CN108159412A - 一种生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法及其产品 - Google Patents

一种生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法及其产品 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法及其产品，该方法包括以下步骤：用EB66传代细胞分别接种鸡新城疫、禽流感病毒株，在病毒EID50效价达到最高时收获病毒并保存；分别灭活鸡新城疫和禽流感病毒；将灭活后的鸡新城疫和禽流感病毒在吐温‑80中完全混合，得到病毒混合液；在病毒混合液中加入已灭菌的油相佐剂，混合乳化配制成二联疫苗。本发明通过采用鸭胚胎干细胞EB66传代细胞系分别进行鸡新城疫和禽流感病毒的培养，然后制备成的二联疫苗具有生产工艺稳定、批间差异小、质量可控、产量和质量显著提高等优点。

Description

一种生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法及其 产品
技术领域
本发明涉及采用全悬浮培养工艺和传代细胞源生产一种鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗的方法及其产品，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
鸡新城疫和禽流感为影响养禽业的最主要的两大传染病，目前，上述两种疫病均可通过疫苗免疫来进行防控。已上市的新城疫和禽流感疫苗大多是通过传统的鸡胚培养制得，鸡胚作为病毒培养的基质，需要经过严格工序来保证其品质。鸡胚培养存在诸多问题，不同批次的鸡胚质量往往存在差异，难以控制品质。此外，鸡胚是许多细菌的天然宿主，容易受到环境中细菌的感染。另外，在鸡胚的尿囊液中含有大量动物源蛋白，在提取病毒时易被带入病毒液中，导致成品疫苗中有大量动物源蛋白，从而引起过敏反应等副作用。
目前，已经有采用传代细胞系包括MDCK细胞系以及鸡胚传代细胞DF-1细胞系来培养新城疫病毒或禽流感病毒制备疫苗，但是由于上述细胞系表面新城疫病毒和禽流感病毒受体丰度低，造成病毒滴度低，给疫苗的大规模制备造成极大困难。因此，选择一株细胞表面受体丰度高，能够大幅提高新城疫病毒及禽流感病毒生长滴度的细胞株显得尤为重要。更为重要的是，随着养殖业的发展，免疫密度大和免疫强度高成为制约规模化养殖的瓶颈，研制安全高效的联苗成为一种趋势。利用相同的工艺和培养载体(细胞)培养2种或多种疫苗毒显得尤为迫切。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法及其产品，该方法具有生产工艺稳定、批间差异小、质量可控、可显著提高疫苗产量和质量的优点，利用本发明提供的方法生产出的疫苗具有较高品质，并降低生产成本。
本发明的具体技术方案如下：
一种生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用EB66传代细胞分别接种鸡新城疫、禽流感病毒株；
(2)在病毒EID50效价达到最高时分别收获鸡新城疫、禽流感病毒并保存；
(3)分别灭活鸡新城疫、禽流感病毒；
(4)将灭活后的鸡新城疫和禽流感病毒在吐温-80中完全混合，得到病毒混合液，在病毒混合液中加入已灭菌的油相佐剂，混合乳化，配制成鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗。
进一步地，步骤(3)的具体操作如下：在病毒中加入甲醛溶液，充分搅拌并混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％，37℃条件下灭活30小时。
进一步地，步骤(4)的具体操作如下：
(a)油相佐剂制备：取注射用白油和司本-80混合，搅拌混匀，灭菌，冷却后备用；
(b)病毒混合液制备：将灭活后的新城疫病毒和禽流感病毒按1:1的比例混合，在混合病毒液中加入灭菌冷却后的吐温-80，充分搅拌至完全溶解，得到病毒混合液；
(c)乳化：在油相佐剂中缓慢加入所述病毒混合液，充分搅拌后乳化。
进一步地，所述油相佐剂与所述病毒混合液的混合体积比为3:2。
进一步地，混合均液与吐温-90的体积为96:4。
进一步地，所述白油和司本-80的混合体积比为94:6。
