CN102166355B - 一种用于预防鸡疾病的四联灭活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于预防鸡疾病的四联灭活疫苗，其是用鸡新城疫病毒ZM10株、传染性支气管炎病毒M41株和禽流感病毒H9亚型S2株分别接种易感鸡胚，收获感染鸡胚液；减蛋综合征病毒AV-127株接种易感鸭胚，收获感染鸭胚液；将收获的病毒液浓缩，经灭活后，再与油佐剂混合乳化制成。本发明提供的四联疫苗可用于预防鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感(H9亚型)病毒引起的疾病，达到一针防四病的效果，减少免疫成本和免疫应激反应。

Description

一种用于预防鸡疾病的四联灭活疫苗

技术领域

本发明涉及一种用于预防鸡疾病的四联灭活疫苗。

背景技术

一直以来禽流感和新城疫都困扰着养殖业的发展，尤其近年来高致病性禽流感的爆发，以及低致病性禽流感的长期存在，都已经给广大养殖户带来了巨大的经济损失，而禽流感病毒本身的高异变性，更给我们增加了防控的难度。同时鸡群常见的传染性支气管炎和减蛋综合征也对养殖的影响非常大，一般情况下，必须同时接种以上4种疾病的单独的疫苗来预防这些疾病在鸡群中的爆发，免疫成本较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于同时预防鸡四种疾病的四联灭活疫苗。

为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种用于预防鸡疾病的四联灭活疫苗，其是用鸡新城疫病毒ZM10株、传染性支气管炎病毒M41株和禽流感病毒H9亚型S2株分别接种易感鸡胚，收获感染鸡胚液；减蛋综合征病毒AV-127株接种易感鸭胚，收获感染鸭胚液；将收获的病毒液浓缩，经灭活后，再与油佐剂混合乳化制成。

上述四联灭活疫苗，所述收获的病毒液中鸡新城疫病毒ZM10株的病毒液每0.1ml病毒含量≥10^8.0EID50，传染性支气管炎病毒M41株的病毒液每0.1ml病毒含量≥10^6.0EID50，减蛋综合征病毒AV-127株的病毒液每0.1ml病毒含量≥10^7.0EID₅₀，禽流感病毒H9亚型S2株的病毒液每0.1ml病毒含量≥10^7.5EID50。

上述四联灭活疫苗，所述收获的病毒液浓缩至原体积的1/4后，按ZM10株占35％、M41株占25％、AV-127株占15％、S2株占25％的体积比例混合后乳化。

上述四联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备生产用毒种：

将鸡新城疫病毒ZM10株毒种、鸡传染性支气管炎M41株毒种和禽流感病毒H9亚型S2株毒种分别用灭菌生理盐水稀释，尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1～0.2ml，置36℃～37℃继续孵育，24小时前死亡的鸡胚弃去，此后每6～8小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至48～96小时，取出全部鸡胚，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时；然后无菌收获鸡胚尿囊液，取检验无菌且对1％鸡红细胞凝集价≥9log2的鸡胚液混合作为鸡新城疫病毒ZM10株生产用毒种、检验无菌且病毒含量≥10^6.0EID₅₀/0.1ml、对1％鸡红细胞凝集试验为阴性的鸡胚液混合作为鸡传染性支气管炎M41株生产用毒种、以及检验无菌且对1％红细胞凝集价在8log2以上的鸡胚液混合作为禽流感病毒H9亚型S2株生产用毒种；

将鸡减蛋综合征AV-127株毒种用灭菌生理盐水比例稀释，尿囊腔接种10日龄易感鸭胚，每胚0.1ml，置36℃～37℃继续孵育，24小时前死亡的鸭胚弃去，此后每6～8小时照蛋1次，死亡的鸭胚随时取出，直至120小时，取出全部鸭胚，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时；然后无菌收获鸭胚尿囊液，取检验无菌且对1％鸡红细胞凝集价≥14log2的鸭胚液混合作为鸡减蛋综合征AV-127株生产用毒种；

(2)孵化制苗用种蛋：采用健康易感鸡种蛋和易感鸭种蛋，消毒后孵化，相对湿度50％～60％，每2小时翻蛋一次。

(3)制备制苗用病毒液：取上述生产用毒种，用灭菌生理盐水稀释，尿囊腔内接种10～11日龄易感鸡胚或鸭胚，每胚0.1ml，接种后封闭针孔，置36～37℃孵育；鸡胚接种后，24小时照蛋1次，死亡的鸡胚弃去；此后，每6～8小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至48～120小时，全部取出，气室向上直立，置2～8℃冷却12～24小时；将冷却后的鸡胚或鸭胚取出，先以碘酒，后以75％酒精消毒气室部位的卵壳，然后以无菌方法剔除气室部位蛋壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜(勿使卵黄破裂)吸取鸡胚液混合后为病毒液；

(4)浓缩病毒液：将步骤(3)制得的病毒液除去大颗粒物质澄清，超滤浓缩至原体积的1/4；

(5)灭活病毒液：将浓缩后的各种病毒液，分别加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％，边加边充分摇匀，置37℃灭活16小时；

(6)制备油乳剂灭活疫苗：

油相：注射用白油94份和司本-80 6份混合后，加入2％硬脂酸铝，高压灭菌后备用。

水相：将浓缩的病毒液，按比例混合ZM10株占35％、M41株占25％、AV-127株占15％、S2株占25％。

吐温-80灭菌后在乳化时加到疫苗水相之中，加入量占水相体积的4％，充分振摇使吐温完全溶解为止。

油相3份：1份水相乳化。在乳化终止前加入防腐剂。防腐剂为硫柳汞配成1％的溶液，无菌过滤后备用。1％硫柳汞的加入量占疫苗总体积的1％，最终浓度为万分之一。

(7)分装：将乳化得到的疫苗分装于灭菌疫苗瓶内，密封，2～8℃保存。

上述制备方法，所述步骤(3)制得的病毒液中，鸡新城疫病毒ZM10株的病毒液每0.1ml病毒含量≥10^8.0EID₅₀，传染性支气管炎病毒M41株的病毒液每0.1ml病毒含量≥10^6.0EID₅₀，减蛋综合征病毒AV-127株的病毒液每0.1ml病毒含量≥10^7.0EID₅₀，禽流感病毒H9亚型S2株的病毒液每0.1ml病毒含量≥10^7.5EID₅₀。

