CN104906570A - 一种鸡新城疫和h9亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗，含有灭活的鸡新城疫病毒La Sota株和H9亚型禽流感病毒SY株；H9亚型禽流感病毒SY株，其保藏编号为CGMCC No.5968。该鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗免疫原性好，产生的抗体水平高，并对同源/非同源的H9亚型禽流感病毒流行株均具有较强的免疫预防作用。

Description

一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

新城疫(Newcastle disease,ND)又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病，以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。该病具有很高的发病率和死亡率，对养鸡业危害严重，是危害养禽业的一种主要传染病，OIE将其列为A类疫病，我国也将其划分一类动物疫病。

禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)隶属于正黏病毒科A型流感病毒属，因为该病毒基因组为分节段、单股负链RNA病毒，所以很容易发生变异并不断突破其感染宿主的种属障碍，引起新的流感流行。该病毒有多种血清亚型，其中H9N2亚型禽流感虽属于低致病性禽流感，死亡率低，但临床上发病率高，主要临床表现为轻度呼吸道症状，食量减少，产蛋率可从90％降至20％以下，甚至绝产，对商品肉鸡可导致30％左右的死亡，且极易与大肠杆菌混合感染，严重影响家禽的生产性能，给养禽业带来严重的经济损失。此外，该亚型AIV可以穿越宿主障碍感染哺乳动物包括人，所以对H9亚型禽流感的防制具有重要的公共卫生意义。

目前，新城疫和H9亚型禽流感严重危害着养禽业的健康发展，在各种防控措施中，疫苗免疫仍为最重要的措施。市场上已有新城疫和H9亚型禽流感的相应灭活单苗和二联苗，但是普遍存在抗体水平低、免疫效果不稳定，对流行毒株交叉保护率不高等问题，给免疫鸡群带来一定的风险。因此，研制一种具有广谱抗原性的鸡新城疫、H9亚型禽流感二联灭活疫苗尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种免疫原性好，产生的抗体水平高，并对同源/非同源的H9亚型禽流感病毒流行株均具有较强的免疫预防作用的鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为，一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗，含有灭活的鸡新城疫病毒La Sota株和H9亚型禽流感病毒SY株；H9亚型禽流感病毒SY株，其保藏编号为CGMCCNo.5968。

进一步地，灭活前每0.1毫升鸡新城疫病毒La Sota株病毒和H9亚型禽流感病毒SY株病毒液中的病毒含量均≥2×10^8.0EID₅₀。

本发明还提供了上述鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗的制备方法，用鸡胚繁殖鸡新城疫病毒La Sota株和H9亚型禽流感病毒SY株，分别收获相应的病毒液，分别浓缩和灭活，然后将灭活后的病毒液混合均匀，得到混合抗原液，将所述混合抗原液乳化，得到所述鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗。

进一步地，该混合抗原液中灭活鸡新城疫病毒La Sota株抗原液和灭活H9亚型禽流感病毒SY株抗原液的量相等。

进一步地，该混合抗原液乳化的过程如下：将所述混合抗原液和灭菌的吐温-80按照体积比96:4混合均匀，得水相溶液；将注射用白油和司本-80按照体积比94:6混合，然后加硬脂酸铝2份，随加热随搅拌至透明为止，高压灭菌得油相溶液；将所述水相溶液和油相溶液混合乳化均匀。

进一步地，该水相溶液和油相溶液的体积为1:2～3。

本发明一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法具有如下优点：

1.优选制苗毒株：本发明中鸡新城疫病毒La Sota株，购自中国兽医药品监察所。实验证明对目前流行的NDV具有较强的交叉保护性。H9亚型禽流感病毒制苗毒株SY株，是从陕西省某地区临床疑似禽流感病毒感染死亡鸡病料上分离到一株低致病性禽流感病毒，具有稳定、良好的特异性和免疫原性，抗体产生时间短，效价高，免疫持续期长，对同源/非同源的H9亚型禽流感病毒流行株均具有较强的免疫预防作用。

2.该鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗质量稳定、安全有效、成本低，可一针防两种疫病，减轻劳动力成本。

3.该二联灭活疫苗中的H9亚型禽流感病毒SY株，免疫原性好，产生的抗体水平高，免疫持续期长，并对同源/非同源的H9亚型禽流感病毒流行株均具有较强的免疫预防作用。

本发明中该H9亚型禽流感病毒SY株经哈尔滨兽医研究所国家禽流感研究中心鉴定，为H9N2亚型禽流感病毒，命名为A/Chicken/Shaanxi/SY/97(H9N2)株，分类命名：A型流感病毒H9N2亚型。

