CN113416797A - 一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents

一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量pcr检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于人呼吸道病原体生物检测技术领域，公开了一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒。该试剂盒引物是由感染人呼吸道7种型别腺病毒高保守区设计。实现了单管单重PCR即可同时检测感染人呼吸道的7种型别腺病毒，且不会受其它感染人类肠道腺病毒型别及其它微生物序列影响，保证高覆盖度、高灵敏性、高特异性和高准确性。对上述7种型别腺病毒建立进化树模型及亲缘关系分析，进行待检片段特异性和敏感性评估后，挑选五联体蛋白对应基因序列作引物结合位点。本试剂盒覆盖型别广，利用熔解曲线染料法，使检测效率、特异性、敏感性、经济型、便捷性，相比于常规的单管多重或多管单重检测显著提高。

Description

一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒
技术领域
本发明属于人呼吸道病原体生物检测技术领域，具体涉及一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术
急性上呼吸道感染、急性气管/支气管炎、支气管扩张/肺炎等是呼吸道感染的常见病，其临床表现各有不同。呼吸道感染的病原体种类较多，一种临床表现可由多个病原体引起，同时一个病原体也可造成多种临床表现。因不能及时发现病原体，致使患者病情延误或加重，同时也加重了抗生素的滥用。因此，及时、快速地对患者血清进行病原体检测，及早明确病原体，对临床诊断、治疗及抗生素的规范使用有着重要的意义。
近年来，人腺病毒(HAdV)感染引起呼吸道传染病时有发生，不仅对相关人群的健康造成严重危害，也为其家庭带来了巨大经济损失。人感染HAdV后可出现流感样症状，且该病毒传染性较强，对处于持续密集接触场所的特定群体如军营、学校等人员的影响较大。
HAdV属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属，是一种无包膜的双链DNA病毒。其衣壳呈二十面体对称，由252个壳粒组成，其中240个为六联体，另12个为五联体基底，每个五联体基底上结合着1根纤突蛋白。不同型别的基因组长度范围在26～45kb。
人腺病毒可分为多种型别，引起呼吸道疾病，也可感染消化道、泌尿道、眼部、心肌等部位而引起疾病。感染呼吸道的主要包括HAdV-B、HAdV-C和HAdV-E组，是呼吸道感染的重要病原之一。
我国北部、西北部和南部地区的优势流行株属于HAdV-B组，以3型和7型为主；而我国东部地区的优势流行株属于HAdV-C组，主要是1型、2型和5型；同时我国南方和北方近年多地均局部发生新型55型感染流行。
腺病毒的传统分型方法主要为血清学分型方法。该种分型方法受限于病毒分离培养耗时长且操作要求严格，一般实验室难以开展，同时对细胞病变的观察受操作人员的主观影响较大，结果可靠性不强。此外，当病毒毒株滴度很低时，也无法进行完整的血清学试验，从而给分型造成困难。
随着分子生物学技术的发展，出现了通过PCR扩增和基因测序等分子生物学技术来进行鉴定的方法。上述方法受限于腺病毒的型别众多，我国地域辽阔，不同地区流行的HAdV的优势基因型不同。重组导致的突变会使得为特定区域流行的几个腺病毒型别设计的荧光定量PCR的引物及探针，在其它地域流行的不同型别腺病毒的序列不匹配，检测易造成“脱靶”、“假阴性”，进而导致误诊、漏诊状况。
由于腺病毒重组率很高，不同型别间保守区域过于狭窄，倘若按照传统方案采用一个型别使用一对引物及一条Taqman探针，这就意味着为了覆盖7个型别，就需要在单管中实现7对引物及7条Taqman探针的7重PCR，一方面造成对单一型别检测的灵敏度下降，另一方面也使得试剂成本成倍提高。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒。
本发明所采用的技术方案为：一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括腺病毒检测液、内参基因检测液、扩增反应液、阴性对照品、阳性对照品、内参质控品和无核酶水；
