CN111549184A

CN111549184A - 一种呼吸道腺病毒的pcr荧光检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN111549184A
Application number: CN202010571644.1A
Authority: CN
Inventors: 马东礼; 邢志浩; 姜含芳; 刘孝荣; 邓栩文
Original assignee: Shenzhen Childrens Hospital
Current assignee: Shenzhen Childrens Hospital
Priority date: 2020-06-22
Filing date: 2020-06-22
Publication date: 2020-08-18
Anticipated expiration: 2040-06-22
Also published as: CN111549184B

Abstract

本发明公开了一种呼吸道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒及其应用，属于生物技术领域。本发明采用“鸬鹚”生物大数据挖掘系统，根据拷贝数、引物二聚体和序列空间结构等关键技术参数，寻找最佳靶序列，针对人类腺病毒B群、C群、E群设计特异性引物和探针以及PCR反应体系，其中特异性引物和探针由人类腺病毒B群、C群、E群六邻体蛋白基因的共同序列、人GADPH基因(内参)片段的特异性引物和探针组成。该试剂盒能精准检测到呼吸道腺病毒，且不会受到其他非呼吸道腺病毒及其它微生物的序列影响，实现高敏感性和高特异性，解决了目前引物设计中敏感性和特异性不能均优的难点问题，同时使检测效率、精准度大大提高。

Description

一种呼吸道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种呼吸道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒及其应用。

背景技术

腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈二十面体排列构成。衣壳内部为线状双链DNA分子，自上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人腺病毒有52种，分为A、B、C、D、E和F六个亚群(subgroup)。呼吸道腺病毒包含B亚群(3、7型)、C亚群(1、2、5、6型)、E亚群(4型)等不同亚群的众多血清型，其中又以3、7型最为常见。六邻体蛋白是由三个pII分子紧密相连组成，六邻体蛋白作为一种壳粒，是腺病毒蛋白质外壳必不可少的组成部分，而六邻体蛋白基因作为保守基因设计引物已经在诸多文献中报道。

呼吸道腺病毒所致的病毒感染典型症状是咳嗽、鼻塞和咽炎，同时伴有发热、寒战、头痛和肌肉痛等。由呼吸道腺病毒引起的肺炎占儿童期肺炎的10％，儿童期腺病毒肺炎的病死率为8％～10％，严重威胁青少年及儿童的生命健康安全。

呼吸道腺病毒的鉴定方法如下：(1)培养：病毒株培养特异度较高，是获得病毒株并进行流行病学调查所必需的，但检测周期长、敏感性低、设备昂贵、需要实验室专业人员操作，二级临床实验室不具备病毒培养条件；(2)酶联免疫试验检测抗体：检测病毒抗体快速、特异，方法重复性差、敏感性低；(3)胶体金法检测抗原：定性实验，简便快速，方法重复性差、敏感性低。由于上述的实验室检查方法分别有敏感性差，特异性低，检测周期长，设备要求高，重复性差等缺点，使检查结果经常出现假阳性或假阴性，导致误诊、漏诊。

发明内容

为了解决上述技术缺陷问题，本发明提供一种呼吸道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒，该试剂盒可特异、敏感、准确、快速地检测咽拭子、痰液中的呼吸道腺病毒。

为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：利用自主研发的“鸬鹚”生物大数据挖掘系统，在国际权威数据库GenBank核酸数据库(Nucleotide)中下载1～7型呼吸道腺病毒六邻体蛋白基因的参照序列(1型GenBank:AC_000017,序列全长2895bp；2型GenBank:AC_000007.1,序列全长2907bp；3型GenBank:NC_011203,序列全长2835bp；4型GenBank:AP014841,序列全长2811bp；5型GenBank:AC_000008,序列全长2859bp；6型GenBank:LC068712,序列全长2892bp；7型GenBank:AC_000018,序列全长2805bp)。由于不同亚群间六邻体蛋白基因有所差异，通过多序列比对，发现B亚群(3、7型)与C亚群(1、2、5、6型)六邻体蛋白基因序列差异大，而与E亚群(4型)六邻体蛋白基因序列相似度高。因此，分别针对B亚群(3、7型)、E亚群(4型)设计一对引物和一个探针，针对C亚群(1、2、5、6型)设计一对引物和一个探针，共设计两对引物和两个探针。以不同型别六邻体蛋白基因参照序列为模板，建立候选短片段文库、评估片段特异性和敏感性、设计引物、评估引物性能、临床样本验证，在此基础上开发出一种敏感性和特异性强、重复性好、检测通量更大的呼吸道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒。

