CN115044686B - 一种同时检测brdc七种病原体的实时荧光定量pcr引物对和探针组合 - Google Patents

一种同时检测brdc七种病原体的实时荧光定量pcr引物对和探针组合 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测牛呼吸疾病综合征七种病原体的实时荧光定量PCR引物对和探针组合，该套引物探针能够特异性的扩增出牛支原体的oppD/F基因、牛多杀性巴氏杆菌的ompH基因、牛溶血曼氏杆菌的GCP基因、牛传染性鼻气管炎病毒的gB基因、牛合胞体病毒的N基因、牛副流感病毒3型a基因型的N基因、牛副流感病毒3型c基因型的N基因，可同时用于上述七种病原体的检测以提高检测效率。

Description

一种同时检测BRDC七种病原体的实时荧光定量PCR引物对和 探针组合
技术领域
本发明涉及一套用于同时检测牛呼吸疾病综合征多种病原体的引物对和探针组合，属于病原检测领域。
背景技术
牛呼吸疾病综合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC或BRD)是在环境应激因素诱导下由多种病原体共同作用所引起的、以牛支气管炎和肺炎为主要症状的疾病的总称，发病率和死淘率高，给养牛业带来重大经济损失。致我国牛呼吸疾病综合征的细菌性病原主要为牛支原体(Mycoplasma bovis,M.b)、牛多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida,P.m)、牛溶血曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,M.h)、昏睡嗜血杆菌(Haemophiluo somnus,H.s)，病毒性病原包括牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovinerhinotracheitis virus,IBRV)、牛合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)、牛副流感病毒3型基因a和c型(Bovine parainfluenza virus types 3a and 3c,BPIV-3a and BPIV-3c)。该病的典型症状主要表现为高热(体温40℃-41.5℃)、精神沉郁、呼吸困难、咳喘、眼分泌物增多、流涎等，易造成永久性的肺损伤；急性型病例甚至会出现突然倒地，口鼻流出泡沫状液体并迅速死亡。牛呼吸疾病综合征在世界范围内严重流行，病死率平均在10％左右，甚至可高达40％。
病原的分离鉴定是检测病原的金标准，但该方法不仅对培养条件要求严苛，而且对病料质量要求较高，另外操作繁琐、耗时长、技术要求高和分离率低，常需要分子生物学、血清学和生化学等鉴定，才可以最终确定病原体。血清学诊断方法虽然已被普遍使用，但是由于抗体在机体内产生速度较为缓慢，因此在病原急性感染或早期感染阶段并不适宜使用。常规PCR方法的扩增结果通过凝胶电泳的目的片段大小及序列测定分析来判断，不够简单直接，且灵敏度较低。
牛呼吸疾病综合征通常是多病原混合感染，只有联合检测才能获得准确的诊断结果。多联实时荧光定量PCR不仅可以同时检测多病原，而且具有高特异性与高敏感性，且需时少，检测效率高，同时可实现菌种或型的鉴定，因此是BRDC多病原同时检测的首选方法。但是，目前国内缺乏针对牛呼吸疾病综合征多种细菌和病毒同时检测的方法。因此，为了填补此空白，满足临床检测的需要，建立了多联荧光定量PCR方法检测牛呼吸疾病综合征的多种病原。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测牛呼吸疾病综合征七种主要细菌和病毒的实时荧光定量PCR引物对和探针组合，用于检测各种样本中的牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛溶血曼氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、牛副流感病毒3型a基因型和c基因型，以提高检测效率。
上述目的是通过以下技术方案实现的：
用于检测牛呼吸疾病综合征七种病原体的实时荧光定量PCR引物对和探针组合，该套引物探针能够特异性的扩增出牛支原体的oppD/F基因、牛多杀性巴氏杆菌的ompH基因、牛溶血曼氏杆菌的GCP基因、牛传染性鼻气管炎病毒的gB基因、牛合胞体病毒的N基因、牛副流感病毒3型a基因型的N基因、牛副流感病毒3型c基因型的N基因，因此可用于上述七种病原体的检测。
所述引物对和探针包括以上每种病原的一对引物和一条探针，各引物探针的核苷酸序列具体如下：
M.b-F：5'-TTCTCAATTCAAGGAACCCC-3'(SEQ ID No.1)
M.b-R：5'-ACGTTGCTGCTTTATGATGAC-3'(SEQ ID No.2)
M.b-P：5'-AAACTTACCTATCGGTGACCCTTTTGC-3'(SEQ ID No.3)
P.m-F：5'-GCGAGCAAGAAGCGATCA-3'(SEQ ID No.4)
P.m-R：5'-CGACTGCACCTTCATTCAGTAC-3'(SEQ ID No.5)
P.m-P：5'-TACCGCGTTTTGAATGCTATCCACT-3'(SEQ ID No.6)