所述腺病毒检测液包括针对人呼吸道腺病毒的特异性引物对，特异性引物对包括第一引物、第二引物、第三引物或第四引物中的一种，第一引物包括第一特异性上游引物和第一特异性下游引物，第二引物包括第二特异性上游引物和第二特异性下游引物，第三引物包括第三特异性上游引物和第三特异性下游引物，第四引物包括第四特异性上游引物和第四特异性下游引物，上述各引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示；优选为第一引物；
所述人呼吸道腺病毒的特异性引物对的结合位点为人腺病毒五联体蛋白所对应的基因序列。
作为优选地，所述内参基因检测液包括针对内参基因的内参引物对，所述内参引物对包括内参上游引物和内参下游引物的核苷酸序列，如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示。
作为优选地，所述腺病毒检测液中的内参基因为人核糖核酸酶P基因。
作为优选地，所述腺病毒检测液的引物浓度均为4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、15μM、18μM和20μM中的任意一种。
作为优选地，所述腺病毒检测液的引物浓度为15μM。
作为优选地，所述扩增反应液包括含热启动的DNA聚合酶、dNTPs、dsDNA染料、PCR扩增缓冲液、Mg2+、UNG酶和dUTP。
作为优选地，荧光定量检测试剂盒的检测方法为染料法，该染料结合于PCR反应产物的双链小沟区域。
作为优选地，所述阴性对照品为生理盐水。
作为优选地，所述阳性对照品为呼吸道腺病毒五联体蛋白基因序列的工程菌悬液。
作为优选地，所述内参质控品为人核糖核酸酶P基因序列的工程菌悬液。
本发明的有益效果为：
(一)、本发明提供了一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒中含有设计的腺病毒检测液特异性引物，是由感染人呼吸道的7种型别腺病毒(1、2、3、4、5、7、55)的高保守区设计而来。该试剂盒中利用挑选出来的、针对人呼吸道腺病毒的特异性引物对，为正反各一条引物构成，单管扩增用于检测样本中呼吸道腺病毒，其PCR产物为单一条带；内参基因的引物，为正反各一条引物构成，单管扩增用于检测样本中人源DNA，防止样本采集错误或检测失败造成的“假阴性”，其PCR产物为单一条带。
该试剂盒实现了单管单重PCR即可同时检测感染人呼吸道的7种型别腺病毒，且不会受到其它感染人类肠道的腺病毒型别，如40型、41型，以及其它微生物的序列的影响，保证了检测的高覆盖度、高灵敏性、高特异性和高准确性，解决了目前检测环节为了覆盖多个型别而采用多组引物或多重PCR等技术而造成覆盖度、灵敏性、特异性、经济性不能均优的难点问题。
(二)、本申请中试剂盒的设计，是对上述7种型别腺病毒建立进化树模型及亲缘关系分析，并进行了待检片段特异性和敏感性评估后，对全基因组数十万碱基序列进行全面比对，找到数十个同源区域，并根据引物设计的多种原则，最终依靠在实验中检测了扩增效能等参数的多轮选择，挑选了五联体蛋白所对应的基因序列作为引物的结合位点。由于本检测试剂盒所覆盖的型别广，基因序列差异过大，引物有效的结合区域短小，遂在此基础上设计开发了基于熔解曲线染料法的检测方案，该方案使检测效率、特异性、敏感性、经济型、便捷性，相比于常规的单管多重或多管单重的检测在效能上显著提高。
(三)、扩增过程中即可实现实时数据的查验；选用的染料法，覆盖面广，成本低。
附图说明
图1为使用上述该试剂盒有效检测7种型别腺病毒的扩增曲线示意图；
图2为使用上述该试剂盒有效检测7种型别腺病毒的熔解曲线示意图；
图3为使用上述该试剂盒有效检测混合有7种型别腺病毒的扩增曲线示意图；
图4为使用上述该试剂盒有效检测混合有7种型别腺病毒的熔解曲线示意图；
图5为使用上述该试剂盒试验检测已知阳性样本的检测管中，腺病毒的熔解曲线示意图；
图6为使用上述该试剂盒内参引物的检测阴性样本，内参引物的扩增曲线示意图；
图7为使用上述该试剂盒在低浓度下的精密度检测扩增曲线示意图；
图8为使用上述该试剂盒在不同病原体检测中的特异性检测扩增曲线示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例：
一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，包括腺病毒检测液、内参基因检测液、扩增反应液、阴性对照品、阳性对照品、内参质控品和无核酶水；腺病毒检测液包括针对人呼吸道腺病毒的特异性引物对、内参基因的内参引物对以及扩增反应液、阴阳及内参质控品、无核酶水。该腺病毒检测液中的各特异性引物结合位点在感染人呼吸道的7种型别腺病毒(1、2、3、4、5、7、55)的全基因组的高保守区段。具体的特异性引物结合位点，是在人腺病毒五联体(penton)蛋白所对应的基因序列。
