CN102399755B - 一种猪伪狂犬病毒天然弱毒株c株及其耐热保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪伪狂犬病毒天然弱毒株C株及其耐热保存方法，其微生物保藏登记号为：CCTCC NO：V201114，用各种冻干保护剂基质按一定的比例混合、配制，将保护剂分别进行无菌处理，对可以进行高压灭菌的保护剂组份溶于双蒸水中，108～121℃灭菌15～30分钟；将不耐高压灭菌的保护剂组份按配比溶于双蒸水中用0.22μm的滤膜除菌，再将两者混合成为耐热保护剂，然后将该耐热保护剂和伪狂犬病毒液进行1：1～1.2混合，采用相应的冻干曲线冻干。与现有技术相比，本发明有很好的稳定性，在连续回传动物5代，基因序列稳定，没有发生变异，为猪伪狂犬弱毒疫苗的研制提供了很好的资源，在2～8℃条件下保存24个月，病毒效价下降不超过1个滴度。

Description

一种猪伪狂犬病毒天然弱毒株C株及其耐热保存方法

技术领域

本发明属于动物用病毒活疫苗制造领域，尤其是涉及一种猪伪狂犬病毒天然弱毒株C株及其耐热保存方法。

背景技术

伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)是一种a-疱疹病毒，可引起多种家畜和野生动物的伪狂犬病。除猪以外的其它动物表现为致死性感染，猪是PRV的天然宿主和贮存宿主，呈流行性感染。成年猪常常表现为隐性感染和呼吸道症状，母猪流产、产死胎和木乃伊胎，公猪表现为睾丸炎。仔猪表现出发热、昏迷和神经症状，死亡率很高。因此，伪狂犬病是养猪业的一种重要的传染病。

目前，弱毒活疫苗是预防畜禽传染病的主要疫苗之一，在我国动物用疫苗中，活疫苗占相当大的比例。但是目前的疫苗毒株大多是人工致弱，这样存在着毒株返强、免疫后虽然可以减轻发病症状、减少死亡率，但是不能阻止野毒的潜伏感染。天然弱毒株的发现会对控制甚至净化猪伪狂犬病开创新的篇章。

国内疫苗企业常用的保护剂主要是蔗糖、牛奶、明胶等，组方简单，保护性能差。如果在2℃～8℃条件下，保存期只有3～6个月，多需要在-15℃以下保存。而国内传统的动物用疫苗保护剂的研制相对滞后，使疫苗的长期保存和长途运输受到很大限制，加上基层防疫部门缺乏必要的冷冻和冷藏设施，容易因免疫失败而造成疫病流行。所以，耐热保护剂的研究非常急需，发达国家在二十世纪八十年代就已开始进行耐热保护剂的研究，目前已经基本采用耐热冻干保护剂生产冻干疫苗，但由于保护剂的研究和应用属于专利资料，处于保密状况中。

当前，进入中国市场的伪狂犬疫苗均是采用耐热保护剂冷冻的而成，存放温度在2～8℃，存放时间甚至长达30个月，很好的保证了疫苗的使用效果。而我国的伪狂犬活疫苗存放温度仍然是-15℃，进口疫苗对国产疫苗造成了巨大的市场冲击，影响国内生物制品企业的发展。技术的落后也限制了国产疫苗海外市场的拓展。耐热型疫苗的研发势在必行。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供猪伪狂犬病毒天然弱毒株C株，其微生物保藏号是：CCTCC NO：V201114；保藏时间：2011年7月20日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心，CHINA CENTER FOR TYPECULTURE COLLECTION(CCTCC)；保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。

本发明猪伪狂犬病毒天然弱毒C株的基因序列缺失全部的gE和部分的gI。

本发明采用细胞培养、PCR、测序、动物试验等一系列手段研究了猪伪狂犬病毒C株的生物学特性、稳定性、安全性，试验结果表明，该毒株在鸡成纤维细胞CEF上生长良好，对猪是安全的，有很好的稳定性，在连续回传动物5代，都很稳定，不发生变异，为猪伪狂犬弱毒疫苗的研制提供了很好的资源。