基因是识别生物物种的名片，寻找特异而保守的基因序列如同大海捞针，是决定试剂盒特异性、敏感性的关键。本发明的创新之处在于：1)此试剂盒引物采用简并碱基，能精准检测到B亚群(3、7型)、C亚群(1、2、5、6型)与E亚群(4型)不同血清型的呼吸道腺病毒，且不会受到其他非呼吸道腺病毒(特别是消化道腺病毒)以及其它微生物的序列影响，实现高敏感性和高特异性，解决了目前引物设计中敏感性和特异性不能均优的难点问题；2)本发明所采用的“鸬鹚”生物大数据挖掘系统，可以对数千万碱基对的全基因组序列进行全面筛查，找到几十个至几百个特异保守序列，再根据拷贝数、引物二聚体和序列空间结构等关键技术参数二次筛查，优中选优，找到最佳靶序列，使检测效率、特异度、敏感度相比于常规设计方法提高10倍。

本发明中的引物设计方法采用自主研发的鸬鹚大数据挖掘系统，在呼吸道腺病毒全基因组(长度约36000bp)范围内搜寻最优的引物和探针片段，相比传统方法只针对Hexon基因(约3000bp)设计引物，扩大了搜索范围10倍以上，而且所用时间较短，效率更高。

本发明所述呼吸道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒包括反应液A与反应液B，反应液A包括三对引物和三个探针：人类腺病毒B群、E群(3、4、7型)的特异性引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2以及对应的FAM标记的探针SEQ ID NO.3；人类腺病毒C群(1、2、5、6型)的特异性引物对SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5以及对应的FAM标记的探针SEQ ID NO.6；人GADPH作为内参片段的引物对SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8以及对应的HEX标记的探针SEQ ID NO.9。其中HEX、FAM为荧光基团，TAMRA为淬灭基团。反应液B包括热启动酶和UNG酶。

本发明中提供了阴性质控品，阳性质控品。阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为克隆两组上下游引物各自对应的人类腺病毒唯一目的序列片段(位于六邻体蛋白基因)的质粒。引物与探针的组合如下：

3,4,7型六邻体蛋白基因目的片段的上游引物SEQ ID NO.1：

5’-AGTCTTCGACGTGGTCAGAG-3’；

3,4,7型六邻体蛋白基因目的片段的下游引物SEQ ID NO.2：

5’-AGGTAGACGGCCTCGATGA-3’；

3,4,7型六邻体蛋白基因目的片段的探针SEQ ID NO.3：

5’-FAM-TGCACCAGCCMCACCGCGG-TAMRA-3’；

1,2,5,6型六邻体蛋白基因目的片段的上游引物SEQ ID NO.4：

5’-CCGAGACGTACTTCAGCCT-3’；

1,2,5,6型六邻体蛋白基因目的片段的下游引物SEQ ID NO.5：

5’-GACCGGTCTGTGGTCACG-3’；

1,2,5,6型六邻体蛋白基因目的片段的探针SEQ ID NO.6：

5’-FAM-CACGGTGGCGCCTACGCACG-TAMRA-3’；

内参片段人GADPH的上游引物SEQ ID NO.7：5’-CAAGGGCATCCTGGGCTA-3’；

内参片段人GADPH的下游引物SEQ ID NO.8：5’-GGTGTCGCTGTTGAAGTCAG-3’；

内参片段人GADPH的探针SEQ ID NO.9：

5’-HEX-CACTGAGCACCAGGTGGTCTCCT-TAMRA-3’。

利用上述三对引物和探针可同时针对人类呼吸道腺病毒(B群、C群、E群)的特异目的片段和人GADPH(内参)片段进行双重荧光PCR扩增。

本发明还提供了该试剂盒的应用，包括如下步骤：

(1)提取待测样品DNA；

(2)进行PCR扩增以待测样品DNA为模板，按一定比例加入PCR反应液A和PCR反应液B，其中反应液A包括12.5mM Tris-HCl，pH9.0、50mM KCl、0.13％