腺病毒检测液中的内参基因为人核糖核酸酶P基因。
扩增反应液，包含热启动的DNA聚合酶、dNTPs、dsDNA染料、PCR扩增缓冲液、Mg2+、UNG酶和dUTP。
阴性对照品为生理盐水。
阳性对照品为呼吸道腺病毒五联体蛋白基因序列的工程菌悬液。
内参质控品为人核糖核酸酶P基因序列的工程菌悬液。
采用实时荧光定量检测的方法为染料法，该染料结合于PCR反应产物的双链小沟区域，如SYBR Green I。SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。
样本可选用呼吸道感染患者提取的离体样本，包括痰液、鼻咽拭子、肺泡灌洗液的途径获得的离体样本。
关于本申请方案中所说的人源DNA样本也属于离体样本，不涉及活体动物直接应用。
上述针对人呼吸道腺病毒的特异性引物对，为正反各一条引物构成，单管扩增用于检测样本中呼吸道腺病毒，其PCR产物为单一条带。
内参基因的引物对，为正反各一条引物构成，单管扩增用于检测样本中人源DNA，防止样本采集错误或检测失败造成的“假阴性”，其PCR产物为单一条带。
检测位点及其序列陈列表1：
Figure BDA0003159287280000061
Figure BDA0003159287280000071
试剂盒的应用，包括如下步骤：
(1)提核酸样本：使用磁珠法或过柱法提取待检离体样本的DNA；
(2)加样：
检测腺病毒：对于待测离体样本检测管、阴性质控检测管、阳性质控检测管，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的PCR反应液(含ROX参比染料)，1μl的人呼吸道腺病毒的特异性引物mix，5μl待测DNA，4μl的无核酶水。
检测内参：对于待测离体样本检测管、内参质控检测管，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的PCR反应液(含ROX参比染料)，1μl的内参引物mix，5μl待测DNA，4μl的无核酶水。
(3)上机扩增：检测仪器可使用ABI公司的stepone plus或7500型号的荧光定量PCR仪，检测模式选择为“SYBR Green Reagents”，“Include Melt Curve”。
程序设置：预变性：95℃2min，1个循环；变性：95℃15s，退火+延伸：60℃1min，40～45个循环；末尾是通用的熔解曲线。
(4)数据分析及结果数据判断：
在检测仪器运行正常，且阴性质控、阳性质控的检测结果均在控的情况下：
对于特异性引物检测管：
当ct值≤38时，样本呈腺病毒检测阳性。
当39≤ct值≤42时，重复该样本的检测；如果ct值仍≤42，则样本呈腺病毒检测弱阳性；否则样本呈腺病毒检测阴性。
当ct值≥43时，样本呈腺病毒检测阴性。
对于内参引物检测管：
当ct值≤38时，样本呈内参基因检测阳性。
当39≤ct值≤42时，重复该样本的检测，如果ct值仍≤42，则样本呈内参基因检测弱阳性；否则样本呈内参基因检测阴性。
当ct值≥43时，样本呈内参基因检测阴性。
实验例
实验例1：使用上述该试剂盒有效检测7种型别腺病毒
1.1核酸的提取：
取外购自国际标准品及国内质控品的出厂已灭活的、感染人呼吸道的7种型别腺病毒(1、2、3、4、5、7、55)，各一管。使用全自动核酸提取仪提取腺病毒核酸，并溶于100μl洗脱液，分装成多个小份后，冻存于-80℃冰箱。
1.2核酸的稀释：
抽取上一步的核酸原液，使用nanodrop测定核酸浓度及纯度后，每个型别抽取10微升，先调整到相同浓度后，再使用无核酶的超纯水，分别稀释500倍，分装成多个小份后，冻存于-20℃冰箱。
1.3引物合成及稀释：
外送生工生物工程公司合成特异性引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，将引物用无核酶的超纯水配制成15μM浓度，分装成多个小份后，冻存于-20℃冰箱。
1.4扩增体系的配制：
对于7种浓度基本相同的腺病毒稀释液进行检测，每种型别分别配制一管特异性引物检测体系，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCR Master Mix反应液(含荧光染料)，1μl的特异性引物mix，5μl待测稀释DNA，4μl的无核酶水。每种型别分别配制一管内参引物检测体系，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCR Master Mix反应液(含荧光染料)，1μl的内参引物mix，5μl待测稀释DNA，4μl的无核酶水。
