CN102776155B - 牛肠道病毒中国分离株及其感染性cDNA克隆的构建和应用 - Google Patents
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Abstract
牛肠道病毒中国分离株及其感染性cDNA克隆的构建和应用。本发明在牛腹泻粪便样品中分离出能够在MA104细胞上稳定产生CPE的牛肠道病毒分离株，其微生物保藏号是：CGMCC No.4782。本发明用该分离株构建了全长感染性cDNA克隆，将其体外转录后转染细胞获得B族基因2型牛肠道拯救病毒。本发明分离的牛肠道病毒毒株、所构建的全长感染性cDNA克隆及其拯救病毒可应用于牛肠道病毒基因结构与功能的研究、作为牛肠道病毒疫苗载体或制备成预防或治疗牛肠道病毒的疫苗或试剂。
Description
技术领域
本发明涉及牛肠道病毒株及其感染性cDNA克隆，尤其涉及牛肠道病毒中国分离株，本发明还涉及该牛肠道病毒中国分离株的感染性cDNA克隆的构建及其应用，属于牛肠道病毒领域。
背景技术
牛肠道病毒(Bovine Enterovirus，BEV)是小RNA病毒科肠道病毒属的成员。病毒粒子呈球形，二十面体，无囊膜，完整病毒粒子直径约为25～30nm。基因组是单股正链RNA，约由7500个核苷酸(nt)组成，可直接作为mRNA，编码并翻译出一个多聚蛋白，然后经过一系列降解，产生4种结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和7种非结蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)。BEV的衣壳是二十面体，病毒粒子由四种结构蛋白(VP1，VP2，VP3，VP4)组成的60个不对称原粒和单股正链RNA基因组构成。早期的研究将BEV分为两个血清型，即BEV-1和BEV-2；后来随着分子生物学的发展，2006年Roland Zell等人对目前已经分离的牛肠道病毒进行系统的基因序列比较分析，又将牛肠道病毒分为A和B两个族，即BEV-A和BEV-B，在BEV-A和BEV-B之内又分别包含2个和3个基因型。1988年Earle等首次发表了BEV的全基因组序列，目前登录在GenBank数据库中的全基因组序列已有12条。1993年，Smyth等获得了BEV粒子的晶体，并且展示了它的三维立体结构。1999年，McCarthy F M等构建了BEV的感染性cDNA克隆。
肠道病毒是脊椎动物肠道中原有的栖居者，牛肠道病毒可以从患肠道疾病、肺炎及呼吸系统疾病和生殖障碍疾病的病牛分泌物或排泄物中分离获得，也可以从正常牛的粪便样品中分离，还可以从牛粪便污染的环境或水体中分离获得。牛肠道病毒的这种高分离率使得其具有重要的研究价值：首先，尽管在试验条件下牛肠道病毒单独感染一般不会引起临床疾病，但是这种病毒是否具有协同致病作用还有待进一步研究；其次，牛肠道病毒的检出可以作为水体被牛排泄物污染的指标；第三，由于牛肠道病毒具有体外高滴度生长和耐强酸强碱的特性，所以病毒可以作为疫苗的载体；第四，BEV具有融瘤作用，Sedmak等人已经在小鼠身上发现BEV-1能够成功减少肿瘤的数量(Sedmak et al.1972)，所以该病毒具有用于人类癌症治疗的潜力。
1959年Moll和Davis首次分离到BEV，随后其它国家也相继有BEV的分离报道，但目前牛肠道病毒还未在中国获得分离。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株牛肠道病毒中国分离株；
本发明的目的之二是提供所述牛肠道病毒中国分离株的全长感染性cDNA克隆及其所拯救的病毒；
本发明目的之三是将所述的牛肠道病毒中国分离株应用于预防、治疗或检测由牛肠道病毒所致疾病的药物或试剂；
本发明目的之四是将所述的牛肠道病毒中国分离株的全长感染性cDNA克隆及其所拯救的病毒应用于预防、治疗或检测由牛肠道病毒所致疾病的药物或试剂；
本发明是通过以下技术方案来实现上述的目的：