上述制备方法，所述步骤(3)中各毒种的稀释倍数优选为：新城疫ZM10株生产用毒种进行10000倍稀释，传染性支气管炎病毒M41株生产用毒种进行100倍稀释，减蛋综合征病毒AV-127株生产用毒种进行1000倍稀释，禽流感H9亚型S2株生产用毒种进行1000倍稀释接种鸡/鸭胚。

上述制备方法，所述步骤(3)中各毒种接种鸡胚或鸭胚后孵育的时间分别优选为：新城疫病毒ZM10株为96小时、M41株病毒为48小时、AV-127株为120小时及S2株病毒为96小时。

上述制备方法，所述步骤(3)中各毒种接种的鸡胚或鸭胚分别优选为：新城疫病毒ZM10株为10日龄，传染性支气管炎病毒M41株为11日龄，减蛋综合征病毒AV-127株为10日龄，禽流感病毒S2株为10日龄。

上文所述的SPF鸡是指生长在屏障系统或隔离器中、无国际、国内(尤其是国内)流行的主要鸡传染病病原的鸡群，其所产蛋即为SPF种蛋。SPF鸡胚对各种病原微生物有敏锐的感受性，且重复性好，是研制人和禽等多种生物制品的高标准原材料。

上述技术方案具有如下优点：上述四联疫苗的制备方法简单，效果良好，经过多批次的动物实验和田间试验，结果表明：疫苗对鸡群无不良反应，鸡群在免疫后1个月测HI抗体水平，几何平均滴度ND为10.8～11.5log2，IB为8.8～9.2log2，EDS为9.7～10.5log2，禽流感H9为10.0～11.0log2。鸡群开产后产蛋性能良好，产蛋量与蛋壳质量正常，在6个月观察期内，免疫组死淘率较同群未免疫四联苗对照组降低0.5％～2.4％，平均每只鸡多产蛋2～7枚。上述制备方法制备的“鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感(H9亚型)四联灭活疫苗(ZM10株+M41株+AV-127株+S2株)”质量确实、可靠，符合要求。本发明提供的四联疫苗可用于预防鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感(H9亚型)病毒引起的疾病，达到一针防四病的效果，减少免疫成本和免疫应激反应。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：毒种

1.1毒种来源  制造本品的鸡新城疫毒种为鸡新城疫病毒ZM10株，效检用毒株为鸡新城疫病毒强毒北京株(CVCC AVl611株)，制苗及效检用鸡传染性支气管炎病毒毒种为M41株，均由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应；制苗及效检用减蛋综合征病毒毒种为EDS₇₆-AV127株，制苗及效检用禽流感病毒毒种为A/Chicken/Shandong/S2/1999(H9N2)株(简称S2株)，均由山东省农业科学院家禽研究所鉴定、保管。

1.2 毒种标准

1.2.1 鸡新城疫病毒ZM10株应符合下列标准

1.2.1.1 对鸡脑内致病指数(ICPI)按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》(2001年版)(以下简称“标准”)附录316页进行，应为0.1～0.4。

1.2.1.2 对鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT/MLD)按“标准”附录316页进行，应为103～119小时。

1.2.1.3 对鸡胚的毒力 将毒种用灭菌生理盐水作100倍稀释，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0.1ml，置36℃～37℃继续孵育，鸡胚应于接种后24～120小时死亡7个以上，胎儿应有明显充血、出血病痕。

1.2.1.4 红细胞凝集价 按“中华人民共和国兽药典”(2005年版)(以下简称“中国兽药典”)附录28页进行，含毒鸡胚液对红细胞凝集价应≥9log2(微量法)。

1.2.1.5 病毒含量 含毒鸡胚尿囊液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-93个稀释度，各尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，24小时前死亡的鸡胚弃去不计，在24～120小时死亡的鸡胚随时取出，置2～8℃保存。120小时，取出所有鸡胚，逐个收获鸡胚尿囊液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥7log2(微量法)者判为感染，按Reed-Muench法计算EID₅₀(鸡胚半数感染量)，每0.1ml病毒含量应≥10^8.0EID₅₀。

1.2.1.6 安全性 用2～7日龄SPF雏鸡20只，分成两组，第1组10只，每只滴鼻接种5倍稀释的含毒尿囊液0.05ml，第2组10只，不接种作为对照，两组在同样条件下分别饲养管理，观察10天，应无不正常反应。如有非特异性死亡，免疫组与对照组均不应超过1只。

1.2.1.7 免疫原性 对1月龄SPF鸡滴鼻接种，最小免疫量应≤5000EID₅₀。

1.2.1.8 纯净 应无细菌、霉菌(按“中国兽药典”附录15页)、支原体(按“中国兽药典”附录19页)及外源病毒(按“中国兽药典”附录20页)污染。

1.2.1.9 特异性 将毒种用灭菌生理盐水稀释为10^5.0EID₅₀/0.1ml，与等量鸡新城疫病毒阳性血清混合，室温下中和1小时后，接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0.2ml，继续孵育观察120小时。在24～120小时内，应不引起特异性死亡，至少存活8个，鸡胚尿囊液作红细胞凝集试验，应为阴性。

