CN103160619A

CN103160619A - 一种腺病毒多重荧光定量pcr检测试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN103160619A
Application number: CN2013101227395A
Authority: CN
Inventors: 辛忠涛; 牛宇辰; 姜曰晓; 张英民
Original assignee: BEIJING BOHAITONGDA BIOTECH Co Ltd
Current assignee: Beijing Haske biological science and Technology Co Ltd
Priority date: 2013-04-10
Filing date: 2013-04-10
Publication date: 2013-06-19

Abstract

本发明公开了一种腺病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR反应液、引物探针组合、阳性质控品、阴性质控品，还包括核酸提取用液及核酸提取用内参照品；所述内参照品为灭活的T4噬菌体，所述引物探针组合包括腺病毒核酸用引物探针（通用：SEQ ID NO4-6；分型SEQ ID NO7-9）及内参照品用引物探针(SEQ ID NO1-3)，其中SEQ ID NO3、6、9的5’端连接荧光报告基团，3’端连接荧光淬灭基团；本发明还公开了上述试剂盒的使用方法，在荧光定量PCR检测反应前还采用核酸提取用液进行病毒核酸提取，并在病毒核酸提取过程中加入所述内参照品；本发明的试剂盒及其使用方法具有使用便捷、检测结果准确的特点，其不仅可以对所有腺病毒进行检测，还可以对B和E亚群进行分型。

Description

一种腺病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及一种腺病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。衣壳含有240个六联体、12个五联体及12根纤毛，除此之外还有其他一些小蛋白，如VI、VIII、IX、IIIa和IVa2等。六联体是形成病毒衣壳20个三角形面的主要蛋白，12个顶端是5个五联体亚单位和3个纤毛蛋白构成的复合物，12根纤毛以五联体蛋白为基底由衣壳表面伸出，纤毛顶端形成头节区。五联体和纤毛的头节区可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。

自上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人腺病毒迄今已发现有58种，分为A、B、C、D、E和F六个亚群。腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染，但大多数腺病毒对于正常人，并不能引起致死性的感染，对于一些免疫抑制的病人（如HIV和骨髓移植），腺病毒感染是引起死亡的主要原因之一，而且这些感染不分病毒型别，均有致死性。因此，开发一种新型的能够检测出所有已知腺病毒的快速检测试剂是非常必要的。我国以及其它国家大量的流行病学调查显示，腺病毒又具有明显的季节和地域流行特征，其中尤以B亚群的Adv3,7,11,14,16,21以及E亚群的Adv4发病率高，而且往往造成爆发流行。

传统腺病毒诊断检测方法通常依赖病毒分离培养和血清学检查，病毒分离费时、费力、敏感性和准确度差，而且一些腺病毒至今尚不能有效分离，血清学不仅灵敏度和特异性差，而且在腺病毒易感的两个人群（免疫抑制人群和儿童）中均存在取样依从性差的问题。

近年来，随着分子生物学的发展,PCR技术在腺病毒检测中的广泛应用，为临床病原体的检测提供了一种快速、特异、敏感、高效的手段，特别是TaqMan荧光定量PCR技术在腺病毒的检测和分型中越来越显示出强大的应用前景。目前已经开发了多种基于常规PCR和荧光定量PCR的腺病毒通用检测方法，但这些方法或只能进行腺病毒的通用检测，或只能按照腺病毒的亚群进行病毒分型检测。

大量研究发现，由于TaqMan荧光定量PCR灵敏度非常高，在样本荧光定量检测过程中，很容易受到一些因素的影响而使结果不准确：（1）样本中存在许多物质，会对PCR反应产生抑制作用，如粪便标本中的胆盐、血液中的血红素及尿中的尿素等；（2）试验操作人员的操作失误会造成样本核酸的丢失，从而导致目的核酸量减少而出现假阴性结果；（3）样本分离过程中残留的提取试剂如乙醇和酚等也能够抑制扩增反应；（4）反应系统的影响因素，如不合适的储存条件所造成的目的片段降解、酶活性下降等导致的检测结果不准确。因此，在做核酸扩增实验时，需要设置严格的内参照品来监控反应进行。根据所加内标物的不同，可分为外标法定量PCR和内标法荧光定量PCR。由于外标法存在不同标本间扩增效率的差异和标本提取的细微变化都将导致扩增产物的巨大差异，为了清除这种影响，国内外都推崇采用内标法，即在试剂中加入竞争性或非竞争性内标，可有效检测核酸提取、扩增及产物分析中出现的误差，从而避免假阴性结果。

