CN101380470B - 一种猪细小病毒活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪细小病毒活疫苗。本发明所涉及的猪细小病毒ZH株(CGMCC No2702)是一株与NADL-2具有极高的同源性、保持高的增殖力，病毒含量明显高于原始毒株而且稳定，具有更好的免疫原性。以该毒株作为活疫苗生产毒株制备的疫苗，超剂量接种怀孕30～50天的妊娠母猪、单剂量3次重复接种后备母猪、超剂量疫苗(10倍使用剂量)接种后备母猪，均未发现任何异常反应；免疫猪细小病毒活疫苗的母猪所产仔猪获得母源抗体维持期为50天。疫苗毒不能水平传播。

Description

一种猪细小病毒活疫苗

【技术领域】

本发明涉及一种猪细小病毒活疫苗，属于微生物学动物用生物制品领域。

【背景技术】

猪细小病毒病是由猪细小病毒(Porcine Parvovirus-PPV)感染而引起的胚胎感染及死亡，而母猪不表现明显症状的繁殖障碍性疾病。本病广泛分布于世界各地，给养猪业造成巨大的经济损失。猪细小病毒是一种非常顽固的病原，该病会导致传染性不孕，是一种特别常见而且特别重要的疾病。猪细小病毒在猪的小肠中繁殖，通常不表现临床症状。世界各地均有分布，如果在猪场里取样化验，大多会检测到这种病原，这种病毒在环境中可存活数月之久，且对大多数消毒剂都具有抵抗力，因此，这种病分布非常广泛，且很难根除。至今各地分离到的PPV经血凝抑制(HJ)试验及血清中和(SN)试验证明，同属一个血清型。

猪细小病毒(PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一。PPV病的主要传染源是感染了PPV的母猪。仔猪、胚胎主要是被感染PPV的母猪在其生产前经胎盘或在其生产后经口垂直感染。公猪、育肥猪主要是通过被污染的食物、环境，经呼吸道、消化道感染。初产母猪主要是经PPV阳性公猪交配时感染。

该病在我国污染十分严重，阳性率为90％以上，几乎很难找到一个PPV阴性的猪场，说明PPV病是普遍存在的。正由于猪细小病毒感染面广且感染后造成严重的经济损失，许多学者进行了猪细小病毒病诊断防治的研究。

疫苗接种是预防PPV感染，提高母猪繁殖率的有效方法。一般的免疫程序为：在母猪配种前2～4周，颈部肌肉分点注射疫苗；种公猪于8月龄时首次免疫接种，以后每年一次，每次颈部肌肉分点注射疫苗。在猪体内被动免疫水平很低的情况下接种灭活苗，不会影响其免疫力，当第二次免疫接种时，PPV疫苗可提供良好和持久的免疫应答，以对抗PPV感染引起的繁殖障碍。因此，研制出一种简单、实用、有效的PPV疫苗成为各国专家学者共同努力的目标。目前已经研制出并大规模使用的疫苗有灭活疫苗和弱毒细胞培养冻干活疫苗。此外，随着免疫学和分子生物学的日益发展，也有许多正在研制的或有发展前景的新型疫苗。

在国外Paul PS，Mengeling WL(Am J Vet Res，1980，41：2007-2011)，FujisakiY，Kurikami Y(Natl Inst Anim Health(Tokyo)，1982，22:36-37)，先后研制出弱毒疫苗。Paul和Mengeling的PPV毒株NADL-2是最先应用于临床的弱毒疫苗株，该毒株通过PFK(Porcine fetal kidney)细胞培养制苗，每代培养物用免疫荧光显微法、血细胞凝集试验来检查PPV的感染。血凝效价的范围在2～512，而细胞感染率的范围在5％～80％；用于制苗的54代PPV培养物的感染效价为10⁶CCID₅₀/ml；血凝效价为64/0.5ml。因PFK(Porcine fetal kidney)细胞的制备涉及到猪，其猪源及质量直接影响到所制备细胞的品质。

【发明内容】本发明的目的：是通过利用蚀斑纯化技术对上世纪80年代从美国引进的一株猪细小病毒弱毒NADL-2株中，克隆出一株具有良好免疫原性和安全性的小蚀斑病毒，通过在传代细胞中的培养，以工厂化生产方法生产出安全、有效的预防猪细小病毒活疫苗。