一种猪伪狂犬病毒天然弱毒株C株的耐热保存方法，包括以下步骤：

(1)按照以下组分及重量百分比含量备料：

明胶1～3％、蔗糖6～8％、牛血清白蛋白1～3％、胰蛋白胨2～3％、EDTA1～3％、谷氨酸单钠1～3％、磷酸氢二钾1～2％、磷酸二氢钾0.52％，余量为双蒸水；

(2)耐热保护剂的配制：

将明胶、蔗糖、EDTA、胰蛋白胨按上述配比溶于双蒸水中，108～121℃高压灭菌15～30分钟；将牛血清白蛋白、谷氨酸单钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾按上述配比溶于双蒸水中，用0.22μm的滤膜除菌，然后将两种耐热保护剂组份混合，配制成耐热保护剂；

(3)病毒保存：

将该耐热保护剂和伪狂犬病毒培养液根据需要按1∶1.2混合，然后进行冻干；

(4)冻干工艺：

将分装好的病毒装入冻干机箱体内，在2～3小时内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持5～6个小时后，开始抽真空至10^-4帕后，在开始升温，14～16小时内升至-20℃，之后以每小时2～5℃的速度升温至20℃，维持5～6小时加塞出箱，冻干全程为42～46个小时。

在2～8℃条件下保存24个月，病毒效价下降保持在1个滴度内。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)研究了猪伪狂犬病毒C株的生物学特性、稳定性、安全性，试验结果表明，该毒株在鸡成纤维细胞CEF上生长良好，对猪是安全的，有很好的稳定性，在连续回传动物5代，基因序列稳定，没有发生变异，为猪伪狂犬弱毒疫苗的研制提供了很好的资源。

(2)用各种冻干保护剂基质按一定的比例混合、配制，将保护剂分别进行无菌处理，对可以进行高压灭菌的保护剂组份溶于双蒸水中，108～121℃灭菌15～30分钟；将不耐高压灭菌的保护剂组份按配比溶于双蒸水中用0.22μm的滤膜除菌，再将两者混合成为耐热保护剂，然后将该耐热保护剂和伪狂犬病毒液进行1∶1～1.2混合，采用相应的冻干曲线冻干，在2～8℃条件下保存24个月，病毒效价下降不超过1个滴度。

附图说明

图1为P0代病毒正向测序的峰图；

图2为P0代病毒反向测序的峰图；

图3为正向测序的遗传距离结果；

图4为正向测序的序列比对结果；

图5为反向测序的遗传距离结果；

图6为反向测序的序列比对结果；

图7为冻干曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

1、C株的分离、鉴定：从无菌采集脑、心、肝、脾、肺、肾等病料，置-20℃冰箱内保存备用。无菌取病猪脑部与PBS(0.1M，pH7.2)以1∶5(V/V)制成匀浆，反复冻融3次3000r/min，离心15min，取上清液中加双抗，37℃作用18h，经0.45μm滤膜除菌。接种0.5mL病毒滤液于长成单层的PK-15细胞，连续观察，直到出现细胞病变(CPE)为止。通过克隆纯化，获得该毒株。

将PRV阴性血清和阳性血清分别进行10倍系列稀释(血清浓度为10^-1～10^-10)。加等量的200TCID₅₀，37℃感作20min。分别接种96孔板单层PK-15细胞，每孔0.1ml，每个稀释度接种8孔，第11列为空白对照，第12列为标准强毒株对照(200TC1D₅₀)。记录各个梯度的细胞病变数，连续观察5d。同时设标准强毒株(闽A株)与阳性血清及标准强毒株(闽A株)与阴性血清对照方法同上。微量中和试验结果分析：PRV阳性血清特异中和分离毒，抑制细胞病变，说明所分离的病毒是伪狂犬病毒。毒株命名为C株。

