CN112592992A - 一种基于荧光rma法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引物探针组、试剂盒 - Google Patents

一种基于荧光rma法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引物探针组、试剂盒 Download PDF

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Abstract

本申请属于肺炎支原体和肺炎衣原体的检测技术领域，具体为一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引物探针组、试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水；所述扩增反应试剂包括MP和Cpn的引物和探针、M‑MLV逆转录酶、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；所述标准阳性质粒为含有MP和Cpn扩增基因序列的重组质粒，用于MP和Cpn核酸检测的阳性对照。

Description

一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引 物探针组、试剂盒
技术领域
本申请属于肺炎支原体和肺炎衣原体的检测技术领域，具体为一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引物探针组、试剂盒及其检测方法。
背景技术
肺炎支原体(MP)是儿童社区获得性肺炎(CAP)的重要病原之一。肺炎支原体是介乎细菌和病毒之间的一种微生物，主要经呼吸道传染，支原体可经血行播散至全身任何器官；另外，支原体感染后可产生自身抗体，导致多系统免疫损伤，引起多个系统的功能异常。肺炎支原体肺炎(MPP)占住院儿童CAP的10％-40％，是儿科医师广泛关注的问题。
肺炎衣原体(Cpn)是专性细胞内细菌样寄生物，属于衣原体科，肺炎衣原体是导致衣原体肺炎的主要病原体。年老体弱、营养不良、COPD、免疫功能低下者易被感染。感染后免疫力很弱，易于反复。肺炎衣原体感染缺乏特异的临床表现，确诊主要依据有关病因的特殊实验室检查，应结合呼吸道和全身症状、X线检查、病原学和血清学检查作综合分析。
目前肺炎支原体和肺炎衣原体常用的检测方法有如下几种：(1)病毒分离培养法：是诊断MP和Cpn感染的最可靠的方法，但到目前为止，这两种病原体很难通过培养获得，一方面是由于这些病人多为干性咳嗽，痰标本难以获得；另一方面是支原体和衣原体的培养要求很高，一般实验室难以开展。(2)血清学检测：最常用的血清学方法是补体结合反应(CFTs)，但此法存在许多缺点，如支原体CFTs的假阳性可以出现在炎症反应过程中，CFTs不能用于鉴别肺炎衣原体与鹦鹉热衣原体感染，因为两者有共同抗原；酶联免疫吸附试验(ELISA)由于可检测血清中IgM和IgG，故能区分急性感染和既往感染，适合于临床实验室作为MP和Cpn感染的常规检查，缺点为敏感性差，阳性预期值较低，不适合人群的筛查。(3)分子生物学检测：应用分子生物学技术对临床标本进行MP和Cpn核酸检测，其敏感性和特异性均很高，但须注意质量控制，否则可能出现较多的假阳性结果，且需要特殊的PCR扩增条件、专门的实验室和PCR仪，而且在检测过程中极易产生污染。
重组酶介导扩增(RMA)技术是一种核酸等温扩增技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。其原理是重组酶与引物结合形成复合体，并在双链DNA中识别同源序列；然后重组酶解开双链，引物与同源序列发生链交换反应并启动DNA合成，对模板进行指数式扩增；被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。RMA反应最适温度在37～42℃，整个过程在10-30min内即可完成，30min内就可以将靶序列扩增到10～12数量级，可实现核酸的快速检测。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引物探针组、试剂盒及其检测方法，本申请是通过下述方案实现的：
一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引物探针组，所述引物探针组为根据MP的粘附蛋白P1基因和Cpn的外膜蛋白A基因序列设计的引物和探针，其中，
(1)MP引物和探针序列为：
MP-F：
5’-TACATCTACCCTTACCGTTACAGTGGCATGTGAGC-3’；
MP-R：
5’-TACCGTTAACTTCTGGTTAAAGCGCTCGTACTCGT-3’；
MP-P：
5’-TCCGGAATTGTTAGCAGCTCTTCCCGACAAGG(FAM-dT)(THF)AAA(BHQ-dT)ACGGTAAGGAAAAC(C3-spacer)-3’。
(2)Cpn引物和探针序列为：
Cpn-F：
5’-ATTGATGGTACAATATGGGAAGGTGCTGCAGGAGA-3’；
Cpn-R：
5’-GCCTGCATTAGTGAACCACTCTGCATCGTGTAAAT-3’；
Cpn-P：
5’-CCTTGCGATCCTTGCGCTACTTGGTGCGACGC(HEX-dT)A(THF)(BHQ-dT)AGCTTACGTGCTGGA(C3-spacer)-3’。
优选的，所述核酸引物长度为30-35bp，GC含量占40-60％，5’端的3-5个核苷酸不可多于两个G，3’端应有G和C且连续的三个核苷酸不可相同。
优选的，所述核酸探针长度为46-52bp，包括携带有荧光基团的胸腺嘧啶核苷酸(T)和携带有猝灭基团的胸腺嘧啶核苷酸(T)，中间由一个四氢呋喃碱基(THF)隔开，荧光基团与猝灭基团间隔2-5个碱基。
优选的，所述荧光基团用FAM、HEX修饰，所述淬灭基团用BHQ修饰；所述探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团(dSpacer)。
一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的试剂盒，所述试剂盒中包括含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水。
优选的，所述扩增反应试剂包括MP和Cpn的引物探针组、M-MLV逆转录酶、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。
优选的，所述扩增反应试剂为干粉且单管分装。
优选的，所述标准阳性质粒为含有MP和Cpn扩增基因序列的重组质粒，用于MP和Cpn核酸检测的阳性对照。
优选的，所述无菌双蒸水为阴性对照，与标准阳性质粒一起检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。
优选的，所述引物和探针在扩增体系中的终浓度为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述M-MLV逆转录酶的终浓度为200ng/μL；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL。
一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样本的总RNA，待测样本选自咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物的至少一种；