1.2.1.10 基础种子代数 E2～E5代。

1.2.1.11 毒种保存-20℃以下保存，冻干毒种保存期为72个月。

1.2.2 鸡新城疫强毒北京株(CVCC AVl611株)应符合下列标准

1.2.2.1 对鸡最小致死量毒力 用2～8月龄SPF鸡4只，各肌肉注射10^-7或10^-8稀释的病毒液1ml，14日内应全部死亡，剖检应为新城疫典型病变。

1.2.2.2对鸡胚半数致死量将毒种作10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-93个稀释度，各尿囊腔接种9-11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，记录接种后24～72小时死亡且胎儿病痕明显的鸡胚，按Reed-Muench法计算ELD₅₀，每0.1ml病毒含量应≥10^7.0ELD₅₀。

1.2.2.3 毒种保存 -20℃以下保存，冻干毒种保存期为72个月。

1.2.3 传染性支气管炎病毒M41株应符合下列标准

1.2.3.1 对鸡胚的毒力 将毒种100倍稀释，尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚10个，每胚0.1ml，置36℃～37℃继续孵育。观察144小时，24小时前死亡的鸡胚弃去不计，24～144小时部分鸡胚死亡，存活的鸡胚均应出现失水、蜷缩、发育小等特异性病痕。

1.2.3.2 对雏鸡的毒力 用1～7日龄SPF雏鸡10只，用10倍稀释的种毒滴鼻，每只约0.1ml，观察14日，应至少有8只出现鸡传染性支气管炎典型呼吸道症状。

1.2.3.3 病毒含量 将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-73个稀释度各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36℃～37℃继续孵育，24小时前死亡的鸡胚弃去不计，接种鸡胚在24～144小时死亡或存活的胚体出现失水、蜷缩、发育小等特异性病痕判为感染。计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量应≥10^6.0EID₅₀。

1.2.3.4 免疫原性 将毒种接种10～11日龄SPF鸡胚培养，无菌收获鸡胚液，用甲醛溶液灭活后，按1∶3(水相∶油相)的比例制成油乳剂灭活疫苗。用3～6周龄SPF鸡10只，各点眼接种H120活疫苗1羽份。21日后，分别采血。接种灭活疫苗0.5ml，21日后再分别采血。将2次血清分别做HI试验。二免血清的HI抗体几何平均滴度(GMT)应较首免血清HI价几何平均滴度高3倍以上。

1.2.3.5 纯净 应无细菌、霉菌(“中国兽药典”附录15页)、支原体(“中国兽药典”附录19页)及外源病毒(“中国兽药典”附录20页)污染。

1.2.3.6 特异性 将毒种用灭菌生理盐水稀释为200个EID₅₀/0.1ml，与等量鸡传染性支气管炎阳性血清混合，在室温下作用1小时，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0.2ml。置37℃孵育，观察24～144小时，应不引起特异性死亡及鸡胚病变，且应至少有8个鸡胚健活。

1.2.3.7 基础种子代数 E2～E5代。

1.2.3.8 毒种保存 -20℃以下保存，冻干毒种保存期为72个月。

1.2.4 鸡减蛋综合征病毒AV-127株应符合下列标准

1.2.4.1 病毒含量 用灭菌生理盐水将毒种作10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-83个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄易感鸭胚5个，每胚0.1ml，置37℃孵育，24小时前死亡的鸭胚弃去不计，在24～120小时死亡的鸭胚随时取出，置2～8℃保存，至120小时，取出所有鸭胚，逐个收获鸭胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥7log2者判为感染，按Reed-Muench法计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量应≥10^7.0EID₅₀。

1.2.4.2 红细胞凝集价 按“中国兽药典”附录28页进行测定，对1％红细胞凝集价应≥14log2。

1.2.4.3 免疫原性 将毒种接种10日龄易感鸭胚培养，无菌收获鸭胚液，用甲醛灭活后，按每羽≥2000HA制成油乳剂灭活疫苗，皮下注射21～28日龄的SPF鸡10只，每只0.5ml，另取10只SPF鸡作对照，21日后，采血测定HI抗体效价，免疫鸡HI抗体几何平均效价应≥7log2，对照鸡HI抗体几何平均效价应≤2log2。

1.2.4.4 纯净 应无细菌、霉菌(“中国兽药典”附录15页)、支原体(“中国兽药典”附录19页)及外源病毒(“中国兽药典”附录20页)污染。

1.2.4.5 特异性 将毒种用灭菌生理盐水稀释为10^5.0EID₅₀/0.1ml，与等量鸡减蛋综合征阳性血清混合，室温下中和1小时，尿囊腔接种易感鸭胚10个，每胚0.2ml，观察120小时。鸭胚液作红细胞凝集试验，应为阴性。

1.2.4.6 基础种子代数 E2～E5代。

1.2.4.7 毒种保存 -20℃以下保存，冻干毒种保存期为72个月。

1.2.5 禽流感病毒H9亚型S2株应符合下列标准

1.2.5.1 对鸡胚的毒力 将毒种用灭菌生理盐水作1000倍稀释，尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚10个，每胚0.1ml，置36℃～37℃继续孵育，鸡胚应于接种后96小时死亡2个以上，胎儿应有明显充血、出血病痕。

1.2.5.2 对鸡静脉致病指数(IVPI)按“标准”附录317页进行，应＜0.5，属低毒力。

1.2.5.3 红细胞凝集价 按“中国兽药典”附录28页进行，含毒鸡胚液对鸡红细胞凝集价应≥8log2(微量法)。

1.2.5.4 病毒含量 将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-83个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，24小时前死亡的鸡胚弃去不计，在24～96小时死亡的鸡胚随时取出，置2～8℃保存，至96小时，取出所有鸡胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥6log2者判为感染，按Reed-Muench法计算EID₅₀，每0.1ml病毒含量应≥10^7.5EID₅₀。