进一步地，所述步骤(1)的具体步骤为：用EB66传代细胞分别接种鸡新城疫、禽流感病毒弱毒株后，分别进行吸附，然后分别补加新的病毒生产培养基，其中，禽流感病毒补加原工作体积1倍的生产培养基，新城疫病毒补加原工作体积1.5倍的生产培养基。
进一步地，在步骤(1)EB66细胞培养病毒时还需补加TPCK胰酶，所述补加TPCK胰酶的方法为：其中，禽流感病毒在接毒后的第0天和第1天各补加2mg/L的TPCK胰酶或在接毒后第0天一次性补加4mg/L的TPCK胰酶；新城疫病毒在接毒后的第0、1、2、3天各补加1mg/L的TPCK胰酶或在病毒接种后第0天一次性补加4mg/L的TPCK胰酶。
本发明还提供一种通过上述方法制备的细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗。
优选地，所述的新城疫病毒为新城疫病毒lasota株，所述的禽流感病毒为禽流感病毒H9亚型DA株。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
1、本发明采用鸭胚胎干细胞EB66传代细胞系分别进行鸡新城疫病毒和禽流感病毒培养，不仅避免了胚体含有外源病毒的风险，还消除了污染生态环境的隐患。本发明制备的鸡新城疫病毒和禽流感病毒抗原纯净、质量稳定均一且安全。
2、采用本发明制备的细胞源鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗各批次之间质量差异小，疫苗质量好，因而有很好的经济效益和应用前景。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
本发明实施例1～5采用的原料来源如下：
1.病毒：鸡新城疫病毒La sota株(中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心，CVCC AV1615)，由肇庆大华农生物药品有限公司保存；禽流感病毒为A型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/DA/2014(H9N2)株(简称DA株)，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定和保存。
2.细胞系：EB66传代细胞系，由甘肃健顺生物科技有限公司提供；
3.无血清、化学界定培养基：CD EB66(DP210)培养基，由甘肃健顺生物科技有限公司提供。
本发明实施例1、2采用的反应器为赛多利斯(Sartorius B Plus)搅拌式反应器(2L)。
EB66细胞的培养
从液氮中迅速取出EB66细胞，在37℃水浴锅中迅速融化，待EB66细胞完全融化后，将复苏细胞加入约30倍体积的培养基中，经离心机300g离心10min，倒掉上清液，加入培养基将细胞吹打重悬均匀，接种至三角摇瓶中，并放置于轨道摇床上进行悬浮培养，每天取样进行细胞计数并计算活率，待培养至第2-3天时，进行细胞传代，连续传代2-3代次后，采用逐级放大的方法，进行扩大生产，待所得EB66细胞的细胞数量满足生物反应器接种量，进行生物反应器接种。所述的EB66细胞在三角摇瓶中的培养温度为35℃-37℃，优选为37℃；培养转速为130rpm-150rpm，优选为150rpm，所述EB66细胞在生物反应器中的培养温度为35℃-37℃，优选为37℃；搅拌速度为80rpm-120rpm，优选为120rpm。当EB66细胞密度达到6×106/mL-15×106/mL时，用于病毒的接种，优选的，细胞密度达到8×106/mL～10×106/mL时，用于接毒(病毒接毒量以体积比为主，按病毒与细胞培养基体积比为1/100-5/100000之间接种，优选的体积比为5/10000-5/100000)。所述的EB66传代细胞培养基为CDEB66(健顺DP210)，该培养基属于无血清、化学界定培养基。
实施例1
新城疫病毒的培养方法如下：
采用二阶培养法，将新城疫病毒接种于全悬浮传代细胞系EB66细胞中，接毒后吸附培养1小时，完成吸附培养后，补加2倍于原有生长培养基体积的新鲜生产培养基，并继续培养。在接毒后向培养基中补加TPCK胰酶。每隔12小时取样，进行EID50的检测。
步骤1：将EB66细胞按0.35×106细胞/mL-0.75×106细胞/mL的细胞密度接种至生物反应器(Sartorius B Plus)中进行培养，具体的培养参数如下：
每天取样计数，并计算活率，当细胞长至8.0×106细胞/mL-16×106细胞/mL，活率在90％以上时，用于病毒的接种。