对于阴性质控检测管和阳性质控检测管，每管都是20μl反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCR Master Mix反应液(含荧光染料)，1μl的特异性引物mix，5μl质控，4μl的无核酶水。
对于内参质控检测管，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCRMaster Mix反应液(含荧光染料)，1μl的内参引物mix，5μl内参质控，4μl的无核酶水。
1.5荧光定量检测的反应条件设置：
使用ABI公司的7500型号的荧光定量PCR仪，检测模式选择为“SYBR GreenReagents”，“Include Melt Curve”。
程序设置：预变性：95℃2min，1个循环；变性：95℃15s，退火+延伸：60℃1min，40～45个循环；末尾是通用的熔解曲线。
1.6结果判定：
阴性质控无扩增曲线；
阳性质控有扩增曲线；
内参质控有扩增曲线。
如图1所示，7个型别的样本分别检测时，内参引物管无扩增；特异性引物管检测出的ct范围在23.9～24.2且具典型的“S”型扩增曲线。
如图2所示，7个型别的样本分别使用特异性引物检测时，每管对应的熔解曲线峰形单一且锐利，无非特异扩增，且相互间扩增片段一致性好。
实验例2：使用上述该试剂盒有效检测7种型别腺病毒的混合物
2.1核酸的提取
参见实验例1中的描述。
2.2核酸的稀释及混合：
抽取上一步的核酸原液，使用nanodrop测定核酸浓度及纯度后，每个型别抽取10微升，先调整到相同浓度后，对这7种腺病毒DNA，各抽取2μl进行混合，再使用300μl的无核酶的超纯水进行稀释(以下简称七合一核酸稀释液)，冻存于-20℃冰箱。
2.3引物合成及稀释：
参见实验例1中的描述。
2.4扩增体系的配制：
对于七合一核酸稀释液的检测，配制一管20μl特异性引物反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCR Master Mix反应液(含荧光染料)，1μl的特异性引物mix，5μl待测稀释DNA，4μl的无核酶水。配制一管20μl内参引物反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCR Master Mix反应液(含荧光染料)，1μl的内参引物mix，5μl待测稀释DNA，4μl的无核酶水。
对于阴性质控检测管和阳性质控检测管，每管都是20μl反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCR Master Mix反应液(含荧光染料)，1μl的特异性引物mix，5μl质控，4μl的无核酶水。
对于内参质控检测管，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCRMaster Mix反应液(含荧光染料)，1μl的内参引物mix，5μl内参质控，4μl的无核酶水。
2.5荧光定量检测的反应条件设置：
参见实验例1中的描述。
2.6结果判定：
阴性质控无扩增曲线；
阳性质控有扩增曲线；
内参质控有扩增曲线。
如图3所示，七合一核酸稀释液的检测，内参引物管无扩增；特异性引物管检测出的ct值是22.63，且具典型的“S”型扩增曲线。
如图4所示，七合一核酸稀释液的检测，特异性引物管对应的熔解曲线峰形单一且锐利，无非特异扩增。
实验例3：使用上述该试剂盒试验检测已知阳性样本的情况
3.1核酸的提取
取已检测为腺病毒阳性的咽拭子分装留存样本，灭活后，使用全自动核酸提取仪提取核酸，并溶于100μl洗脱液，冻存于-20℃冰箱。
3.2引物合成及稀释：
参见实验例1中的描述。
3.3扩增体系的配制：
对于待检测样本，配制20μl特异性引物检测体系，具体为：10μl的GoTaq qPCRMaster Mix反应液(含荧光染料)，1μl的特异性引物mix，5μl待测稀释DNA，4μl的无核酶水。配制20μl内参引物检测体系，10μl的GoTaq qPCR Master Mix反应液(含荧光染料)，1μl的内参引物mix，5μl待测稀释DNA，4μl的无核酶水。
对于阴性质控检测管和阳性质控检测管，每管都是20μl反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCR Master Mix反应液(含荧光染料)，1μl的特异性引物mix，5μl质控，4μl的无核酶水。
对于内参质控检测管，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCRMaster Mix反应液(含荧光染料)，1μl的内参引物mix，5μl内参质控，4μl的无核酶水。