1.2.5.5 免疫原性 将毒种接种10～11龄SPF鸡胚，收获鸡胚液，用甲醛溶液灭活，按水相∶油相(1∶3)的比例制成油乳剂灭活疫苗，按每羽份0.5ml颈部皮下注射3周龄的SPF雏鸡10只，同时设条件相同的对照SPF鸡5只，免疫后3～4周，各静脉注射禽流感病毒H9亚型S2株病毒液0.2ml(含2×10^6.0EID₅₀)。攻毒后第5日，采集每只鸡喉头和泄殖腔棉拭子，置于含有青、链霉素的生理盐水中，分别尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.2ml，37℃孵育96小时，检测所有鸡胚尿囊液HA效价。每只鸡棉拭子样品接种的鸡胚中，只要有1个鸡胚的尿囊液HA效价≥4log2，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1代后再进行判定。免疫鸡中应至少9只鸡病毒分离阴性，对照鸡应至少4只病毒分离阳性。

1.2.5.6特异性毒种用灭菌生理盐水稀释为10^5.0EID₅₀/0.1ml，与等量抗禽流感H9亚型特异性血清混合后，在室温下作用1小时，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0.2ml，应不引起特异性死亡，至少有8个鸡胚健活，鸡胚液红细胞凝集试验应为阴性。

1.2.5.7 纯净 应无细菌、霉菌(“中国兽药典”附录15页)、支原体(“中国兽药典”附录19页)及外源病毒(“中国兽药典”附录20页)污染。

1.2.5.8 基础种子代数E 2～E8代。

1.2.5.9 毒种保存-20℃以下保存，冻干毒种保存期为72个月。

实施例2：制备生产用毒种

将鸡新城疫病毒ZM10株毒种、鸡传染性支气管炎M41株毒种和禽流感病毒H9亚型S2株毒种分别用灭菌生理盐水稀释后尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，36～37℃孵育48～96小时，再置于2～8℃冷却12～24小时；然后无菌收获鸡胚尿囊液，取检验无菌且对1％鸡红细胞凝集价≥9log2的鸡胚液混合作为鸡新城疫病毒ZM10株生产用毒种，检验无菌且病毒含量≥10^6.0EID₅₀/0.1ml、对1％鸡红细胞凝集试验为阴性的鸡胚液混合作为鸡传染性支气管炎M41株生产用毒种，以及检验无菌且对1％红细胞凝集价在8log2以上的鸡胚液混合作为禽流感病毒H9亚型S2株生产用毒种；

将鸡减蛋综合征AV-127株毒种用灭菌生理盐水稀释后尿囊腔接种10～11日龄易感鸭胚，36℃～37℃孵育96～120小时，再置于2～8℃冷却12～24小时；然后无菌收获鸭胚尿囊液，取检验无菌且对1％鸡红细胞凝集价≥14log2的鸭胚液混合作为鸡减蛋综合征AV-127株生产用毒种；

实施例3：疫苗制造生产工艺

1、生产用毒种不同稀释度对鸡胚病毒含量的影响

进行了毒种不同稀释倍数对收获鸡胚液中病毒含量的影响实验，经多次重复，结果证实：ZM10株10000倍与1000倍稀释后接种SPF鸡胚，收获的病毒量一致(10^8.83EID₅₀/0.1ml)；AV-127株1000倍稀释接种易感鸭胚，病毒含量与100倍收获的病毒量一致(107.38EID50/0.1ml)；而M41株100倍稀释接种SPF鸡胚，收获的病毒量(10^7.16EID₅₀/0.1ml)，则明显高于1000倍稀释(10^6.16EID₅₀/0.1ml)；S2株1000倍稀释接种SPF鸡胚，收获的病毒量(10^8.17EID₅₀/0.1ml)，明显高于10000倍稀释(10^7.63EID₅₀/0.1ml)；因此，ZM10株毒种采用10000倍稀释毒种接种，M41株毒种100倍稀释，AV-127株和S2株毒种1000倍稀释接种。

2、病毒增殖时间对尿囊液中病毒含量的影响

对毒种接种鸡/鸭胚后不同繁殖时间(36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h及120h)收获胚液的病毒含量进行了检测，经过多次重复，结果表明：LaSota株毒种接种鸡胚后，在84～120小时病毒含量均较高(10^8.50～10⁸⁸³EID₅₀/0.1ml)，因此选择收获时间为96小时；M41株毒种接种鸡胚后，在EID₅₀检测结果36h达到第1次高峰值(10^7.00EID₅₀/0.1ml)，60h后开始略有降低(10^6.32EID₅₀/0.1ml)，至96～120h后，病毒含量又上升至高峰(10^6.84～10^7.16EID₅₀/0.1ml)，两次高峰值基本无差异，因此选择的最佳收获时间为36～48h；AV-127株毒种接种鸭胚后，至108h，病毒含量逐渐趋于稳定(10^7.32EID₅₀/0.1ml)，因此选择的最佳收获时间为120h；S2株毒种接种鸡胚后，病毒含量至84h，病毒含量逐渐趋于稳定(10^8.17～10^8.32EID₅₀/0.1ml)，因此选择的最佳收获时间为96h。

3、不同日龄接种对鸡/鸭胚尿囊液收获量的影响

为提高病毒的收获量，结合上述1和2的结果，将毒种按规定稀释后分别接种9、10、11、12及13日龄SPF鸡/鸭胚，每组60个鸡胚或鸭胚，计算鸡胚或鸭胚平均收获量，进行了综合评价。结果表明：ZM10株以10日龄鸡胚接种收获的尿囊液较多，平均为11毫升；M41株以11日龄鸡胚接种收获的尿囊液较多，平均为11.1毫升；AV-127株以10日龄鸭胚接种收获的尿囊液量较多，平均为9.2毫升；S2株以10日龄鸡胚接种收获的尿囊液较多，平均为10.9毫升。