步骤2：采用二阶培养法，将反应器中的细胞留600mL，在反应器中，新城疫病毒按MOI为0.01接种EB66细胞，接毒后搅拌速度调整为80rpm，进行吸附培养1小时，病毒吸附培养完成后，补加1.5倍于原有生长培养基体积的新鲜生产培养基，温度调整为33℃，pH设置为7.20±0.1继续培养，搅拌速度调整为120rpm，其他培养参数不变；同时，在接毒后的第0、1、2、3天分别向反应器、三角摇瓶中各补加1mg/L的TPCK胰酶，并每隔12h取样，进行EID50的检测。当培养条件稳定时，收获的病毒的效价最高为109.75EID50/0.1mL。
实施例2
禽流感病毒(H9亚型)的培养方法如下：
采用二阶培养法，将禽流感病毒接种于全悬浮传代细胞系EB66细胞中，接毒后吸附培养1小时，完成吸附培养后，补加1倍于原有生长培养基体积的新鲜生产培养基，并继续培养。在接毒后向培养基中补加TPCK胰酶。每隔12小时取样，进行EID50的检测。
步骤1：将EB66细胞按0.35×106细胞/mL-0.75×106细胞/mL的细胞密度接种至生物反应器(Sartorius B Plus)中进行培养，具体的培养参数如下：
每天取样计数，并计算活率，当细胞长至8.0×106细胞/mL-16×106细胞/mL，活率在90％以上时，用于病毒的接种。
步骤2：采用二阶培养法，将反应器中的细胞留600mL，禽流感病毒按MOI为0.01接种EB66细胞，接毒后搅拌速度调整为80rpm，进行吸附培养1小时，病毒吸附培养完成后，补加1倍于原有生长培养基体积的新鲜生产培养基，温度调整为33℃，pH设置为7.20±0.1继续培养，搅拌速度调整为120rpm，其他培养参数不变；同时，在接毒后的第0天和第1天各补加2mg/L的TPCK胰酶，并每隔12h取样，进行EID50的检测。当培养条件稳定时，收获的病毒的效价最高为108.0EID50/0.1mL。
实施例3
病毒液灭活与检验
将实施例1-2收获的病毒液(将灭活前取出的病毒液进行EID50测定，每0.1ml病毒液病毒含量应≥107.0EID50)分别加入甲醛溶液，边加边搅拌，使其充分混合。甲醛溶液的最终浓度为0.1％。37℃条件下灭活30小时(以罐内温度达到37℃开始计时)，期间不停搅拌。灭活后的病毒液置2～8℃保存。取灭活的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。取灭活的病毒液，尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚10个，每胚0.2ml。36～37℃孵育72小时，收获鸡胚液，测定HA价，检测结果为阴性；盲传1代，测定HA价，也为阴性，结果表明，病毒液灭活完全。
实施例4
疫苗制备
(1)油相佐剂制备：取注射用白油94份、司本-80 6份混合，随加随搅拌至混匀，121℃灭菌30分钟，冷却后备用。
(2)病毒混合液制备：将灭活后的新城疫病毒和禽流感病毒按1:1混合，取混合后的新城疫、禽流感H9亚型灭活抗原菌液96份，加入灭菌冷却后的吐温-80 4份，充分搅拌至完全溶解。
(3)乳化：取油相佐剂3份倾入乳化罐内搅拌，再缓慢加入病毒混合液2份，进行充分搅拌后乳化。
(4)分装：定量分装，加盖密封。
实施例5
疫苗免疫效力
(1)对鸡新城疫的免疫保护
用28日龄SPF鸡15只，10只颈部皮下注射传代细胞源鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗20μl，另5只作新城疫攻毒对照；接种后21日，每只鸡各肌肉注射新城疫病毒北京株强毒0.5ml(含105ELD50)，观察14日。
结果表明，对照组全部死亡，免疫组保护9只。
(2)对禽流感(H9亚型)的免疫保护
用28日龄SPF鸡15只，其中10只颈部皮下注射传代细胞源鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗0.3ml，另5只作禽流感攻毒对照。接种后21日，每只鸡各静脉注射H9亚型禽流感病毒DA株鸡胚毒0.2ml(含2×107.0EID50)。攻毒后第5日，采集每只鸡喉头和泄殖腔棉拭子，并将两者上清液混合后经尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml，孵育观察72小时，测定所有鸡胚液HA效价。每份混合拭子样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚的鸡胚液HA效价不低于1∶16，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1代后再进行判定。