保藏信息如下：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2012年4月11日；

保藏编号：CGMCC No.5968。

本发明中H9亚型禽流感病毒SY株具有以下特点：

1.病毒含量：将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-93个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，24小时以内死亡的鸡胚弃去不计，在24小时～96小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集效价，当到96小时时，取出所有鸡活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集效价，凝集价不低于1:32(微量法)者判为感染，计算EID₅₀。每0.1ml病毒含量应≥10^8.0EID₅₀。

2.对鸡胚的毒力：将毒种用灭菌生理盐水作10^-4稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.1ml，置37℃孵育96小时。应至少有8枚鸡胚死亡，胚体表现重度充血、出血等病变。

3.对雏鸡的毒力：将毒种用灭菌生理盐水作10倍稀释，滴鼻接种4周龄SPF鸡10只，每只0.1ml，另取条件相同的SPF鸡5只，不接种作为对照，在同条件下分别饲养，观察14日，应不出现死亡或明显异常反应。接种后第5日，采集鸡喉头和泄殖腔棉拭子，用9～11日龄SPF鸡胚分离病毒。试验组中应至少9只为阳性，对照鸡应全部为阴性。

4.特异性：将毒种稀释至含10^5.0EID₅₀/0.1ml，与等量的抗H9亚型禽流感病毒特异性血清混合，室温中和1小时后，接种SPF鸡胚10枚，观察96小时。在24～96小时内，应不引起特异性死亡，且至少存活8枚；取鸡胚液作红细胞凝集试验，应为阴性。

5.免疫原性：将毒种接种鸡胚制备病毒液，经甲醛灭活后，按本规程油佐剂配方制成灭活疫苗。取4周龄SPF鸡15只，其中10只各皮下或肌肉接种该灭活疫苗0.3ml，另5只不接种，作为对照。接种后21日，分别采血，分离血清，用H9亚型禽流感抗原检测HI抗体。免疫鸡HI抗体效价的几何平均值应不低于1:64(微量法)，对照鸡HI抗体效价的几何平均值应不高于1:4(微量法)。

6.纯净：按《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。

7.基础种子代数：E3～E10代。

具体实施方式

本发明实施例中所用的SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。禽流感H5、H7、H9阳性血清购自哈尔滨维科生物技术有限公司，新城疫(ND)、减蛋综合征(EDS)阳性血清购自中国兽医药品监察所。

实施例1

本发明一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗，含有灭活的鸡新城疫病毒La Sota株和H9亚型禽流感病毒SY株；所述H9亚型禽流感病毒SY株，其保藏编号为CGMCC No.5968。灭活前每0.1毫升鸡新城疫病毒LaSota株病毒和H9亚型禽流感病毒SY株病毒液中的病毒含量均≥2×10^8.0EID₅₀。

上述该鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗的制备方法：

1.生产用毒种制备：

1.1新城疫毒种繁殖与鉴定：

1.1.1.毒种繁殖：将鸡新城疫病毒La Sota株毒种用灭菌生理盐水适当稀释(如10^-4或10^-5)，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后72～120小时之间死亡，且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液(尿囊液及羊水)，装于灭菌容器内。将检验无菌，且对1％鸡红细胞悬液凝集价在1:512(微量法)以上的鸡胚液混合，定量分装于安瓿瓶中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。

1.1.2.病毒含量：将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-93个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在48～120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:128(微量法)者判为感染，计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量应≥10^8.0EID₅₀。

1.1.3.纯净：按《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。

1.1.4.毒种保存：在-15℃以下保存，应不超过6个月。

1.1.5.毒种继代：应不超过3代。

1.2.H9亚型禽流感毒种繁殖与鉴定

1.2.1毒种繁殖：将H9亚型禽流感病毒SY株毒种用生理盐水作10^-4稀释，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃孵育。收集接种后72～96小时死亡且病变明显的鸡胚，收获感染鸡胚液，装于无菌容器内。将检验无菌，且对1％鸡红细胞凝集价不低于1:512(微量法)的鸡胚液混合，定量分装，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。

1.2.2.病毒含量：将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-93个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，24小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在24～96小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集效价，至96小时，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集效价，凝集价不低于1:32(微量法)者判为感染，计算EID₅₀。每0.1ml病毒含量应≥10^8.0EID₅₀。