4、疫苗抗原液的浓缩

为达到疫苗的最佳免疫效果，以新城疫、减蛋综合征和禽流感(H9亚型)三种单价灭活苗的质量标准和OIE关于传支灭活疫苗的标准为参照，分别进行了不同比例的浓缩预备试验。既考虑到四联苗中每种抗原的含量不低于相应单苗的抗原量，同时考虑工业化生产的便捷性和经济性。多次预实验的结果证实，不同病毒抗原浓缩4倍时，综合效果最好。

具体操作方法是，将抗原液分别浓缩至原体积的1/4，对浓缩前后HA效价和病毒含量变化进行了检测。结果表明：ZM10株抗原液的HA效价提高了2个滴度，即由10～11log2上升为12～13log2，病毒含量由10^8.38～10^8.67升至10^8.83～10^9.17；M41株抗原液的病毒含量由10^6.38～10^6.50升至10^6.83～10^7.00；AV-127株抗原液的HA效价约提高了2个滴度，由14～16log2上升为16～18log2，S2株抗原液的HA效价约提高了2个滴度，由9log2上升为11log2，病毒含量由10^8.00～10^8.17升至10^8.50～10^8.68。结果表明：新城疫、减蛋综合征、禽流感三种病毒液浓缩后HA价较浓缩前提高了4倍，滤出液HA效价为0，病毒含量也随着浓缩倍数的增加而增加；传染性支气管炎病毒液经浓缩后，病毒含量也相应增加，滤出液中病毒含量低，浓缩过程中病毒损失忽略不计。将浓缩前后的病毒液分别配制疫苗，比较效力，浓缩后的抗体水平比浓缩前有明显提高。

5、甲醛灭活剂的使用浓度和灭活时间

在确保完全灭活病毒的同时尽量减少甲醛使用量，对四种病毒抗原液浓缩后不同甲醛灭活终浓度(0.1％、0.2％、0.3％和0.4％)及灭活时间(8h、12h、16h、20h和24h)进行了多次交叉重复实验。研究结果表明：甲醛终浓度为0.2％，灭活时间为16h，灭活效果最佳。

6、四联灭活疫苗的生产工艺

为完善生产工艺，经对不同生产过程进行了多次重复比较后，建立了相应的规范。

抗原制备采用新城疫ZM10株，接种10日龄易感鸡胚生产病毒抗原液，收获的病毒抗原液病毒含量≥10^8.0EID₅₀/0.1ml，对1％红细胞的凝集价≥9log2；用传染性支气管炎M41株接种11日龄易感鸡胚生产病毒抗原液，收获的病毒抗原液病毒含量≥10^6.0EID₅₀/0.1ml，每批留鸡胚在接种144h后观察病变，90％以上应出现IB典型病变；用减蛋综合征AV-127株接种10日龄易感鸭胚生产病毒抗原液，收获的病毒抗原液对1％鸡红细胞的凝集价≥14log2，病毒含量≥10^7.0EID₅₀/0.1ml；用禽流感S2标准株接种11日龄易感鸡胚生产病毒抗原液，收获的病毒抗原液病毒含量≥10⁷⁵EID₅₀/0.1ml，对1％红细胞的凝集价≥8log2。

抗原浓缩和配比不同配比筛选试验表明：当将抗原液进行4倍浓缩，按照ZM10株占35％、M41株占25％、AV-127株占15％和S2株占25％的配比，研制的四联苗免疫效果较好，针对每种病毒的抗体均可达到技术要求，且生产成本经济。

乳化工艺水相与油相按1∶3的比例制备的油乳剂灭活疫苗稳定性较好，粘度适中。

在多次重复工艺性探索基础之上，并结合实验室研制和工厂化生产，经过一系列的检测验证，证实该工艺技术稳定，成熟度高，各项指标均符合“生物制品规程”和“进口兽药质量标准”中四个单价疫苗标准。

实施例4：成品检验

1物理性状

外观为乳白色乳剂。

剂型呈油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第一滴外，应呈油滴状，不扩散。

稳定性取10ml疫苗于离心管中，经3000r/m离心15min，应不出现分层现象；37℃条件下放置21日，应不破乳。

粘度用1ml吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)，吸取25℃左右的疫苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需的时间，在8秒以内判为合格。

2无菌检验按“中国兽药典”附录15页进行，应无菌生长。

3安全检验取3～6周龄SPF鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1ml(2羽份)，观察14日，应不发生因注射疫苗而出现的任何局部及全身反应。

4效力检验

4.1鸡新城疫部分采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行效力检验。

血清学方法用3～6周龄SPF鸡15只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗20μl(1/25羽份)，另5只作对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，按“中国兽药典”进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应≥4log2，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应≤2log2。

免疫攻毒法用3～6周龄SPF鸡15只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗20μl(1/25羽份)，另5只作对照。接种后21～28日，每只鸡各肌肉注射鸡新城疫病毒北京株(CVCC AV1611株)1ml(含10^5.0ELD₅₀)，观察14日，对照组全部死亡，免疫组至少保护7只。

4.2传染性支气管炎部分用3～6周龄SPF鸡10只，各点眼接种H120活疫苗1羽份。21日后，分别采血。再接种待检疫苗0.5ml(1羽份)，21日后再分别采血。将2次血清分别做HI试验。二免血清的HI抗体几何平均滴度应较首免血清HI几何平均滴度高3倍以上。

4.3减蛋综合征部分用3～6周龄SPF鸡10只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗1羽份(0.5ml)。21日后，连同条件相同的SPF对照鸡5只，采血，测定HI抗体效价，免疫鸡HI抗体几何平均效价应≥7log2，对照鸡HI抗体效价应≤2log2。