M.h-F：5'-TTGCTCTAACGCTCGCTTG-3'(SEQ ID No.7)
M.h-R：5'-GGACTGGATTTCAGTTTCTCC-3'(SEQ ID No.8)
M.h-P：5'-ATCAACCACGGCTTGTTGGAATGC-3'(SEQ ID No.9)
IBRV-F：5'-AGCACCTTTGTGGACCTAA-3'(SEQ ID No.10)
IBRV-R：5'-GCTGTATCTCGCTGTAGTCG-3'(SEQ ID No.11)
IBRV-P：5'-CCGCGAGTTCTTGCCGCTAGAAGTGT-3'(SEQ ID No.12)
BRSV-F：5'-ACGATACAAAGGACTTATCCCA-3'(SEQ ID No.13)
BRSV-R：5'-CTGCAAAGATTCCTTCTACCC-3'(SEQ ID No.14)
BRSV-P：5'-ATTTTGGCATTGCTCAATCCTCAAC-3'(SEQ ID No.15)
BPIV-3a-F：5'-CATCCATAGTTCCTTATGCATG-3'(SEQ ID No.16)
BPIV-3a-R：5'-TTGGGTCGCTCTGTTTCC-3'(SEQ ID No.17)
BPIV-3a-P：5'-CGTTGAGTCTTTTGTTCAGCCTGTCTCT-3'(SEQ ID No.18)
BPIV-3c-F：5'-ACAGTATGTAACAGGACGGTCC-3'(SEQ ID No.19)
BPIV-3c-R：5'-GCCTCTTGTGTAATCCCCAA-3'(SEQ ID No.20)
BPIV-3c-P：5'-TGCCACTGCTTGACCTAGTTGGAAC-3'(SEQ ID No.21)
其中，所述探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。
具体地，检测牛支原体的探针标记的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；检测牛多杀性巴氏杆菌的探针标记的荧光报告基团为Texas red，荧光淬灭基团为BHQ2；检测牛溶血曼氏杆菌的探针标记的荧光报告基团为HEX，荧光淬灭基团为BHQ1；检测牛传染性鼻气管炎病毒的探针标记的荧光报告基团为CY5，荧光淬灭基团为BHQ2；检测牛合胞体病毒的探针标记的荧光报告基团为CY5.5，荧光淬灭基团为BHQ2；检测牛副流感病毒3型a基因型的探针标记的荧光报告基团为Texas red，荧光淬灭基团为BHQ2；检测牛副流感病毒3型c基因型的探针标记的荧光报告基团为HEX，荧光淬灭基团为BHQ1。
本发明提供的引物对和探针组合可应用于牛呼吸疾病综合征的临床诊断，以及非诊断目的的病原体实验室筛查鉴定。
所述的引物对和探针组合在制备检测牛呼吸疾病综合征七种病原体的试剂盒中的应用。
一种检测牛呼吸疾病综合征七种病原体的试剂盒，该试剂盒包含所述的引物对和探针组合。
一种非诊断目的检测牛呼吸疾病综合征七种病原体的实时荧光定量PCR方法，该方法包括向反应体系中加入所述的引物对和探针组合进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增的步骤。
优选地，在进行PCR扩增时，采用三管联合的方法，所述反应体系如下：
管1：2×Probe PCR Master Mix 10μL，牛多杀性巴氏杆菌的上下游引物终浓度250nmol/L；牛溶血曼氏杆菌的上下游引物终浓度为200nmol/L；牛多杀性巴氏杆菌的探针终浓度为350nmol/L，牛溶血曼氏杆菌的探针终浓度为350nmol/L，模板5μL，双蒸水补足20μL；
管2：2×Probe PCR Master Mix 10μL，牛合胞体病毒的上下游引物终浓度250nmol/L；牛副流感病毒3型a基因型的上下游引物终浓度为400nmol/L；牛副流感病毒3型c基因型的上下游引物终浓度为350nmol/L；牛合胞体病毒的探针终浓度为350nmol/L，牛副流感病毒3型a基因型的探针终浓度为250nmol/L，牛副流感病毒3型c基因型的探针终浓度为300nmol/L，模板5μL，双蒸水补足20μL；
管3：2×Probe PCR Master Mix 10μL，牛支原体的上下游引物终浓度250nmol/L；牛传染性鼻气管炎的上下游引物终浓度为350nmol/L；牛支原体的探针终浓度为350nmol/L，牛传染性鼻气管炎病毒的探针终浓度为250nmol/L，模板5μL，双蒸水补足20μL。
进一步优选地，3管在同一程序下扩增，反应程序为：95℃预变性30s，1个循环；95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环，每个循环结束时自动收集荧光信号。
本发明对所述牛呼吸疾病综合征七种病原体的分析灵敏度为：牛支原体102copies/μL、牛多杀性巴氏杆菌102copies/μL、牛溶血曼氏杆菌101copies/μL、牛传染性鼻气管炎病毒102copies/μL、牛合胞体病毒102copies/μL，牛副流感病毒3型a基因型102copies/μL，牛副流感病毒3型c基因型101copies/μL。
