：精密吸取对照品溶液和被检品溶液各0.5mL，分别加醋酸-醋酸铵缓冲液 10mL，乙酰丙酮试液10mL，置60℃恒温水浴15分钟，冷水冷却5分钟，放置20分钟后，按紫外-可见分光光度计法，在410nm的波长处测定吸收度，计算即得。甲醛溶液(40％) 含量％(g/mL)＝0.25×(被检样品溶液的吸收度/对照样本溶液的吸收度)×100％。甲醛含量符合国家标准，即检验合格。
(5)装量检查：取供试品3个，使之恢复至室温，开启时注意避免损失。参照装量检查使用量取参考表，用经标化的吸管、注射器或量筒进行装量检查。
试验例一、免疫原性试验
分别使用实施例3-4和对比例1-4收获的病毒液制得的成品疫苗进行抗体诱导试验和攻读试验，具体为：筛选21日龄健康仔猪(猪伪狂犬中和抗体＜1:4)56头，随机分为对照组、实施例3-4组、对比例1-4组，每组8头。其中，对照组中每头猪肌肉或颈部皮下注射2mLPBS，实施例3-4组和对比例1-4组中每头猪分别肌肉或颈部皮下注射2mL实施例3-4和对比例1-4收获的病毒液制得的成品疫苗，免疫后28天后，各组分别采血、分离血清后，于 56℃灭活30min用于中和抗体测定，并采用IDEXX PRV gE-EILSA抗体检测试剂盒检测gE 抗体。同时采用PRV-ZJ01细胞毒(106.0TCID/ml)对各组的仔猪进行攻毒，滴鼻1ml/头，观察攻毒后各组仔猪的临床表现，其结果见下表4-5。
表4各组仔猪血清中中和抗体和gE抗体的检测结果
组别 中和抗体效价 gE抗体
实施例3 1:24.8 -
实施例4 1:25.0 -
对比例1 1:9.0 -
对比例2 1:11.6 -
对比例3 1:12.8 -
对比例4 1:13.0 -
对照组 ＜1:4 -
表5各组仔猪免疫效力的检测结果
由上表4和5可知，本发明实施例3、4制得的成品疫苗具有较强的免疫原性，可诱导仔猪体内产生较多的中和抗体，其血清中检测的中和抗体效价分别为1:24.8和1:25.0，显著高于对比例1-4制得的成品疫苗；对免疫仔猪进行攻毒试验的结果表明，本发明实施例3和 4制得的成品疫苗对仔猪的免疫保护率达到100％，完全达到疫苗效力评价标准。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种用BHK细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将种子细胞BHK21进行复苏，然后接入转瓶中，加入细胞生长液，置于转瓶机上培养，培养条件为：转速15~20 r/min、pH值7.2~7.4、温度36.5~37.5℃；
（2）待步骤（1）中转瓶培养的BHK21细胞长成片后接入猪伪狂犬gE基因缺失病毒，接入毒种的感染复数为0.01，在转速为15~20r/min，pH值为7.2~7.4、温度为35.5~36.5℃的培养条件下培养12h，使病毒与细胞充分接触吸附，然后将转速设为5~10r/min，连续培养4~5天，待细胞病变CPE达90%以上，收获细胞毒液；
（3）将收获的病毒液进行浓缩、灭活、除菌，制成成品，即得；
其中，所述的将种子细胞BHK21进行复苏具体为：将BHK21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10%新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5%CO2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02%EDTA胰蛋白酶消化液，37℃消化6~8min，使用含10%新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为2~4×105个/mL的细胞悬液；
所述的细胞生长液为含有4~8 mmol/L谷氨酰胺、0.4~1.2mg/L二亚油酰磷脂酰 胆碱、2~6% (m/v) D-氨基葡萄糖、2~4% (m/v)生长促进剂、1.0~1.2% (v/v)双抗的DMEM培养液；
所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.05~0.2的质量比组成，所述的活性矿物酵母多肽为购自美国艾缇科技公司的ACB Bio-Chelate 5。
2.根据权利要求1所述的用BHK细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成。
3.根据权利要求1所述的用BHK细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素溶液。
4.根据权利要求1所述的用BHK细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤（3）浓缩具体为：将病毒液通过50K中空纤维柱进行浓缩；
灭活具体为：采用福尔马林灭活，所述福尔马林在病毒浓缩液的终浓度为0.1%；
除菌具体为：将灭活后的浓缩液使用过滤精度为0.45μm的筒式滤芯精滤，再用过滤精度为0.20μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，即得。
5.根据权利要求1所述的用BHK细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，经浓缩后的病毒液的病毒滴度≥108.0TCID50/mL，方可用于制苗。
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