CN105903011B - 一种猪伪狂犬病活疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种猪伪狂犬病活疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种猪伪狂犬病活疫苗及其制备方法。本发明的疫苗毒株为gE基因自然缺失的变异株弱毒，能够有效应对当前猪伪狂犬病的流行形势；采用生物反应器悬浮培养工艺培养病毒，可以在细胞培养罐进行大规模培养，同批次产量大、质量稳定均一；采用新型耐热冻干保护剂进行疫苗冻干，能彻底改变兽用活疫苗低温保存的缺点，这对于疫苗的保存、运输、使用提供了极大的便利。

Description

一种猪伪狂犬病活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种猪伪狂犬病活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒引起的一种猪急性传染病。猪伪狂犬病病毒可以感染不同年龄段的猪，但以妊娠母猪和哺乳仔猪感染最为严重：导致妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎；哺乳仔猪出现神经症状、麻痹、衰竭死亡，死亡率几乎高达100％。(邓仕伟，汪勇，薛春芳。我国伪狂犬病流行现状及新特点[J].动物医学进展，2006,27(9)：105-107)(TambaM,Calabrese R,Finelli E,et al.Risk factors for Aujeszky,s-diseaseseropositivity of swine herds of a region of northern Italy[J].Prev Vet Med,2002,54(3):203-212)。我国于上世纪70年代从匈牙利引进了PRV Bartha-K61株，该病毒株是公认的优良疫苗株，上世纪90年代以来国内规模化猪场普遍使用该疫苗进行防治，对猪伪狂犬病起到了很好的控制作用。
但是，自2011年以来，在我国华北、华中、华东、东北等地区的许多使用基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场出现了疑似猪伪狂犬病的流行，发病猪场数量多，损失较大，主要表现为猪群gE抗体阳性率显著升高，母猪产弱仔、死胎，仔猪出现神经症状及死亡等。通过对发病猪群组织器官中PRV病毒的序列分析及致病性研究，科学家发现猪伪狂犬病病毒的抗原性发生了一定程度的变异，变异伪狂犬毒株对猪的致病性更强。(赵鸿远，等.猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及其gE基因的分子特征.中国预防兽医学报，1008-0589(2014)07-0506-04)。
我公司在为猪场提供疾病诊断的过程中，从送检病料中分离到一株gE基因自然缺失的变异株弱毒HZ株。我们用HZ株作为制苗用毒株，在对HZ株进行安全性、免疫原性等研究的基础上，进行了猪伪狂犬病活疫苗的研制，并对疫苗的安全性、效力和免疫期等进行试验，综合分析各种试验数据，本疫苗安全性高、免疫原性良好，能够有效应对当前猪伪狂犬病的流行形势。
发明内容
本发明的目的是研制一种猪伪狂犬病流行毒株弱毒活疫苗，以应对目前国内猪伪狂犬病毒病流行形势。
本发明的技术方案：
一种猪伪狂犬病活疫苗，其特征在于所述活疫苗含有猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)HZ株，该毒株已于2016年05月10日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCNo.11912。
其中，所述猪伪狂犬病病毒HZ株gE基因自然缺失。
其中，所述猪伪狂犬病病毒HZ株gB基因207-208位是CG、276-277位是CG、在269位后有连续3个碱基CGG的插入。
其中，所述猪伪狂犬病病毒HZ株gD基因824位后有连续6个碱基CAGGCC的插入。