竞争性内标是在同一反应内，采用两对不同的引物，同时扩增来自检测靶序列和内标序列，该方法的主要优点是制备简单，可在一定程度上排除样本间的差异，但有时存在目标序列所用扩增引物和探针与内参序列所用引物和探针竞争的情况发生。而竞争性内标，则是构建一个与靶序列相同的扩增效率和引物结合微点仅探针结合位点不同的内标，在同一反应管内，靶基因与内标物和引物竞争性结合，进行同步扩增。

不管是竞争性内标还是非竞争性内标，主要采用三种形式：1）质粒或DNA、RNA片段：这种形式的内标制备简单，但往往不稳定，而且质粒极易形成气溶胶，很容易造成PCR过程的污染，特别是由于是DNA片段，往往不参与样本提取的过程，只在荧光定量PCR的过程中加入，因此只能监控PCR过程，而不能监控样本提取质量的好坏。目前文献报导的腺病毒荧光定量PCR检测的论文，主要是采用质粒作为内参照品或质控品；2）病毒颗粒：主要包括减毒、灭活病毒或阳性患者血浆和血清，采用这些病毒颗粒作为内参照品，可以监控病毒颗粒的释放和核酸提取效率，弥补了质粒DNA或裸露DNA、RNA片段作为内参品或质控品的不足，但由于常规病毒颗粒制备运输困难，而且对于一些来源于病人标本的病毒颗粒（HBV和HCV）也存在伦理学的问题，因此较少用;3）病毒样颗粒：某些病毒如MS2噬菌体、丝状噬菌体、Lamda噬菌体和烟草花叶病毒(TMV)的外壳可以耐受RNase和DNase的作用，因此可将外源性的靶序列包裹到这些病毒的外壳内，就可以使其免受环境中的RNase和DNase的降解。这一技术比较经典的是基于MS2噬菌体的ArmoredRNA技术制备的质控品，由于这种病毒样颗粒的稳定性高，而且也容易制备，并在最大程度上模拟天然病毒，因此已经在Roche和Abbott等公司的RNA诊断产品中广泛使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于实验室内使用的、便捷的腺病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，检测结果准确。

本发明的另一个目的在于提供上述腺病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种腺病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR反应液、引物探针组合、阳性质控品、阴性质控品，还包括核酸提取用液及核酸提取用内参照品；

所述内参照品为灭活的T4噬菌体，所述引物探针组合包括腺病毒核酸用引物探针及内参照品用引物探针，所述内参照品用引物探针为：

SEQ ID NO1:CCATCCATAGAGAAAATATCAGAACGA；

SEQ ID NO2：TAAATAATTCCTCTTTTCCCAGCG；

SEQ ID NO3：AACCAGTAATTTCATCTGCTTCTGATGTGAGGC,其5’端连接荧光报告基团，3’端连接荧光淬灭基团。

进一步地，所述腺病毒核酸用引物探针包括通用型引物探针：

SEQ ID NO4:GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT；

SEQ ID NO5:GCCCCAGTGGTCTTACATCATGCACATC；

SEQ ID NO6:TGCACCAGACCCGGGCTCAGGAGGTACTCCGA，其5’端连接荧光报告基团，3’端连接荧光淬灭基团。

进一步地，所述腺病毒核酸用引物探针还包括B和E亚群分型引物探针：

SEQ ID NO7：GATGGCCACCCCATCGATGMTGC

SEQ ID NO8：GCGAACTGCACCAGACCCGGAC

SEQ ID NO9：TACATGCACATCGCCGGACAGGAMGCTTCGGAGT，其5’端连接荧光报告基团，3’端连接荧光淬灭基团。

进一步地，所述5’端荧光报告基团为ROX、FAM、VIC、HEX、Cy3或Cy5，3’端荧光萃灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3。