1.2.3.按《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。

1.2.4.毒种保存：在-15℃以下保存，应不超过6个月。

1.2.5毒种继代：应不超过3代。

2.制苗用毒液的制备：

2.1.鸡新城疫病毒La Sota株制苗用毒液的制备：

2.1.1.接种：取生产用毒种，用灭菌生理盐水适当(10^-4～10^-5)稀释，每胚尿囊腔内接种0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。

2.1.2.孵育与观察：鸡胚接种后，每天照蛋1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至96小时。96小时后无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2℃～8℃冷却4～24小时。

2.1.3.收获：将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(谨防卵黄破裂)，吸取胚液。对每枚鸡胚在吸取胚液前均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干枚鸡胚分为一组，吸取胚液放于同一灭菌的容器内，每组抽样测定红细胞凝集价，应不低于1:160(微量法1:128)。同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无细菌生长。毒液在-20℃下保存备用。

2.2.H9亚型禽流感病毒SY株制苗用病毒液的制备：

2.2.1.接种：取生产用毒种用灭菌生理盐水作10^-4稀释，每胚尿囊腔内接种0.1ml，接种后密封针孔，置37℃继续孵育，不必翻蛋。

2.2.2.孵育与观察：将接种后24小时前死亡的鸡胚弃去。24小时后，每4～8小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至96小时。96h后不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却4～24小时。

2.2.3.收获：将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取胚液。对每枚鸡胚在吸取胚液前均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。每若干枚鸡胚的胚液混合为一组，装于灭菌容器内，同时每组抽样按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长。毒液在-20℃下保存备用。

3.制苗用毒液的浓缩：将收获的两种病毒液用适当方法澄清，除去病毒液中的大颗粒杂质，使其成为透明或半透明溶液。然后，用病毒超滤浓缩系统分别将二种病毒液浓缩至原体积的1/2。

4.灭活：将检验合格的各病毒浓缩液分别混合于一个灭菌大容器内，然后各加入10％的甲醛溶液，使甲醛终浓度为0.1％，随加随搅拌，使其充分混匀，加入甲醛溶液后应倾倒于另一灭菌容器中，以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后分别置36～37℃灭活16小时、24小时(以瓶内温度达到36℃开始计时)。期间每4小时振摇1次。灭活后的病毒液在2～8℃保存，应不超过1个月。

5.半成品检验：

5.1.无菌检验：取灭活的胚液，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

5.2病毒含量测定：

5.2.1.将灭活前的鸡新城疫病毒浓缩液抽样检测，每0.1ml病毒含量应≥2×10^8.0EID₅₀。

5.2.2.将灭活前的禽流感病毒浓缩液抽样检测，每0.1ml病毒含量应≥2×10^8.0EID₅₀。

5.3.灭活检验

5.3.1.取灭活后的鸡新城疫病毒浓缩液，尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，37℃下继续孵育，剔除24小时内死亡鸡胚，观察5日，鸡胚非特异死亡不应超过2枚，收获所有鸡胚的胚液，然后观察鸡胚胎儿病变，应全部为阴性。将收获的鸡胚液混合，以上述相同方法进行盲传，取传代鸡胚的胚液进行HA试验，应全部为阴性。

5.3.2.取灭活后的H9亚型禽流感病毒浓缩液，尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，37℃下继续孵育，剔除24小时内死亡鸡胚，观察4日，鸡胚非特异性死亡应不超过2枚，收获所有鸡胚的胚液，然后观察鸡胚胎儿病变，应全部为阴性。将收获的鸡胚液混合，以上述相同方法进行盲传，取传代鸡胚的胚液进行HA试验，应全部为阴性。

6.油佐剂灭活疫苗的制备：

6.1.油相制备：取注射用白油94份，加司盘-80 6份，混合后，加硬脂酸铝2份，硬脂酸铝指的是2％(g/V)硬脂酸铝溶液，随加热随搅拌至透明为止，高压灭菌备用。

6.2.水相制备：将检验合格的鸡新城疫灭活胚液和禽流感灭活胚液按1:1的比例充分混合。取吐温-80 4份装入带玻璃珠的瓶中灭菌，冷却后加入混合的灭活病毒液96份，充分振摇，至吐温-80完全溶解为止。

6.3.乳化：将2～3份油相注入乳化罐内，慢速搅拌同时缓缓加入1份水相，加完后，中速混合，然后高速乳化。在乳化终止前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。乳化后，取样10ml以3000r/min离心15分钟，应不出现分层。

7.分装：定量分装，加盖密封并贴标签。

实施例2

一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗的安全性和效力检验：

本发明一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗，含有灭活的鸡新城疫病毒La Sota株和H9亚型禽流感病毒SY株；所述H9亚型禽流感病毒SY株，其保藏编号为CGMCC No.5968。灭活前每0.1毫升鸡新城疫病毒LaSota株病毒和H9亚型禽流感病毒SY株病毒液中的病毒含量均≥2×10^8.0EID₅₀。