所述猪伪狂犬病活疫苗的制备方法是将所述猪伪狂犬病病毒HZ株接种ST细胞进行悬浮培养，收获病毒培养物，加适宜耐热冻干保护剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。
具体实施方式
一、生产用病毒株的分离鉴定
1.病毒分离
(1)病料处理称取病料组织，按1:5比例加入MEM培养基匀浆研磨，反复冻融3次，4000r/min离心10min；收上清，过滤除菌。
(2)病料接种将上述上清液接种已长成单层的ST细胞，1ml/瓶，并设正常细胞对照。置37℃、含5％CO2培养箱吸附1h后，弃去接种液，用MEM维持液洗一遍，然后加入MEM维持液，置37℃、含5％CO2培养箱培养观察96～120小时，出现CPE，则冻融3次收毒。
(3)病毒纯化及病毒含量测定
1)病毒纯化将病毒用MEM维持液10倍系列稀释至10-10，取10-3～10-10 8个稀释度的悬液接种已长成单层的ST细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，另设8个孔不接毒作为对照。置37℃、含5％CO2培养箱培养5日，对照孔细胞形态应良好。取最高稀释度病变孔，收取上清，即为第一次纯化病毒。
取第一次纯化病毒接种已长成单层的ST细胞进行增殖，病变达到80％左右时，冻融3次，取上清用MEM维持液10倍系列稀释，接种已长成单层的ST细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，另设8个孔不接毒作为对照。置37℃、含5％CO2培养箱培养5日，对照孔细胞形态应良好。取最高稀释度病变孔，收取上清，即为第二次纯化病毒。
按照上述方法将病毒再纯化一次，所得到的纯化病毒即为三次纯化的病毒命名为猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)HZ株，测定TCID50后，置-70℃以下保存备用，该株病毒已于2016年05月10日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.11912。
2)病毒含量测定将毒液用含2％新生牛血清的维持液作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8 4个稀释度，分别接种长成良好单层ST细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔100μl。每孔补加含2％新生牛血清的细胞培养液100μl。同时设不接毒对照8孔，置37℃、含5％CO2培养箱中培养、观察96～120小时，记录细胞病变(CPE)的孔数。按Reed-Muench法计算TCID50。
2.病毒鉴定
(1)PCR鉴定
1)引物设计根据GenBank发表的PRV gB、gE基因序列，设计扩增部分gB、gE基因片段的引物如下：
扩增gB基因的引物：扩增片段大小为600bp。
gB-P1:5’-GGATCCGCGC ACGTGAACGACAT-3’23(序列1)；
gB-P2:5’-AAGCTTGAGC GCGTGCAGCT GGTT-3’24(序列2)。
扩增gE基因的引物：扩增片段大小为298bp。
gE-P1:5’-GCCCACGCAC GAGGACTACT ACGA-3’24(序列3)；gE-P2:5’-TTAAGCGGGGCGGGACATCA ACAG-3’24(序列4)。
2)PCR扩增提取病毒DNA，分别用以上2对引物进行PCR扩增和电泳检测。
(2)特异性鉴定将毒液稀释至200TCID50/0.1ml，与等量1:10稀释的猪伪狂犬病病毒特异性抗血清混合，经37℃中和1小时后，接种已长成单层的ST细胞96孔微量细胞培养板，共接种12孔，每孔100μl。同时设不中和对照组(将毒种稀释至200TCID50/0.1ml，与等量培养液混合)和正常细胞对照组，各接种6孔，每孔100μl。每孔补加含2％新生牛血清的细胞培养液100μl。将细胞培养板置37℃、含5％CO2培养箱中培养，观察96～120小时。记录有无细胞病变。
(3)生物学特性鉴定