本发明用经过克隆纯化的猪细小病毒ZH克隆株病毒通过接种对其敏感的传代细胞单层细胞，37℃培养5～6天，当80％以上的细胞出现细胞病变时，收获病毒细胞培养物；将收获病毒细胞培养物经荧光抗体法测定，0.1ml病毒含量应≥10^6.0FA-TCID₅₀、含毒病毒液对1％豚鼠红细胞血凝价应≥1：256为合格；将收获病毒细胞培养液加入常规的冻干保护剂，充分混合后分装后经冷冻干燥而制成冻干活疫苗。

【具体实施方案】

1.毒种克隆纯化

猪细小病毒弱毒株NADL-2病毒(中国兽医药品监察所提供)在琼脂糖作为覆盖物的传代细胞株ST细胞(中国兽医药品监察所提供)上形成了大、中、小三种蚀斑，从中筛选到符合我们要求的小蚀斑克隆株：能在ST细胞上产生明显细胞病变(CPE)、高增殖力的弱毒株，并命名为猪细小病毒ZH株(Porcine Parvovirus ZH，本菌株已于2008年10月13日送交北京市大屯中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No2702)。

2.猪细小病毒ZH株的特性

(1)蚀斑形状接种后96～120h，出现肉眼可见的蚀斑。蚀斑形态较规则，略呈圆形，斑径约为1mm以下的小蚀斑。

(2)蚀斑培养物病毒含量测定

1)TCID₅₀测定ZH株培养物的病毒滴度平均为10^5.9TCID₅₀/0.1ml，而原始毒株、大蚀斑和中蚀斑培养物的病毒滴度分别为10^4.5～5.0TCID₅₀/0.1ml、10^5.1TCID₅₀/0.1ml和10^5.3TCID₅₀/0.1ml。

2)FA-TCID₅₀测定用细胞生长液【含10％犊牛血清的细胞生长液(MEM培养基和犊牛血清购自美国HYclone公司)】将ZH株培养物作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-73个稀释度病毒液，与ST细胞同步接种细胞“飞片”(飞片：在细胞培养瓶中放置的用于培养单层细胞的1/2块盖玻片)，每个滴度4管，每孔加病毒稀释液100μL、ST细胞悬液900μL。同时设病毒阳性对照和细胞阴性对照，37℃培养72～96小时，用荧光抗体法计算FA-TCID₅₀。每0.1ml病毒含量应≥10^6.0FA-TCID₅₀。

(3)病毒粒子形态

在病毒培养物中观察到直径为22nm圆形或六角形的病毒粒子。

(4)理化特性测定结果

病毒在50℃和55℃水浴作用30min，增殖滴度无明显变化，70℃水浴作用30min增殖滴度有较大的下降，而75℃和80℃水浴作用30min感染性完全丧失；56℃作用15min、30min感染力无显著下降，作用45min时开始下降，而作用60min时增殖滴度有较大的下降。

ZH株病毒对酸碱的敏感性不强，能耐受pH3.0～9.0的环境。

ZH株病毒不但对胰蛋白酶不敏感，而且胰蛋白酶处理后病毒的增殖滴度还略有升高。

(5)病毒的血凝性

ZH株病毒能够凝集豚鼠的红细胞，血凝价可达1:2⁹；该病毒血凝特性能够被特异性兔抗猪细小病毒阳性血清(购自中国兽医药品监察所)所抑制，中和后再接种ST传代细胞，37℃培养未出现病变，盲传2代，也无病变产生。

(6)病毒非结构蛋白NS1基因的扩增和序列鉴定

以提取病毒基因组复制型DNA为模板，用设计的P1和P2引物扩增出了大小约为1.98k的条带，结果与预期的大小一致，而正常对照细胞中未扩增出目的条带。扩增产物的电泳结果见附图1。

将其目的条带回收，与pGEM-T Easy载体(购自Promega公司)连接，转化至TOP10(购自Promega公司)，提取质粒，酶切鉴定结果见附图2，然后阳性质粒送英骏公司测序，结果得到了与预期一样大小的1.98kb序列。将测得的序列，运用生物学软件DNAMAN(Lynnon Biosoft)进行比对，结果与NADL—2标准株有99.38％的同源性。

(7)病毒增殖稳定性

对克隆筛选的ZH株在ST细胞上传代的第1代、3代、5代分别进行病毒的TCID₅₀检测和稳定性试验。结果分别为10^5.8TCID₅₀/0.1ml、10^6.7TCID₅₀/0.1ml、10^5.9TCID₅₀/0.1ml，表明猪细小病毒ZH株经传5代，依然稳定，产生CPE明显，仍保持高的增殖力。