进一步地，所述核酸提取用液包括裂解液、核酸结合液、洗涤液，其中：裂解液主要是由如下组份组成：胍盐浓度为5-8M；Tris-HCl浓度为10-100mM,pH值为5.0-6.7；EDTA浓度为10-100mM；核酸结合液是由非结晶的二氧化硅经盐酸处理配制而成；洗涤液是用DEPC处理的去离子水配制70%的乙醇。

上述腺病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法，包括荧光定量PCR检测反应，在荧光定量PCR检测反应前还采用所述核酸提取用液进行病毒核酸提取，并在病毒核酸提取过程中加入所述内参照品，对应地，在荧光定量PCR检测反应中加入所述的内参照品用引物探针。

由于采用以上技术方案，本发明具有以下有益效果：

（1）相对以往发表的文献（只提供扩增方法，在提取上采用商品化的提取试剂），本试剂盒提供从核酸提取以及PCR扩增的全过程试剂，按照此试剂盒进行操作，不需要其它额外试剂就可完成腺病毒的检测工作，具有便捷的特点。同时，以往方法往往采用质粒作为内参照品，且质粒不参与核酸提取的过程，而本发明采用灭活的T4噬菌体作为核酸提取用内参照品，同时针对T4噬菌体设计特异性的引物探针，在样本提取前就把T4噬菌体加入到样品中，这样加入的T4噬菌体可与可能出现的病毒核酸一同被提取出来，通过检测T4噬菌体核酸提取量的多少以及提取的核酸样本中是否含有抑制下游PCR反应的物质，因此就可以监控样本提取过程是否有效，灭活的T4噬菌体具有制备方便、成本低廉且稳定的特点。

（2）通过针对腺病毒的保守区设计特异性的引物探针，可用于腺病毒所有血清型的检测。

（3）通过针对常见流行的AdvB和AdvE两个亚群的保守区设计特异性的引物探针，引物和探针与其它血清型的腺病毒反应无交叉，只特异性地检测AdvB和AdvE两个亚群。

（4）该试剂盒不仅可以完成对所有腺病毒的检测，而且还可以对引起常见流行的AdvB和AdvE两个亚群的腺病毒进行分型检测。

（5）核酸提取用液可以在15min内从粪便、血清以及口腔拭子等标本中提取高质量的核酸，满足下游PCR反应需求。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1是从口腔拭子中检测腺病毒7型的检测结果示意图；其中1a为分型引物探针检测阳性质控，1b为通用引物探针检测阳性质控，1c为分型引物探针检测Adv7，1d为通用引物探针检测Adv7，1e为内参照品，1f为阴性质控；

图2是从粪便标本中检测腺病毒40型的检测结果示意图；其中2a为通用引物探针检测阳性质控，2b为分型引物探针检测阳性质控，2c为通用引物探针检测Adv40，2d为内参照品，2e为阴性质控；

图3是从血清标本中检测腺病毒3型的检测结果示意图；其中3a为分型引物探针检测阳性质控，3b为通用引物探针检测阳性质控，3c为分型引物探针检测Adv3，3d为通用引物探针检测Adv3，3e为内参照品，3f为阴性质控；

图4是试剂盒的非特异性检测结果示意图；其中4a为分型引物探针检测阳性质控，4b为通用引物探针检测阳性质控，4c为内参照品，4d为非特异性检测样品；

图5是试剂盒的通用引物探针灵敏度检测结果示意图（图中自左至右所对应的病毒滴度依次为10⁷,10⁶,10⁵,10⁴,10³TCID₅₀/ml）。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的一种腺病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括核酸提取用液（裂解液、核酸结合液、洗涤液）、PCR反应液、引物探针组合、核酸提取用内参照品、阳性质控品及阴性质控品。

