CN101099863B

CN101099863B - 预防鸡新城疫、传染性支气管炎和产蛋下降综合征的三联灭活疫苗的制备方法

Info

Publication number: CN101099863B
Application number: CN2006100180669A
Authority: CN
Inventors: 崔保安; 舒德广; 王学斌; 魏战勇; 徐端红; 王莉; 高文明; 张素梅
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2006-07-03
Filing date: 2006-07-03
Publication date: 2010-09-29
Anticipated expiration: 2026-07-03
Also published as: CN101099863A

Abstract

预防鸡新城疫、传染性支气管炎和产蛋下降综合征的三联灭活疫苗的制备方法，选用毒种为新城疫病毒La Sota株、传染性支气管炎病毒M₄₁株和HN₉₉肾型变异株、EDS₇₆京911株制备三联灭活疫苗，制备步骤如下：将三种病毒稀释后分别接种SPF鸡胚和易感鸭胚尿囊腔内，收取活胚和死胚的胚液作为毒种，稀释后分别接种易感鸡胚或鸭胚的尿囊腔，分别收获病毒尿囊液，然后通过超滤装置浓缩，浓缩后病毒液分别加入甲醛水溶液灭活后混合，用乳化法制成疫苗。使用三联疫苗可以做到打一针防鸡新城疫、鸡肾型和呼吸型传染性支气管炎、鸡产蛋下降综合征，减少打针次数，降低防疫成本，使用方便，经济实用。

Description

预防鸡新城疫、传染性支气管炎和产蛋下降综合征的三联灭活疫苗的制备方法

技术领域

本发明属于预防家禽传染病的疫苗，尤其涉及一种预防鸡新城疫、传染性支气管炎和产蛋下降综合征的三联灭活疫苗的制备方法。

背景技术

鸡新城疫、传染性支气管炎M₄₁株(呼吸型和HN₉₉肾型双价)、产蛋下降综合征四种传染病对养鸡业危害十分严重，目前仅有相应的单项灭活苗，如鸡新城疫灭活苗、传染性支气管炎(单价)灭活苗、产蛋下降综合征疫苗，需要单独注射，手续繁琐使用很不方便，防疫成本又高。

发明内容

本发明的目的是提供一种打一针预防四种传染病的鸡新城疫、传染性支气管炎(呼吸型和肾型)、产蛋下降综合征的三联灭活疫苗的制备方法。

本发明采用以下技术方案来实现上述目的：预防鸡新城疫、传染性支气管炎和产蛋下降综合征的三联灭活疫苗的制备方法，选用毒种为新城疫病毒La Sota株、传染性支气管炎病毒M₄₁和HN₉₉肾型变异株、EDS₇₆京911株，制备三联疫苗的步骤如下：

(1)、将新城疫病毒La Sota株，传染性支气管炎病毒M₄₁和HN₉₉肾型变异株、EDS₇₆京911株稀释后接种SPF鸡胚尿囊腔内，收取胚液作为毒种；

(2)、将La Sota株、M₄₁株和HN₉₉株、EDS₇₆京911株的毒种稀释后分别接种易感鸡胚尿囊腔，分别收获La Sota株、M₄₁株和HN₉₉、EDS₇₆京911株的鸡胚病毒尿囊液；

(3)、将病毒尿囊液浓缩；

(4)、浓缩后的4种病毒液分别加入灭活剂灭活，等量混合后乳化制成单相油乳剂灭活疫苗。

所述的乳化法为将体积份数92-95份的兽用白油、5-8份的司本-80和占兽用白油与司本-80总重量1％-3％的硬脂酸铝混合、加热熔化并灭菌后冷却为油相；将4种灭活浓缩病毒液等量混合并充分振荡，加入占其体积百分比4％-5％的吐温-80混合为水相；按水相与油相体积比1∶3-4的比例，乳化制成单相油乳剂灭活疫苗。

灭活剂为体积百分比浓度0.1％-0.2％的甲醛水溶液，灭活时间为12-24小时。

鸡肾型传染性支气管炎HN₉₉株病毒为新分离鉴定的病毒，其具有以下特征：

(1)在电镜下见有冠状病毒粒子，直径90～105nm，有囊膜，周围有长约18nm的梨状突出，呈放射状排列；

(2)、发病鸡症状除呼吸道症状外，大部份死鸡均有肾脏肿大、尿酸盐沉积、花斑肾等病变。

(3)、病毒分离物对NDV La Sota株病毒的繁殖产生干扰；

(4)、病毒分离物对1％鸡红细胞不产生凝集；

(5)、回归SPF鸡试验可出现呼吸道症状和肾肿、花斑肾等病变；

(6)、特异性血清中和结果证明，病鸡的病毒分离物与HN₉₉阳性血清呈阳性反应，而与NDV La Sota株、IBDV B₈₇株、AIV H₉N₂株均呈阴性反应；

(7)、将HN₉₉株阳性血清与EID₅₀的M₄₁株、Holte株、Gray株、T株和地方分离株湖北株、哈尔滨株、山东株、北京株、上海株、天津株等病毒做血清中和试验，结果显示，HN₉₉株阳性血清与T株、湖北株、天津株和山东株呈阳性反应，与其他株病毒均呈阴性反应。