本实施例中使用的疫苗是按本发明提供的技术方案制备的3批鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗，批号分别为070601，070602和070603。

1.安全性试验：

1.1.对14日龄SPF鸡的安全性试验：

1.1.1.单剂量接种：每批疫苗使用20只14日龄SPF鸡，通过颈部皮下和肌肉两种途径各接种10只，每只接种疫苗0.3ml，免后14日内连同同批对照鸡5只观察有无局部或全身不良反应；第14天剖检所有试验鸡，检查接种部位和各内脏器官有无明显病变。

1.1.2.超剂量接种：每批疫苗使用20只14日龄SPF鸡，颈部皮下和肌肉二种途径各接种10只，1ml/只，免后14日内连同同批对照鸡5只观察有无局部或全身不良反应；并于第14天解剖所有试验鸡，检查接种部位和各内脏器官有无明显病变。

1.1.3.单剂量重复接种：每批疫苗使用20只14日龄SPF鸡，颈部皮下和肌肉两种途径各接种10只，0.3ml/只，14天后每只试验鸡同样接种途径再次注苗0.3ml，第二次注苗后14日内连同同批对照鸡5只观察有无局部或全身不良反应；并于第14天解剖所有试验鸡，检查接种部位和各内脏器官有无明显病变。

试验结果表明，3批二联苗以颈部皮下接种或肌肉注射的方式，无论以单剂量、单剂量重复免疫或超剂量免疫接种2周龄SPF鸡后14天内，所有试验鸡精神状态良好，采食、饮水量均正常，生长发育未见异常，大小均匀度一致，与对照鸡相比未发现任何局部或全身不良反应；试验鸡剖解后，疫苗接种部位未发现肿胀、溃烂等异常情况，各个脏器亦未发现肉眼可见病变。说明3批二联苗接种14日龄SPF鸡是安全的。

1.2.对产蛋鸡的安全性试验：

1.2.1.单剂量接种：每批疫苗使用60只6月龄产蛋鸡，通过颈部皮下和肌肉两种途径各接种30只，每只接种疫苗0.5ml，注苗后4周内连同同批对照鸡30只，观察有无局部或全身不良反应；记录试验鸡的产蛋情况，连续统计4周蛋鸡的产蛋量，并观察所产蛋的品质有无变化。

1.2.2.超剂量接种：每批疫苗使用60只6月龄产蛋鸡，通过颈部皮下和肌肉两种途径各接种30只，每只接种疫苗1ml，注苗后4周内连同同批对照鸡30只观察有无局部或全身不良反应；记录试验鸡的产蛋情况，连续统计4周蛋鸡的产蛋量，并观察所产蛋的品质有无变化。

1.2.3.单剂量重复接种：每批疫苗使用60只6月龄产蛋鸡，通过颈部皮下和肌肉两种途径各接种30只，每只接种疫苗0.5ml，14天后再次接种疫苗0.5ml，重复免疫后4周内连同同批对照鸡30只，观察有无局部或全身不良反应；记录试验鸡的产蛋情况，连续统计4周蛋鸡的产蛋量，并观察所产蛋的品质有无变化。

结果，二联苗以颈部皮下接种或肌肉注射的方式，无论以单剂量、单剂量重复免疫或超剂量免疫接种6月龄罗曼蛋鸡后4周内，所有试验鸡精神状态良好，采食、饮水量均无异常，未见营养不良的试验鸡，亦未发现其它局部或全身不良反应。

二联苗对蛋鸡生产性能的影响试验结果见表1。从表1可看出，单剂量、超剂量免疫组试验鸡免后4周内产蛋数量为741～747枚，对照鸡产蛋749枚，单剂量重复免疫组试验鸡产蛋数量为786～792枚，对照鸡产蛋792枚；免疫组与对照组鸡4周内产蛋率相差≤0.96％。考虑到疫苗接种对鸡群造成的应激可以引起鸡群产蛋量和蛋的品质的短暂下降，故认为二联苗对产蛋鸡的生产性能没有影响。