（1）裂解液

裂解液是主要由如下组份组成：胍盐（异硫氰酸胍、盐酸胍），浓度为5-8M；Tris-HCl浓度为10-100mM,pH值为5.0-6.7之间，EDTA浓度为10-100mM。

（2）核酸结合液

核酸结合液是由非结晶的二氧化硅经盐酸处理配制而成，在酸性条件下，经裂解液裂释放的病毒核酸可以结合到结合酸结合液中的二氧化硅颗粒上。

（3）洗涤液

用DEPC处理的去离子水配制70%的乙醇。

（4）PCR反应液

包括Tris-HCl,5-50mM,pH为8.0-8.5,KCl浓度在50-100mM之间,MgCl₂浓度在1.5-5.0mM之间，dNTP(0.2-0.5μM),化学修饰的热启动酶(0.0125-0.125Units/μl)，UNG酶（0.5-1.0Unit/反应），非离子变性剂（Tween-20,Triton X-100,NP40）(0.05-0.1%)等。

（5）引物探针组合（包括腺病毒核酸用引物探针及内参照品用引物探针）

引物和探针是根据靶基因序列合成的特异性的寡核苷酸片段，均经HPLC纯化，探针在5’端标记荧光基团，常见的荧光基团为FAM、VIC、HEX、Cy3、Cy5和ROX,探针在3’端标记萃灭基团，常见的萃灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2和BHQ3，引物和探针在PCR反应体系中的浓度为200-900nM。本发明所用的引物和探针序列如下：

针对T4噬菌体的rIIA基因（X52686.1）设计引物和探针，该引物探针与人基因组无交叉，相关序列如下，核苷酸位置为该引物或探针在X52686.1序列上的位置：

SEQ ID NO1：CCATCCATAGAGAAAATATCAGAACGA（2165-2139）；

SEQ ID NO2：TAAATAATTCCTCTTTTCCCAGCG（2088-2065）；

SEQ ID NO3：HEX-AACCAGTAATTTCATCTGCTTCTGATGTGAGGC-BHQ1（2122-2090）。

针对所有腺病毒hexon基因在所有腺病毒的保守区域设计引物和探针，该引物和探针可检测所有已知的58个腺病毒血清型。

SEQ ID NO4：GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT；

SEQ ID NO5：GCCCCAGTGGTCTTACATCATGCACATC；

SEQ ID NO6：FAM-TGCACCAGACCCGGGCTCAGGAGGTACTCCGA-BHQ1。

针对所有腺病毒B和E两个亚群hexon基因保守区域设计引物和探针，该引物和探针可检测已知的腺病毒B和E两个亚群，而不能检测A,C,D,F亚群，引物探针序列如下，核苷酸位置为该引物或探针在JX423388.1序列上的位置。

SEQ ID NO7：GATGGCCACCCCATCGATGMTGC（18351-18373）；

SEQ ID NO8：GCGAACTGCACCAGACCCGGAC（18446-18425）；

SEQ ID NO9：ROX-TACATGCACATCGCCGGACAGGAMGCTTCGGAGT-BHQ2（18385-18418）。

（6）内参照品

是经大肠杆菌培养的T4噬菌体，并经加热和紫外线双重灭活，并经大肠杆菌增殖确保100%灭活。在使用试剂盒提取样本核酸前，按照5-50μl体积加入到每个样本中，随样本核酸的提取，T4噬菌体的DNA也被提取出来。正常情况下，在荧光定量PCR检测中，应均为阳性，Ct值在25-30Ct之间，如为阴性，则证明样本提取效率不高、样本中存在抑制PCR反应的物质或PCR反应的试剂出现问题。

（7）阳性质控品

为体外培养的腺病毒3型培养物，并经加热和紫外线双重灭活。在试剂盒中阳性质控品作为一个阳性对照，参与样本提取和PCR反应过程，作为一个独立于样品的质控品，监控反应体系是否正常，正常情况下不论腺病毒通用（SEQ ID NO4、5、6）还是腺病毒AdvB&AdvE分型（SEQ ID NO7、8、9）均为阳性，如为阴性，证明反应过程出现异常，应重复检测。