X-100、3.13mMMgCl₂、0.45mM dATP、0.45mM dGTP、0.45mM dCTP、0.78mM dUTP、三对引物SEQ ID NO.1和2、4和5、7和8，浓度都为0.3-0.7μM，三个探针SEQ ID NO.3、6、9，浓度都为0.1-0.2μM；反应液B包括20mM Tris-HCl、100mM KCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、50％Glycerine、0.5％

20、1-3U/μL热启动酶、0.1-0.3U/μLUNG酶，进行PCR扩增，同时以阴性质控品、阳性质控品代替待测样品DNA，作为模板，加入PCR反应液A和PCR反应液B，进行阴性质控品和阳性质控品的PCR扩增；

(3)根据Ct值进行结果判定。

进一步的，所述步骤(2)中，反应液A中含有三对引物SEQ ID NO.1和2、4和5、7和8，浓度都为0.5μM，三个探针SEQ ID NO.3、6、9，浓度都为0.15μM；PCR反应液B含有热启动酶和UNG酶，其浓度分别为2U/μL和0.2U/μL。

进一步的，待测样品DNA与反应液A、反应液B的体积比为3：46：1。

进一步的，PCR扩增程序的参数如下：

50℃120s，1个循环；

95℃600s，1个循环；

95℃、15s，55℃、45s(收集荧光)，40个循环；

37℃、20s，1个循环。

进一步的，所述阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为含有克隆SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4两组上下游引物各自所对应的人类腺病毒唯一目的序列片段(位于六邻体蛋白基因)的质粒。含有上述质粒的工程菌的构建过程如下：

1.目的片段分别扩增

1.1用Takara Taq^TM Hot Start Version(Lot#AIG1122A)按照表1对目的片段分别进行扩增

表1

试剂名称	使用量
		10×PCR buffer(Mg<sup>2+</sup> plus)	5μL
dNTP Mixture(2.5mM each)	4μL
		Forward Primer(SEQ ID NO.1/4)	0.5μM
Reverse Primer(SEQ ID NO.2/5)	0.5μM
		Takara Tap HS(5U/μL)	2.5U
呼吸道腺病毒阳性样本核酸	2μL
		灭菌水	upto50μL

1.2 PCR参数

95℃300s，1个循环；

95℃、15s，55℃、30s，72℃、30s，40个循环；

72℃、300s，1个循环；

37℃、20s，1个循环。

1.3用琼脂糖凝胶电泳验证

2.末端平滑DNA片段的3’末端加“A”反应

用Takara DNAA-Tailing Kit进行工程菌的构建

2.1在微量离心管中按照表2配制加“A”反应液，全量为50μL

表2

试剂名称	使用量
		10×A-Tailing Buffer	5μL
dNTP Mixture	4μlL
		A-Tailing Enzyme	0.5μL
末端平滑DNA片段	0.5～5μg
		灭菌水	up to 50μL