使用三联疫苗可以做到打一针防四种病-鸡新城疫、鸡肾型传染性支气管炎、鸡呼吸型传染性支气管炎、鸡产蛋下降综合征，减少打针次数，降低防疫成本，使用方便，经济实用。疫苗安全性好，用正常剂量的4倍注射鸡，表现安全未见全身症状和局部反应。疫苗效力好，每鸡注射1羽份(0.5ml)，即能抵抗以上4种传染病的发生。HN₉₉株病毒首次于制造鸡的三联灭活疫苗，HN₉₉肾型变异株为新分离鉴定的病毒，该病毒株免疫原性良好，能有效预防鸡肾型传染性支气管炎传染病，保护率达到80～100％；该病毒株特异性强，专门预防鸡肾型传染性支气管炎，这是其他病毒株不能替代的。

本发明所述的鸡传染性支气管炎病毒株于2006年5月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏编号：CGMCC No.1729，分类命名：鸡肾型传染性支气管炎病毒，拉丁文名称为Tarpeia nephrite pulli，英文名称为Avain nephropathogenic Infectious bronchitis virusHN99 Strain，保藏单位地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮编：100080。

具体实施方式

预防鸡新城疫、传染性支气管炎和产蛋下降综合征的三联灭活疫苗的制备方法，采用以下步骤制备和检验三联灭活疫苗：

1、毒种的来源、培育及鉴定

(1)鸡新城疫病毒采用LaSota株，效检用强毒为F₄₈E₉，均由河南农业大学提供。毒种的标准及保存方法同“中华人民共和国兽用生物制品规程”(以下简称“规程”)中“鸡新城疫低毒力活疫苗制造及检验规程”1项的规定。

(2)传染性支气管炎病毒制造及检验均采用强毒M₄₁株和HN₉₉株，由河南农业大学提供。其毒力及毒种标准如下：

病毒含量 M₄₁株和HN₉₉株毒种对10日龄SPF鸡胚尿囊腔内接种的感染剂量均≥10^6.5EID₅₀/0.1ml。感染判定标准是按接种后鸡胚在24～144小时内全部或部分死亡，存活的鸡胚以胎儿出现失水、卷缩、发育小或肾肿、尿酸盐沉积等特异性病痕为标准。

免疫原性毒价≥10^6.0EID₅₀/0.1ml的M₄₁株和HN₉₉株鸡胚病毒液，经灭活后，分别按1∶3(水相∶油相)的比例制成油乳剂灭活疫苗，按每羽份免疫15日龄SPF鸡10只，1月后，连同条件相同的对照鸡10只，分别采血作HI试验，HI抗体价均≥6 log 2。

纯净毒种按“中华人民共和国兽用生物制品质量标准”(以下简称“标准”)附录301页检验，无细菌、霉菌及支原体和外源病毒污染。

特异性 M₄₁株和HN₉₉株毒种分别与M₄₁株和HN₉₉株型特异性血清中和后，接种鸡胚不引起死亡或感染。

保存在-15℃保存，湿毒保存期6个月，M₄₁株冻干毒为3年，HN₉₉株暂定为2年。冻干毒在-80℃以下保存至少10年。

(3)鸡产蛋下降综合征采用EDS₇₆京911株，由河南农业大学提供。毒种标准及毒种保存同“规程”中“鸡产蛋下降综合征灭活疫苗制造及检验规程”1项。

2、试验用鸡

三联苗安全试验、效力检验用鸡为SPF鸡或健康易感鸡。

3、攻击用强毒及攻毒方法

NDV F₄₈E₉株强毒，用前以SPF鸡胚传2代，毒价ELD₅₀为10^-7.0/0.1ml，肌肉或皮下注射，攻毒剂量为10⁵ELD₅₀。

IBV M₄₁株强毒，用SPF鸡胚传2代，其毒价≥10^6.5EID₅₀，对1～7日龄SPF雏鸡，以10倍稀释的强毒气管内滴入0.2ml，观察10天，80％以上的雏鸡出现典型的支气管炎等症状为发病标准。