1)对氯仿敏感性试验在病毒液中加入氯仿，使其终浓度为4.8％，在4℃冰箱中震荡混匀10min，500r/min离心5min，吸取上层液体，测定病毒含量。同时设不加氯仿对照，测定病毒含量，若二者的对数差大于2，说明该病毒对氯仿敏感。
2)对乙醚敏感性试验在病毒液中加入乙醚，使其终浓度为20％，密封后置4℃过夜，期间不时振荡。2000r/min离心20min，用毛细管吸取病毒液，适当吹打，使剩余乙醚挥发殆尽，测定病毒含量。同时设不加乙醚对照，测定病毒含量，若二者的对数差大于2，说明该病毒对乙醚敏感。
(4)动物回归试验
1)家兔接种试验取1.5～2.0kg健康易感新西兰兔5只，腹部皮下接种细胞毒液0.1ml/只，另取5只不接种作为对照。隔离饲养，连续观察14日，记录家兔死亡情况。
2)仔猪接种试验取3～4周龄健康易感仔猪3头，用分离到的猪伪狂犬病病毒攻毒，每头滴鼻2ml、肌肉注射2ml。同时设不攻毒对照猪2头。攻毒后观察14日，记录猪的发病和死亡情况。
(5)序列分析参考GenBank发表的猪伪狂犬病病毒gB、gD基因序列，设计测序引物，对分离病毒的gB、gD基因序列进行测定分析。
扩增gB基因的测序引物gB-P1(序列1)和gB-P2(序列2)，扩增片段大小为600bp。
扩增gD基因测序引物：扩增片段大小为677bp。
gD-P1:5’-GGATCCATGC TGCTCGCAGC GCTAT-3’25(序列5)
gD-P2:5’-AAGCTTGTCA GGAATCGCAT CACGT-3’25(序列6)。
二、猪伪狂犬病活疫苗(HZ株)的制备与检验
1.疫苗制备
本发明所提供的制备疫苗的方法是将伪狂犬病病毒HZ株接种ST细胞进行悬浮培养，收获病毒培养物，加适宜耐热冻干保护剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。
2.疫苗成品检验
(1)性状微黄白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
(2)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
(3)支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无支原体生长。
(4)外源病毒检验将疫苗与猪伪狂犬病病毒特异性抗血清中和后，接种Vero细胞、MDBK细胞、ST细胞单层，按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一〇年版三部，中国农业出版社，2011，以下称《中国兽药典》)附录进行检验，应无外源病毒污染。
(5)鉴别检验
1)血清中和试验将疫苗稀释至200TCID50/0.1ml，与等量1:10稀释的猪伪狂犬病病毒特异性抗血清混合，经37℃中和1小时后，接种已长成单层的ST细胞96孔微量细胞培养板，共接种12孔，每孔100μl。同时设不中和对照组(将疫苗稀释至200TCID50/0.1ml，与等量培养液混合)和正常细胞对照组，各接种6孔，每孔100μl。每孔补加含2％新生牛血清的细胞培养液100μl。将细胞培养板置37℃、含5％CO2培养箱中培养，观察96～120小时。中和组和细胞对照组应不出现CPE，不中和对照组应全部出现CPE。
2)病毒基因鉴定采用基因鉴定PCR检测法，用扩增gB基因的引物(序列1、序列2)进行PCR检测，应扩增出大小约为600bp的特异性条带。
用扩增gE基因的引物(序列3、序列4)进行PCR检测，应扩增不出大小约为298bp的特异性条带。
(6)安全检验用3～4周龄健康易感仔猪5头，每头肌肉接种疫苗10头份，观察14日，仔猪应全部健活。
(7)效力检验将疫苗稀释至1头份/ml后，免疫5头3～4周龄健康易感仔猪，每头肌肉接种疫苗1头份，同时设对照仔猪5头。免疫后21日，连同对照猪用猪伪狂犬病病毒S12株强毒(106.5TCID50/ml)攻毒，每头滴鼻2ml、肌肉注射2ml，攻毒后观察10日。对照猪应全部发病，免疫猪应全部保护。
(8)真空度测定按《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。