2.2 72℃反应20分钟。

2.3冰中静置1～2分钟。

3.A-Tailing DNA片段与T载体的连接转化

3.1在微量离心管中按照表3配制DNA溶液，全量为5μL。

表3

试剂名称	使用量
		pMD18-T Vector*	1μL
上述1-③的A-Tailing DNA溶液	0.1～0.3pmol
		灭菌水	up to 5μL

*CodeNo.6011是pMD18-T Vector的商品化编号，实验中其所需浓度为1μL(50ng)约为0.03pmol。

3.2加入5μL(等量)的Solution I*

*Solution I是CodeNo.6022 DNA Ligation Kit Ver.2.1的组份。

3.316℃反应30分钟*。

*室温(25℃)也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

长片段DNA(2kb以上)进行克隆时，连接反应时间请延长至数小时。

3.4全量(10μL)加入至100μL JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。

3.542℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。

3.6加入890μL SOC培养基，37℃振荡培养60分钟。

3.7在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，计数白色、蓝色菌落。

3.8挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。

3.9 PCR法检测插入片段大小正确的菌株即为克隆两组上下游引物对应的人类腺病毒唯一目的序列片段(位于六邻体蛋白基因)的工程菌。

3.10对分别含有两个不同目的片段的工程菌进行液体培养。

3.11分别提取含有目的片段的工程菌的质粒。

本发明还提供了上述呼吸道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒的应用。

附图说明

图1为实施例1中PCR扩增条件温度曲线图。

图2为实施例1中引物探针组合1FAM通道PCR扩增曲线图。

图3为实施例1中引物探针组合1HAX通道PCR扩增曲线图。

图4为实施例1中引物探针组合2FAM通道PCR扩增曲线图。

图5为实施例1中引物探针组合2HAX通道PCR扩增曲线图。

图6为实施例1中引物探针组合3FAM通道PCR扩增曲线图。

图7为实施例1中引物探针组合3HAX通道PCR扩增曲线图。

图8为实施例2中PCR扩增条件温度曲线图。

图9为实施例2中特异性实验FAM通道PCR扩增曲线图。

图10为实施例2中敏感性实验FAM通道PCR扩增曲线图。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供了呼吸道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒引物的筛选

利用“鸬鹚”生物大数据挖掘系统，设计三组引物及探针组合，收集312个临床标本，反复试验探索最佳试验条件，比较三组引物探针组合的准确度，保留最优者。

1.样本采集

取咽拭子样本，及时送检。收集样本312个，所有临床样本均来源于深圳市儿童医院。

2.核酸提取

2.1向咽拭子加入1.0mL生理盐水，震荡混匀；

2.2取50μl核酸提取液(10mM Tris-HCl,pH＝8.0；25mM NaOH；1％TritonX-100；1％NP-40；1mM EDTA；2％Chelex 100)到一洁净EP管中；