本发明对无乳支原体、昏睡嗜血杆菌、副猪嗜血杆菌、化脓隐秘杆菌、摩氏摩根菌、不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、乳房链球菌、停乳链球菌、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、猪伪狂犬病毒的阳性核酸检测呈现阴性结果，具有良好的特异性。
七种病原体的批内重复变异系数均小于2.5％，批间重复变异系数均小于5.5％，具有良好的重复性。
对临床样本的检测结果表明，相比常规PCR，本发明的阳性检出率更高，结果更加准确。
综上，本发明提供的引物探针和检测方法，可一次检测七种牛呼吸疾病综合征病原，大幅提高了检测效率。而且本发明灵敏度高、特异性好，与其他致牛呼吸疾病综合征细菌和病毒没有交叉反应性，临床样品检测结果表明，该方法结果准确可靠，可以用于临床和实验室对牛呼吸疾病综合征的主要病原进行检测。
附图说明
图1：多联实时荧光定量PCR体系检测牛支原体标准曲线：横坐标为质粒拷贝数的对数，纵坐标为检出Ct值。
图:2：多联实时荧光定量PCR体系检测牛多杀性巴氏杆菌标准曲线：横坐标为质粒拷贝数的对数，纵坐标为检出Ct值。
图3：多联实时荧光定量PCR体系检测牛溶血曼氏杆菌标准曲线：横坐标为质粒拷贝数的对数，纵坐标为检出Ct值。
图4：多联实时荧光定量PCR体系检测牛传染性鼻气管炎病毒标准曲线：横坐标为质粒拷贝数的对数，纵坐标为检出Ct值。
图5：多联实时荧光定量PCR体系检测牛合胞体病毒标准曲线：横坐标为质粒拷贝数的对数，纵坐标为检出Ct值。
图6：多联实时荧光定量PCR体系检测牛副流感病毒3型a基因型标准曲线：横坐标为质粒拷贝数的对数，纵坐标为检出Ct值。
图7：多联实时荧光定量PCR体系检测牛副流感病毒3型c基因型标准曲线：横坐标为质粒拷贝数的对数，纵坐标为检出Ct值。
图8：多联实时荧光定量PCR体系检测牛支原体敏感性试验。
图9：多联实时荧光定量PCR体系检测牛多杀性巴氏杆菌敏感性试验。
图10：多联实时荧光定量PCR体系检测牛溶血曼氏杆菌敏感性试验。
图11：多联实时荧光定量PCR体系检测牛传染性鼻气管炎病毒敏感性试验。
图12：多联实时荧光定量PCR体系检测牛合胞体病毒敏感性试验。
图13：多联实时荧光定量PCR体系检测牛副流感病毒3型a基因型敏感性试验。
图14：多联实时荧光定量PCR体系检测牛副流感病毒3型c基因型敏感性试验。
图15：多联实时荧光定量PCR体系检测24种病原特异性试验结果。1为多杀性巴氏杆菌A型；2为多杀性巴氏杆菌B型；3为多杀性巴氏杆菌D型；4为多杀性巴氏杆菌F型；5为牛溶血曼氏杆菌A1型；6牛溶血曼氏杆菌A6型；7为牛传染性鼻气管炎病毒；8为牛支原体，9为牛合胞体病毒；10为牛副流感病毒3型a基因型；11为牛副流感病毒3型c基因型；12-24分别为无乳支原体、昏睡嗜血杆菌、副猪嗜血杆菌、化脓隐秘杆菌、摩氏摩根菌、不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、乳房链球菌、停乳链球菌、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、猪伪狂犬病毒；25为阴性对照。
具体实施方式
实施例1：引物序列的设计和优化
根据NCBI公布的牛支原体的oppD/F基因，牛多杀性巴氏杆菌的ompH基因，牛溶血曼氏杆菌的GCP基因，牛传染性鼻气管炎病毒的gB基因，牛合胞体病毒的N基因，牛副流感病毒3型a基因型的N基因和牛副流感病毒3型c基因型的N基因序列设计引物和探针，参考相关文献，使用Primer Premier 5设计引物和探针并优化，所涉及引物和探针序列如表1所示，产物序列如SEQ ID No.22-28所示。引物和探针由北京擎科生物科技有限公司合成，使用ddH2O稀释至浓度为10μmol/L，4℃保存备用。
表1引物和探针序列
实施例2：检测条件的优化
浓度为1×104copies/μL的牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛溶血曼氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型a基因型、牛副流感病毒3型c基因型的重组质粒作为标准品，采用20μL反应体系，2×Probe PCR Master Mix 10μL，将上、下游引物和探针引物终浓度在100nmol/L-500nmol/L之间调整，模板5μL，ddH2O水补足20μL。反应程序为：95℃预变性30s，1个循环；95℃变性10s，55℃-65℃退火30s，40个循环。根据荧光定量PCR扩增曲线和Ct值确定最佳引物浓度和反应程序。
优化后的反应条件为：
管1：2×Probe PCR Master Mix 10μL，牛多杀性巴氏杆菌上下游引物终浓度250nmol/L；牛溶血曼氏杆菌的上下游引物终浓度为200nmol/L；牛多杀性巴氏杆菌的探针终浓度为350nmol/L，牛溶血曼氏杆菌的探针终浓度为350nmol/L，模板5μL，双蒸水补足20μL；
管2：2×Probe PCR Master Mix 10μL，牛合胞体病毒上下游引物终浓度250nmol/L；牛副流感病毒3型a基因型的上下游引物终浓度为400nmol/L；牛副流感病毒3型c基因型的上下游引物终浓度为350nmol/L；牛合胞体病毒的探针终浓度为350nmol/L，牛副流感病毒3型a基因型的探针终浓度为250nmol/L，牛副流感病毒3型c基因型的探针终浓度为300nmol/L，模板5μL，双蒸水补足20μL；