4.4禽流感H9部分下列方法任择其一。

血清学方法取3～6周龄SPF鸡10只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗1羽份(0.5ml)。接种21日后，连同条件相同的SPF对照鸡5只，采血，测定HI抗体效价，免疫鸡HI抗体几何平均效价应≥6log2；对照鸡HI抗体效价应≤2log2。

免疫攻毒法取3～6周龄SPF鸡10只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗1羽份(0.5ml)。接种21日后，连同条件相同的SPF对照鸡5只，各静脉注射禽流感S2株病毒液0.2ml(含2×10^6.0EID₅₀)。攻毒后第5日，采集每只鸡喉头和泄殖腔棉拭子，置于含有青、链霉素的生理盐水中，分别尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.2ml，37℃孵育96小时，检测所有鸡胚尿囊液HA效价。每只鸡棉拭子样品接种的鸡胚中只要有1个鸡胚的尿囊液HA效价≥4log2，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1代后再进行判定。免疫鸡中应至少9只鸡病毒分离阴性，对照鸡应至少4只病毒分离阳性。

5甲醛、硫柳汞含量测定分别按“中国兽药典”附录24、25页进行，应符合规定。

6作用与用途用于预防产蛋鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征和禽流感(H9亚型)，免疫期为4个月。

7用法与用量皮下或肌肉注射，用于开产前(110～140日龄)蛋鸡及种鸡的免疫接种，每只0.5ml。

8注意事项

8.1非健康鸡切忌注射本品。

8.2所要预防的禽流感亚型一定要与本品标示的亚型相一致，否则无效。

8.3本品严禁冻结，应保存在2～8℃恒温条件下。

8.4本品如出现破损、异物或破乳分层等异常现象切勿使用。

8.5注射前应将疫苗恢复至室温。

8.6建议在当地兽医正确指导下正确使用。

9贮藏  2～8℃保存，有效期为18个月。

10规格  100ml/瓶、250ml/瓶、500ml/瓶。

实施例4：中间试制研究

乾元浩生物股份有限公司郑州生药厂，按照实验室制备鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感(H9亚型)四联灭活疫苗(ZM10株+M41株+AV-127株+S2株)的试制工艺，在成熟的工业生产条件下，利用现有设施和设备，组织试生产四联灭活疫苗五批，共125.4万毫升，疫苗物理性状、无菌检验、安全检验和防腐剂含量检验等检测指标，均符合“中国兽药典”中有关规定，效力检验结果与多次预试验及实验室产品检测结果一致，证实该工艺是切实可行的。

实施例5：临床试验

1.试验材料

1.1试验疫苗  鸡新城疫(ZM10株)、传染性支气管炎(M41株)、减蛋综合征(AV-127株)、禽流感(H9N2亚型，S2株)四联灭活疫苗，乾元浩生物制品有限公司郑州生物药厂生产，中试产品批次分别为：200601、200602、200603、200604及200605。

1.2器材 V型96孔微量滴定板、微量混合器、塑料采血管、一次性注射器、50ul可调移量移液器。

1.3负压隔离器购自苏州冯氏实验动物设备有限公司。

1.4试验鸡场和鸡群

1.4.1山东济南槐荫彭庄养鸡场110日龄罗曼父母代种鸡10200只，随机分为5组，每组2000只左右，分别用200601、200602、200603、200604和200605批疫苗免疫，每只鸡胸部肌肉注射0.5ml，设同批未免疫鸡120只为对照组，相同条件下饲养。

1.4.2山东金牌种鸡场110日龄海兰父母代种鸡10200只，随机分为5组，每组2000只左右，分别用200601、200602、200603、200604和200605批疫苗免疫，每只鸡胸部肌肉注射0.5ml，设同批未免疫鸡100只为对照组，相同条件下饲养。

1.4.3山东德州久益农牧发展有限公司110日龄罗曼父母代种鸡10200只，随机分为5组，分别用200601、200602、200603、200604和200605批疫苗免疫，每只鸡胸部肌肉注射0.5ml，设同批未免疫鸡100只为对照组，相同条件下饲养。

1.5诊断抗原

1.5.1新城疫病毒血凝抗原、减蛋综合征病毒血凝抗原和禽流感病毒H9亚型血凝抗原购自哈尔滨兽医研究所。

1.5.2传染性支气管炎病毒血凝抗原由山东省农业科学院家禽研究所研制。

1.6阳性、阴性血清由山东省农业科学院家禽研究所提供。

2 试验方法

2.1安全试验 各养鸡场取相应日龄鸡专笼饲养，戴脚环作为标记，每批次疫苗注射100只鸡，每只胸部肌肉注射1ml(2羽份)，每天观察注射部位，连续14天，按照如下标准判定：

重反应：“+++”注射部位严重肿胀，蔓延至整个胸部，试验鸡精神萎靡，卧地不起，甚至死亡者。

中反应：“++”注射部位肿胀，14天内不能自愈，试验鸡精神不振，食欲减退者。

轻反应：“±”注射部位轻微肿胀，试验鸡间有精神沉郁，7天内恢复正常者。

无反应：“-”无任何可见反应。

重反应、中反应为不安全，轻反应、无反应为安全。

2.2效力试验

2.2.1血清学方法 在不同的种鸡场每批次疫苗分别免疫开产前鸡群，同时设未免疫对照鸡群100～120只，免疫前采血一次，免疫后每月采血一次，每次均按照鸡群数量的0.3％采血，用HI法分别测定新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征和禽流感(H9亚型)血清抗体效价，直至6个月。