2.3取50μl样本混悬液置于一洁净EP管中，震荡混匀；

2.4将混合样本放入干浴锅中，100℃加热10min；

2.5 12000g离心5min，上清液即为咽拭子样本的DNA提取液(样本)，备用。

3.引物设计

实验室共设计3个引物探针组合，引物对和探针组合如下：

(1)引物探针组合1序列：

3,4,7型六邻体蛋白基因目的片段的上游引物SEQ ID NO.1：

5’-AGTCTTCGACGTGGTCAGAG-3’；

3,4,7型六邻体蛋白基因目的片段的下游引物SEQ ID NO.2：

5’-AGGTAGACGGCCTCGATGA-3’；

3,4,7型六邻体蛋白基因目的片段的探针SEQ ID NO.3：

5’-FAM-TGCACCAGCCMCACCGCGG-TAMRA-3’；

1,2,5,6型六邻体蛋白基因目的片段的上游引物SEQ ID NO.4：

5’-CCGAGACGTACTTCAGCCT-3’；

1,2,5,6型六邻体蛋白基因目的片段的下游引物SEQ ID NO.5：

5’-GACCGGTCTGTGGTCACG-3’；

1,2,5,6型六邻体蛋白基因目的片段的探针SEQ ID NO.6：

5’-FAM-CACGGTGGCGCCTACGCACG-TAMRA-3’；

(2)引物探针组合2序列：

全型别目的片段的上游引物1SEQ ID NO.10：

5’-GCGAGTGACCATTACTGACG-3’；

全型别目的片段的上游引物2SEQ ID NO.11：

5’-GCGCGTGACCGTTACTGACG-3’；

全型别目的片段的下游引物SEQ ID NO.12：

5’-CCAGGGCCTTGTARACGTAG-3’；

全型别目的片段的探针SEQ ID NO.13：

5’-FAM-CCAGACGCCGCACCTGYCC-TAMRA-3’；

(3)引物探针组合3序列：

3,4,7型六邻体蛋白基因目的片段的上游引物SEQ ID NO.14：

5’-CAGGACGCYTCGGAGTACCTGA-3’；

3,4,7型六邻体蛋白基因目的片段的下游引物SEQ ID NO.15：

5’-CGGTGGTCACATCGTGGGT-3’；

1,2,5,6型六邻体蛋白基因目的片段的上游引物SEQ ID NO.16：

5’-CAGGATGCYTCGGAGTACCTGA-3’；

1,2,5,6型六邻体蛋白基因目的片段的下游引物SEQ ID NO.17：

5’-GCTGAAGTACGTVTCGGTGGC-3’；

目的片段的共有探针SEQ ID NO.18：

5’-FAM-TGGTGCAGTTYGCCCG-TAMRA-3’；

4.反应体系

PCR反应液包括PCR反应液A、PCR反应液B。其中反应液A包括12.5mM Tris-HCl,pH9.0、50mM KCl、0.13％

X-100、3.13mM MgCl₂、0.45mM dATP、0.45mM dGTP、0.45mMdCTP、0.79mM dUTP、引物浓度各为0.5μM，探针浓度都为0.15μM；反应液B包括20mM Tris-HCl、100mM KCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、50％Glycerine、0.5％

20、2U/μL热启动酶、0.2U/μLUNG酶。

体系加样量如表4所示。

表4

组分名称	组成成分	加量
			PCR反应液A	引物、探针	46μl
PCR反应液B	热启动酶、UNG酶	1μl
			DNA提取液(样本)		3μL
总体积		50μL

所述PCR反应液A分别有3个组合：(1)包括三组引物对SEQ ID NO.1和2、4和5、7和8，三个探针SEQ ID NO.3、6、9；(2)包括两组引物SEQ ID NO.10,11和12、7和8，两个探针SEQID NO.13、9；(3)包括三组引物对SEQ ID NO.14和15、16和17、7和8，两个探针SEQ IDNO.18、9。

所述PCR反应液B包括热启动酶和UNG酶。

5.上机检测

对应上述加样体系，将试剂盒中各成份分别加入PCR反应管中，进行PCR扩增反应，具体反应步骤如下：

50℃120s，1个循环；

95℃600s，1个循环；

95℃、15s，55℃、45s(收集荧光)，40个循环；

37℃、20s，1个循环。

(见附图1)

6.结果判定(根据Ct值及扩增曲线形态)

表5

7.检测结果

引物探针组合1、引物探针组合2、引物探针组合3三个组合的内参(HAX)都能正常扩增，呈现出正常的S型曲线(见附图3、5、7)；对于目的基因的扩增，引物探针组合1组所呈现的曲线相对于其他两个引物探针的组合表现出更好的线性关系(见附图2、4、6)和更低的Ct值，所以选择引物探针组合1作为试剂盒所用的引物和探针。

实施例2

本实施例提供了呼吸道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒特异性及敏感性评价试验

1.样本准备：

(1)阳性样本：培养克隆两组上下游引物对应的人类腺病毒唯一目的序列片段的工程菌并提取质粒，用Qubit测定浓度，然后计算其浓度，并将质粒用AE buffer以10倍的稀释度稀释至5.0×10¹⁰copies/mL～5.0×10²copies/mL九个浓度梯度，并且相同浓度的两个质粒等体积混合。

(2)阴性样本(呼吸道腺病毒以外的其他病原体)：生理盐水，大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、A群链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、卡他球菌、百日咳鲍特杆菌(痰液培养得到的细菌，质谱及Sanger测序确证)的核酸，及咽拭子和痰液中提取的甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型、巨细胞病毒、EB病毒、肺炎支原体的核酸，Sanger测序确证。

2.反应体系：

X-100、3.13mM MgCl₂、0.45mM dATP、0.45mM dGTP、0.45mMdCTP、0.79mM dUTP、三对引物SEQ ID NO.1和2、4和5、7和8，浓度都为0.5μM，三个探针SEQID NO.3、6、9，浓度都为0.15μM；反应液B包括20mM Tris-HCl、100mM KCl、0.1mM EDTA、1mMDTT、50％Glycerine、0.5％

20、2U/μL热启动酶、0.2U/μL UNG酶。

体系加样量如表6和表7所示。

表6阴性样本孔

组分名称	组成成分	加量
			PCR反应液A	引物、探针	46μl
PCR反应液B	热启动酶、UNG酶	1μl
			阴性样本	生理盐水及病原体的核酸	3μL
总体积		50μL

表7阳性样本孔

组分名称	组成成分	加量
			PCR反应液A	引物、探针	46μl
PCR反应液B	热启动酶、UNG酶	1μl
			阳性样本	4个浓度重组质粒	3μL
总体积		50μL