(9)剩余水分测定按《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。
本发明涉及的微生物菌种资源信息
本发明涉及到的猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)HZ株，系本申请人自行由菏泽某猪场采集病死猪脑和扁桃体组织病料中分离、鉴定而获得，该毒株为gE基因自然缺失的变异株弱毒。该毒株已于2016年05月10日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.11912。
附图说明
图1：HZ株gE基因PCR扩增结果(1:阳性对照；2:阴性对照；3:HZ株；4:DL2000Marker)
图2：HZ株gB基因PCR扩增结果(1:阳性对照；2:DL2000Marker；3:阴性对照；4:HZ株)
图3：PRV gB基因系统进化树
图4：PRV gB基因核苷酸同源性比较
图5：PRV gD基因系统进化树
图6：PRV gD基因核苷酸同源性比较
本发明的积极意义
本发明涉及一种猪伪狂犬病活疫苗的研制。本发明的疫苗毒株为gE基因自然缺失的变异株弱毒，能够有效应对当前猪伪狂犬病的流行形势；采用生物反应器悬浮培养工艺培养病毒，可以在细胞培养罐进行大规模培养，同批次产量大、质量稳定均一；采用新型耐热冻干保护剂进行疫苗冻干，能彻底改变兽用活疫苗低温保存的缺点，这对于疫苗的保存、运输、使用提供了极大的便利。
实施例
以下实施例进一步说明本发明。
实施例1
——生产用病毒株的分离鉴定
1.病毒分离
(1)病料处理 称取病料组织，按1:5比例加入MEM培养基匀浆研磨，反复冻融3次，4000r/min离心10min；收上清，过滤除菌。
(2)病料接种 将上述上清液接种已长成单层的ST细胞，1ml/瓶，并设正常细胞对照。置37℃、含5％CO2培养箱吸附1h后，弃去接种液，用MEM维持液洗一遍，然后加入MEM维持液，置37℃、含5％CO2培养箱培养观察96～120小时，若出现CPE，则冻融3次收毒；若无CPE，则盲传2代，若仍无CPE，则放弃。分离到的病毒接种ST细胞48～72h后，细胞出现典型病变，表现为细胞圆缩，形成合胞体，脱落形成空隙，而对照细胞仍能保持完整单层。
(3)病毒纯化及病毒含量测定
1)病毒纯化将病毒用MEM维持液10倍系列稀释至10-10，取10-3～10-10 8个稀释度的悬液接种已长成单层的ST细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，另设8个孔不接毒作为对照。置37℃、含5％CO2培养箱培养5日，对照孔细胞形态应良好。取最高稀释度病变孔，收取上清，即为第一次纯化病毒。
取第一次纯化病毒接种已长成单层的ST细胞进行增殖，病变达到80％左右时，冻融3次，取上清用MEM维持液10倍系列稀释，接种已长成单层的ST细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，另设8个孔不接毒作为对照。置37℃、含5％CO2培养箱培养5日，对照孔细胞形态应良好。取最高稀释度病变孔，收取上清，即为第二次纯化病毒。
按照上述方法将病毒再纯化一次，所得到的纯化病毒即为三次纯化的病毒，命名为猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)HZ株，该毒株已于2016年05月10日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.11912，测定TCID50后，置-70℃以下保存备用。
2)病毒含量测定将毒液用含2％新生牛血清的维持液作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8 4个稀释度，分别接种长成良好单层ST细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔100μl。每孔补加含2％新生牛血清的细胞培养液100μl。同时设不接毒对照8孔，置37℃、含5％CO2培养箱中培养、观察96～120小时，记录细胞病变(CPE)的孔数。按Reed-Muench法计算TCID50。病毒接种ST细胞，经有限稀释法克隆纯化3代，病毒含量均有明显提高，达到107.5～109.0TCID50/ml。