IBV HN₉₉株强毒，对鸡胚的毒价≥10^6.5EID₅₀。对1～7日龄SPF雏鸡，以10倍稀释后，气管内滴入0.2ml，观察10天，80％以上的雏鸡出现咳嗽，甩鼻等支气管炎症状，或解剖后有肾肿、尿酸盐沉积等发病症状。

4、EID₅₀、HI、HA测定方法

HI、HA测定方法参照“规程”附录40页，EID₅₀的测定方法同“规程”附录47页。

5、制苗用毒种制备和生产用种子批的建立

(1)NDV LaSota株制苗用毒种制备和种子批的建立同“规程”中“鸡新城疫低毒力活疫苗制造及检验规程”的2.1项。

(2)IBV M₄₁株和HN₉₉株的制苗用毒种制备和种子批的建立。

毒种繁殖将毒种分别用灭菌生理盐水稀释100倍，尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。接种后30～72小时，收取活胚和死胚胚液，选择经检验无菌，对鸡胚毒价≥10^6.5EID₅₀，对1％鸡红细胞凝集试验为阴性的胚液作毒种用，注明收获日期、毒种代次。

毒种鉴定按上述项目进行，应符合规定。

毒种保存在-15℃以下条件，使用期不超过3个月。

毒种继代不超过3代。

(3)EDS₇₆京911株制苗用毒种制备和生产用种子批的建立。同“规程”中“鸡产蛋下降综合征灭活疫苗制造及检验规程”第2.1项。

6、制苗用病毒液的制备及检验

(1)NDV LaSota株病毒液的制备及检验同“规程”中“鸡新城疫低毒力活疫苗制造及检验规程”2.2、2.3、2.4项。

(2)IBV M₄₁株和HN₉₉株病毒液的制备及检验

制苗用材料选择发育良好的10～11日龄易感鸡胚作为制苗用材料。

鸡胚接种将M₄₁株和HN₉₉株毒种分别用灭菌生理盐水稀释至10^-2～10^-3，分别接种易感鸡胚尿囊腔，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置37℃继续孵育，停止翻蛋。

孵育与观察鸡胚接种后，30小时前照蛋1次，弃去死胚，以后每隔4～8小时照蛋一次，死亡的鸡胚随时挑出，至72小时不论死亡与否，全部取出，气室向上，置于2～8℃。冷却12～24小时。

收获分别收获M₄₁株和HN₉₉株鸡胚液。将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌方法剥除气室部位卵壳，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取鸡胚液，每若干个胚的胚液混合为一组，置于灭菌瓶中，每毫升加入青霉素、链霉素各1000单位，放2～8℃感作4～12小时。

在收获胚液的同时应逐个检查鸡胚，凡胎儿腐败，胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用。

鸡胚病毒液的检验经处理后的M₄₁株和HN₉₉株鸡胚病毒液，分别按照“规程”附录50页进行无菌检查(可不移植)，应无菌生长；胚液对1％鸡红细胞应无凝集；对10日龄易感鸡胚尿囊腔内接种EID₅₀应≤10^-6.0/0.1ml。符合以上规定的方可作为制苗用病毒液。

(3)EDS₇₆京911株病毒液的制备及检验

制苗用材料选择发育良好的9～10日龄的易感鸭胚作为制苗材料。

接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水稀释至10^-2～10^-3，每胚尿囊内接种0.1ml，接种后将针孔用蜡封闭，置37℃静置孵育。

孵育与观察鸭胚接种后，弃去72小时前的死胎，72小时后，每4-8小时照蛋一次，死亡的鸭胚随时取出，直至120小时，不论死活，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却。

收获将冷却12～24小时的鸭胚取出，用碘酊消毒气室部位，以无菌手术吸取胚液(尿囊液和羊水)，置于灭菌室器中，每若干个胚的胚液混为一组，置2～8℃沉淀，去除下部沉淀液。

在收获的同时，应逐个检查鸭胚，如胎儿腐败，胚液混浊者，弃去不用。

血凝价或毒价测定将以上收获的胚液取样，测定血凝价(“规程”附录439页)，HA应≥1∶10240倍，或测定对鸭胚成纤维细胞的TCID₅₀，应达到10^-6.0/ml。