本发明应用MA104细胞在牛腹泻粪便样品中分离出2株能够在MA104细胞上稳定产生CPE的牛肠道病毒，命名为BHM26和BJ50。本发明将BHM26提交到专利认可的机构保藏，其微生物保藏号是：CGMCC No.4782；分类命名：牛肠道病毒(BovineEnterovirus)；保藏时间是2011年4月15日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明所分离的BHM26株和BJ50株病毒在有MgCl2存在的时候对热稳定，在pH值为3～10的环境中稳定存在，能够耐受氯仿等脂溶剂的处理。用感染病毒的单层细胞制备超薄切片，透射电子显微镜进行观察，细胞浆中可见结晶状排列的病毒粒子，单一病毒粒子直径约25～30nm，无囊膜，呈现典型的小RNA病毒粒子形态。
序列比对及遗传进化分析结果显示，这2株病毒均属于B族基因2型牛肠道病毒。包含poly(A)尾结构在内，BHM26和BJ50株的全长基因组序列分别为7433和7416nt。病毒基因组具有小RNA病毒基因组的结构特征，全长基因组包含：VPg-5′UTR-结构蛋白(VP4，VP2，VP3，VP1)编码区-非结构蛋白(2A-2C，3A-3D)编码区-3′UTR-poly(A)尾。对2株病毒的高变基因(VP1和VP3蛋白编码区)进行核苷酸遗传进化分析，2株病毒均与B族基因2型牛肠道病毒在同一进化分支上。上述生物学定性和序列分析结果显示，本发明所分离的2株病毒为牛肠道病毒，分类上属于B族基因2型牛肠道病毒。
本发明进一步的构建了用于拯救B族基因2型牛肠道病毒的全长感染性cDNA克隆。
优选的，所述的牛肠道病毒全长感染性cDNA的构建方法，包括：
(1)、提取所分离的BHM26株的总RNA；
(2)、以所述总RNA为模板，用oligo(dT)引物反转录合成cDNA；
(3)、用根据牛肠道病毒RNA设计带有酶切位点的特异性引物，分段扩增所述cDNA各片段，并分别克隆入质粒载体；
(4)、将上述cDNA各片段连接构成带有基因组全长cDNA的质粒载体，即得。
其中，步骤(3)中所述的特异性引物的核苷酸分别为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9或SEQ ID No.10所示。
将所构建的全长感染性cDNA克隆通过体外转录方法获得的RNA转染细胞，获到B族基因2型牛肠道病毒拯救病毒。本发明将所购建得到的B族基因2型牛肠道病毒全长感染性cDNA克隆提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏号是：CGMCCNo.4781；分类命名：牛肠道病毒(Bovine Enterovirus)；保藏时间是2011年4月15日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
牛肠道病毒作为疫苗载体具有独特的优点，首先，病毒对环境具有强耐受作用，所以易于保存；其次，因为牛肠道病毒是消化道常在病毒，能够诱导粘膜免疫。所以本发明分离的牛肠道病毒毒株、所构建的全长感染性cDNA克隆及其拯救病毒可应用于牛肠道病毒基因结构与功能的研究、作为牛肠道病毒疫苗载体或制备成预防或治疗牛肠道病毒的疫苗或试剂。
附图说明
图1牛肠道病毒BHM26基因组拼接策略示意图。
图2牛粪便样品接种MA104细胞；A.牛粪便样品接种的MA104细胞(200×)；
B.正常MA104细胞(200×)。
图3病毒粒子的形态学观察。
图4BEV保守区段的RT-PCR扩增。
图5BHM26和BJ50毒株1C和1D蛋白编码区遗传进化分析。
图6全基因组cDNA的酶切鉴定图：A：DL15000Ladder；B：Nde I和Bgl II双酶切(7.4+2.1kb)鉴定；C：DL15000Ladder；D：Bgl II单酶切鉴定(9.5kb)。
图7(A)拯救病毒感染的MA104细胞；(B)正常MA104细胞。