2.2.2新城疫强毒攻毒试验 每批次疫苗免疫21～28日后，从免疫鸡群中取10只鸡，同群未免疫四联苗鸡取10只，5只SPF鸡对照，置负压隔离器中进行攻毒试验。攻毒毒株为鸡新城疫病毒北京强毒株(CVCC AV1611株)，攻毒剂量为10⁵ELD₅₀，攻毒途径为肌肉注射。观察2周。

2.2.4禽流感(H9亚型)免疫攻毒试验 每批次疫苗免疫21～28日后，从免疫鸡群中取10只鸡，同群未免疫四联苗鸡取10只，同时取日龄相近的SPF鸡5只作为对照，置负压隔离器中进行攻毒试验。攻毒毒株为S2株，静脉注射，每只0.2ml(含2×10⁶EID₅₀)，攻毒后第5日，采集每只鸡喉头和泄殖腔棉拭子，分别尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.2ml，37℃孵育96小时，检测所有鸡胚尿囊液HA效价。每个棉拭子样品接种的鸡胚中只要有1个鸡胚的尿囊液HA效价≥4log2，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1代后再进行判定。

2.3免疫鸡群产蛋性能观察 开产前3～4周进行疫苗免疫，鸡群产蛋后即收集鸡蛋，连续25周(6个月)，计算产蛋率，与同群未免疫四联苗对照鸡群及往年同期饲养的鸡群进行比较，观察疫苗免疫对产蛋的影响。

3.结果

3.1安全检验5批中试疫苗接种后，胸部肌肉注射部位没有肿胀、硬结或溃烂现象，接种鸡的饮水、采食及精神状态无任何可见反应。

3.2山东济南槐荫彭庄种鸡场试验结果

3.2.1抗体检测结果 见表1。

表1山东济南槐荫彭庄种鸡场临床试验抗体检测

中试疫苗免疫鸡群的新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征和禽流感(H9)亚型抗体水平首先呈上升趋势，2～3个月后，抗体水平呈缓慢下降趋势，维持期较长，抗体均匀度较好；同群未免疫四联苗对照组鸡群各项抗体缓慢下降。

3.2.2新城疫及禽流感H9亚型攻毒实验结果 见表2。

表2山东济南槐荫彭庄种鸡场抽样攻毒试验

3.2.3免疫鸡群25周观察期内产蛋及淘汰情况彭庄鸡场鸡群使用四联疫苗中试产品后，鸡群淘汰率较往年同期降低了2.6％～2.8％，平均每只鸡多下蛋4～8枚，较同群未免疫四联苗对照组淘汰率降低了1.8％～2.0％，平均每只鸡多下蛋2～6枚。详细数据见表3。

表3山东济南槐荫彭庄种鸡场鸡群的产蛋及淘汰情况

3.3山东聊城金牌种鸡场试验结果

3.3.1抗体检测结果

同群未免疫四联苗对照组鸡群各项抗体缓慢下降；5批中试疫苗免疫鸡群的新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征和禽流感(H9)亚型抗体水平首先呈上升趋势，2～3个月后，抗体水平呈缓慢下降趋势，维持期较长，抗体均匀度较好，抗体检测结果见表4。

表4 山东金牌种鸡场临床试验鸡群抗体检测结果

3.3.2新城疫及禽流感H9亚型攻毒实验结果 见表5。

表5山东金牌种鸡场抽样攻毒试验

3.3.3 25周观察期内产蛋及淘汰情况金牌种鸡场使用四联疫苗中试产品后，鸡群淘汰率较往年同期降低了2.0％～2.6％，平均每只鸡多下蛋3～8枚；同群未免疫四联苗对照组淘汰率降低了1.8％～2.4％，平均每只鸡多下蛋2～7枚，详细数据见表6。

表6山东金牌种鸡场不同批次中试产品免疫后鸡群的产蛋及淘汰情况

3.4德州久益农牧发展有限公司鸡场试验结果

3.4.1抗体检测结果 见表7。

表7德州久益临床试验鸡群抗体检测结果

同群未免疫四联苗对照组鸡群的上述四种抗体水平呈逐渐下降趋势；免疫鸡群的新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征和禽流感(H9)亚型抗体水平首先呈上升趋势，2～3个月后，抗体水平呈缓慢下降趋势，维持期较长，抗体均匀度较好。

3.4.2德州久益新城疫及禽流感H9亚型攻毒实验结果 见表8。

表8 德州久益鸡群抽样攻毒试验

3.4.3德州久益免疫鸡群25周观察期内产蛋及淘汰情况德州久益鸡群使用四联疫苗中试产品后，鸡群淘汰率较往年同期降低了1.0％～1.3％，平均每只鸡多下蛋4～7枚；较同群未免疫四联苗对照组淘汰率降低了0.5～0.8％，平均每只鸡多下蛋3～6枚，详细数据见表9。

表9不同批次四联疫苗免疫后鸡群的产蛋及淘汰情况

4.结论

临床实验的结果表明：疫苗对鸡群无不良反应，鸡群在免疫后1个月测HI抗体水平，几何平均滴度ND为10.8～11.5log2，IB为8.8～9.2log2，EDS为9.7～10.5log2，禽流感H9为10.0～11.0log2。鸡群开产后产蛋性能良好，产蛋量与蛋壳质量正常，在6个月观察期内，免疫组死淘率较同群未免疫四联苗对照组降低0.5％～2.4％，平均每只鸡多产蛋2～7枚。由于抗原浓缩后联合制备的疫苗能保证每种抗原达到或超过单苗的抗原量，免疫后鸡群可产生较高的抗体水平，维持期较长，对强毒攻击具有较好的保护效果；同时减少了免疫次数，避免了多次免疫对鸡群的应激反应，在生产应用中证明取得了预想的结果。