7、病毒液的浓缩与灭活

(1)浓缩设备

使用美国密理博公司的MINI-PELLICON标准超滤设备。该设备由两部分装置组成。其一是病毒尿囊液预过滤装置，此装置使用平板式293圆盘过滤器，该滤器用316L不锈钢制造，全不锈钢接口。运行成本低，病毒液残留体积很小，可夹持预过滤及除菌过滤膜数片。由于NDV LaSota株和M₄₁株、HN₉₉株鸡胚尿囊液、EDS₇₆京911株鸭胚尿囊液的黏度高，采用常规的除菌滤膜流量很低，时间长会导致病毒液丢毒，因此，使用0.45μm孔径的MILLIPORE的AP2529325型号专用预过滤膜，对病毒尿囊液进行粗滤，可滤除尿囊液中的杂质和很多微生物。结合生产后期的病毒灭活步骤，可达到无菌效果。其二是病毒液超过滤浓缩装置，该装置使用316L不锈钢膜包夹具及管路，全部采用卫生接口，内外表面电抛光处理。动力装置使用不锈钢蠕动泵和硅胶蠕动泵管。超滤浓缩使用分子量为500K～800K的超滤膜包，可截留ND、IB、EDS₇₆等病毒粒子。此超滤膜包采用低蛋白吸附改良纤维材料，其蛋白吸附量仅为国际通用的聚醚砜材料的1/4～1/5。本超滤装置的进液口和回流口及透过口均配有隔膜压力表及隔膜阀，可控制系统的压力，保证超滤浓缩过程的安全和高效。同时膜包夹具为直立式结构，系统排放容易，残留体积小，再加上最后用灭菌生理盐水冲洗、顶洗病毒液，使病毒液损耗极小。

(2)超滤浓缩工艺方法

粗滤：将病毒尿囊液先用灭菌的100目/cm²的不锈钢漏斗滤过，除去大颗粗杂质。或用3000～5000rpm/min的离心机离心30min，去除沉渣，吸取上清夜至一消毒的容器内。

预过滤：将293园盘平板滤器及管道等高压蒸汽消毒(121℃30min)，然后装入10μl的微孔滤膜，把盛有病毒液的容器通过管道与滤器连接充入除菌的空气加压后，(一般控制在0.05μpa)，病毒液在一定压力下通过平板滤器的滤膜，从出口流出。用消毒的容器收集从平板滤器滤过后流出的病毒液，完成预过滤。

超滤浓缩：先将装有5～8万道尔顿微孔滤板的超滤装置用蒸馏水反复冲洗干净，然后用2N浓度的氢氧化钠溶液浸泡过夜12小时以上，直至排出的洗液PH近中性，使用时先用消毒的蒸馏水反复冲洗，将NaOH冲洗干净，直至排出冲洗液的PH值近中性。然后将预过滤的病毒液容器通过消毒管道与超滤装置连接，开启蠕动泵，使其流量达到4L/分钟，这样高的流速保证超滤膜包较长的使用寿命和最佳的超滤效果。经超滤浓缩的病毒液盛入密闭的容器内，并反复循环通过超滤装置，直至达到要求的浓缩终点。

(3)浓缩效果测定四种病毒浓缩前和浓缩后，用测血凝价HA或EID₅₀、TCID₅₀等方法进行检查，并确定浓缩终点。浓缩终点的确定以抗原量表示如下：

NDV浓缩终点的确定：三联苗中LaSota株的浓缩终点的病毒含量应≥4×10^8.0EID₅₀，HA应≥1∶2560。

IBV M₄₁株和HN₉₉株浓缩终点的确定：三联苗中M₄₁株或HN₉₉株的浓缩终点的病毒含量应为≥4×10^6.0EID₅₀。

EDS₇₆V浓缩终点的确定：三联苗中京911株浓缩终点。病毒含量应为对DEF应≥4×10^6.7TCID₅₀；HA应≥1∶40960。

四种病毒液按上述浓缩终点进行浓缩，浓缩后的病毒应达到浓缩终点的要求，同时对浓缩过程中的废弃液应随时抽样进行检查，检查其EID₅₀、HA价或TCID₅₀等均应为零值。

表1三联苗四种抗原ND、IB(M₄₁株和HN₉₉株)EDS₇₆株病毒液浓缩效果试验：

(4)浓缩病毒液的灭活与检验：浓缩后的四种病毒液，分别加入10％的甲醛(分析纯)，使其最终浓度为0.1％，当苗温升至37℃时开始计算灭活时间，共灭活16小时。灭活后的4种病毒液，分别接种SPF鸡胚、易感鸭胚和鸭胚成纤维细胞，进行HA、EID₅₀、TCID₅₀测定，证明病毒已彻底灭活。同时按“规程”P50页方法作无菌检验。证明无细菌生长者，方可作为制苗抗原。