3.4荧光定量检测的反应条件设置：
参见实验例1中的描述。
3.5结果判定：
如图5所示：阴性质控无扩增曲线；
阳性质控有扩增曲线；
内参质控有扩增曲线；
已知阳性样本的检测管中，特异性引物检测管有扩增曲线；内参引物检测管有扩增曲线，且熔解曲线峰形单一且锐利，无非特异扩增。
实验例4：使用上述该试剂盒内参引物的检测阴性样本的情况
4.1核酸的提取
取6支已检测为腺病毒阴性的咽拭子分装留存样本，灭活后，使用全自动核酸提取仪提取核酸，并溶于100μl洗脱液，冻存于-20℃冰箱。
4.2引物合成及稀释：
参见实验例1中的描述。
4.3扩增体系的配制：
对于待检测样本，配制20μl特异性引物检测体系，具体为：10μl的GoTaq qPCRMaster Mix反应液(含荧光染料)，1μl的特异性引物mix，5μl待测稀释DNA，4μl的无核酶水。配制20μl内参引物检测体系，10μl的GoTaq qPCR Master Mix反应液(含荧光染料)，1μl的内参引物mix，5μl待测稀释DNA，4μl的无核酶水。
对于阴性质控检测管和阳性质控检测管，每管都是20μl反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCR Master Mix反应液(含荧光染料)，1μl的特异性引物mix，5μl质控，4μl的无核酶水。
对于内参质控检测管，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCRMaster Mix反应液(含荧光染料)，1μl的内参引物mix，5μl内参质控，4μl的无核酶水。
4.4荧光定量检测的反应条件设置：
参见实验例1中的描述。
4.5结果判定：
如图6所示，阴性质控无扩增曲线；
阳性质控有扩增曲线；
内参质控有扩增曲线；
已知阴性的样本的检测管中，特异性引物检测管无扩增曲线；内参引物检测管有扩增曲线。
实验例5：使用上述该试剂盒在低浓度下的精密度检测情况
5.1核酸的提取
取一份已灭活的感染人呼吸道的3型腺病毒，一管。使用全自动核酸提取仪提取核酸，并溶于100μl洗脱液，分装成多个小份后，冻存于-80℃冰箱。
5.2核酸的稀释：
抽取上一步的核酸原液，使用nanodrop测定核酸浓度及纯度后，抽取10微升，使用无核酶的超纯水，直接稀释5000倍，分装成多个小份后，冻存于-20℃冰箱。
5.3引物合成及稀释：
外送生工生物工程公司合成特异性引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，将引物用无核酶的超纯水配制成15μM浓度，分装成多个小份后，冻存于-20℃冰箱。
5.4扩增体系的配制：
对于该型别腺病毒稀释液进行检测，使用特异性引物体系检测10管，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCR Master Mix反应液(含荧光染料)，1μl的特异性引物mix，5μl待测稀释DNA，4μl的无核酶水。每种型别分别配制一管内参引物检测体系，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCR Master Mix反应液(含荧光染料)，1μl的内参引物mix，5μl待测稀释DNA，4μl的无核酶水。
对于阴性质控检测管和阳性质控检测管，每管都是20μl反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCR Master Mix反应液(含荧光染料)，1μl的特异性引物mix，5μl质控，4μl的无核酶水。
对于内参质控检测管，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCRMaster Mix反应液(含荧光染料)，1μl的内参引物mix，5μl内参质控，4μl的无核酶水。
5.5荧光定量检测的反应条件设置：
使用ABI公司的7500型号的荧光定量PCR仪，检测模式选择为“SYBR GreenReagents”，“Include Melt Curve”。程序设置：预变性：95℃2min，1个循环；变性：95℃15s，退火+延伸：60℃1min，40～45个循环；末尾是通用的熔解曲线。
5.6结果判定：
如图7所示，阴性质控无扩增曲线；
阳性质控有扩增曲线；
内参质控有扩增曲线；
对于该型别腺病毒样本检测时，内参引物管无扩增；10次重复的特异性引物管检测出的ct范围在34.2～34.8，且具典型的“S”型扩增曲线。