3.上机检测：

50℃120s，1个循环；

95℃600s，1个循环；

95℃、15s，55℃、45s(收集荧光)，40个循环；

37℃、20s，1个循环。

(见附图8)

3.结果判定(根据Ct值)

表8

5.检测结果：

在特异性实验中，阴性样本(FAM通道)的扩增曲线不呈S型曲线，八种细菌和十种病毒的扩增曲线一致呈阴性(见图9)，表明该试剂盒引物和探针有很强的特异性；在敏感性实验中，阳性样本(FAM通道)在5.0×10¹⁰copies/mL～5.0×10²copies/mL之间有很好的线性关系(见图10)，最低检测线5.0×10²copies/mL，表现出很高的敏感性。

实施例3

本实施例提供了所述呼吸道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒与普瑞康腺病毒核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法)的比对实验

1.样本采集

取咽拭子样本，及时送检。共收集样本487个，所有临床样本均来源于深圳市儿童医院。

2.普瑞康腺病毒核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法)(国械注准20163400197)操作流程：

2.1取内标加入到样本处理液中，加入比例为1:50。(后面实验步骤均使用加入内标的样本处理液)。

2.2阴性、弱阳性和强阳性对照的处理：

2.2.1 50μL对照品中加入50μL样品处理液，充分震荡混匀。

2.2.2 100℃干浴或沸水浴10min；4℃放置30min；13,000rpm离心5min，备用。

2.3样本处理

2.3.1将浸有拭子头的采样液充分震荡混匀，挤干拭子头；室温静置5-10min，待大块状物下沉后，取上清置另一1.5mL灭菌离心管中，12,000rpm离心5min弃上清；沉淀用100μL灭菌生理盐水重悬。

2.3.2取50μL液体转至0.5mL灭菌离心管中，加入50μL样品处理液，充分震荡混匀。以下处理同2.2.2。

2.4按PCR反应液A为26μL×n，PCR反应液B为1μL×n混合配制PCR反应液。(注意：使用前确保PCR反应液充分溶解，PCR反应液B在使用前需离心以确保所有酶集中在底部)

2.5将反应液以27μL/管分装至PCR反应管中，将装有PCR反应液的反应管移至样本处理区。

2.6用移液枪分别取已处理好的样本、阴性对照、阳性对照上清各3μL分别加到装有PCR反应液的PCR反应管中。盖上管盖，离心数秒后转移至扩增检测区。

2.7将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪中进行扩增检测。

2.8循环参数设定

表9

2.9仪器通检测通道选择：FAM为ADV扩增信号，HEX/VIC为内标扩增通道。

3.检测结果

487个咽拭子样本的检测结果如表10所示：(1)本发明所用试剂盒检测出153个呼吸道腺病毒阳性，334个呼吸道腺病毒阴性；(2)普瑞康试剂盒检测出126个腺病毒阳性，有361个腺病毒阴性；

表10

由上表可知，本发明试剂盒的敏感性为100％；特异性为92.5％。进一步设计一代测序引物(B群上游引物SEQ ID NO.19：5’-GCATAGGACCAGGGAACAAATA-3’，B群下游引物SEQID NO.20：5’-TGTAGGAGCCAGGTAGAAGAA-3’；C/E群上游引物SEQ ID NO.21：5’-AGTGGTCTTACATGCACATCTC-3’，C/E群下游引物SEQ ID NO.22：5’-CATGTCTAGCACACGGTTATCA-3’)，对27个差异样本(本发明试剂盒检测阳性，普瑞康试剂盒检测阴性)中有剩余样本的16个样本进行Sanger测序，结果都为人类腺病毒3型或7型阳性(都为B群人类腺病毒)，与本发明试剂盒一致；普瑞康腺病毒检测试剂盒可以检测到消化道腺病毒(人类腺病毒40型、41型)，并与呼吸道腺病毒在相同的荧光通道检测荧光，无法区分型别，会导致误诊。由此对比得出本试剂盒有着更高的敏感性和特异性。一代测序虽是核酸检测的金标准，但需配备专用仪器，且价格昂贵，操作繁琐，且在测序前扩增产物的电泳检测容易发生气溶胶污染，而本发明检测通量大，成本低，兼容性好，能在不同的实时荧光定量PCR仪上使用，具有更加广泛的应用前景。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 深圳市儿童医院