管3：2×Probe PCR Master Mix 10μL，牛支原体上下游引物终浓度250nmol/L；牛传染性鼻气管炎的上下游引物终浓度为350nmol/L；牛支原体的探针终浓度为350nmol/L，牛传染性鼻气管炎病毒的探针终浓度为250nmol/L，模板5μL，双蒸水补足20μL。
3管在同一程序下扩增，反应程序为：95℃预变性30s，1个循环；95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。
实施例3：检测方法的标准曲线、灵敏性、特异性与重复性
标准曲线：对浓度为1×108copies/μL的七种病原质粒进行10倍梯度稀释做为模板，按照已优化好的TaqMan实时荧光定量PCR反应条件进行扩增，以各质粒浓度拷贝数的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标建立标准曲线，结果见图1-图7。牛多杀性巴氏杆菌标准曲线方程：y＝-3.361×log(x)+40.145；牛溶血曼氏杆菌标准曲线方程：y＝-3.238×log(x)+39.809；牛支原体标准曲线方程：y＝-3.336×log(x)+44.849；牛传染性鼻气管炎病毒标准曲线方程：y＝-3.438×log(x)+44.388；牛合胞体病毒标准曲线方程：y＝-3.3.675×log(x)+45.397；牛副流感病毒3型a基因型标准曲线方程：y＝-3.743×log(x)+43.467；牛副流感病毒3型c基因型标准曲线方程：y＝-3.584×log(x)+46.071，七种病原标准曲线的相关系数R2均大于0.99，标准曲线可用。
灵敏性：本方法可检测到牛支原体102copies/μL、牛多杀性巴氏杆菌102copies/μL、牛溶血曼氏杆菌101copies/μL、牛传染性鼻气管炎病毒102copies/μL、牛合胞体病毒102copies/μL，牛副流感病毒3型a基因型102copies/μL，牛副流感病毒3型c基因型101copies/μL，具有较高的分析灵敏度。敏感性实验结果见图8-图14。
特异性：当反应体系中只加入牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌(A、B、D、F型)、牛溶血曼氏杆菌(A1、A6型)、牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、牛副流感病毒3型a基因型、牛副流感病毒3型c基因型的基因组DNA作为模板，采用本方法进行实时荧光定量PCR扩增时，结果得到特异性荧光曲线。对无乳支原体、昏睡嗜血杆菌、副猪嗜血杆菌、化脓隐秘杆菌、摩氏摩根菌、不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、乳房链球菌、停乳链球菌、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、猪伪狂犬病毒的阳性核酸的扩增结果显示，这13种病原的DNA/cDNA、阴性对照以及空白对照均不能产生扩增曲线，呈现阴性结果，见图15，表明本申请建立的Taqman实时荧光定量PCR法具有良好的特异性。
重复性：分别以3个不同时间，不同批次稀释的浓度为1×106copies/μL-1×104copies/μL的牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛溶血曼氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、牛副流感病毒3型a基因型、牛副流感病毒3型c基因型的重组质粒作为模板，每次进行7种样本的3个不同浓度同时检测，每次检测做3个重复。通过计算Ct值的标准差(standard deviation，SD)和变异系数(coefficient of variation，CV)验证本申请的方法的批内重复性和批间重复性，重复性试验结果如表2所示。
表2重复性试验
实施例4：临床样品检测
本研究对115份临床细菌牛鼻拭子样品和105份临床病毒牛鼻拭子样品同时用多种方法进行牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛溶血曼氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、牛副流感病毒3型a基因型、牛副流感病毒3型c基因型七种病原的检测，结果如下:
(1)同时用本方法、普通PCR及行业标准PCR法(NY/T3234-2018)进行牛支原体检测，结果显示，本方法检出阳性样品数为32；普通PCR检出阳性样品数为10；行业标准PCR法检出阳性样品数为9。本方法对牛支原体的阳性检出率高于普通PCR和行业标准PCR法。
(2)同时用本方法和普通PCR对牛多杀性巴氏杆菌进行检测，结果显示，本方法检出阳性样品数为41；普通PCR检出阳性样品数为33。本方法对牛多杀性巴氏杆菌的阳性检出率高于普通PCR。
(3)同时用本方法和普通PCR对牛溶血曼氏杆菌进行检测，结果显示，本方法检出阳性样品数为29；普通PCR检出阳性样品数为9。本方法对牛溶血曼氏杆菌的阳性检出率高于普通PCR。