(8)安全性

1)对乳鼠的安全性选取4～7日龄的乳鼠5只，每只皮下注射病毒液0.1ml。并设不接种的乳鼠5只作为对照，观察7日。乳鼠应不出现因接种病毒导致的不良反应。

2)对妊娠母猪的安全性取怀孕30～50日龄PPV抗体阴性(血清HI抗体≤1:8)的初产妊娠母猪4头，各肌肉注射病毒液2ml。连续观察21天，应无任何异常；一直观察到分娩，应无流产、早产、死胎、弱仔等临床症状表现，从其所产全部胎儿的血液或脏器中均不能分离出病毒。

(9)免疫原性

按本发明所制订的猪细小病毒活疫苗的制备方法，将病毒制成疫苗后进行试验。

1)用初产后备母猪5头(PPV HI抗体≤1∶8)(HI的测定方法见附注)，配种前肌肉注射疫苗1头份，在妊娠30～50天时，连同条件相同的对照猪4头，28天后肌肉注射猪细小病毒强毒株10^6.0FA-TCID₅₀，观察至分娩。对照猪应至少3头出现流产、死胎、木乃伊胎或胎儿重吸收等繁殖障碍症状，免疫猪应至少保护4头。

2)将疫苗经颈部肌肉注射5月龄健康易感猪(PPV HI抗体≤1∶8)4头，每头1头份，接种后28天连同条件相同的对照猪3头，分别采血，分离血清，测定血清HI抗体水平。对照猪HI效价均应≤1∶8，免疫猪至少有3头HI效价≥1∶128。

3)最小免疫剂量猪细小病毒活疫苗(ZH株)的4种不同剂量(10^4.8FA-TCID₅₀/头份、10^4.5FA-TCID₅₀/头份、10^4.0FA-TCID₅₀/头份和10^3.5FA-TCID₅₀/头份)接种易感母猪后均无不良临床反应出现。免疫后第50天，用PPV7909标准强毒株攻击后，当易感母猪的免疫剂量低于10^4.5FA-TCID₅₀/头份时，有1～3头母猪能抵抗强毒的攻击，当免疫剂量大于等于10^4.5TCID₅₀/头份时所有母猪均能抵抗强毒的攻击，对照组的猪攻毒后出现采食减少，精神不振，均有不同程度的发病。最小免疫剂量测定结果表明，当易感母猪免疫剂量大于等于10^4.5FA-TCID₅₀/头份时所有母猪均能抵抗强毒的攻击，因此将研制的猪细小病毒活疫苗(ZH株)的最小免疫剂量确定为10^4.5FA-TCID₅₀/头份。

本发明所指“易感母猪”即为经血清学检查细小病毒抗体阴性，对细小病毒敏感的母猪。

(10)猪细小病毒ZH株在不同细胞中的增殖

1)细胞适应性研究结果

将病毒与ST、IBRS-2、PK15【猪睾丸传代细胞系(ST)、猪肾传代细胞系(PK15)购自中国兽医药品监察所；仔猪肾传代细胞系(1BRS-2)购自中国典型物保藏中心(武汉大学)】等同步培养出现了细胞病变，有的在接种后36小时就可以观察到病变，到72小时病变达到80％以上，主要表现为细胞圆缩、聚集、拉网、脱落。

2)DMEM生长液与MEM生长液对病毒增殖影响的比较

在同样的培养条件下，用DMEM和MEM【含10％犊牛血清的DMEM生长液或MEM生长液(培养基和犊牛血清购自美国HYclone公司)】作为细胞生长液，维持液犊牛血清为2％分别培养了3批ST和IBRS-2细胞，并按常规方法接毒、测毒。在同样的培养条件下，用DMEM和MEM分别培养了3批ST和IBRS-2细胞，并按常规方法接毒，结果用两种不同培养基增殖的病毒的滴度无显著差异，说明在生产上可以根据情况选择不同的培养基进行猪细小病毒ZH株的大量培养。

3)不同细胞的培养和病毒的繁殖

分别在中方瓶、大扁瓶中按常规方法培养ST、PK15、BHK21、IBRS-2，在细胞液中按1～2％的比例同步接种加入猪细小病毒ZH株，37℃培养，观察细胞病变。当细胞病变达80％时收毒，然后在细胞上用荧光法测定其FA-TCID₅₀。结果如下表1：

表1PPV-ZH株病毒在ST、IBRS-2、PK15细胞中的增殖滴度(FA-TCID₅₀/0.1ml)