表1 二联苗对产蛋鸡的安全性

注：*表示于6月龄产蛋鸡接种疫苗0.5ml后，间隔两周再次接种疫苗0.5ml

2.效力检验：

2.1.ND效力检验：取30日龄SPF鸡60只，分为6组，每组10只，分别以颈部皮下和肌肉注射的途径接种3批二联苗，每只鸡接种剂量为20μL，另取5只不免疫作为对照，3周后，每只鸡先采血分离血清，测定ND HI抗体价；然后肌肉注射鸡新城疫强毒北京株，剂量为10⁵ELD₅₀/只，观察14天，记录免疫鸡与对照鸡的ND HI抗体效价及攻毒后免疫鸡与对照鸡的攻毒保护率。结果见表2，免疫组ND HI抗体均≥1:36.8，对照组ND HI抗体为1:2.3；攻击强毒后，免疫鸡保护8/10～10/10，对照鸡5/5死亡，达到《中国兽药典》的规定标准。

表2 新城疫部分效检结果

2.2.AI效力检验：取28日龄SPF鸡60只，分为6组，每组10只，分别以颈部皮下和肌肉注射的途径接种3批二联苗，每只鸡接种剂量为0.3ml，另取10只不免疫作为对照，接种后3周，所有试验鸡分别采血、分离血清，测定AI HI抗体效价；同时各静脉注射AIV SY株病毒液0.2ml(含10^8.0EID₅₀)，攻毒后第5日，从鸡喉头和泄殖腔采样，用9～11日龄SPF鸡胚分离病毒，记录免疫鸡与对照鸡的AI HI抗体效价及攻毒后免疫鸡与对照鸡的病毒分离率。结果见表3。表3结果表明，颈部皮下与肌肉注射两种免疫途径接种同批二联苗后3周，AI HI抗体水平相差不大，免疫组鸡AI HI抗体均≥1:415.9，对照鸡AI HI抗体为1:1.9；所有试验鸡分别攻击AIV SY株，免疫组病毒分离率均为0/10，对照鸡病毒分离率为10/10。

表3 禽流感部分效检结果

实施例3

一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗的最小免疫剂量试验：

3批二联苗分别以0.07ml、0.15ml、0.3ml的接种剂量，分组免疫4周龄SPF鸡，每组免疫10只，免后21天与对照鸡15只同时采血、分离血清，分别测定ND HI、AI HI抗体。同时取070601批疫苗免疫的3组鸡和5只对照鸡，每只鸡肌肉注射NDV北京株强毒10^5.0ELD₅₀，观察14天；取070602批疫苗免疫的3组鸡和10只对照鸡各静脉注射AIV SY株病毒液0.2ml(含10^8.0EID₅₀)，攻毒后第5日从鸡喉头和泄殖腔采样，用9～11日龄SPF鸡胚分离病毒。结果如表4。二联苗免后4周，ND HI、AI HI抗体水平随着免疫剂量的增加而递增。其中ND HI抗体水平均≥1:52.7，070601批疫苗免后21天试验鸡攻NDV强毒，免疫组保护率均为100％，对照鸡全部死亡；AI HI抗体水平均≥1:82.7，070602批疫苗免后21天试验鸡攻击AIV SY株，免疫组病毒分离率为0/10，对照鸡病毒分离率为9/10。因此，最小免疫剂量为0.15ml。

表4 最小免疫剂量试验结果

Claims (6)

1.一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于，含有灭活的鸡新城疫病毒La Sota株和H9亚型禽流感病毒SY株；所述H9亚型禽流感病毒SY株，其保藏编号为CGMCC No.5968。

2.如权利要求1所述的一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于，灭活前每0.1毫升鸡新城疫病毒La Sota株病毒和H9亚型禽流感病毒SY株病毒液中的病毒含量均≥2×10^8.0EID₅₀。

3.一种如权利要求1或2所述的鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，用鸡胚繁殖鸡新城疫病毒La Sota株和H9亚型禽流感病毒SY株，分别收获相应的病毒液，分别浓缩和灭活，然后将灭活后的病毒液混合均匀，得到混合抗原液，将所述混合抗原液乳化，得到所述鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗。

4.一种如权利要求3所述的鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述混合抗原液中灭活鸡新城疫病毒La Sota株抗原液和灭活H9亚型禽流感病毒SY株抗原液的量相等。

5.一种如权利要求3或4所述的鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述混合抗原液乳化的过程如下：将所述混合抗原液和灭菌的吐温-80按照体积比96:4混合均匀，得水相溶液；将注射用白油和司本-80按照体积比94:6混合，然后加入2份硬脂酸铝溶液，随加热随搅拌至透明为止，高压灭菌得油相溶液；将所述水相溶液和油相溶液混合乳化均匀。

6.一种如权利要求5所述的鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述水相溶液和油相溶液的体积为1:2～3。