实验例6：使用上述该试剂盒在不同病原体检测中的特异性检测情况
6.1核酸的提取
取外购自国际标准品及国内质控品的出厂已灭活的，感染人呼吸道的腺病毒(7型)、合胞病毒A型、副流感病毒、EB病毒、甲流、大肠杆菌，6种病原体各一管。使用全自动核酸提取仪提取核酸，并溶于100μl洗脱液，分装成多个小份后，冻存于-80℃冰箱。
6.2核酸的稀释：
抽取上一步的核酸原液，使用nanodrop测定核酸浓度及纯度后，每个型别抽取10μl，为体现本检测的特异性对于非腺病毒病原体的检测，即便是高浓度下也无非特异扩增，因此使用无核酶的超纯水，分别稀释10倍，分装成多个小份后，冻存于-20℃冰箱。
6.3引物合成及稀释：
外送生工生物工程公司合成特异性引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，将引物用无核酶的超纯水配制成15μM浓度，分装成多个小份后，冻存于-20℃冰箱。
6.4扩增体系的配制：
对于6种病原体核酸的高浓度稀释液进行检测，每种分别配制一管特异性引物检测体系，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCR Master Mix反应液(含荧光染料)，1μl的特异性引物mix，5μl待测稀释DNA，4μl的无核酶水。每种分别配制一管内参引物检测体系，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCR Master Mix反应液(含荧光染料)，1μl的内参引物mix，5μl待测稀释DNA，4μl的无核酶水。
对于阴性质控检测管和阳性质控检测管，每管都是20μl反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCR Master Mix反应液(含荧光染料)，1μl的特异性引物mix，5μl质控，4μl的无核酶水。
对于内参质控检测管，每管均是20μl反应体系，具体为：10μl的GoTaq qPCRMaster Mix反应液(含荧光染料)，1μl的内参引物mix，5μl内参质控，4μl的无核酶水。
6.5荧光定量检测的反应条件设置：
使用ABI公司的7500型号的荧光定量PCR仪，检测模式选择为“SYBR GreenReagents”，“Include Melt Curve”。程序设置：预变性：95℃2min，1个循环；变性：95℃15s，退火+延伸：60℃1min，40～45个循环；末尾是通用的熔解曲线。
6.6结果判定：
如图8所示，阴性质控无扩增曲线；阳性质控有扩增曲线；
内参质控有扩增曲线；
6种待测样本分别检测时，内参引物管均无扩增；特异性引物管只有腺病毒的且具典型的“S”型扩增曲线，检测出的ct值在19.6。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，均属于本发明的保护范围。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本领域的普通技术人员应当理解，在不背离本发明的范围下，可对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，与此同时这些修改或者替换，并不会使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 北京华瑞康源生物科技发展有限公司
<120> 一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> 人呼吸道腺病毒第一特异性上游引物核苷酸序列
<400> 1
tgaaaacgtt cctgctctca ca 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> 人呼吸道腺病毒第一特异性下游引物核苷酸序列
<400> 2
gtctggcgtc agtaatggtc ac 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> 人呼吸道腺病毒第二特异性上游引物核苷酸序列
<400> 5
cccctgacag aggacagcaa gaaa 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> 人呼吸道腺病毒第二特异性下游引物核苷酸序列
<400> 6
ggtctgaggg tcgccgtagt tgtat 25
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> 人呼吸道腺病毒第三特异性上游引物核苷酸序列