图8拯救病毒分子标签的鉴定；(A)Lane1：DL2000DNA Ladder；Lane2：拯救病毒PCR产物PvuII酶切鉴定；Lane3：亲本病毒PCR产物PvuII酶切鉴定；(B)亲本毒株基因组PvuII位点区的序列分析；(C)拯救病毒PvuII位点消除的序列分析验证。
图9拯救病毒感染细胞的IFA检测；A：拯救病毒感染的MA104细胞；B：亲本病毒感染的MA104细胞；A：正常MA104细胞对照。
图10拯救病毒和亲本病毒的一步生长曲线；BHM026为亲本病毒，C34-2为拯救病毒。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
材料和仪器
1.试验材料
MA104细胞为本发明人研究室保存，培养液为含8％胎牛血清的DMEM。牛粪便样品系2008年采自北京、内蒙古、黑龙江及安徽等地奶牛场，-70℃冻存。PrimeSTAR DNA聚合酶、Primescript反转录酶、oligo(dT)引物、各种限制性内切酶、dNTPs、DNALadder Marker、5’FULL-RACE Kit均购自TaKaRa公司；碱性磷酸酶、T4DNA连接酶(New England Biolabs公司)、Trizol购自GibcoBRL公司；体外转录采用Promega公司的RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems-T7试剂盒；转染试剂采用QIAGEN公司的
Transfection Reagent转染试剂盒；羊抗兔荧光二抗购自Sigma公司；SDS、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母抽提物、Tris、EDTA、焦碳酸二乙酯(DEPC)等试剂均为国外产品国内公司分装；氯化钠、氯仿、异丙醇、乙醇、异戊醇、NaCl、MgCl2、磷酸二氢钠、饱和酚等均为国产分析纯试剂。
2.主要仪器设备
各种规格移液器及5415R、5810R高速台式低温离心机(德国eppendorf公司)；MCO-15AC二氧化碳培养箱、MDF-U32V超低温冰箱(日本SANYO公司)；IX51倒置显微镜
(OLYMPUS公司)；生物二级安全柜(美国LABCONCO公司)；DK-8D电热恒温水槽(上海精宏)；空气浴恒温摇床(KYC 100B，上海福玛实验设备有限公司)；旋涡混合器(QL-901，江苏海门麒麟医用仪器厂)；PCR仪(MyCycl erTM型，美国Bio-Rad公司)；GIS-2020全自动凝胶成像系统(上海天能)；YDS60/210液氮罐(新乡豫新航空低温容器)；ASTACUS小型超纯水仪(德国MEMBRAPURE公司)。
实施例1牛肠道病毒中国分离株BHM26的分离及鉴定
1实验方法
1.1病料处理
新鲜采集的粪便样品，用PBS制成1∶10(W/V)粪便悬液，漩涡振荡器震荡，反复冻融三次，3000r/min，4℃离心10min，取上清，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后，于-70℃冰箱保存备用。
1.2病毒分离培养
用PBS将已长成单层的MA104细胞洗3遍，处理好的粪便样品接种到MA104单层细胞，37℃吸附1h，加入无血清的DMEM，在含5％CO2条件下于37℃培养，每天观察细胞病变
(CPE)。如果细胞培养1周后仍无CPE，或者接种后细胞呈现50％-80％CPE时，将细胞培养物反复冻融3次，并收获。用同样方法将0.1ml上一代细胞培养物接种MA104细胞进行传代。
1.3病毒半数组织感染量(TCID50)的测定
病毒的接种方法与方法4相同。将病毒作10倍连续倍比稀释即10-1，10-2，10-3……10-11，每孔加病毒悬液量为100μl，每个稀释度作8孔，每块板的最后一列设8孔细胞对照。把培养板置5％CO2温箱37℃培养，逐日观察细胞病变，记录结果。按Reed-Muench氏法计算TCID50。
举例说明
TCID50计算(接种剂量100μl)