<120> 一种呼吸道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒及其应用

<130> 2020.06.15

<141> 2020-06-22

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

agtcttcgac gtggtcagag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

aggtagacgg cctcgatga 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tgcaccagcc mcaccgcgg 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ccgagacgta cttcagcct 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gaccggtctg tggtcacg 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

cacggtggcg cctacgcacg 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

caagggcatc ctgggcta 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

ggtgtcgctg ttgaagtcag 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

cactgagcac caggtggtct cct 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gcgagtgacc attactgacg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

gcgcgtgacc gttactgacg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

ccagggcctt gtaracgtag 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

ccagacgccg cacctgycc 19

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

caggacgcyt cggagtacct ga 22

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

cggtggtcac atcgtgggt 19

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

caggatgcyt cggagtacct ga 22

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

gctgaagtac gtvtcggtgg c 21

<210> 18

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

tggtgcagtt ygcccg 16

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

gcataggacc agggaacaaa ta 22

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

tgtaggagcc aggtagaaga a 21

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

agtggtctta catgcacatc tc 22

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

catgtctagc acacggttat ca 22

Claims

1.一种呼吸道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒，包括特异性引物和探针以及PCR反应试剂，所述特异性引物和探针是由人类腺病毒1-7型别的六邻体蛋白基因的共同序列、人GADPH作为内参片段的特异性引物和探针组成，其特征在于，所述特异性引物和探针序列如下：

3,4,7型六邻体蛋白基因目的片段的上游引物SEQ ID NO.1：

5’-AGTCTTCGACGTGGTCAGAG-3’；

3,4,7型六邻体蛋白基因目的片段的下游引物SEQ ID NO.2：

5’-AGGTAGACGGCCTCGATGA-3’；

3,4,7型六邻体蛋白基因目的片段的探针SEQ ID NO.3：

5’-FAM-TGCACCAGCCMCACCGCGG-TAMRA-3’；

1,2,5,6型六邻体蛋白基因目的片段的上游引物SEQ ID NO.4：

5’-CCGAGACGTACTTCAGCCT-3’；

1,2,5,6型六邻体蛋白基因目的片段的下游引物SEQ ID NO.5：

5’-GACCGGTCTGTGGTCACG-3’；

1,2,5,6型六邻体蛋白基因目的片段的探针SEQ ID NO.6：

5’-FAM-CACGGTGGCGCCTACGCACG-TAMRA-3’；

内参片段人GADPH的探针SEQ ID NO.9：

5’-HEX-CACTGAGCACCAGGTGGTCTCCT-TAMRA-3’。

2.如权利要求1所述的呼吸道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测样品DNA；

(2)以待测样品DNA为模板，按一定比例加入PCR反应液A和PCR反应液B，其中反应液A包括12.5mM Tris-HCl，pH9.0、50mM KCl、0.13％

X-100、3.13mM MgCl₂、0.45mM dATP、0.45mM dGTP、0.45mM dCTP、0.79mM dUTP、三对引物SEQ ID NO.1和2、4和5、7和8，浓度都为0.3-0.7μM，三个探针SEQ ID NO.3、6、9，浓度都为0.1-0.2μM；反应液B包括20mM Tris-HCl、100mM KCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、50％Glycerine、0.5％

(3)根据Ct值进行结果判定。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，待测样品DNA与反应液A、反应液B的体积比为3：46：1。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，反应液A中含有三对引物SEQID NO.1和2、4和5、7和8，浓度都为0.5μM，三个探针SEQ ID NO.3、6、9，浓度都为0.15μM；PCR反应液B含有热启动酶和UNG酶，其浓度分别为2U/μL和0.2U/μL。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，PCR扩增程序的参数如下：

50℃120s，1个循环；

95℃600s，1个循环；

95℃、15s，55℃、45s，40个循环；

37℃、20s，1个循环。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为含有克隆SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4两组上下游引物各自对应的人类腺病毒唯一目的序列片段的质粒。