2.病毒鉴定
(1)PCR鉴定
根据GenBank发表的PRV gB、gE基因序列，设计扩增部分gB、gE基因片段的引物如下：
扩增gB基因的引物：gB-P1:5’-GGATCCGCGCACGTGAACGACAT-3’(序列1)；gB-P2:5’-AAGCTTGAGCGCGTGCAGCTGGTT-3’(序列2)。扩增片段大小为600bp。
扩增gE基因的引物：gE-P1:5’-GCCCACGCACGAGGACTACTACGA-3’(序列3)；gE-P2:5’-TTAAGCGGGGCGGGACATCAACAG-3’(序列4)。扩增片段大小为298bp。
提取病毒DNA，分别用以上2对引物进行PCR扩增和电泳检测。结果用扩增gB基因的引物对HZ株进行PCR扩增，扩增到目的条带；而用扩增gE基因的引物未扩增到目的条带。具体结果见图1～图2。
(2)特异性鉴定将毒液稀释至200TCID50/0.1ml，与等量1:10稀释的猪伪狂犬病病毒特异性抗血清混合，经37℃中和1小时后，接种已长成单层的ST细胞96孔微量细胞培养板，共接种12孔，每孔100μl。同时设不中和对照组(将毒种稀释至200TCID50/0.1ml，与等量培养液混合)和正常细胞对照组，各接种6孔，每孔100μl。每孔补加含2％新生牛血清的细胞培养液100μl。将细胞培养板置37℃、含5％CO2培养箱中培养，观察120小时，中和组细胞和正常对照组细胞均无病变，不中和对照组细胞全部出现病变。
(3)生物学特性鉴定
1)对氯仿敏感性试验在病毒液中加入氯仿，使其终浓度为4.8％，在4℃冰箱中震荡混匀10min，500r/min离心5分钟，吸取上层液体，测定病毒含量。同时设不加氯仿对照，测定病毒含量。结果经氯仿处理后病毒失活，与不加氯仿处理的病毒含量检测结果差异极显著。
2)对乙醚敏感性试验在病毒液中加入乙醚，使其终浓度为20％，密封后置4℃过夜，期间不时振荡。2000r/min离心20min，用毛细管吸取病毒液，适当吹打，使剩余乙醚挥发殆尽，测定病毒含量。同时设不加乙醚对照，测定病毒含量。结果经乙醚处理后病毒失活，与不加乙醚处理的病毒含量检测结果差异极显著。
(4)动物回归试验
1)家兔接种试验取1.5～2.0kg健康易感新西兰兔5只，腹部皮下接种细胞毒液0.1ml/只，另取5只不接种作为对照。隔离饲养，连续观察14日，结果HZ株接种的家兔全部健活。
2)仔猪接种试验取3～4周龄健康易感仔猪3头，用分离到的猪伪狂犬病病毒攻毒，每头滴鼻2ml、肌肉注射2ml。同时设不攻毒对照猪2头。攻毒后观察14日，结果接种仔猪和对照仔猪均全部健活。
(5)序列分析参考GenBank发表的猪伪狂犬病病毒gB、gD基因序列，设计测序引物，对分离病毒的gB、gD基因序列进行测定分析。
gB基因测序引物：gB-P1:5’-GGATCCGCGCACGTGAACGACAT-3’(序列1)；gB-P2:5’-AAGCTTGAGCGCGTGCAGCTGGTT-3’(序列2)。扩增片段大小为600bp。
gD基因测序引物：gD-P1:5’-GGATCCATGCTGCTCGCAGCGCTAT-3’(序列5)；gD-P2:5’-AAGCTTGTCAGGAATCGCATCACGT-3’(序列6)。扩增片段大小为677bp。将HZ株分离毒gB基因扩增产物送测序。系统进化树分析(见图3)，HZ株与GenBank中发表的2012年分离株KJ789182、KC981239、KP098534、KM061380、KJ526433、KJ526439处在同一个大分支上，核苷酸同源性为100％(见图4)；而与1987～2011年分离株GQ325658、JF797217、M17321、BK001744处在不同的分支上，核苷酸同源性在98.3％～98.8％(见图4)。