8、三联苗的乳化与分装

(1)油相制备：兽用白油为杭州炼油厂生产，司本-80为上海大众制药厂生产，硬脂酸铝为上海远航化工厂生产。以上三种成份混合、加热熔化至透明，经高压灭菌后冷却备用。

(2)水相制备：经检验合格后的4种灭活浓缩病毒液，等量混合并充分振荡均匀，加入灭菌冷却后的吐温-80(上海大众制药厂生产)，混合均匀备用。

(3)疫苗的乳化：应用“规程”(P84～85)方法，把水相、油相混合后用胶体磨或与匀浆泵配合使用的方法，进行乳化。

乳化工具：胶体磨JTM50为沈阳新光机械厂制造，匀浆泵为上海东华机械厂制造。使用前先用0.5％甲醛溶液浸泡消毒8小时以上，用前以灭菌的热蒸馏水冲洗干净。用后用热水反复冲洗，彻底消除残留油苗。

具体乳化法为将体积份数92-95份的兽用白油、5-8份的司本-80和占兽用白油与司本-80总重量1％-3％的硬脂酸铝混合、加热熔化并灭菌后冷却为油相；将4种灭活浓缩病毒液等量混合并充分振荡，加入占其体积百分比4％-5％的吐温-80混合为水相；按水相与油相体积比1∶3-4的比例，乳化制成单相油乳剂灭活疫苗。

各实施例具体成分配比如下：

	实施例1	实施例2	实施例3
	实施例1	实施例2	实施例3	兽用白油	92	94	95
司本-80	8	6	5	兽用白油	92	94	95
司本-80	8	6	5	硬脂酸铝	1％	2％	3％
吐温-80	4％	4.5％	5％	硬脂酸铝	1％	2％	3％
吐温-80	4％	4.5％	5％	水相∶油相 (体积比)	1∶3	1∶3.5	1∶4

9、三联苗的实验室检验：从实验室试制的三联苗中选择三批疫苗分别作如下试验。

(1)三联苗的物理性状检验：

A、剂型：将三批三联苗滴于冷水表面，不分散为W/O型，分散为O/W型。

B、粘度：用出口内径1.2毫米的1ml吸管，在室温条件下吸取1ml三联苗，计算垂直放出0.4ml所需的时间。

C、稳定性：将三联苗以3000rpm离心15分钟，观察疫苗分层情况。将疫苗放37℃条件下经21天，观察疫苗分层情况。

(2)无菌检验：按“规程”附录50页的方法对三批三联苗进行无菌检验。

(3)安全试验：用15日龄的SPF鸡，肌肉注射三联苗2ml(4羽份)，观察二周，并进行解剖，记录试验鸡的反应情况和剖检情况。

(4)效力检验：

ND效力检验：每批疫苗用1月龄易感鸡15只(ND HI＜1∶4，EDS₇₆HI＜1∶4)，其中10只各皮下或肌肉注射三联苗20μl，另5只不免疫作为对照，3周后，每只鸡肌肉注射ND强毒F₄₈E₉/E2，剂量为10⁵ELD₅₀，观察14天，记录免疫鸡与对照鸡存活与死亡情况。

IB效力试验：每批疫苗用3周龄SPF鸡16只，皮下或肌肉注射三联苗一羽份(0.3ml)，另外8只不免疫作为对照。三周后其中8只免疫鸡连同对照鸡4只，气管内滴入M₄₁强毒病毒液(EID₅₀≥10^6.5/0.1ml)0.2ml，观察1周，记录免疫鸡与对照鸡的反应和死亡情况。另外8只免疫鸡和4只对照鸡气管内滴入HN₉₉株强毒病毒液(EID₅₀≥10^6.5/0.1ml)0.2ml，观察1周，记录免疫鸡与对照鸡的反应和死亡情况。

EDS₇₆效力试验：每批疫苗接种3周龄易感鸡10只，每只肌肉或皮下注射苗0.5ml(1羽份)，同时设同条件不接种疫苗的对照鸡10只，上述各组免疫鸡观察21天后，采血测定HI抗体。

(5)三联苗的实验室检验结果

三联苗物理性状检验结果

剂型：0203～0205三批三联苗检验样品滴于冷水表面，基本不分散，为W/O(油包水)型。

粘度：用出口内径1.2毫米的1毫升吸管，在室温条件下吸取1ml三联苗，垂直放出0.4ml所需的时间分别为0.8和0.7秒，符合“规程”中“鸡新城疫灭活疫苗制造及检验规程”中关于油乳剂的粘度要求。

稳定性：三批三联苗以3000rpm离心30分钟，疫苗不分层、不破乳。符合“规程”要求。37℃放一个月不分层，二个月疫苗表面有2mm左右的油层，摇荡后即成均匀的乳剂。结果如表2。