(2)根据MP的粘附蛋白P1基因和Cpn的外膜蛋白A基因序列分别设计用于MP和Cpn检测的引物和探针；
(3)配制荧光RMA反应体系，向反应体系中加入提取的总RNA，进行反转录和RMA扩增反应；扩增反应在温度设定为42℃的荧光检测器中进行，反应时间为20min；
(4)结果分析：因为恒温扩增反应管中包含了两对特异性的正、反向引物和两条特异性探针；其中，两条特异性探针分别标记了不同的荧光基团(如FAM、HEX等)和淬灭基团(如BHQ)，在荧光RMA反应过程中两条探针将发出不同的荧光，在荧光检测器上显示不同的扩增曲线；根据是否出现相应扩增曲线，分析待测样本中是否含有MP或Cpn；出现相应的扩增曲线表示待测样本含有该种病原体，表现为阳性结果；不出现相应的扩增曲线或扩增曲线低于检测阈值表示待测样本中未检测到该种病原体，表现为阴性结果。
本申请克服现有技术的不足而提供一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的试剂盒，可广泛用于肺炎支原体和肺炎衣原体感染的辅助诊断，指导临床用药以及进行流行病学回顾性研究等多个领域。
本发明的优点在于：(1)可以对未知样本中的病原体核酸进行快速检测，可真实反映出患者体内病原体类型，有助于判断疾病预后，选择治疗方案及监测治疗效果；(2)与血清学相比，具有更高的灵敏性，适用于痰液、咽拭子、支气管肺泡灌洗液等多种样本的检测；(3)针对肺炎支原体和肺炎衣原体特异性序列设计引物探针，与血清学检验所用的抗原片段相比，具有更高的特异性，避免了常规血清学检测中与其它呼吸道病原体的交叉反应；(4)运用恒温扩增技术，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，降低了反应时间和温度，简化了操作步骤；(5)闭管检测不需PCR后处理，避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环境污染。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1荧光RMA法检测MP的灵敏度实验；
图2荧光RMA法检测MP的灵敏度实验；
图3荧光RMA法检测Cpn的特异性实验；
图4荧光RMA法检测Cpn的特异性实验。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
1、阳性标准质粒的制备
提取MP和Cpn的RNA为模板，对MP的粘附蛋白P1基因和Cpn的外膜蛋白A基因进行PCR扩增，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，克隆连接至pMD18-T载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落PCR验证。将阳性重组菌送公司测序，将测序正确的重组菌培养过夜，提取质粒DNA，获得阳性质粒(P-MP、P-Cpn)。
2、荧光RMA引物与探针的设计
针对MP的粘附蛋白P1基因和Cpn的外膜蛋白A基因设计了荧光RMA引物与探针，具体如表2所示：
表2引物与探针序列
Figure BDA0002871384290000061
注：MP-探针的荧光基团用FAM修饰，Cpn-探针的荧光基团用HEX修饰，淬灭基团都用BHQ修饰，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰。
3、荧光RMA反应体系的建立
将42.5μL缓冲液和5μL提取的病原体RNA模板加入到含有引物探针酶的冻干粉的恒温扩增反应管中，混匀；最后向管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀；将上述反应管放置于荧光检测器中，在42℃反应20min。每次反应均以标准阳性质粒作为阳性对照，以无菌双蒸水为阴性对照。
4、结果判读
根据是否出现相应扩增曲线，分析待测样本中是否含有MP或Cpn。仅出现MP的扩增曲线，表现为MP阳性；仅出现Cpn的扩增曲线，表现为Cpn阳性。
5、荧光RMA法检测MP和Cpn的灵敏度分析
将标准阳性质粒经PBS进行10倍系列稀释(包括104、103、102、101和100拷贝/反应)，以无菌双蒸水作为阴性对照，在上述反应体系条件下进行荧光RMA反应，每个浓度重复3次试验。根据图1-2可知，104-101结果均为阳性。即，荧光RMA法检测试剂盒的灵敏度达到10个拷贝/反应。
6、荧光RMA法检测MP和Cpn的特异性分析
用建立的荧光RMA方法分别检测肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(Cpn)、流感嗜血杆菌(HI)、肺炎链球菌(SP)和嗜肺军团杆菌(LP)等病原体核酸样本，评价方法的特异性，以无菌双蒸水作为阴性对照，每个试验重复检测3次。根据图3-4可知，仅当靶标病原体为MP时，荧光RMA法检测为MP阳性，而对Cpn和其他病原体检测为阴性；仅当靶标病原体为Cpn时，检测为Cpn阳性，而对MP和其他病原体检测为阴性。说明该荧光RMA法具有良好的检出效果和特异性。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 济南国益生物科技有限公司
<120> 一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引物探针组、试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA/RNA
<213> 肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)
<400> 1
tacatctacc cttaccgtta cagtggcatg tgagc 35
<210> 2
<211> 35
<212> DNA/RNA
<213> 肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)
<400> 2
taccgttaac ttctggttaa agcgctcgta ctcgt 35
<210> 3
<211> 52
<212> DNA/RNA
<213> 肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)
<400> 3
tccggaattg ttagcagctc ttcccgacaa ggttaaatac ggtaaggaaa ac 52
<210> 4
<211> 35
<212> DNA/RNA
<213> 肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia)
<400> 4
attgatggta caatatggga aggtgctgca ggaga 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA/RNA
<213> 肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia)
<400> 5
gcctgcatta gtgaaccact ctgcatcgtg taaat 35
<210> 6
<211> 51
<212> DNA/RNA
<213> 肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia)
<400> 6
ccttgcgatc cttgcgctac ttggtgcgac gctattagct tacgtgctgg a 51