(4)分别采用本方法、国家标准荧光定量PCR法(GB/T27981-2011)及普通PCR法对牛传染性鼻气管炎病毒进行检测，结果显示三种方法检出阳性样品数目分别为10、13、0。本方法与国家标准荧光定量PCR相比，符合率为97.14％，且比普通PCR阳性检出率高。
(5)同时用本方法和普通PCR对牛合胞体病毒进行检测，结果显示，本方法检出阳性样品数为1；普通PCR检出阳性样品数为0。对阳性产物测序，证明确为牛合胞体病毒阳性。本方法对牛合胞体病毒的阳性检出率高于普通PCR。
(6)同时用本方法和牛副流感病毒3型通用引物普通PCR对牛副流感病毒3型c基因型进行检测，结果显示，本方法检出阳性样品数为9；普通PCR检出阳性样品数为6。对检测阳性样品产物测序，证明均为牛副流感病毒3型c基因型阳性。本方法对牛副流感病毒3型c基因型的阳性检出率高于普通PCR。
(7)由于本方法和普通PCR均未检测到牛副流感病毒3型a基因型阳性样品，为验证本方法对检测牛副流感病毒3型a基因型的可行性，利用本方法对牛副流感病毒3型病毒液检测，显示为牛副流感病毒3型a基因型阳性，产物测序结果确为牛副流感病毒3型a基因型阳性。
综上，本申请建立的Taqman实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性好，与其他病原无交叉反应；适用于实验室对牛呼吸疾病综合征七种主要病原体的常规检测，可为牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛溶血曼氏杆菌、牛支原体、牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、牛副流感病毒3型a基因型、牛副流感病毒3型c基因型感染引起牛呼吸疾病综合征的快速诊断提供必要的技术支撑。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种同时检测BRDC七种病原体的实时荧光定量PCR引物对和探针组合
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttctcaattc aaggaacccc 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttgctgc tttatgatga c 21
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaacttacct atcggtgacc cttttgc 27
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgagcaaga agcgatca 18
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgactgcacc ttcattcagt ac 22
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taccgcgttt tgaatgctat ccact 25
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttgctctaac gctcgcttg 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggactggatt tcagtttctc c 21
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atcaaccacg gcttgttgga atgc 24
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agcacctttg tggacctaa 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gctgtatctc gctgtagtcg 20
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccgcgagttc ttgccgctag aagtgt 26
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acgatacaaa ggacttatcc ca 22
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctgcaaagat tccttctacc c 21
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
attttggcat tgctcaatcc tcaac 25
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
catccatagt tccttatgca tg 22
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttgggtcgct ctgtttcc 18
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgttgagtct tttgttcagc ctgtctct 28