表2三联苗物理性状检验结果

无菌检验结果按“规程”附录50页的方法对三批三联苗进行无菌检验，结果均无菌生长，如表3。

表3三联苗无菌检验结果

安全试验结果用15日龄的SPF鸡，肌肉注射三联苗2ml(4羽份)。疫苗注射后部分试验鸡出现短时间精神不振，1～2小时后即恢复正常。共观察3周，所有试验鸡精神良好，吃喝正常。三周后捕杀，所有脏器未见异常变化。注射局部有少量未吸收的疫苗，但无肿胀溃烂。试验证明疫苗安全，结果如表4。

表4三联苗安全检验结果

注：“-”表示无反应，“±”表示有少量未吸收疫苗。

效力检验结果对0203、0204、0205三批三联苗进行了效力检验，结果如表5。

表5三联苗效力试验

注：攻毒剂量：

ND为F₄₈E₉-E₂，ELD₅₀为10^-7.7/0.1ml，稀释500倍，肌肉注射0.1ml。

M₄₁株EID₅₀为10^-7.0/0.1ml，10倍稀释后气管内注射器0.2ml。

HN₉₉株EID₅₀为10^-6.5/0.1ml，10倍稀释后气管内注射器0.2ml。

表5的结果表明，3批三联苗新城疫部分用1月龄易感鸡10只，每鸡注射疫苗20μl，其中肌肉和皮下注射各5只，以比较肌肉注射和皮下注射二种方法的免疫效果。免疫3周后，免疫鸡和未免疫的对照鸡一起攻击F₄₈E₉鸡胚尿囊液强毒10⁵ELD₅₀(ELD₅₀为10^-7.7/0.1ml，实际攻毒量为500倍稀释0.1ml)观察14天，结果3批三联苗新城疫免疫鸡均保护10/10，对照鸡死亡5/5，达到“规程”和“标准”的规定标准，也说明用肌肉注射和皮下注射的新城疫免疫效力相同。

3批三联苗传支M₄₁部分和HN₉₉部分，分别按照“标准”的方法，每批三联苗用3周龄SPF鸡对M₄₁和HN₉₉分别免疫注射8只鸡，其中肌肉和皮下注射各4只。免疫3周后，免疫鸡和对照鸡一起，分别攻击M₄₁株和HN₉₉株强毒鸡胚尿囊液。10倍稀释后气管内注射0.2ml。因为传支攻击后的发病症状不易观察，因此试验鸡攻毒后应施行冷刺激，方法是气管内注射0.2ml，攻击后从18小时开始，往隔离器内充入低于室温的冷空气，每天充2次，每次10-15分钟。冷空气吹入后仔细观察免疫鸡和对照鸡有无咳嗽、甩头等典型的支气管炎症状。观察14日，M₄₁免疫鸡有1批(0204批)全部保护，其余2批均保护7/8，其中0203批肌肉注射保护4只，皮下注射保护3只；0205批肌肉注射保护3只，皮下注射保护4只，二者保护数基本一致。HN₉₉免疫鸡均保护8/8，对照3/4发病。3批三联苗传支M₄₁和HN₉₉部份的效检结果均达到了“标准”中的规定标准。也说明传支效检中肌肉注射和皮下注射的免疫效果基本一致。

3批三联苗EDS₇₆部分，按照“标准”P65的方法进行检验。每批三联苗用30日龄健康易感鸡(HI为1∶2)10只，每只注射三联苗0.5ml(肌肉和皮下注射各5只)。三周后免疫鸡和同条件的对照鸡10只采血分离血清，测定HI抗体价，结果对照鸡抗体HI为1∶4，肌肉和皮下注

射的免疫鸡HI抗体价平均值均一致：0203批为7.5 log 2(1∶181)、0204批为8.5 log 2(1∶362)、0205批为7.5 log 2(1∶181)，均达到并超过了“标准”中1∶128(7 log 2)的规定。同时也证明了三联苗肌肉注射与皮下注射的EDS₇₆抗体价是一致的。

10、三联苗不同免疫剂量试验

(1)材料与方法

试验用疫苗0203批、0204批、0205批三联苗

试验用鸡三周龄SPF鸡，由SPAFAS济南SPF鸡场供给。

一月龄易感鸡，由河南农业大学种鸡场提供，NDHI为1∶4，EDS₇₆HI为1∶2。

攻毒用强毒同上项第2.6.4项。

ND HI、EDS₇₆HI抗体测定方法

试验方法三联苗0203、0204、0205三批疫苗，分别用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml的剂量。颈部皮下注射试验鸡。每个剂量免疫鸡数：ND部分10只一月龄易感鸡，IBM₄₁和HN₉₉各8只三周龄SPF鸡，EDS₇₆部分10只一月龄易感鸡，同时用条件相同的对照鸡同条件饲养。免疫21天后，ND、EDS₇₆试验鸡采血，测定NDHI和EDS₇₆HI。ND试验鸡攻击10⁵ELD₅₀的F₄₈E₉-E₂代鸡胚尿囊液强毒，IB部分分别攻击EID₅₀≤10^-6.5/0.1ml的M₄₁株和HN₉₉株强毒鸡胚尿囊液。攻毒后观察14天，记录结果。