（8）阴性质控品

为体外培养的HSV-1病毒，并经加热和紫外线双重灭活。在试剂盒中阴性质控品作为一个阴性对照，参与样本提取和PCR反应过程，作为一个独立于样品的阴性质控品，正常情况下应为阴性，如在荧光定量PCR过程中有起峰或有明显Ct值，证明样本被污染，反应无效，应重新重复试验。

上述腺病毒荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法，包括荧光定量PCR检测反应，在荧光定量PCR检测反应前还采用上述核酸提取用液进行病毒核酸提取，并在病毒核酸提取过程中加入上述内参照品，对应地，在荧光定量PCR检测反应中加入上述的内参照品用引物探针。

所有PCR反应在一个管内完成，这样通过一次PCR反应检测所有可能出现的腺病毒，如果腺病毒通用检测为阳性，证实样品中存在可通过分型检测确认是否为常见的流行株。

实施例1：从口腔拭子中检测腺病毒7型

1、各种试剂准备：

裂解液配制：准确称取30g异硫氰酸胍，溶于25ml 0.1M Tris-HCl(pH6.4)，然后加入8.8ml 0.5M EDTA(pH 8.0)、13.2ml ddH₂O，充分混匀后备用。

核酸结合液配制：准确称取3g非结晶型二氧化硅，溶于25ml ddH₂O中，充分混匀后室温下静置24h；去上清22ml，再加22ml ddH₂O混匀，室温下静置5h；去上清22ml，将剩余悬液充分混匀后，添加7μl浓盐酸调节pH至2，终浓度为1g/ml。将上述悬液装入小玻璃瓶中，高压灭菌，室温避光保存。

洗涤液配制：用DEPC处理的去离子水配制70%的乙醇，作为洗涤液。

2、病毒核酸提取：

（1）取以前实验室冻存的咽拭子样本棉签，该病人已经常规PCR测序方法验证，感染了腺病毒7型，其它腺病毒为阴性。取咽拭子棉签，迅速将棉签放入装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。

（2）提取基因组DNA前，请将咽拭子在保存液中充分搅动10次，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等；

（3）取3只1.5ml灭菌离心管，分别加入浸过咽拭子的保存液100μl，阳性质控品100μl，阴性质控品100μl；

（4）在上述的1.5ml离心管内各加入10μl的内参照品；

（5）加入200μl裂解液，震荡混匀；

（6）加入10μl核酸结合液，震荡15s，6000×g离心1分钟，小心弃去所有液体，留沉淀；

（7）加入500μl的裂解液混匀，8000rpm离心，去除液体；

（8）加入400μl洗涤液，震荡混匀，如沉淀不能分散，必须用移液器吸头吹打至悬匀;

（9）12000×g离心1分钟，尽可能将液体去除干净（避免触及沉淀颗粒）；

（10）重复步骤（8）-（9）一次；

（11）加入1ml冰丙酮，震荡混匀；

（12）12000×g离心1分钟，尽可能将液体去除干净（避免触及沉淀颗粒）；

（13）将装有沉淀的离心管置于通风橱中风干15分钟（也可使用开放式加热器于60℃干燥5分钟，需防止样本交叉污染），加入30μl预热至70℃的DEPC水，如沉淀不能分散，用移液器吸头吹打至悬匀上清，离心30s，上清可直接用于检测，或将上清转移至另一无RNANsae污染的1.5ml管子中冻存于-80℃备用。

3、PCR检测：

按标本数量（需包含阴性质控品及阳性质控品）分装HAdvPCR反应液。按每管38μl分装至0.2mlPCR反应管/板中。在分装好的各反应管/板分别加入处理好的DNA样品2μl、阴阳质控品各2μl。最终体系各个组分的浓度如下：15mM Tris-HCl(pH8.0),50mM KCl,5mM MgCl₂,0.2μM dNTP,0.05% Tween-20,0.05%，NP-40,0.06U/μl化学修饰的热启动酶，0.5UnitUNG酶引物浓度如下：500mM（SEQ ID NO4、5、7、8）,200mM(SEQ ID NO1、2),200mM（SEQ ID NO3、6、9）。短暂离心使所有试剂集中到反应管底部（不能有气泡），确定盖好管盖或封膜后，立即进行PCR扩增反应。