lgTCID50＝高于50％病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数
高于50％病毒稀释度的对数为-6，距离比例为0.26，稀释系数的对数为-1。
lgTCID50＝-6+0.26×(-1)＝-6.3
则TCID50＝10-6.3/0.1ml，即病毒作10-6.3稀释，每孔接种100μl，可使半数组织培养管发生病变。
1.4氯仿敏感性试验
病毒培养物加入终浓度为5％的氯仿，4℃振摇10min，然后将混合物反复吹打使氯仿挥发。对照组病毒培养物不加氯仿，同样处理。将处理后病毒培养物用MA104细胞测定其TCID50。
1.5温度敏感性试验
病毒培养物中加入终浓度为1M的MgCl2，相同混合物的不同等分在56℃条件下分别作用15min，30min，1h，2h和3h；相同混合物的不同等分分别在50℃，56℃，60℃，70℃和80℃条件下作用1h。将所有处理后病毒培养物用MA104细胞测定其TCID50。
1.6pH敏感性试验
将不同等份的病毒培养物的pH值分别调至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11，将其置37℃水浴中作用2h。将所有处理后病毒培养物用MA104细胞测定其TCID50。
1.7病毒粒子的电镜观察
取病毒上清，接种单层MA104细胞，6～8h后，送哈尔滨兽医研究所电镜室制备超薄切片，于JEM-1200EX电镜下观察病毒粒子。
1.8RT-PCR
(1)引物设计：通过比对已经登录在GenBank数据库中12条牛肠道病毒全基因组核苷酸序列，设计牛肠道病毒BHM26和BJ50株的测序引物(表1)。根据牛肠道病毒BHM26株的全基因组测序结果，设计构建全长cDNA的拼接和组装引物(表2)。
表1牛肠道病毒BHM26和BJ50株的测序引物
a加黑字体表示为非BEV序列。为了优化PCR反应条件而引入G和C碱基。
*5′RACE试剂盒所用到的BEV特异性下游引物。
b用于扩增BHM26株基因组的引物。
c用于扩增BJ50株基因组的引物。
d同时用于扩增BHM26和BJ50株基因组的引物。
表2构建cDNA克隆所用的引物(其中M-1和M-2为定点突变引物)
(2)RNA提取：Trizol法提取病毒细胞培养物的总RNA，具体操作按说明书进行。
(3)RT-PCR：首先是以提取的总RNA为模板进行的反转录(RT)反应，反应体系如下(25μl)：
反应条件为：25℃10min，42℃1h。
其次是以反转录的cDNA为模板进行PCR反应，反应体系如下(25μl)：
反应条件为：94℃预变性4min，94℃45S，50℃45S，72℃1min 30个循环，最后72℃延伸10min。
(4)5′RACE：5′末端序列用5’FULL-RACE试剂盒进行扩增，具体操作按试剂盒说明书进行。采用“去帽法原理”，测定病毒基因组5’末端的真实序列。简言之，用Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)去掉mRNA的5’端帽子结构，之后用T4RNALigase将5’RACE Adaptor连接到mRNA的5’端，最后用5’RACE Adaptor上的引物与已知序列部分的引物进行反转录和PCR扩增5’末端序列，采用的引物见表1。
a.反转录：按照Trizol试剂产品说明书提取病毒RNA，反转录引物为606L24，按步骤(3)所示反应体系及反应条件进行反转录。
b.PCR扩增：外套PCR反应体系为50μl：5x缓冲液10μl，dNTPs(2.5mM)4μl，5’RACE试剂盒外套引物2μl，BEV特异性下游引物606L242μl，DNA聚合酶1μl，水26μl，cDNA模板5μl。内套PCR反应体系为50μl：5x缓冲液10μl，dNTPs(2.5mM)4μl，5’RACE试剂盒内套引物2μl，BEV特异性下游引物534L242μl，DNA聚合酶1μl，水26μl，cDNA模板5μl。PCR反应程序：首先94℃变性4min，再按以下参数进行25个循环：94℃1min，56℃30s，72℃30s，最后72℃延伸10min。