比较结果表明，按Reed-Muench法计算，在相同的条件下在猪睾丸原代细胞、IBRS-2、PK-15这3种不同细胞上培养猪细小病毒ZH株，结果病毒在3种细胞中都能稳定地增殖，说明3种细胞都能用于猪细小病毒ZH株的增殖培养，其中猪睾丸原代细胞(ST)培养病毒增殖滴渡略高于其他两种细胞。

(11)疫苗的安全性

试验结果表明，超剂量接种怀孕30～50天的妊娠母猪，所有试验动物精神状态良好，食欲正常，无异常反应；单剂量3次重复接种后备母猪，未出现异常反应，说明该疫苗单剂量重复注射安全可靠；超剂量疫苗(10倍使用剂量)接种后备母猪，均未发现任何异常反应，表明安全可靠；疫苗毒不能水平传播。以上所有试验证明疫苗是十分安全的。

(12)疫苗免疫效力

本发明研究结果表明，该疫苗可以通过深部肌肉注射免疫效果较好；疫苗的最小免疫剂量为每头份含毒10^4.5FA-TCID₅₀；PPV HI抗体效价与攻毒保护具有相关性，当PPV HI抗体滴度≥6log2时，能够抵抗强毒的攻击。

采用微量血凝抑制试验测定3批实验室产品猪细小病毒病(ZH株)活疫苗免疫母猪后抗体消长和仔猪母源抗体，进行免疫持续期的评估.免疫母猪的PPV HI抗体在免疫后第7天时即可检出，7天后逐渐升高，21天后达到高峰，此抗体可维持到150天，以后开始下降，180天后大多数开始为阴性(低于1:64)。仔猪出生后在第3天即可检测到PPV HI抗体，第14天达到高峰，50天以后持续下降，第60天抗体大部分为阴性(低于1:64)。

免疫猪细小病毒活疫苗(ZH株)的母猪所产仔猪获得母源抗体维持期为50天。

(13)疫苗保存期试验

疫苗在2～8℃保存9个月的疫苗以及在—15℃以下保存24个月的疫苗2头份/头注射4～7日龄的乳鼠和猪(10头份)，均无任何临床不良反应，注射部位也无任何异常变化；在2～8℃保存9个月的疫苗以及在—15℃以下保存24个月的疫苗分别免疫300～500g豚鼠各5只，1头份/只，免疫后21天，免疫组豚鼠的抗体效价均≥6log2，对照组豚鼠的抗体效价均≤3log2，安全试验和效力试验证明疫苗在2～8℃保存9个月的疫苗以及在—15℃以下保存24个月仍然安全有效。

(14)关于疫苗的免疫程序

为确定疫苗的免疫期，进而制定疫苗的免疫程序，本发明人将研制的3批猪细小病毒病活疫苗，分别用不同批次的疫苗免疫后备母猪和种公猪，免疫后定期检测PPV HI抗体并攻毒，试验结果表明，母猪的免疫期定为5个月，免疫猪细小病毒活疫苗(ZH株)的母猪所产仔猪获得母源抗体维持期为50天.说明母猪配种前免疫1次，可保护1个产仔周期，公猪免疫1次的免疫期也为5个月。所以在试行规程中将疫苗的用法用量及免疫程序规定为：按瓶签注明的头份，用灭菌生理盐水或专用稀释液稀释疫苗，深部肌肉注射，1头份/头/次。留作种用后备猪在2月龄时免疫一次，母猪每次配种前2～3周各免疫一次，公猪于6月龄时首免，以后每半年免疫1次。

3.疫苗制备

将形成良好单层的ST细胞消化后制备细胞悬液，按细胞生长液总量的1％～2％加入猪细小病毒ZH株种毒液接种到细胞培养瓶中，置37℃培养。接种后72～120小时，当细胞病变达到80％以上时，即可收获。冻融后，收集于灭菌的容器中，并取样进行检验：

毒价测定按荧光抗体法进行测定，0.1ml病毒含量应≥10^6.0FA-TCID₅₀。(荧光抗体法测定病毒含量：用细胞生长液将病毒作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-73个稀释度病毒液，与ST细胞同步接种细胞“飞片”，每个滴度4管，每孔加病毒稀释液100μL、ST细胞悬液900μL。同时设病毒阳性对照和细胞阴性对照，37℃培养72～96小时，用荧光抗体法计算FA-TCID₅₀(邵振华，田海燕.多价荧光抗体监测外源病毒污染的研究[J].中国兽药杂志.1997，31(2)：1-6.)每0.1ml病毒含量应≥10^6.0FA-TCID₅₀)。