HZ株gB基因变异较大，存在几个部位的特征性病变，存在很多碱基的替换和缺失部位，在207-208位发生了GA-CG的特征性替换，在276-277位发生了GT-CG的特征性替换，在269位后有连续3个碱基CGG的插入。测序结果表明HZ株是gE基因自然缺失的变异株弱毒。将HZ株分离毒gD基因扩增产物送测序。系统进化树分析(见图5)，HZ株与GenBank中发表的2012～2014年分离株KC981239、KF017330、KP257591、KM189914、KT818620处在同一个大分支上，核苷酸同源性为99.7％～100％(见图6)；而与2012年之前分离株BK001744、JF797217、JF797218、JQ809329处在不同的分支上，核苷酸同源性在99.2％～99.5％(见图6)，与2012年之前的分离株相比，HZ株gD基因内部824位后插入了连续6个碱基CAGGCC，而且存在较多的A-G替换。测序结果表明HZ株为近几年流行毒株。
实施例2
——HZ株安全和免疫原性试验
1.对3～4周龄仔猪的安全试验将伪狂犬病病毒HZ株以107.0TCID50病毒量接种3～4周龄健康易感仔猪5头，观察14日，均健活。
2.对妊娠母猪的安全试验将伪狂犬病病毒HZ株以107.0TCID50病毒量接种妊娠70～80日健康易感母猪3头，观察14日，母猪没有发生流产现象，平均产仔数与对照猪没有明显差异。妊娠母猪所产仔猪观察至断奶，体温、精神、饮食、粪便等均无异常，无猪伪狂犬病发病症状。
3.对山羊的安全试验将伪狂犬病病毒HZ株以107.0TCID50病毒量接种6月龄健康易感山羊3只，观察14日，均健活。
4.对仔猪免疫原性试验将伪狂犬病病毒HZ株以105.0TCID50病毒量接种3～4周龄健康易感仔猪5头，免后21日用强毒株S12攻毒(4×106.5TCID50)，攻毒后观察10天，免疫组5头均保护，对照组5头均发病，且死亡3头。
5.对母猪免疫原性试验将伪狂犬病病毒HZ株以105.0TCID50病毒量接种配种前1个月健康易感母猪3头，在产前6～7周以同样剂量加强免疫1次，产前2周左右用强毒株S12攻毒(4×106.5TCID50)，攻毒后观察母猪产仔、仔猪成活率情况，结果免疫组母猪及其所产仔猪均正常，对照组母猪及其所产仔猪均发病。
实施例3
——猪伪狂犬病活疫苗(HZ株)的制备
1.生产用毒种制备取生长良好的ST细胞单层，弃去生长液，换以含1％毒种的维持液，置37℃继续培养，待80％左右的细胞出现典型CPE时收获。定量分装，注明收获日期、毒种代数等，冷冻保存。
2.制苗用毒液的繁殖
(1)细胞培养罐清洗、灭菌及微载体平衡将细胞培养罐清洗干净，121℃灭菌30分钟。灭菌结束后，将灭菌完全的微载体打入细胞培养罐，加入含2％左右新生牛血清的MEM(低血清)培养液至最小培养体积进行平衡。
(2)细胞接种选择生长良好的ST细胞单层，用EDTA-胰蛋白酶分散液消化后，接种细胞培养罐，接种密度不低于6.0×105个细胞/ml，培养基为含2％左右新生牛血清的MEM(低血清)培养液，连续培养2～3日。细胞培养过程中测定葡萄糖含量，当葡萄糖含量低于500mg/L时，用含2％左右新生牛血清的MEM换液。当细胞密度高于2.5×106个细胞/ml时进行消化转移。
(3)细胞消化转移及放大培养将微载体细胞悬液转移至消化器中，弃上清，加入PBS(0.1mol/L，pH值为7.2左右)清洗2次，弃PBS，加入0.16％胰蛋白酶溶液进行消化，消化完全后，加入含2％左右新生牛血清的MEM(低血清)培养液终止消化。将微载体细胞悬液转入到下一级细胞培养罐放大培养，接种密度不低于6.0×105个细胞/ml，连续培养2～3日。细胞培养过程中测定葡萄糖含量，当葡萄糖含量低于500mg/L时，用含2％左右新生牛血清的MEM换液。当细胞密度高于2.5×106个细胞/ml时进行放大或接毒操作。
(4)接毒及收获微载体细胞悬液转入到新的细胞培养罐培养2～3日，当细胞密度达到2.5×106～3.0×106个细胞/ml时，换以含0.5％左右新生牛血清的MEM(低血清)培养液，并按MOI＝0.1～0.15接种猪伪狂犬病病毒HZ株生产用毒种。接毒后取样观察细胞状态，待微载体表面90％左右细胞突起且有部分脱落时，收获病毒液，标明名称、收获日期、批号，置-15℃以下保存备用。