(2)试验结果 3批三联苗不同免疫剂量试验结果如表6。

表6三联苗不同免疫剂量试验

上述3批三联苗分别用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml的剂量，免疫注射试验鸡，21天后攻击ND、IBM₄₁和HN₉₉强毒，EDS₇₆测定HI抗体。结果表明，3批三联苗ND部分，0.1ml剂量分别保护10/10、9/10、9/10，0.2ml剂量均9/10保护，0.3ml剂量分别保护10/10、10/10、9/9(未攻毒前非特异性死亡1只)，0.4ml和0.5ml剂量均10/10保护，而对照5/5死亡。以上结果表明，0.1～0.5ml不同免疫剂量，ND部分免疫效力均达到了国家“标准”的规定。

3批三联苗IB部分试验鸡分别攻击M₄₁株和HN₉₉株强毒，结果免疫0.1ml剂量的M₄₁免疫鸡分别保护7/8、8/8、6/8，HN₉₉免疫鸡分别保护6/8、6/8、8/8，免疫0.2ml剂量的M₄₁免疫鸡均8/8全保护，HN₉₉免疫鸡分别保护8/8、6/8、8/8，免疫0.3ml剂量的M₄₁免疫鸡分别保护7/8、8/8、8/8，HN₉₉免疫鸡分别保护8/8、7/8、6/8。免疫0.4ml和0.5ml剂量的M₄₁株和HN₉₉株均8/8保护。各剂量攻毒的对照鸡M₄₁株和HN₉₉株均4/4发病。以上结果表明，各剂量免疫保护数虽与免疫剂量不完全呈规律性的正比关系，但各个剂量的免疫结果均达到了“标准”的规定。

3批三联苗EDS₇₆部分的试验鸡，均采用测定HI抗体的方法衡量免疫效果。从表10的结果看，各个免疫剂量的所有试验鸡HI均在7 log 2(1∶128)以上，而对照鸡HI为1∶4，以上结果均达到了“标准”中的规定(1∶128)。

11、三联苗实验室试制结果与讨论

(1)IBV M₄₁株和HN₉₉株基础种毒代数为最高代次E₅，生产用种毒为最高代次第3代；冻干毒在-18℃以下，保存期至少3年，生产用毒种(鸡胚病毒液)在-15℃以下保存，不超过6个月。

(2)三联苗制苗用病毒液的制备按照前述方法制备出了合乎要求的NDV、IBV(M₄₁株、HN₉₉株)、EDS₇₆V等四种病毒液。经测定，NDV LaSota株鸡胚尿囊液的病毒含量≥10^8.0EID₅₀，HA≥1∶640；IBV M₄₁株、HN₉₉株鸡胚尿囊液的病毒含量≥10^6.0EID₅₀；EDS₇₆京911株细胞病毒液的血凝价HA≥1∶10240倍。四种病毒液经无菌检验均无菌生长，符合制苗的要求。

(3)三联苗三种病毒液的浓缩试验结果

三联苗中四种病毒液用美国密里博超滤装置浓缩病毒的工艺是可行的。选用适宜孔径的超滤膜包(20～30KDa)，用测定病毒含量或HA的方法，按照预先设计的浓缩终点，可以达到浓缩NDV、IBV、EDS₇₆四种病毒液的目的。浓缩后的废弃液，采用检查EID₅₀、TCID₅₀和HA价的方法，证明浓缩后的排放液中不含病毒，浓缩效果较为理想。

(4)三联苗浓缩病毒液的灭活试验证实，四种浓缩病毒液，采用0.1％甲醛溶液，在37℃条件下灭活16小时后，LaSota株、M₄₁株、HN₉₉株病毒灭活液10倍稀释接种鸡胚，EDS₇₆京911株病毒液10倍稀释接种鸭胚，结果鸡胚和鸭胚在规定时间内，全部健活，解剖后收取胚液，测定Lasota株、京911株胚液的HA为阴性，测定M₄₁和HN₉₉株胚液的EID₅₀均为零，四种病毒液经灭活后均失去活性，证明灭活彻底。