在按以下方案运行仪器程序：

（1）UNG反应：50℃ 2min；

（2）预变性：95℃ 10min；

（3）PCR：(95℃ 10sec,55℃ 20sec,65℃ 20sec)40个循环；65℃时分别检测FAM、Rox、HEX通道荧光信号，选择反应体系40μl。

检测结果如图1所示：所有标本的内参照品扩增也均为阳性，表明样品提取以及扩增过程有效。咽拭子标本中腺病毒通用引物探针以及AdvB&E分型引物探针均出现阳性扩增曲线，阳性质控品的两个腺病毒扩增也均为阳性，阴性质控品两个腺病毒的检测为阴性，表明该试剂盒可有效检测出腺病毒7型，并在分型检测中有效区分出为AdvB&E流行株。

实施例2：从粪便中检测腺病毒40型

1、病毒核酸提取：

取实验室保存的经常规PCR测序验证的腺病毒40型阳性水样便悬液，5000×g离心1min，吸上清100μl进行HAdV DNA提取，同时设立阴阳性质控各一，在上述试管内加入10μl的内参照品，并加入200μl裂解液裂和10μl核酸结合液，震荡15s，6000×g离心1分钟，小心弃去所有液体，留沉淀，分别用500μl裂解液洗涤沉淀一次、400μl洗涤液洗涤沉淀两次以及1ml的冷丙酮洗涤沉淀一次，最后用30μl预热至70℃的DEPC水进行洗脱。

2、PCR加样与荧光定量PCR检测同实施例1

3、检测结果如图2所示：

所有标本的内参照品扩增也均为阳性，表明样品提取以及扩增过程有效。粪便标本仅腺病毒通用引物探针检测为阳性，AdvB&E分型引物探针检测为阴性，阳性质控品的两个腺病毒扩增均为阳性，阴性质控两个腺病毒的检测为阴性，表明该试剂盒可有效检测出粪便中的腺病毒40型，但由于腺病毒40型属于腺病毒F亚群，因此在AdvB&E分型检测中为阴性，进一步证明该试剂盒在分型检测中的特异性。

实施例3：从血清中检测腺病毒3型

1、病毒核酸提取

取HBV、HIV、HCV阴性血清1ml，加入10μl体外培养的腺病毒3型病毒培养物，充分混匀，取100μl进行HAdV DNA提取，同时设立阴阳性质控各一，在上述试管内加入10μl的内参照品，并加入200μl裂解液裂和10μl核酸结合液，震荡15s，6000×g离心1分钟，小心弃去所有液体，留沉淀，分别用500μl裂解液洗涤沉淀一次、400μl洗涤液洗涤沉淀两次以及1ml的冷丙酮洗涤沉淀一次，最后用30μl预热至70℃的DEPC水进行洗脱。

2、PCR加样与荧光定量PCR检测同实施例1

3、检测结果如图3所示：

所有标本的内参照品扩增也均为阳性，表明样品提取以及扩增过程有效。在加入体外培养腺病毒的人血清标本中腺病毒通用引物探针以及AdvB&E分型引物探针均出现阳性扩增曲线，阳性质控品的两个腺病毒扩增也均为阳性，阴性质控两个腺病毒的检测为阴性，表明该试剂盒可有效检测出血清标本中的腺病毒3型，并在分型检测中有效区分出为AdvB&E流行株，血清中的干扰物质不影响检测。