2.安全性试验：试验分为4组，每组4只健康的兔子。第一组：每只兔子注射C株1×10⁵TCID₅₀，2mL；第二组：每只兔子注射Bartha K-61株1×105TCID50，2mL；第三组：每只兔子注射闽(A)株1×10⁵TCID₅₀，2mL；第四组：对照组，每只兔子注射PBS 2mL。注射后24h，第三组(闽(A)株)家兔开始表现兴奋不安，食欲下降，48h后不断低头用舌舔、嘴啃或用爪抓接种部位，明显出现瘙痒症状，接种部位被毛脱落、皮肤潮红、出血，暴露出红色肌肉，体温升高，呼吸急促，至72h四肢麻痹，角弓反张，后抽搐而死；第一组(注射C株)、第二组(注射BarthaK-61株)和第四组(对照组)家兔健康无任何症状。说明C株和自然弱毒株BarthaK-61株一样是安全的。

3.毒株返强试验：克隆纯化得来的毒株为原代，即为P0代。用P0代接种7～10日龄伪狂犬病毒抗体阴性的健康仔猪，接种后取三叉神经节、嗅球或扁桃体等组织病料回收病毒，记为P1代。然后用P1代接种仔猪，回收病毒，记为P2代。依次类推，直到P5代。把P0-P5代病毒接种7～10日龄伪狂犬病毒抗体阴性的健康仔猪3头，1.0mL/头(含10^5.0TCID₅₀)，纪录仔猪的体温变化、呼吸症状和神经症状，观察至11d，剖检并观察是否具有结膜炎、浆液性纤维坏死性鼻炎、喉炎、气管炎或坏死性扁桃体炎等组织病理变化。通过测序比较这6个代次的基因变化。

结果显示这6个代次的病毒的临床症状和病理剖检差异不显著。从临床动物试验上可以看出C株连续回归动物，毒性没有返强。

伪狂犬天然弱毒株C株与经典的自然弱毒Bartha-k61类似，有大量核酸缺失。并且在猪体上传代5次后，扩增的目的序列未发现序列插入，即仍有约3500bp的碱基的缺失。缺失区域包括了部分gI，全部gE。

为进一步验证5个代次的疫苗毒是否发生变异和返强，对所扩增的PCR产物进行切胶回收，PCR产物直接送去测序公司进行正反两个方向测序，结果为病毒原代(P0)与其他各代次的正方面的序列同源性在98.5-99.9％，反方向的序列同源性在99.7-100％。说明传代后，扩增的约1500bp目的序列的5’端发生了微量变异，3’端则相当保守。伪狂犬天然弱毒株C株原代与Bartha-K61株的相应位置的序列比较3’端的相似性则达98.7％，而5’端只有96％的相似性，说明和Bartha-K61株不是同一种毒株。

该病毒株基因组的Us区缺失了3692bp，为第122458～126150位核苷酸，其间包括部分gI基因、全部的gE。P0代病毒正反向测序的峰图如图1和图2所示，正向测序的遗传距离结果如图3所示，正向测序的序列比对结果如图4所示，反向测序的遗传距离结果如图5所示，反向测序的序列比对结果如图6所示。

4.C株的耐热保存：通过各种冻干保护剂基质按一定的比例混合、配制，将保护剂分别进行无菌处理，对可以进行高压灭菌的保护剂组份溶于双蒸水中，108～121℃灭菌15～30分钟；将不耐高压灭菌的保护剂组份按配比溶于双蒸水中用0.22μm的滤膜除菌，再将两者混合成为耐热保护剂，然后将该耐热保护剂和伪狂犬病毒液进行1∶1～1.2混合，采用相应的冻干曲线冻干，可在2～8℃条件下保存24个月，病毒效价下降保持在1个滴度。