结果表明，免疫鸡10只病毒分离阴性，对照鸡病毒分离5只全为阳性。
综上所述，本发明采用无血清化学界定的个性化培养基进行新城疫病毒和禽流感病毒的全悬浮培养，既解决了传统病毒培养受制于鸡胚供应的缺陷，又避免了感染外源病毒的风险，同时，无血清全悬浮培养程中无需微载体和消化液，大大减少了产品杂质的引入，简化产品后期的分离纯化过程，有效的降低生产成本。本发明利用EB66细胞系，采用全悬浮无血清的方式生产传代细胞源鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗具有安全有效，质量稳定的优点。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用EB66传代细胞分别接种鸡新城疫、禽流感病毒株；
(2)在病毒EID50效价达到最高时分别收获鸡新城疫、禽流感病毒并保存；
(3)分别灭活鸡新城疫、禽流感病毒；
(4)将灭活后的鸡新城疫和禽流感病毒在吐温-80中完全混合，得到病毒混合液，在病毒混合液中加入已灭菌的油相佐剂，混合乳化，配制成鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗。
2.如权利要求1所述生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤(3)的具体操作如下：在病毒中加入甲醛溶液，充分搅拌并混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％，37℃条件下灭活30小时。
3.如权利要求1所述生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤(4)的具体操作如下：
(a)油相佐剂制备：取注射用白油和司本-80混合，搅拌混匀，灭菌，冷却后备用；
(b)病毒混合液制备：将灭活后的新城疫病毒和禽流感病毒按1:1的比例混合，在混合病毒液中加入灭菌冷却后的吐温-80，充分搅拌至完全溶解，得到病毒混合液；
(c)乳化：在油相佐剂中缓慢加入所述病毒混合液，充分搅拌后乳化。
4.如权利要求3所述生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法其特征在于，所述油相佐剂与所述病毒混合液的混合体积比为3:2。
5.如权利要求3所述生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法其特征在于，混合病毒液与吐温-80的体积为96:4。
6.如权利要求3所述生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法其特征在于，所述白油和司本-80的混合体积比为94:6。
7.如权利要求1所述生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体步骤为：用EB66传代细胞分别接种鸡新城疫、禽流感病毒株后，分别进行吸附，然后分别补加新的病毒生产培养基，其中，禽流感病毒补加原工作体积1倍的生产培养基，新城疫病毒补加原工作体积1.5倍的生产培养基。
8.如权利要求1所述生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法，其特征在于在，在步骤(1)EB66细胞培养病毒时还需补加TPCK胰酶，其中，禽流感病毒在接毒后的第0天和第1天各补加2mg/L的TPCK胰酶或在接毒后第0天一次性补加4mg/L的TPCK胰酶；新城疫病毒在接毒后的第0、1、2、3天各补加1mg/L的TPCK胰酶或在病毒接种后第0天一次性补加4mg/L的TPCK胰酶。
9.一种通过权利要求1～8任一项所述的方法制备的细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗。
10.如权利要求9所述细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗，其特征在于，所述的新城疫病毒为新城疫病毒lasota株，所述的禽流感病毒为禽流感病毒H9亚型DA株。
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