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acagtatgta acaggacggt cc 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcctcttgtg taatccccaa 20
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgccactgct tgacctagtt ggaac 25
<210> 22
<211> 145
<212> DNA
<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)
<400> 22
ttctcaattc aaggaacccc accagatatg gcaaacttac ctatcggtga cccttttgca 60
cctagaaatg actttgcctt agaaattgac tatgaaaaag aaccaccatt aattgaaatt 120
aatagtcatc ataaagcagc aacgt 145
<210> 23
<211> 183
<212> DNA
<213> 牛多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)
<400> 23
gcgagcaaga agcgatcaat aaactcgtta ctgcacatga tgaagaagtc agtaaatatc 60
aagacgatta tgcaaaacgt gaacgtgaag aaaccgcaaa attagtggat agcattcaaa 120
acgcggtaaa tacggttgca agagagaaaa actatacatt agtactgaat gaaggtgcag 180
tcg 183
<210> 24
<211> 171
<212> DNA
<213> 牛溶血曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)
<400> 24
ttgctctaac gctcgcttgc atttaattaa aatagtatca accacggctt gttggaatgc 60
gtgggcaata tcgcatttgg tttgctcatc gagttcacca ttttcattaa gattggcttt 120
aatcgtattc gcagcaaagg tttttaaacc ggagaaactg aaatccagtc c 171
<210> 25
<211> 118
<212> DNA
<213> 牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus)
<400> 25
agcacctttg tggacctaaa cctcacggtt ctggaggacc gcgagttctt gccgctagaa 60
gtgtacacgc gcgccgagct cgccgacacg ggtctgctcg actacagcga gatacagc 118
<210> 26
<211> 149
<212> DNA
<213> 牛合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus)
<400> 26
acgatacaaa ggacttatcc caaaagatat agccaacagc ttctatgaag tatttgaaaa 60
gtaccctcat tacatagatg tattcgtgca ttttggcatt gctcaatcct caactagagg 120
aggtagtagg gtagaaggaa tctttgcag 149
<210> 27
<211> 153
<212> DNA
<213> 牛副流感病毒3 a型(Bovine parainfluenza virus types 3a)
<400> 27
catccatagt tccttatgca tgggcagacg aaaccaggag tgatacccag actgaatctg 60
tcacagaaat cgaaagcatc aaaaccgaac aaagaaacat cagagacagg ctgaacaaaa 120
gactcaacga aaagaggaaa cagagcgacc caa 153
<210> 28
<211> 126
<212> DNA
<213> 牛副流感病毒3 c型(Bovine parainfluenza virus types 3c)
<400> 28
acagtatgta acaggacggt cctatctaga tattgagatg ttccaactag gtcaagcagt 60
ggcacgtgac gccgagtcac aaatgaattc aatattggat gaagaattgg ggattacaca 120
agaggc 126

Claims (1)