保护剂的组份包括明胶、蔗糖、EDTA、胰蛋白胨、牛血清白蛋白、谷氨酸单钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾。其特征是：明胶1～3％、蔗糖6～8％、牛血清白蛋白1～3％、胰蛋白胨2～3％、EDTA1～3％、谷氨酸单钠1～3％、磷酸氢二钾1～2％、磷酸二氢钾0.52％。上述各制剂中为干物质组份，百分比剩余份均为蒸双水。保护剂的除菌工艺如下：将明胶、蔗糖、EDTA、胰蛋白胨按上述配比溶于双蒸水中，108～121℃高压灭菌15～30分钟；将牛血清白蛋白、谷氨酸单钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾按上述配比溶于双蒸水中，用0.22μm的滤膜除菌，然后将两种耐热保护剂组份混合，配制成伪狂犬病毒的耐热保护剂。

冷冻曲线如下：将分装好的病毒液装入冻干机箱体内，在2～3小时内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持5～6个小时后，开始抽真空至10-4帕后，在开始升温，14～16小时内升至-20℃，之后以每小时2～5℃的速度升温至20℃，维持5～6小时加塞出箱。冻干全程为42～46个小时，冻干曲线如图7所示。

实施例2

伪狂犬病毒耐热型保存工艺

(1)冻干保护剂的配方及配制方法

耐热成份：明胶1％、蔗糖8％、EDTA1％，然后用双蒸水定溶到合适的刻度。121℃高压灭菌30分钟。

不耐热成份：谷氨酸单钠1％、磷酸氢二钾2％、磷酸二氢钾0.52％，牛血清白蛋白1％、胰蛋白胨2％用双蒸水定溶到合适的刻度，用0.22μm的滤膜除菌。

然后两者按1∶1混合。

(2)伪狂犬病毒经过培养后，进行无菌检验和病毒含量的测定，将合格的病毒液和配制好的冻干保护剂1∶1混合后，充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥。

(3)将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，在3小时内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持6个小时后，开始抽真空至10-4帕后，在开始升温，7小时内升至-20℃，之后以每小时2℃的速度升温至20℃，维持6小时加塞出箱。冻干全程为42个小时。

实施例2

伪狂犬病毒耐热型保存工艺

(1)冻干保护剂的配方及配制方法

耐热成份：明胶3％、蔗糖6％、EDTA1％，然后用双蒸水定溶到合适的刻度。121℃高压灭菌30分钟。

不耐热成份：谷氨酸单钠3％、磷酸氢二钾1％、磷酸二氢钾0.52％，牛血清白蛋白3％、胰蛋白胨2％用双蒸水定溶到合适的刻度，用0.22μm的滤膜除菌。

然后两者按1∶1混合。

(2)伪狂犬病毒经过培养后，进行无菌检验和病毒含量的测定，将合格的病毒液和配制好的冻干保护剂1∶1混合后，充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥。

(3)将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，在2小时内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持8个小时后，抽真空至10-4帕，开始升温，8小时内升至-20℃，之后以每小时2℃的速度升温至20℃，维持8小时加塞出箱。冻干全程为46个小时。

冻干产品的测试

将不同实施案例冻干的产品，置于100℃、37℃、2～8℃条件下保存，不同时间取样，测定病毒含量及其物理性状。

表1冻干制品置于100℃间接煮沸10分钟后的物理性状和TCID₅₀的测定结果

表2冻干前后疫苗于37℃保存不同时间TCID₅₀

表3冻干前后疫苗于2～8℃保存不同时间TCID₅₀

Claims (2)

1.一种猪伪狂犬病毒天然弱毒株C株，其特征在于，猪伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus,PRV）为天然弱毒C株，其微生物保藏登记号为：CCTCC NO:V201114。

2.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬病毒天然弱毒株C株，其特征在于，该病毒株基因组的Us区缺失了3692bp，为第122458～126150位核苷酸，其间包括部分gI基因、全部的gE。 

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