Claims (5)

1.一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组为根据MP的粘附蛋白P1基因和Cpn的外膜蛋白A基因序列设计的引物和探针，引物和探针序列为：
(1)MP引物和探针序列为：
MP-F：
5’-TACATCTACCCTTACCGTTACAGTGGCATGTGAGC-3’；
MP-R：
5’-TACCGTTAACTTCTGGTTAAAGCGCTCGTACTCGT-3’；
MP-P：
5’-TCCGGAATTGTTAGCAGCTCTTCCCGACAAGG(FAM-dT)(THF)AAA(BHQ-dT)ACGGTAAGGAAAAC(C3-spacer)-3’。
(2)Cpn引物和探针序列为：
Cpn-F：
5’-ATTGATGGTACAATATGGGAAGGTGCTGCAGGAGA-3’；
Cpn-R：
5’-GCCTGCATTAGTGAACCACTCTGCATCGTGTAAAT-3’；
Cpn-P：
5’-CCTTGCGATCCTTGCGCTACTTGGTGCGACGC(HEX-dT)A(THF)(BHQ-dT)AGCTTACGTGCTGGA(C3-spacer)-3’。
2.如权利要求1所述的一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、标准阳性质粒、无菌双蒸水。
3.如权利要求2所述的一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应试剂包括MP和Cpn的引物探针组、M-MLV逆转录酶、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。
4.如权利要求3所述的一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的试剂盒，其特征在于，所述标准阳性质粒为含有MP和Cpn扩增基因序列的重组质粒，用于MP和Cpn核酸检测的阳性对照。
5.如权利要求4所述的一种基于荧光RMA法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应试剂为干粉且单管分装。
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