实施例4：试剂盒的非特异性检测

1、病毒核酸提取

取5支试管分别加入10μl HBV阳性血清、CMV细胞培养物、HPV阳性标本、大肠杆菌和HSV-2细胞培养物，充分混匀，取100μl进行HAdV DNA提取，同时设立阴阳性质控各一，在上述试管内加入10μl的内参照品，并加入200μl裂解液裂和10μl核酸结合液，震荡15s，6000×g离心1分钟，小心弃去所有液体，留沉淀，分别用500μl裂解液洗涤沉淀一次、400μl洗涤液洗涤沉淀两次以及1ml的冷丙酮洗涤沉淀一次，最后用30μl预热至70℃的DEPC水进行洗脱。

2、PCR加样与荧光定量PCR检测同实施例1

3、检测结果如图4所示：

所有标本的内参照品扩增均为阳性，表明样品提取以及扩增过程有效，在所有标本中仅阳性质控的腺病毒通用和AdvB&E分型检测为阳性，其它标本均为阴性，证实该试剂盒与其它常见的DNA病毒和大肠杆菌没有交叉反应。

实施例5：试剂盒的灵敏度检测

将10⁷TCID₅₀/ml的腺病毒3型病毒溶液，做1:10系列稀释，提取基因组DNA，采用Adv通用和分型检测的PCR引物和探针进行检测，结果本试剂盒通用PCR引物探针可以检测到10³TCID₅₀/ml滴度的腺病毒3型（图5），采用分型检测的引物探针可以检测到5×10³TCID₅₀/ml滴度的腺病毒3型。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>北京博海通达生物科技有限公司

<120>一种腺病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法

<160>9

<17O>PatentIn Version 3.3

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ccatccatag agaaaatatc agaacga 27

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

taaataattc ctcttttccc agcg 24

<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<4OO>3

aaccagtaat ttcatctgct tctgatgtga ggc 33

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gccacggtgg ggtttctaaa ctt 23

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gccccagtgg tcttacatca tgcacatc 28

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

tgcaccagac ccgggctcag gaggtactcc ga 32

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gatggccacc ccatcgatgm tgc 23

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gcgaactgca ccagacccgg ac 22

<210>9

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

tacatgcaca tcgccggaca ggamgcttcg gagt 34

Claims

1.一种腺病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR反应液、引物探针组合、阳性质控品、阴性质控品，其特征在于，还包括核酸提取用液及核酸提取用内参照品；

SEQ ID NO1:CCATCCATAGAGAAAATATCAGAACGA；

SEQ ID NO2：TAAATAATTCCTCTTTTCCCAGCG；

2.根据权利要求1所述的腺病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述腺病毒核酸用引物探针包括通用型引物探针：

SEQ ID NO4:GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT；

SEQ ID NO5:GCCCCAGTGGTCTTACATCATGCACATC；

3.根据权利要求1或2所述的腺病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述腺病毒核酸用引物探针还包括B和E亚群分型引物探针：

SEQ ID NO7：GATGGCCACCCCATCGATGMTGC

SEQ ID NO8：GCGAACTGCACCAGACCCGGAC

4.根据权利要求1或2所述的腺病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述5’端荧光报告基团为ROX、FAM、VIC、HEX、Cy3或Cy5，3’端荧光萃灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3。

5.根据权利要求3所述的腺病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述5’端荧光报告基团为ROX、FAM、VIC、HEX、Cy3或Cy5，3’端荧光萃灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3。

6.根据权利要求1所述的腺病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述核酸提取用液包括裂解液、核酸结合液、洗涤液，其中：

裂解液主要是由如下组份组成：胍盐浓度为5-8M；Tris-HCl浓度为10-100mM,pH值为5.0-6.7；EDTA浓度为10-100mM。

核酸结合液是由非结晶的二氧化硅经盐酸处理配制而成；

洗涤液是用DEPC处理的去离子水配制70%的乙醇。

7.根据权利要求1-6任一项所述的腺病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法，包括荧光定量PCR检测反应，其特征在于，在荧光定量PCR检测反应前还采用所述核酸提取用液进行病毒核酸提取，并在病毒核酸提取过程中加入所述内参照品，对应地，在荧光定量PCR检测反应中加入所述的内参照品用引物探针。