3.半成品检验
(1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
(2)病毒含量每毫升病毒含量均≥106.8TCID50。
4.配苗及分装将检验合格的病毒液与适宜保护剂按一定比例混合均匀后，定量分装。每头份疫苗含猪伪狂犬病病毒≥106.5TCID50。
5.冻干分装后迅速进行冷冻真空干燥。
实施例4
——猪伪狂犬病活疫苗(HZ株)成品检验
1.性状微黄白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
2.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无菌生长。
3.支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无支原体生长。
4.外源病毒检验将疫苗与猪伪狂犬病病毒特异性抗血清中和后，接种Vero细胞、MDBK细胞、ST细胞单层，按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无外源病毒污染。
5.鉴别检验
(1)血清中和试验将疫苗稀释至200TCID50/0.1ml，与等量1:10稀释的猪伪狂犬病病毒特异性抗血清混合，经37℃中和1小时后，接种已长成单层的ST细胞96孔微量细胞培养板，共接种12孔，每孔100μl。同时设不中和对照组(将疫苗稀释至200TCID50/0.1ml，与等量培养液混合)和正常细胞对照组，各接种6孔，每孔100μl。每孔补加含2％新生牛血清的细胞培养液100μl。将细胞培养板置37℃、含5％CO2培养箱中培养，观察96～120小时。中和组和细胞对照组未出现CPE，不中和对照组全部出现CPE。
(2)病毒基因鉴定采用基因鉴定PCR检测法，用扩增gB基因的引物(序列1、2)进行PCR检测，均扩增出大小约为600bp的特异性条带。
用扩增gE基因的引物(序列3、4)进行PCR检测，均扩增不出大小约为298bp的特异性条带。
6.安全检验用3～4周龄健康易感仔猪5头，每头肌肉接种疫苗10头份，观察14日，仔猪全部健活。
7.效力检验将疫苗稀释至1头份/ml后，免疫5头3～4周龄健康易感仔猪，每头肌肉接种毒种1头份，同时设对照仔猪5头。免疫后21日，连同对照猪用猪伪狂犬病病毒S12株强毒(106.5TCID50/ml)攻毒，每头滴鼻2ml、肌肉注射2ml，攻毒后观察10日。结果对照猪全部发病，免疫猪全部保护。
8.真空度测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，均为紫色辉光。
9.剩余水分测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，均低于4％。

Claims (4)

1.一种猪伪狂犬病活疫苗，其特征在于所述活疫苗含有猪伪狂犬病病毒HZ株活病毒，该株病毒已于2016年05月10日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.11912；
所述猪伪狂犬病病毒HZ株gE基因为自然缺失；
所述猪伪狂犬病病毒HZ株对兔、猪为一株弱毒病毒株。
2.如权利要求1所述的猪伪狂犬病活疫苗，其特征在于所述猪伪狂犬病病毒HZ株gB基因207-208位是CG、276-277位是CG、在269位后有连续3个碱基CGG的插入。
3.如权利要求1所述的猪伪狂犬病活疫苗，其特征在于所述猪伪狂犬病病毒HZ株gD基因824位后有连续6个碱基CAGGCC的插入。
4.如权利要求1所述的猪伪狂犬病活疫苗，其特征在于其制备方法是将所述猪伪狂犬病病毒HZ株接种ST细胞进行悬浮培养，收获病毒培养物，加适宜耐热冻干保护剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。
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