(5)3′末端RT-PCR：因牛肠道病毒基因组3′末端具有poly(A)尾结构，所以应用oligo(dT)引物反转录合成cDNA，然后应用oligo(dT)引物和上游BEV特异性引物进行PCR扩增，获得3′末端真实序列，采用的引物见表1。
1.9序列测定与分析
PCR扩增产物用上海华舜生物工程公司生产的凝胶回收试剂盒回收纯化，纯化产物直接送上海生物工程公司进行序列测定，用MegAlign软件将测序结果与国际已知毒株的相应基因序列进行比对分析。
2、实验结果
2.1.牛肠道病毒BHM26和BJ50株的分离鉴定
经处理的粪便样品接种已长成单层的MA104细胞并吸附1h，逐日观察细胞病变。编号为26和99050的两份样品接种细胞后传至第2代，细胞出现明显的CPE，分别命名为BHM26和BJ50。2株病毒在MA104细胞上的CPE表现相同，主要表现为细胞皱缩变圆、边缘模糊、集聚、漂落(图2)。传至第3代细胞病变稳定出现。对分离的病毒进行3次噬斑纯化，进行下一步的鉴定。BHM26株和BJ50株在MA104细胞上的生长滴度分别为107.3TCID50/ml和107TCID50/ml。制备感染病毒的单层细胞的超薄切片，透射电子显微镜观察，在细胞质中可见匀称排列的病毒粒子的结晶，单个病毒粒子的直径大约25～30nm，无囊膜结构(图3)。这符合小RNA病毒的形态特征。2株病毒经5％氯仿4℃振摇处理10分钟后，测定处理病毒与未处理病毒的TCID50，结果显示，2株病毒对乙醚不敏感。在有MgCl2存在的前提下，2株病毒可在70℃的环境中稳定存在1h。2株病毒在pH 2-10的环境中能够稳定存在。上述理化特性显示，2株病毒对环境具有较强的抵抗力，这也符合牛肠道病毒的特性。
表1中的6424U24和7450L24引物是针对BEV高度保守的部分3D蛋白编码区和全长3′UTR而设计的，可作为BEV检测引物。用该引物对两株病毒进行RT-PCR扩增，结果显示，两株病毒均能扩增出与预期大小一致的1026bp的DNA片段(图4)。将PCR产物直接测序，并将测定的序列进行比对分析，BHM26和BJ50毒株的扩增序列和BEV参考毒株Jena38/02的相应序列分别具有86％和88％的核苷酸序列同源性。结果表明，本发明分离的两株病毒为牛肠道病毒，牛肠道病毒的分离在中国尚属首次。
2.2.BHM26和BJ50株的全长基因组序列测定
针对BHM26和BJ50毒株的全基因组分别设计10对和8对重叠引物(表1)，分别扩增覆盖BHM26和BJ50基因组全长的10个和8个重叠片段。5′末端序列用5′RACE试剂盒进行扩增。3′末端序列用oligo(dT)引物和BEV特异性上游引物进行扩增。所有PCR产物经凝胶回收纯化后直接测序。应用DNASTAR软件包中的SeqMan II软件将测定的DNA片段拼接为完整全基因组序列，同时应用DNASTAR软件包中的EditSeq软件推导两个毒株的全长氨基酸序列。BHM26和BJ50株的基因组全长分别为7,433bp(SEQ ID No.1)和7,416bp，分别包含42A和21A的poly(A)结构。基因组结构具有小RNA病毒典型的结构特征，主要包括5′UTR，一个大的开放阅读框(single openreading frame，ORF)，3′UTR和poly(A)尾结构。BHM26和BJ50的ORF均编码含有2,167个氨基酸残基(SEQ ID No.2)的多聚蛋白。
2.3BHM26和BJ50株的序列比对及遗传进化分析