12、三联灭活疫苗田间试验

田间试验中使用的产品批数、批号：3批，0203、0204、0205三批

试验时间和地点：郑州市荥阳鸡场2002年6月份

主要试验内容和结果：三批三联苗分别免疫罗曼90日龄和210产蛋鸡各1000只，每只肌肉注射0.5ml。注射后共观察14日，所有注射鸡均无全身症状出现，吃食、饮水正常，210日龄产蛋鸡产蛋率未受影响。少数鸡因注射时抓鸡有应激反应，当天不产蛋，但次日即恢复正常。所有免疫鸡的注射部位反应正常，无红肿或溃烂现象。说明三批三联苗对开产前母鸡和正在产蛋的鸡使用后无不良的全身症状和局部症状出现，产蛋率不受影响。试验证明，三批三联苗使用安全。

三批三联苗免疫后第三周，采血测定抗体，ND HI(log 2)由原来的7.0～8.25升至9.0～11.5，EDS₇₆HI由4 log 2升至8.0～9.5log2，IB中和抗体价由原来的1∶8升至1∶16～1∶32。试验证明，三批三联苗免疫三周后，ND HI、EDS₇₆HI、IB中和抗体上升到较高的水平。4个月后回访客户，免疫鸡均未发生ND、IB和EDS₇₆这三种传染病。

三批三联苗免疫非免疫雏鸡各500只，每鸡注射0.3ml，注射后观察14日，所有免疫鸡均未出现任何全身症状和局部症状，免疫雏鸡饮食、精神正常，发育正常，注射部位未有红肿、溃烂等异常情况，证明三联苗对雏鸡安全性良好。

上述三批三联苗免疫雏鸡二周后按“规程”和“标准”的方法，分别用NDV F₄₈E₉强毒10⁵ELD₅₀的剂量和IBV M₄₁株和HN₉₉株强毒尿囊液0.2ml分别以肌肉注射和气管滴入法进行攻击，EDS₇₆采血测定HI，结果三批三联苗ND免疫雏鸡均全保护，对照死亡5/5，传支M₄₁和HN₉₉的HI抗体价均≥6 log 2，证明三联苗对雏鸡免疫效果较好。

13、三联苗灭活疫苗中试生产结果：

按照“农业部兽用新生物制品管理办法”的要求，在北京市兽医生物药品厂进行了三联苗的中间试产，共试制三联苗6批(0401～0406批)，并参照“中华人民共和国兽用生物制品规程”(以下简称“规程”)和“中华人民共和国兽用生物制品质量标准”(以下简称“国标”)的要求对6批疫苗进行了安全试验、效力试验、物理性状检测、无菌检验等检测，各项检验结果均达到了“规程”和“国标”的要求。产品检验结果如表7、8、9。

表7三联苗中试物理性状检验及无菌检验

表8三联苗中试安全检验

注：(-)表示无异常反应。

表9三联苗中试生产效力检验

14、三联灭活疫苗大面积区域试验

用中试生产的5批疫苗，在河南省鹤壁、南阳、漯河等地市5个种鸡场，进行了大面积区域性试验，共注射开产前种鸡和产蛋鸡46500只，品种有罗曼、海兰、肉种鸡、三黄种鸡。注射后观察2～3周精神、采食、饮水、产蛋均正常，注射局部无肿胀、溃烂等异常反应，疫苗安全性良好。注射后ND HI(log 2)由6～9上升至10～13。EDS₇₆HI(log2)由4～6上升至8～10，用户反应使用该“三联多价苗注射后反应小、效果不错”“安全可靠”，“一针防多种病，方法简便，经济实用”。详细结果见表10。

表10三联苗区域性试验情况

Claims

1.预防鸡新城疫、传染性支气管炎和产蛋下降综合征的三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，选用毒种为新城疫病毒La Sota株、传染性支气管炎病毒M₄₁和HN₉₉肾型变异株、EDS₇₆京911株，制备三联疫苗的步骤如下：

(3)、将病毒尿囊液浓缩；

2.如权利要求1所述的预防鸡新城疫、传染性支气管炎和产蛋下降综合征的三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的乳化法为将体积份数92-95份的兽用白油、5-8份的司本-80和占兽用白油与司本-80总重量1％-3％的硬脂酸铝混合、加热熔化并灭菌后冷却为油相；将4种灭活浓缩病毒液等量混合并充分振荡，加入占其体积百分比4％-5％的吐温-80混合为水相；按水相与油相体积比1∶3-4的比例，乳化制成单相油乳剂灭活疫苗。

3.如权利要求1所述的预防鸡新城疫、传染性支气管炎和产蛋下降综合征的三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，灭活剂为体积百分比浓度0.1％-0.2％的甲醛水溶液，灭活时间为12-24小时。