1.一种非诊断目的检测牛呼吸疾病综合征七种病原体的实时荧光定量PCR方法，其特征在于：包括向反应体系中加入引物对和探针组合进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增的步骤，所述七种病原体为牛支原体（Mycoplasma bovis）、牛多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）、牛溶血曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）、牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus）、牛合胞体病毒（Bovine respiratorysyncytial virus）、牛副流感病毒3型a基因型（Bovine parainfluenza virus types 3a）和牛副流感病毒3型c基因型（Bovine parainfluenza virus types 3c），
所述引物对和探针组合为：
用于检测牛支原体的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示；
用于检测牛多杀性巴氏杆菌的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQID No.5所示，探针序列如SEQ ID No.6所示；
用于检测牛溶血曼氏杆菌的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQID No.8所示，探针序列如SEQ ID No.9所示；
用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的上游引物序列如SEQ ID No.10所示，下游引物序列如SEQ ID No.11所示，探针序列如SEQ ID No.12所示；
用于检测牛合胞体病毒的上游引物序列如SEQ ID No.13所示，下游引物序列如SEQ IDNo.14所示，探针序列如SEQ ID No.15所示；
用于检测牛副流感病毒3型a基因型的上游引物序列如SEQ ID No.16所示，下游引物序列如SEQ ID No.17所示，探针序列如SEQ ID No.18所示；
用于检测牛副流感病毒3型c基因型的上游引物序列如SEQ ID No.19所示，下游引物序列如SEQ ID No.20所示，探针序列如SEQ ID No.21所示，
所述探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团，检测牛支原体的探针标记的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；检测牛多杀性巴氏杆菌的探针标记的荧光报告基团为Texas red，荧光淬灭基团为BHQ2；检测牛溶血曼氏杆菌的探针标记的荧光报告基团为HEX，荧光淬灭基团为BHQ1；检测牛传染性鼻气管炎病毒的探针标记的荧光报告基团为CY5，荧光淬灭基团为BHQ2；检测牛合胞体病毒的探针标记的荧光报告基团为CY5.5，荧光淬灭基团为BHQ2；检测牛副流感病毒3型a基因型的探针标记的荧光报告基团为Texas red，荧光淬灭基团为BHQ2；检测牛副流感病毒3型c基因型的探针标记的荧光报告基团为HEX，荧光淬灭基团为BHQ1，
采用三管联合的方法，所述反应体系如下：
管1：2×Probe PCR Master Mix 10μL，牛多杀性巴氏杆菌（P.m）的上下游引物终浓度250nmol/L；牛溶血曼氏杆菌（M.h）的上下游引物终浓度为200nmol/L；牛多杀性巴氏杆菌的探针终浓度为350nmol/L，牛溶血曼氏杆菌的探针终浓度为350nmol/L，模板5μL，双蒸水补足20μL；
管2：2×Probe PCR Master Mix 10μL，牛合胞体病毒（BRSV）的上下游引物终浓度250nmol/L；牛副流感病毒3型a基因型（BPIV-3a）的上下游引物终浓度为400nmol/L；牛副流感病毒3型c基因型（BPIV-3c）的上下游引物终浓度为350nmol/L；牛合胞体病毒的探针终浓度为350nmol/L，牛副流感病毒3型a基因型的探针终浓度为250nmol/L，牛副流感病毒3型c基因型的探针终浓度为300nmol/L，模板5μL，双蒸水补足20μL；
管3：2×Probe PCR Master Mix 10μL，牛支原体（M.b）的上下游引物终浓度250nmol/L；牛传染性鼻气管炎（IBRV）的上下游引物终浓度为350nmol/L；牛支原体的探针终浓度为350nmol/L，牛传染性鼻气管炎病毒的探针终浓度为250nmol/L，模板5μL，双蒸水补足20μL，
3管在同一程序下扩增，反应程序为：95℃预变性30s，1个循环；95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环，每个循环结束时自动收集荧光信号，
该方法对无乳支原体、昏睡嗜血杆菌、副猪嗜血杆菌、化脓隐秘杆菌、摩氏摩根菌、不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、乳房链球菌、停乳链球菌、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、猪伪狂犬病毒的阳性核酸检测呈现阴性结果。
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