将两个分离株的基因组分成5′UTR、3′UTR、P1、P2和P3区，对两个毒株的每个区段的核苷酸序列与BEV参考毒株的相应核苷酸序列进行同源性比对。对5′UTR、3′UTR、P1、P2和P3区而言，两个分离株与BEV-B毒株的核苷酸序列同源性分别为86.3～89.6％，90.1～97.2％，75.2～75.9％，78.7～80.9％和80.3～84.6％；而与BEV-A毒株的核苷酸序列同源性分别为78.2～78.8％，77.1％，62～63.4％，66.8～69.5％和68.4～69.7％(表3)。结果表明，两个分离株分类上应属于BEV-B。对两株病毒的高变基因(1C和1D蛋白编码区)的遗传进化分析显示，两株病毒与B族基因2型BEV位居同一进化分支上(图5)，结果表明，本发明所分离的2株病毒BHM26和BJ50均属于B族基因2型牛肠道病毒。
表3.BHM26和BJ50株与牛肠道病毒参考毒株核苷酸及氨基酸序列同源性比较
a对5′UTR和3′UTR而言，表格右上方的值代表5′UTR的核苷酸序列同源性，表格左下方的值代表3′UTR的核苷酸序列同源性。
b对P1，P2和P3而言，表格右上方的值代表核苷酸序列同源性，表格左下方的值代表氨基酸序列同源性。
实施例2、2型牛肠道拯救病毒的构建及鉴定
1.全长感染性cDNA克隆的构建
用Trizol法从牛肠道病毒BHM26株的细胞培养物中抽提牛肠道病毒基因组RNA。然后用oligo(dT)-15进行反转录，以此反转录产物为模板，用表2中引物扩增覆盖基因组全长的A、B、C 3个重叠片段。通过PCR扩增，在病毒基因组5’端引入T7RNA聚合酶启动子序列，在病毒基因组的3’端引入Bgl II限制性酶切位点。用定点突变技术，在病毒基因组4074nt位置将C突变为T，使该位置CAGCTG(PvuII)变为TAGCTG，消除PvuII酶切位点作为分子标记。将3个片段由3’端到5’端顺次拼接克隆于经改造的pOK12载体，拼接完成的含基因组全长cDNA质粒被命名pOKT7-BHM26。拼接策略见图1。再将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。挑取菌落，扩增培养，用碱裂解法小量提取质拉。用限制酶完全消化法鉴定阳性质粒。结果显示，采用Nde I和Bgl II双酶切鉴定重组质粒，可见分子量分别约为7.4kb和2.1kb的插入基因组片段和pOK载体片段；采用BglII单酶切鉴定重组质粒，可见分子量约为9.5kb的插入片段和pOK载体重组片段(图6)。
2.细胞外转录
采用RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems-T7系统进行细胞外转录，反应体系为：25mmol/L rNTP 6μl，5×缓冲液4μl，T7RNA聚合酶混合液2μl，BglII线性化的pOKT7-BHM26重组质粒8μl(2g)，总体积为20μl。将反应物充分混匀后，于37℃温育2～4h，用无RNA酶的DNA酶消化，除去DNA模板，按酚氯仿抽提方法纯化转录产物。
3.转染
MA104细胞在6孔板中生长至70％～90％单层时，用PBS洗2遍，加1.5mL正常细胞培养液。将细胞外转录获得的RNA转染MA 104细胞，进行病毒拯救。转染按QIAGEN公司的
Transfection Reagent转染试剂盒说明书进行，转染的细胞在5％CO2于37℃培养4h，用无血清的DMEM更换培养基继续培养，观察细胞病变，大约3d左右收获病毒，反复冻融3次后传代接种MA104细胞，直到病毒能稳定产生CPE。
4.间接免疫荧光
将转染后收获的细胞培养物上清或牛肠道病毒BHM26株的细胞培养物上清接种96孔板上的MA104细胞，待产生明显的细胞病变后，用预冷的无水乙醇固定20min，漂洗后吸净残液，室温干燥。加入牛肠道病毒特异性多克隆抗体(1∶200)50μl/孔，置湿盒中，37℃作用1h。用PBS洗3次，滴加羊抗兔FITC(1∶200)，置湿盒，37℃孵育50min。PBS洗3次，于倒置荧光显微镜下观察，用Leica成像系统拍照记录。
5.病毒的一步生长曲线
将预接种病毒稀释成106TCID50，各取1mL分别接种MA104细胞，37℃吸附1h后用PBS洗2遍，加无血清的维持液继续培养。在1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h和22h的时间点分别测定每瓶培养物的TCID50。每个时间点做3个重复，以病毒生长时间为横坐标，以病毒在不同时间点的TCID50平均值为纵坐标，绘制病毒的一步生长曲线。