红细胞凝集价测定含毒细胞液对1％豚鼠红细胞血凝价应≥1:256。

将检验合格的细胞毒液，混合于同一灭菌容器内，并按一定比例加入常规的冻干稳定剂，同时加入适宜的抗生素，充分摇匀，定量分装，使每头份病毒含量应≥10^5.2FA-TCID₅₀，分装后按常规方法进行冷冻真空干燥(中国兽药典委员会.中国兽药典二○○五年版三部.中国农业出版社，2005.)。

4猪细小病毒活疫苗(ZH株)的质量标准

(1)安全检验下述两种方法任择其一。

1)用乳鼠检验取4～7日龄同窝健康乳鼠5只，各皮下注射2头份，观察7天，均健活，应无任何临床不良反应。如有死亡，可重检一次。

2)用猪检验用猪细小病毒HI抗体阴性猪2头，各深部肌肉注射疫苗10头份，另取条件相同的2头猪不接种作为对照，观察21日，试验猪和对照猪均应无不良临床反应。

(2)效力检验下述两种方法任择其一。

1)病毒含量测定用不含血清的细胞营养液将疫苗稀释至1头份/ML，再作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的病毒液，与ST细胞同步接种细胞“飞片”，每个滴度4管，每孔加病毒稀释液100μL、ST细胞悬液900μL。同时设病毒阳性对照和细胞阴性对照，37℃培养72～96小时，用荧光抗体法计算FA-TCID₅₀。每头份疫苗病毒含量应≥10^5.0FA-TCID₅₀。

2)抗体检测用体重350g以上HI抗体阴性(HI抗体效价≤1∶8)豚鼠5只各肌肉注射疫苗1头份。21日后，连同条件相同的对照豚鼠2只，采血，测定抗体，对照豚鼠应为阴性，注苗豚鼠其HI效价应≥1∶64。如达不到上述要求，可复检一次。

或用猪细小病毒HI抗体阴性猪4头(HI抗体效价≤1∶8)，各深部肌肉注射疫苗1头份，另取条件相同的2头猪不接种作为对照，28日后，连同条件相同的对照猪2头，采血，测定抗体，对照猪应为阴性，注苗猪应全部出现抗体反应，其HI效价应≥1∶64。

(3)用途用于预防猪细小病毒感染。

(4)用法与用量按瓶签注明的头份，用灭菌生理盐或专用稀释液稀释疫苗，深部肌肉注射，1头份/头/次。留作种用后备猪在2月龄时免疫一次，母猪每次配种前2～3周免疫一次，公猪于6月龄时首免，以后每半年免疫1次。

【附图说明】

本发明涉及的猪细小病毒ZH株(本菌株已于2008年10月13日送交北京市大屯中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo2702)。

附图1猪细小病毒ZH株PCR扩增基因电泳图A：Marker；B：ST细胞对照；C：ZH病毒培养物NS1。

附图2重组质粒酶切鉴定电泳图1：Marker(DL15000)；7：Marker(DL2000)；2，3，4，5，6为阳性质粒。

【本发明的优点】

本发明所涉及的猪细小病毒ZH株(CGMCC No2702)是一株与NADL-2具有极高的同源性、保持高的增殖力，病毒含量明显高于原始毒株而且稳定，具有更好的免疫原性。使用传代细胞增殖猪细小病毒病毒生产猪细小病毒活疫苗，对稳定疫苗质量非常有利。本发明所涉及的疫苗用于预防猪细小病毒感染安全有效，且免疫猪细小病毒活疫苗的母猪所产仔猪获得母源抗体维持期为50天。

Claims (3)

1.一种猪细小病毒活疫苗，其特征在于含有猪细小病毒CGMCC No.2702病毒和常用的冻干保护剂，每头份疫苗病毒含量应≥10^5.0FA-TCID₅₀。

2.一种猪细小病毒活疫苗的制备方法，其特征在于用猪细小病毒CGMCC No2702病毒通过接种猪睾丸传代细胞ST的单层细胞，37℃培养5～6天，当80％以上的细胞出现细胞病变时，收获病毒细胞培养物；将收获病毒细胞培养物经荧光抗体法测定，0.1ml病毒含量应≥10^6.0FA-TCID₅₀、含毒病毒液对1％豚鼠红细胞血凝价应≥1∶256为合格；将收获病毒细胞培养液加入常用的冻干保护剂，充分混合后分装后经冷冻干燥而制成冻干活疫苗。

3.如权利2所述的一种猪细小病毒活疫苗的制备方法，其特征在于可以用仔猪肾传代细胞系1BRS-2细胞取代制苗过程培养病毒所用的ST细胞。

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