<400> 7
ttcaatcgct ttcccgagaa cca 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> 人呼吸道腺病毒第三特异性下游引物核苷酸序列
<400> 8
gcggtagcgt cccgtgatct gt 22
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> 人呼吸道腺病毒第四特异性上游引物核苷酸序列
<400> 9
ggacagcaag aaacgcagtt acaacc 26
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> 人呼吸道腺病毒第四特异性下游引物核苷酸序列
<400> 10
tccatgagcg gattccggtc tg 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 内参基因上游引物核苷酸序列
<400> 3
gctcaccttg gctattcagt t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 内参基因下游引物核苷酸序列
<400> 4
ttggcaaagt tgtgaagagt t 21

Claims (10)

1.一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括腺病毒检测液、内参基因检测液、扩增反应液、阴性对照品、阳性对照品、内参质控品和无核酶水；
所述腺病毒检测液包括针对人呼吸道腺病毒的特异性引物对，特异性引物对包括第一引物、第二引物、第三引物或第四引物中的一种，第一引物包括第一特异性上游引物和第一特异性下游引物，第二引物包括第二特异性上游引物和第二特异性下游引物，第三引物包括第三特异性上游引物和第三特异性下游引物，第四引物包括第四特异性上游引物和第四特异性下游引物，上述各引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示；优选为第一引物；
所述人呼吸道腺病毒的特异性引物对的结合位点为人腺病毒五联体蛋白所对应的基因序列。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述内参基因检测液包括针对内参基因的内参引物对，所述内参引物对包括内参上游引物和内参下游引物的核苷酸序列，如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示。
3.根据权利要求1所述的一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述腺病毒检测液中的内参基因为人核糖核酸酶P基因。
4.根据权利要求1所述的一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述腺病毒检测液的引物浓度均为4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、15μM、18μM和20μM中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述腺病毒检测液的引物浓度为15μM。
6.根据权利要求1所述的一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液包括含热启动的DNA聚合酶、dNTPs、dsDNA染料、PCR扩增缓冲液、Mg2+、UNG酶和dUTP。
7.根据权利要求1所述的一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，荧光定量检测试剂盒的检测方法为染料法，该染料结合于PCR反应产物的双链小沟区域。
8.根据权利要求1所述的一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为生理盐水。
9.根据权利要求1所述的一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为呼吸道腺病毒五联体蛋白基因序列的工程菌悬液。
10.根据权利要求1所述的一种同时检测7种型别腺病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述内参质控品为人核糖核酸酶P基因序列的工程菌悬液。
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