6.B族基因2型牛肠道病毒的拯救
用体外转录的RNA转染MA104细胞后52h，细胞出现CPE，表现为细胞变圆，集聚，脱落，最后崩解成碎片(图7A)。将细胞培养物连续传代，细胞病变出现的时间缩短，病变更加典型，传至第3代细胞可在接种病毒后8h出现明显CPE，培养12h可使80％细胞单层脱落形成空斑。而对照细胞的形态正常(图7B)。
7.拯救病毒分子标记的验证
序列比较分析表明，所有野生型B族基因2型牛肠道病毒基因组在4074位存在PvuII酶切位点(CAGCTG)，因此在构建全长cDNA克隆时将4074位的PvuII酶切位点消除，作为分子标记。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收后用PvuII酶切，1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。结果表明，亲本毒株的PCR产物被切成预期大小约为269bp和705bp两个片段，拯救病毒的PCR产物未被切开，大小约为974bp，这与预期结果一致(图8A)。同时，对PCR扩增产物胶回收后进行序列测定表明，亲本毒株具有PvuII酶切位点(图8B)，而拯救病毒的PvuII酶切位点消失(图8C)。因此，排除了在拯救病毒过程中污染亲本毒株的可能性。
8.拯救病毒的免疫特异性鉴定
将亲本病毒和拯救病毒分别感染MA104细胞后用牛肠道病毒特异性多克隆抗体进行免疫荧光检测，可见拯救的子代病毒(图9A)和亲本病毒(图9B)感染的MA104细胞均有特异性免疫荧光产生，而正常细胞(图9C)没有出现荧光反应。免疫特异性检测结果表明，拯救的病毒为牛肠道病毒。
9.拯救病毒的增殖特性
将拯救病毒和亲本毒稀释成106TCID50，各取1mL分别接种MA104细胞，吸附1h后用PBS洗去未吸附的病毒。在接种后第1h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，14h，16h，18h，20和22h分别收获病毒，测定每个时间点收获病毒的TCID50，绘制一步生长曲线，以比较拯救病毒和亲本病毒在MA104细胞上的增殖特性和复制能力。结果表明，拯救病毒与亲本病毒的复制能力和增殖特性相近(图10)。
Claims (6)
1.一株牛肠道病毒（Bovine Enterovirus）中国分离株，其特征在于，其微生物保藏号是：CGMCC No.4782。
2.牛肠道病毒（Bovine Enterovirus）中国分离株的全基因，其特征在于：其核苷酸为SEQ ID No.1所示。
3.权利要求2所述全基因所编码的蛋白，其特征在于：其氨基酸为SEQ ID No.2所示。
4.权利要求1所述的牛肠道病毒（Bovine Enterovirus）中国分离株的全长感染性cDNA克隆的构建方法，包括：
（1）、提取权利要求1所述牛肠道病毒中国分离株的总RNA；
（2）、以所述总RNA为模板，用oligo(dT)引物反转录合成cDNA；
（3）、用根据牛肠道病毒RNA设计带有酶切位点的特异性引物，分段扩增所述cDNA各片段，并分别克隆入质粒载体；所述的特异性引物的核苷酸分别为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9或SEQ ID No.10所示；
（4）、将上述cDNA各片段连接构成带有基因组全长cDNA的质粒载体，即得。
5.B族基因2型牛肠道病毒的全长感染性cDNA克隆，其特征在于：其微生物保藏号是：CGMCC No.4781。
6.权利要求5所述的全长感染性cDNA克隆在拯救B族基因2型牛肠道病毒中的应用。
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