本发明通过小试、实验室工作、工艺探索、中试生产、工业化扩增放大工艺流程的质量控制与验证等具体工作，结合实验室研究多批次试制产品和5个批次的工业化流水生产线中试生产，经过多批次的动物实验和田间试验，获得了大量的实验数据，实验结果的符合对比均证实，研制的“鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感(H9亚型)四联灭活疫苗(ZM10株+M41株+AV-127株+S2株)”质量确实、可靠，符合要求。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于预防鸡疾病的四联灭活疫苗，其特征在于，用鸡新城疫病毒ZM10株、传染性支气管炎病毒M41株和禽流感病毒H9亚型S2株分别接种易感鸡胚，收获感染鸡胚液；减蛋综合征病毒AV-127株接种易感鸭胚，收获感染鸭胚液；将收获的病毒液浓缩，经灭活后，再与油佐剂混合乳化制成。

2.如权利要求1所述的四联灭活疫苗，其特征在于，所述收获的病毒液中鸡新城疫病毒ZM10株的病毒液每0.1ml病毒含量≥10^8.0EID₅₀，传染性支气管炎病毒M41株的病毒液每0.1ml病毒含量≥10^6.0EID₅₀，减蛋综合征病毒AV-127株的病毒液每0.1ml病毒含量≥10^7.0EID₅₀，禽流感病毒H9亚型S2株的病毒液每0.1ml病毒含量≥10^7.5EID₅₀。

3.如权利要求2所述的四联灭活疫苗，其特征在于，所述收获的病毒液浓缩至原体积的1/4后，按ZM10株占35％、M41株占25％、AV-127株占15％、S2株占25％的体积比例混合后乳化。

4.权利要求1所述的四联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备生产用毒种：将鸡新城疫病毒ZM10株毒种、鸡传染性支气管炎M41株毒种和禽流感病毒H9亚型S2株毒种分别用灭菌生理盐水稀释后尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，36～37℃孵育48～96小时，再置于2～8℃冷却12～24小时；然后无菌收获鸡胚尿囊液，取检验无菌且对1％鸡红细胞凝集价≥9log2的鸡胚液混合作为鸡新城疫病毒ZM10株生产用毒种，检验无菌且病毒含量≥10^6.0EID₅₀/0.1ml、对1％鸡红细胞凝集试验为阴性的鸡胚液混合作为鸡传染性支气管炎M41株生产用毒种，以及检验无菌且对1％红细胞凝集价在8log2以上的鸡胚液混合作为禽流感病毒H9亚型S2株生产用毒种； 

将鸡减蛋综合征AV-127株毒种用灭菌生理盐水稀释后尿囊腔接种10～11日龄易感鸭胚，36℃～37℃孵育96～120小时，再置于2～8℃冷却12～24小时；然后无菌收获鸭胚尿囊液，取检验无菌且对1％鸡红细胞凝集价≥14log2的鸭胚液混合作为鸡减蛋综合征AV-127株生产用毒种；

(2)孵化制苗用种蛋：采用健康易感鸡种蛋和易感鸭种蛋，消毒后孵化得易感鸡胚和鸭胚，相对湿度50％～60％，每2小时翻蛋一次；

(3)制备制苗用病毒液：取上述生产用毒种，用灭菌生理盐水稀释，尿囊腔内接种10～11日龄易感鸡胚或鸭胚，36～37℃孵育48～120小时，再置2～8℃冷却12～24小时；将冷却后的鸡胚或鸭胚取出，吸取鸡胚液或鸭胚液混合后为病毒液；

(4)浓缩病毒液：将步骤(3)制得的病毒液除去大颗粒物质澄清，超滤浓缩至原体积的1/4；

(5)灭活病毒液：将浓缩后的各种病毒液，分别加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％，边加边充分摇匀，置37℃灭活16小时；

(6)制备油乳剂灭活疫苗：油相3份：1份水相乳化，其中水相为浓缩的病毒液按体积比例混合，ZM10株占35％、M41株占25％、AV-127株占15％、S2株占25％；

(7)分装：将乳化得到的疫苗分装于灭菌疫苗瓶内，密封，2～8℃保存。

5.如权利要求4所述的四联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)制得的病毒液中，鸡新城疫病毒ZM10株的病毒液每0.1ml病毒含量≥10^8.0EID₅₀，传染性支气管炎病毒M41株的病毒液每0.1ml病毒含量≥10^6.0EID₅₀，减蛋综合征病毒AV-127株的病毒液每0.1ml病毒含量≥10^7.0EID₅₀，株的病毒液每0.1ml病毒含量≥10^7.5EID₅₀。

6.如权利要求4所述的四联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中各毒种的稀释倍数分别为：新城疫ZM10株生产用毒种进行10000倍稀释，传染性支气管炎病毒M41株生产用毒种进行100倍稀释，减蛋综合征病毒AV-127株生产用毒种进行1000倍稀释，禽流感H9亚型S2株生产用毒种进行1000倍稀释接种鸡/鸭胚。

7.如权利要求4-6任一项所述的四联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中各毒种接种鸡胚或鸭胚后孵育的时间分别为：新城疫病毒ZM10株为96小时、M41株病毒为48小时、AV-127株为120小时及S2株病毒为96小时。

8.如权利要求4-6任一项所述的四联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中各毒种接种的鸡胚或鸭胚分别为：新城疫病毒ZM10株为10日龄，传染性支气管炎病毒M41株为11日龄，减蛋综合征病毒AV-127株为10日龄，禽流感病毒S2株为10日龄。

9.如权利要求4-6任一项所述的四联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中油相为注射用白油94重量份和司本-806重量份混合后，加入2重量%硬脂酸铝，高压灭菌。

10.如权利要求4-6任一项所述的四联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中在乳化时向疫苗水相中加入灭菌后的吐温-80，加入量占水相体积的4%；在乳化终止前加入防腐剂。